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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
RELATORIO DE ESTÁGIO
II MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Andreia Delgado Crisóstomo
LISBOA , 4 de Maio de 2011
UNIVERSIDADE DE L ISBOA Faculdade de Farmácia
II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 2 Andreia Delgado Crisóstomo
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
II MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
RELATÓRIO DE ESTÁGIO HOSPITAL DE CASCAIS- GENERAL-LAB
SOPRELAB – GENERAL-LAB
ORIENTAÇÃO : DRA JOANA SELADA LAMEIRO DOMINGUES
Andreia Delgado Crisóstomo
LISBOA, 4 de Maio de 2011
UNIVERSIDADE DE L ISBOA Faculdade de Farmácia
II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 3 Andreia Delgado Crisóstomo
AGRADECIMENTOS
Muitas foram as pessoas que contribuíram para que o meu sonho pessoal,
profissional e académico se tornasse real.
Os meus sinceros agradecimentos...
Aos meus pais, António e Ana Maria, pois sem eles não teria condições para
engreçar nesta demanda. Agradeço por me terem apoiado, ouvido, pelas incansáveis
leituras e correções do meu relatório e monografia e por sempre apostarem em mim.
A toda a minha família, namorado e família dele por me acompanharem e
incentivarem em todo o meu percurso.
Às minhas colegas de mestrado, principalmente Ana Catarina, Ana Filipa, Ana
Rita e Marisa pela amizade, pelas conversas, trocas de experiências e pelo carinho.
À minha orientadora Dra Joana Selada e à Dra Anabela Cunha por me terem
apoiado, motivado durante todo o estágio e na elaboração deste relatório e também da
monografia.
Aos professores de mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da
Universidade de Lisboa pelas aprendizagens que me proporcionaram.
Ao pessoal médico e técnico do Hospital de Cascais por me terem acolhido nesta
importante etapa da minha vida profissional. Quero agradecer, em especial, às pessoas
responsáveis pela Microbiologia (Patrícia, Andreia e Manuel), por me terem mostrado a
magia desta área, que, inicialmente, não me atraía, e que presentemente me desperta
bastante interesse.
Também aos responsáveis pela Bioquímica, presentes no Hospital e no
Laboratório, quero prestar o meu agradecimento, pela maneira como me inseriram no
quotidiano desta valência bastante automatizada.
Às pessoas responsáveis pelas valências de Hematologia e Imunologia mostro-
me extremamente grata pois, perante um imprevisto em relação ao meu tempo de estágio
(que foi encurtado), me apoiaram em tudo o que precisei.
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 4 Andreia Delgado Crisóstomo
Para finalizar, quero ainda demonstrar a minha gratidão para com as minhas
orientadoras, Dra Margarida Leão e Prof. Maria Manuela Catarino por me terem
auxiliado na pesquisa e na realização da monografia sobre Artrite Reumatóide.
A todos os anteriormente referidos, mais uma vez, os meus sinceros
agradecimentos.
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II Mestrado em Análises Clínicas
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ÍNDICE
i. Capa
ii. Agradecimentos
iii. Índice
iv. Índice de Figuras
v. Índice de Tabelas
Relatório de Estágio
1.1- Introdução 19
1.2- Pré-Analítica 21
1.2.1- Normas Gerais de Colheitas 21
1.2.2- Urina 22
1.2.2.1- Colheita do jacto médio - Mulher 22
1.2.2.2- Colheita do jacto médio – Homem 22
1.2.2.3- Punção de catéter urinário - Doente algaliado 22
1.2.2.4- Punção supra-púbica 23
1.2.2.5- Saco colector (utilizado na criança sem
controlo dos esfíncteres) 23
1.2.3- Fezes 23
1.2.3.1- Coprocultura/Exame Parasitológico 23
1.2.3.2- Pesquisa de Rotavírus 24
1.2.4- LCR 24
1.2.5-Hemoculturas 25
1.2.5.1- Volume de sangue 26
1.2.5.2- Número e Momento de execução das Hemoculturas 26
1.2.6- Amostras Respiratórias 27
1.2.6.1- Expectoração/Sec. Brônquicas 27
1.2.6.2- Expectoração induzida 27
1.2.6.3- Exsudado Faríngeo 27
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 6 Andreia Delgado Crisóstomo
1.2.6.4- Exsudado Nasal 28
1.2.6.5- Exsudado nasofaríngeo 28
1.2.7- Lesões (Exsudados) PROFUNDA(O)S 28
1.2.8 Lesões (Exsudados) SUPERFICIAIS 28
1.2.9- Catéter Intravascular 29
1.2.10- Exsudado uretral/vaginal 29
1.2.11- Rastreio de Streptococcus agalactiae (grupo B) na gravidez 30
1.2.12- Sangue Venoso 30
1.2.12.1- Possíveis erros associados 31
1.2.13- Normas Gerais de Transporte 31
1.2.14- Triagem 32
1.3- Bioquímica 33
1.3.1- ARKRAY® 33
1.3.2- DIMENSION® EXL 34
Teste de Absorvância 34
Glucose 34
Azoto Ureico 35
Creatinina 36
Colesterol 37
Triglicéridos 37
Colesterol ligado a HDL automático 38
Colesterol ligado a LDL automático 40
Fosfatase alcalina 42
Alanina aminotransferase 42
Aspartato aminotransferase 43
Lactato Desidrogenase 44
Lipase 45
Amilase 45
γ-Glutamil Transferase 46
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 7 Andreia Delgado Crisóstomo
Creatinina Quinase 46
Massa de Isoenzima Creatinina Quinase MB 47
Bilirrubina Directa 48
Bilirrubina Total 49
Albumina 49
Transferrina 50
Ferritina 51
Mioglobina 52
Intervalo Alargado de Proteína C Reactiva 53
Rastreio de Anfetaminas/Metanfetaminas 54
Rastreio de Benzodiazepinas 55
Rastreio de metabolito da Cocaína 57
Carbamazepina 58
Vancomicina 59
Troponina I Cardíaca 60
Proteína Total 61
Proteína urinária/do LCR 63
Ferro 63
Cálcio 64
Magnésio 65
Fósforo 65
N-Terminal Pro-Péptido Natriurético Cerebral 65
Acido Úrico 67
Na+ /K+/Cl- 67
1.3.3- Doseamento de Hemoglobinas A1c 72
1.3.4- Testes Serológicos 74
1.3.4.1- Clearview® IM 74
1.3.4.2- AVITEX® ROSE WAALER 76
1.3.4.3- AVITEX® SLE 77
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1.3.4.4- Brucelloslide-Test 77
1.3.4.5- IMMUTHREP® TPHA 79
1.3.4.6- MACRO-VUE RPR Card Test 80
1.4- Imunologia 82
1.4.1- CENTAUR® XP 82
1.4.1.1- Testes para a Função Adrenal 85
Cortisol 85
1.4.1.2- Testes para a Fertilização 86
Hormona Estimulante do Folículo 86
Hormona Luteinizante 87
Progesterona 89
Prolactina 90
Estradiol 91
1.4.1.3- Testes para Doenças Infecciosas 92
Antigénio de superfície da Hepatite B 92
Anticorpos totais do Antigénio de superfície
Hepatite B 94
Anticorpos totais do Antigénio central da Hepatite B 95
Antigénio e da Hepatite B 96
Anticorpo do Antigénio e da Hepatite B 96
Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1,
incuindo subtipo O e/ tipo 2 97
Anticorpo IgG para o vírus da Hepatite C 98
Anticorpo IgM para o vírus da Hepatite A 99
Rubéola IgG/M 100
Toxoplasma IgG/M 101
1.4.1.4- Testes para Marcadores Tumorais 102
CA 15-3 102
CA 19-9 103
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CA 125 II 103
Antigénio Carcino-Embrionário 104
1.4.1.5- Testes para a Função Tiróideia 105
Triiodotironina 105
Tiroxina 106
Hormona Estimulante da Tiróide 107
Triiodotironina Livre 108
Tiroxina Livre 109
Auto-Anticorpos contra a Peroxidase Tiroidiana 110
Auto-Anticorpos contra a Tiroglobulina 110
1.4.2- ImmunoCAP 250 114
dsDNA 114
MBG 115
Cardiolipina IgM/G 116
Β2-glicoproteína IgM/G 117
PR3 118
MPO 119
CCP 119
Gliadina IgG/A 120
Transaminase IgG/A 121
Specific IgE 122
1.5- Hematologia 125
1.5.1- Eritrograma 125
1.5.2- Leucograma 128
1.5.3- Contagem de reticulócitos 129
1.5.4- Velocidade de Segmentação 129
1.5.5- Esfregaço de sangue 130
1.5.6- Coagulação 131
1.5.6.1- Provas Laboratoriais da Hemostase Primária 133
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1.5.6.2- Provas Laboratoriais da Hemostase Secundária
e Terciária 134
1.5.7- Electroforese de Hemoglobinas e Proteínas 135
1.5.7.1- Electroforese de Hemoglobinas 135
1.5.7.2- Electroforese de Proteínas 138
1.5.8- Grupagem ABO / D 140
1.5.8.1. Prova Directa 140
1.5.8.2- Prova Reversa 142
1.5.9- Teste de Coombs 143
1.5.9.1- Teste de Coombs Directo 143
1.5.9.2- Teste de Coombs Indirecto 143
1.5.10- Pesquisa de D fraco 144
1.6- Microbiologia 146
1.6.1- Urina 146
1.6.1.1- Uroculturas 146
1.6.1.2- Pesquisa de Antigénios
(Streptococcus pneumoniae/Legionella) 148
1.6.2- Fezes 148
1.6.2.1- Coproculturas 149
1.6.2.1.1- Tipagem de Salmonella 149
1.6.2.2- Exame Parasitológico de Fezes 150
1.6.2.3- Pesquisa de Rotavírus 150
1.6.3- LCR 151
1.6.4-Hemoculturas 152
1.6.4.1- Hemoculturas Positivas 152
1.6.5- Secreções Brônquicas, Expectoração, Lavado Bronco-Alveolar 152
1.6.6- Líquidos Pleurais, Ascíticos, Auriculares, Pericárdicos 153
1.6.7- Exsudados Purulentos 154
1.6.8- Catéter Intravascular 154
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1.6.9- Exsudado Vaginal 154
1.6.10- Exsudados Vaginais/Anais
(Pesquisa de Streptococcus agalactiae). 155
1.6.11- Exsudado Faríngeo 157
1.6.12- Técnicas de apoio à identificação do microorganismo 157
1.6.12.1- Coloração de Gram 157
1.6.12.2- Coloração de Ziehl-Nelsen 158
1.6.12.3- Gram de colónias 158
1.6.12.4- Teste da Potassa 159
1.6.12.5- Teste de Oxidase 159
1.6.12.6- Teste da Catalase 159
1.6.12.7- Teste de Optoquina 160
1.6.12.8- Slidex® Strepto Plus 160
1.6.12.9- Slidex® STAPH PLUS 160
1.6.12.10- VITEK 2 161
1.6.13- Identificação de Microrganismos 162
1.6.13.1- Identificação de Cocos Gram Positivos 162
GÉNERO STAPHYLOCOCCUS 162
GÉNERO STREPTOCOCCUS e outros
COCOS GRAM POSITIVO e CATALASE
NEGATIVA 163
1.6.13.2- Identificação de Cocobacilos Gram Negativos 163
GÉNEROS NEISSERIA 163
GÉNERO HAEMOPHILUS 164
1.6.13.3- Identificação das Enterobacteriáceae 165
1.6.13.4- Bacilos Gram Negativo não fermentativos 166
GÉNERO PSEUDOMONAS 166
1.7- Controlo de Qualidade 167
1.7.1- Controlo Interno 167
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1.7.2- Controlo Externo 167
1.7.3- Cálculo e utilização dos valores estatísticos no
Controlo de Qualidade 168
1.8- Conclusão 171
Bibliografia 172
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Aparelho automático (ARKRAY®) para análise de
Urinas ocasionais e de 24 horas. 33
Figura 2- Aparelho automático (DIMENSION® EXL) para análise
de amostras de soro e urina. 34
Figura 3- Estrutura de uma lipoproteína plasmática. 39
Figura 4- Aparelho automático (Bio-Rad D-10™ Dual Program)
para amostras de sangue total humano. 72
Figura 5- Apresentação do resultado do teste Clearview® IM. 76
Figura 6- Aparelho automático (ADVIA CENTAUR® XP) para
análise de soros/plasma humanos. 82
Figura 7- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em
relação à concentração de amostra para uma reacção de sandwich. 83
Figura 8- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em relação à
concentração da amostra para uma reacção de competição, seja
ela de anticorpo marcado ou de antigénio marcado. 84
Figura 9- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em relação
à concentração de analito para uma reacção de captura de anticorpo. 85
Figura 10- Aparelho automático (ImmunoCAP 250) para estudo
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de parâmetros de autoimunidade e alergias em soros humanos. 114
Figura 11- Novo conceito de Coagulação. 132
Figura 12- Perfil Electroforético de Hemoglobinas para uma
amostra de sangue normal. 137
Figura 13- Perfil proteico para uma amostra de soro normal. 139
Figura 14- Kits para pesquisa de antigénio na urina
para Streptococcus pneumoniae/Legionella. 148
Figura 15- tubo A e tubo de filtração cónico (B), respectivamente. 150
Figura 16 – Microrganismos possíveis de serem encontrados nos
esfregaços com coloração de Gram. 156
Figura 17- Slidex® Strepto Plus. 160
Figura 18- Embalagem Slidex® STAPH PLUS. 161
Figura 19- Constituintes do aparelho (VITEK2) usado para
identificar e fazer o antibiograma quando necessário. 162
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1– Valores de Referência para cada parâmetro analisado
pelo aparelho automático (DIMENSION® EXL). 68
Tabela 2- Plano de Controlo Interno para os parâmetros abaixo indicados,
determinados pelo aparelho automático (DIMENSION® EXL). 72
Tabela 3- Grau de controle da glicose para valores relativos (%) de
hemoglobina A1c. 73
Tabela 4- Valores de Referência para Homens dos 13 aos 70 anos e
Mulheres menstruadas normalmente, grávidas ou em pós-menopausa. 87
Tabela 5- Valores de Referência para Homens dos 20 aos 70 anos e os maiores
de 70 anos, para Mulheres menstruadas normalmente, grávidas, em
pós-menopausa ou que usem métodos contraceptivos e ainda para Crianças. 89
Tabela 6- Valores de Referência para Homens e para Mulheres
menstruadas normalmente, em pós-menopausa ou gestantes. 90
Tabela 7- Valores de Referência para homens e para mulheres não grávidas,
grávidas ou em pós-menopausa. 91
Tabela 8- Valores de Referência para Homens e para Mulheres
menstruadas normalmente ou em pós-menopausa. 92
Tabela 9- Técnicas usadas, o plano de controlo interno e os valores de
referência para cada parâmetro determinado pelo aparelho automático
(CENTAUR® XP). 111
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Tabela 10- Plano de Controlo Interno para cada parâmetro determinado
pelo aparelho automático (ImmunoCAP 250). 123
Tabela 11- Valores de Referência de Hematócrito para Homens, Mulheres,
Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120). 125
Tabela 12- Valores de Referência de Concentração de Hemoglobina
para Homens, Mulheres, Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos
(ADVIA ® 120). 126
Tabela 13- Valores de Referência do Número de Eritrócitos Circulantes
para Homens, Mulheres, Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120). 127
Tabela 14- Índices eritrocitários com respectivas unidades, valores de
referência e classificação de eritrócitos (ADVIA® 120). 127
Tabela 15- Valores de Referência para contagem de Leucóctios em Adultos,
as Crianças (1 ano; 2-12 anos) e Recém-Nascidos (ADVIA ® 120). 128
Tabela 16- Valores de Referência para Contagem de Reticulócitos em Adultos,
Crianças de 1-12 anos, Crianças de 1 mês e Recém-Nascidos (ADVIA® 120). 129
Tabela 17- Valores de Referência para a Velocidade de Sedimentação em
Homens e Mulheres com idades até aos 50 anos e depois dos 50 anos
(VES-MATIC 30). 130
Tabela 18- Plano de controlo interno para o Hemograma e Plaquetas para
o contador automático (ADVIA® 120). 131
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Tabela 19- Valores de Referência para Contagem de Plaquetas em Adultos,
Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120). 133
Tabela 20- Valores de Referência para os parâmetros da Hemostase
Secundária e Terciária. 134
Tabela 21- Valores normais para as zonas electroforéticas de hemoglobina
individuais principais no caso do Adulto e do Recém-Nascido. 137
Tabela 22- Valores normais para as principais fracções individuais de
proteínas no soro. 139
Tabela 23- Reacções para os grupos sanguíneos ABO. 141
Tabela 24- Reacções para Rh D. 141
Tabela 25- Reacção com eritrócitos teste. 125
Tabela 26- Avaliação do número de colónias e respectivo valor em unidades
formadoras de colónias por mL. Sementeira com ansa de 1µL. 147
Tabela 27- Bactérias mais frequentes que se conseguem identificar neste
meio através da coloração/características das colónias assim como carta de
identificação e antibiograma (TSA) mais indicado para as mesmas. 147
Tabela 28- Condições de incubação e resultado esperado (coloração/características
das colónias) para os meios HEKT, MCK, YER, CAMP e Selenito. 149
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 18 Andreia Delgado Crisóstomo
Tabela 29- Meios usados para amostras de LCR e condições de incubação
dos mesmos. 151
Tabela 30- Meios usados para amostras respiratórias
(Secreções Brônquicas, Expectoração e Lavado Bronco-Alveolar) e
condições de incubação dos mesmos. 152
Tabela 31- Meios usados para amostras de Líquidos Pleurais, Ascíticos,
Auriculares e Pericárdicos e condições de incubação dos mesmos. 153
Tabela 32- Meios usados para amostras de Exsudados Purulentos e
condições de incubação dos mesmos. 154
Tabela 33- Meios usados para amostras de Exsudados Exsudados Vaginais e
condições de incubação dos mesmos. 156
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1.1- Introdução
Durante o meu estágio tive a possibilidade de contactar com dois contextos
distintos – o Hospital de Cascais e o Laboratório Soprelab (Laboratório Central da
General Lab). Na primeira instituição contactei com as valências de Microbiologia,
Bioquímica e Hematologia, ao longo de três meses e meio. Já na segunda, decorreram
apenas dois meses (facto que veio a ser influenciado pelo encurtamento determinado por
um despacho do Reitor da Faculdade de Farmácia e que era, previamente, de 1080 horas).
Ainda assim, tive a possibilidade de terminar a valência de Hematologia e contactar com
a de Imunologia.
O espaço físico do Hospital de Cascais caracterizava-se por estar dividido por
diversas secções: (1) na primeira, procedia-se à recepção de produtos e à sua triagem
para, posteriormente, serem entregues às valências respectivas para que se pudesse dar
início à análise; (2) seguidamente, surgia a zona de trabalho das análises às urinas de 24h
e urinas ocasionais, que eram introduzidas num aparelho específico para esta função – o
ARKRAY; nesta zona existiam ainda duas centrífugas, dois aparelhos de Bioquímica –
DIMENSION’s da Siemens – um destinado às urgências e outro às de rotina, um
aparelho de Imunologia – o CENTAUR – dois aparelhos de Hematologia – o ADVIA –
um também destinado às urgências e outro às de rotina; um aparelho medidor de
Velocidade de Sedimentação – VS - VES-MATIC30 – e, por fim, um corador de lâminas
– HEMA-TEK 2000; (3) numa terceira zona surgiam os microscópios destinados à
visualização de lâminas coradas pelo aparelho descrito anteriormente; (4) e, numa zona
isolada, caracterizada por uma pressão mais baixa, encontrava-se a zona da
Microbiologia que também se sub-dividia por: a) zona de trabalho; b) zona de bancada.
Na primeira – zona de trabalho – encontrava-se uma área de entrada onde eram recebidas
as amostras triadas e se retiravam as respectivas folhas de trabalho. Nela ainda se podia
encontrar uma centrífuga, uma câmara de fluxo laminar, um aparelho para hemoculturas
(BacT ALERT’3D), uma zona esterilizada pelo bico de Busen e, por fim, um corador de
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 20 Andreia Delgado Crisóstomo
lâminas (Mirastainer II). Já na segunda, na zona de trabalho, encontravam-se as placas
semeadas do dia anterior disponíveis para serem avaliadas e dar seguimento ao trabalho,
passando para o VITEK2 – aparelho que faz a identificação do microrganismo patológico
presente na amostra e possível TSA.
Em relação ao armazém e à arca friogorífica, todos os controlos, reagentes, e
suportes para o bom funcionamento do laboratório estão bem organizados por valências
de modo a facilitar a sua utilização.
A última parte do meu estágio decorreu no Laboratório Central, local para onde
eram enviadas as amostras a fim de concluir todo um role de análises que os hospitais não
realizam.
Também aqui se começa pela zona de recepção de amostras, onde são triadas e
são dirigidas para as valências correspondentes. Inicia-se a análise dos parâmetros na
Bioquímica, onde estão à disposição dois aparelhos (DIMENSION), e depois a
Imunologia (CENTAUR, ImunoCAP 250, MAGO PLUS e IMMULITE 2000). As
amostras que por seu lado vão para a Hematologia são encaminhadas para o aparelho de
hemogramas (ADVIA), passando posteriomente para o aparelho de electroforese para a
Hemoglobina A1c e por fim para o CAPILLARYS (electroforese de Hemoglobinas e de
Proteínas). Os tubos de coagulação são encaminhados por seu lado para o aparelho da
Coagulação (ACL ELITE PRO).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 21 Andreia Delgado Crisóstomo
1.2- Pré-Analítica
É uma fase extremamente importante num laboratório de Análises Clínicas. É
uma área que por si só apresenta maiores erros necessitando dum maior controlo. Trata-se
da fase inicial do trabalho e como tal deve ser feito com muita atenção podem ocorrer
certas irregularidades dificeis de detectar posteriormente.
Esta é constituída pela colheita do material biológico, do seu transporte até ao
laboratório e por fim a triagem.
1.2.1- Normas Gerais de Colheitas
• Se possível, efectuar as colheitas, antes de iniciar a terapêutica antibiótica.
• Evitar a contaminação da amostra com a flora saprófita do doente e/ou
bactérias do ambiente, de modo a que a amostra seja representativa do local da
infecção.
• Utilizar material de colheita e de transporte apropriados e esterilizados.
• Identificar claramente os recipientes e não o invólucro de papel ou plástico com o
nome do doente, serviço, n.º de processo, data e hora da colheita e origem do
produto biológico.
• Colher o produto em quantidade suficiente para o(s) exame(s) requisitado(s).
Quantidade insuficiente pode originar resultados falsamente negativos. Os
recipientes para a recolha de produtos líquidos não devem encher-se para além
dos seus 2/3 de capacidade. Utilizar recipientes inquebráveis, esterilizados e de
encerramento hermético e que não permitam ao abrir a formação de aerossóis.
• Se o produto for colhido através da pele intacta, desinfectar a pele
primeiro, de acordo com a política de anti-sépticos do hospital. Prevenir a
queimadura pela tintura de iodo removendo o excesso após a colheita.
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1.2.2- Urina
• Métodos de colheita:
- Jacto médio
- Punção de catéter urinário
- Punção supra-púbica
- Saco colector em crianças
1.2.2.1- Colheita do jacto médio - Mulher
• Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos.
• Com compressas embebidas em água e sabão (não utilizar anti-sépticos,
pois podem inibir o crescimento dos microrganismos), proceder à lavagem
dos órgãos genitais da frente para trás, com uma compressa de cada vez, repetir a
operação três vezes.
• Usando o mesmo processo, lavar só com água esterilizada e secar.
• Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm3
• para recipiente esterilizado de boca larga.
1.2.2.2- Colheita do jacto médio – Homem
• Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos.
• Afastar o prepúcio e manter essa posição durante toda a colheita.
• Limpar a glande com compressas embebidas em água e sabão.
• Usando o mesmo processo, lavar agora só com água esterilizada e secar.
• Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm3
• para recipiente esterilizado de boca larga.
1.2.2.3- Punção de catéter urinário - Doente algaliado
• Clampar a algália durante 10-15 minutos, acima da derivação, na zona de
borracha.
• Desinfectar com álcool a 70º o local a puncionar.
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• Com agulha e seringa esterilizada aspirar a urina (5 a 20 mL).
• Transferir a urina para recipiente esterilizado, ou usar seringa própria para
transporte de urina.
1.2.2.4- Punção supra-púbica
• O doente deve ter a bexiga cheia.
• Desinfectar a pele da região supra-púbica com a solução anti-séptica
segundo a política de anti-sépticos do hospital.
• Com agulha e seringa esterilizada, puncionar a pele e bexiga ao nível do 1/3
inferior da linha que une o umbigo à sínfise púbica.
• Aspirar a urina e colocá-la em recipiente esterilizado ou enviar na própria seringa
após remoção da agulha.
1.2.2.5- Saco colector (utilizado na criança sem controlo dos esfíncteres)
• Lavar com água e sabão a área genital, limpar com água esterilizada e
secar com compressa esterilizada.
• Aplicar um saco autocolante estéril.
• Se, ao fim de 30 minutos não tiver urinado, retirar o saco e repetir todo o
procedimento anterior;
• Transferir a urina para recipiente esterilizado
1.2.3- Fezes
1.2.3.1- Coprocultura/Exame Parasitológico
• Utilizar tubos de recolha de fezes (de preferência com uma pequena colher de
plástico acoplada à tampa), que poderão ser solicitados no laboratório ou obtidos
na farmácia
• Recolher uma porção (tamanho aproximado de uma avelã) para o recipiente. Não
exceder os 2/3 da capacidade do recipiente.
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• Deverá fazer a recolha da porção com muco, pús ou sangue, caso exista.
• Vedar correctamente o recipiente e evitar que o produto fique em contacto com a
tampa.
• Entregar no laboratório no próprio dia
• Se for solicitado pelo médico assistente 3 amostras, estas deverão ser colhidas em
dias alternados (p.e. 2ª, 4ª e 6ª).
1.2.3.2- Pesquisa de Rotavírus
• Utilizar tubos de recolha de fezes (de preferência com uma pequena colher de
plástico acoplada à tampa), que poderão ser solicitados no laboratório ou obtidos
na farmácia
• Recolher uma porção (tamanho aproximado de uma avelã) para o recipiente. Não
exceder os 2/3 da capacidade do recipiente.
• Deverá fazer a recolha da porção com muco, pús ou sangue, caso exista.
• Vedar correctamente o recipiente e evitar que o produto fique em contacto com a
tampa.
• Entregar no laboratório no próprio dia
1.2.4- LCR
O diagnóstico laboratorial é uma urgência e geralmente são as bactérias aeróbias que
causam esta infecção, mas na presença de abcesso cerebral o agente etiológico pode
ser uma bactéria anaeróbia.
Os Agentes etiológicos das meningites agudas são os seguintes:
• Recém-nascido - E.coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes,
Herpes Simples Virus 2;
• <2meses - Strep. agalactiae, L. monocytogenes, E.coli;
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• <10meses - Virus, Haemophilus influenza, Strep. pneumoniae, Neisseria
meningitidis;
• Adulto jovem - Vírus, N. meningitides;
• Adulto - Strep. pneumoniae, N. meningitidis;
• Idosos - Strep. pneumoniae, Bacilos Gram negativos, L. monocytogenes;
• Doentes imunodeprimidos - Crytococcus neoforman.s
Colheita
• Colheita deve ser feita antes do início da terapêutica antimicrobiana
• Colheita é realizada por acto médico onde é feita uma punção lombar e o LCR
deve ser colhido em tubos inquebráveis, transparentes, com tampa de rosca e
fundo cónico para a concentração de produto, uma vez que pode conter muito
poucas bactérias
• São necessários 3 tubos: 2 para exame citológico e bioquímico e outro para exame
microbiológico
1.2.5- Hemoculturas
• O sangue deve ser colhido por punção duma veia periférica. É incorrecta a
colheita através de catéter I.V.
• Desinfectar o local da punção com álcool a 70% de modo circular e do interior
para a periferia.
• Repetir a operação com solução alcoólica iodada a 1%, ou seguir a política de
anti-sépticos do hospital.
• Deixar o anti-séptico secar.
IMPORTANTE - Não palpar a veia após a desinfecção da pele e antes de inserir a
agulha. Se isto acontecer repetir todo o processo de desinfecção.
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• Desinfectar a rolha de borracha do frasco com álcool. Aspirar o sangue e inocular
o(s) frasco(s), sem mudar de agulha, não ultrapassando a proporção
recomendada pelo fabricante.
• Após a colheita, limpar a pele com álcool, para prevenir reacções adversas ao
iodo.
1.2.5.1- Volume de sangue
• O volume de sangue é crítico, porque a concentração de microrganismos na
maioria das bacteriémias é baixa, especialmente se o doente já está com
antibioticoterapia. Nas crianças a concentração de microrganismos durante
as bacteriémias é maior que nos adultos pelo que é necessário menos sangue. O
volume de sangue recomendado é, em geral:
Crianças – 1 a 5 mL por punção venosa
Adultos – 10 a 30 mL por punção venosa
O volume de sangue colhido deverá ser repartido pelo n.º de frascos necessários de modo
a que a diluição final seja de 1: 5 a 1:10, respeitando as indicações do fabricante.
1.2.5.2- Número e Momento de execução das Hemoculturas
• Habitualmente são suficientes 3 hemoculturas em 24 horas, colhidas
separadamente, sendo o intervalo entre as colheitas variável conforme a situação
do doente ou a urgência do início de administração de antibióticos.
• Uma só hemocultura pode levar a que uma bacteriémia intermitente não seja
diagnosticada assim como pode dificultar a interpretação do significado clínico
do isolamento de certos microrganismos.
• Geralmente a informação adicional obtida com mais de 3 hemoculturas é mínima.
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1.2.6- Amostras Respiratórias
1.2.6.1- Expectoração/Sec. Brônquicas
• Preferir a 1ª amostra da manhã em jejum. Lavar a boca e gargarejar só com água
antes de iniciar a colheita.
• Instruir o doente para colher expectoração por tosse profunda.
• Colher o produto em recipiente esterilizado, de boca larga de encerramento
hermético.
1.2.6.2- Expectoração induzida
Se o doente não conseguir expectorar esta pode ser induzida por:
• Cinesioterapia respiratória.
• Nebulização efectuada apenas com NaCl 0,85% (inalar 20 a 30 mL de uma
solução de 3 a 10% de NaCl 0,85% em H2O).
• Restantes procedimentos iguais aos da expectoração
• Procedimento não recomendado em caso de suspeita de tuberculose
1.2.6.3- Exsudado Faríngeo
• Usado para a detecção de Streptococcus β-hemolítico do grupo A. Se
solicitado, poderá ser efectuado para pesquisa de N. gonorrhoeae, N. meningitidis
(despiste de portadores).
• Não obter amostra se existir inflamação da epiglote, pois pode causar
espasmos com consequente obstrução respiratória.
• Baixar a língua com espátula.
• Colher com zaragatoa entre os pilares e por detrás da úvula – faringe posterior,
amígdalas e qualquer área inflamada ou ulcerada evitando tocar na mucosa bucal
e língua.
• Enviar no meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.
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1.2.6.4- Exsudado Nasal
• Usado essencialmente para fins epidemiológicos, na detecção de portadores
de Staphylococcus aureus meticilina resistente.
• Inserir uma zaragatoa estéril em cada narina até encontrar resistência (mais ou
menos a nível dos cornetos).
• Rodar a zaragatoa contra a mucosa nasal.
• Colocar, eventualmente em meio de transporte, e enviar rapidamente ao
laboratório.
1.2.6.5- Exsudado nasofaríngeo
• Para detecção de portadores de Streptococcus β-hemolítico do grupo A, e N.
meningitidis.
• Cuidadosamente introduzir uma zaragatoa flexível de alginato de cálcio através
do nariz e colocá-la em recipiente esterilizado com o meio de transporte
adequado.
1.2.7- Lesões (Exsudados) PROFUNDA(O)S
• Descontaminar a pele com solução anti-séptica de acordo com a política de anti-
sépticos do hospital.
• Puncionar e aspirar directamente com seringa.
• Colocar a amostra no recipiente esterilizado ou enviar a própria seringa sem
agulha, mas devidamente fechada.
1.2.8- Lesões (Exsudados) SUPERFICIAIS
• Limpar a superfície da lesão com água destilada ou soro fisiológico esterilizado e
realizar o desbridamento dos tecidos necrosados.
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• Biopsar a base e bordo da lesão e colocar em recipiente esterilizado, de
preferência com pérolas de vidro.
• ou Introduzir uma agulha fina por baixo da camada superficial da lesão e
aspirar com a seringa e colocando a amostra no recipiente esterilizado ou enviar
a própria seringa sem agulha, mas devidamente fechada.
• ou Com uma zaragatoa esterilizada esfregar toda a base da lesão e colocá-
la no meio de transporte adequado
1.2.9- Catéter Intravascular
• O envio de catéter para exame bacteriológico só é aconselhado se existirem
sinais de infecção relacionadas com o catéter.
• Antes de retirar o catéter, colher sangue para hemocultura de uma veia periférica,
pois só assim será possível valorizar o exame cultural do catéter.
• Desinfectar a pele em redor do catéter, utilizando um anti-séptico de acordo com a
política de anti-sépticos do hospital.
• Retirar o catéter; e cortar assépticamente cerca de 3 a 5 cm da porção terminal e
colocá-lo em recipiente esterilizado.
• Nunca enviar pontas de catéter em meio líquido ou de transporte.
1.2.10- Exsudado uretral/vaginal
Colher 3 zaragatoas (finas):
• Colheita com uma 1ª zaragatoa que é introduzida em meio de transporte com
carvão.
• Efectuar em seguida colheita com uma zaragatoa seca, que é utilizada para a
realização de esfregaço(s).
• Zaragatoa seca que é colocada em meio de Diamond (meio de cultura para
Trichomonas).
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1.2.11- Rastreio de Streptococcus agalactiae (grupo B) na gravidez
• Zaragatoa vaginal (sem meio de transporte) colhida no intróito vaginal
• Zaragatoa rectal (sem meio de transporte)
• Colocar as duas zaragatoas em meio de Todd com antibióticos
• Colocar na estufa com brevidade
1.2.12- Sangue Venoso
• Confirmar sempre a identidade do paciente
• Aplicar o garrote, acima da zona de punção
• Pedir ao paciente para fechar e abrir a mão algumas vezes
• Palpar a zona de punção, na procura da veia adequada
• Desinfectar o local onde se vai fazer a punção (álcool etílico a 70%)
• Colocar luvas
• Inserir a agulha, fazendo um ângulo de 15º com a pele
• Poceder à extracção do sangue, puxando suavemente o êmbolo do tubo (primeiro
o tubo de soro, depois o citrato, seguido do hemograma e por último a VS)
• Soltar o garrote (não deve permanecer mais de 2 minutos)
• Retirar o tubo e depois a agulha, fazendo pressão no local com uma compressa de
gaze
• Pedir ao doente para abrir a mão e continuar a pressionar o local até estrancar a
hemorragia
• Colocar um penso.
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1.2.12.1- Possíveis erros associados:
• Hemoconcentração: Devida à aplicação prolongada do garrote (mais de 2
min).
Como evitar? Remover o garrote quando se ultrapassam 2 min;
Se garrote permaneçer mais do que 2 min para localização
da veia, remover durante 2–3min, antes de o recolocar para
proceder à venipunctura;
• Hemólise: Devida à ruptura da membrana dos glóbulos vermelhos ou
hemácias
Como evitar? Usar material absolutamente seco (seringas e agulhas);
Não despejar o sangue através da agulha;
Deitar o sangue para os tubos através das paredes;
Homogeneizar a mistura sangue-anticoagulante com
movimentos de inversão suaves;
Assegurar a isotonicidade das soluções usadas;
Evitar deixar o sangue a temperatura ambiente elevada
1.2.13- Normas Gerais de Transporte
• Transportar rapidamente todos os produtos para o laboratório.
• Alternativas ao transporte rápido:
LCR – enviado à temperatura ambiente (ou na estufa a 37ºC) e NUNCA
REFRIGERADO; Apenas o LCR para estudos virais deve ser refrigerado
ou congelado.
Hemocultura – Nunca refrigerar as hemoculturas após a colheita. Conservar o
frasco em estufa a 37ºC até ser enviada ao laboratório (ou à
temperatura ambiente nos métodos automáticos se assim fôr
recomendado pelo fabricante).
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Restantes produtos – refrigerar a 2-8º C
Utilização de Meios de transporte:
1. Para pesquisa de microrganismos muito sensíveis, tais como a
Neisseria spp,
devem ser colhidos para meio de transporte apropriado (com carvão
para pesquisa
de N. gonorrhoae) e mantidos à temperatura ambiente.
2. Em todos os produtos sempre que o processamento
laboratorial não possa ser efectuado dentro do período de tempo
adequado para cada produto.
1.2.14- Triagem
A triagem serve para controlar que amostras entram e quando entram no
laboratório e ainda para aceder à ficha do doente, de modo a confirmar que a amostra em
questão é realmente a que foi pedida pelo médico e para saber qual ou quais os testes a
realizar. Seguidamente, é necessário imprimir folhas de trabalho e etiquetas para passar
ao processamento da am ocorrer sem problemas ou precalços.
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1.3- Bioquímica
A bioquímica é uma valência obrigatória em qualquer laboratório de análises
clínicas. Engloba todo o tipo de parâmetros essenciais que complementam qualquer
boletim de análises. Nesta valência foram usados 2 aparelhos, um para urianálise
(ARKRAY®) e outro para doseamentos de parâmetros bioquímicos, em amostras de soro
e urina (DIMENSION® EXL).
1.3.1 – ARKRAY®
Este aparelho automático (Figura 1) tem como função a análise das urinas – Urina
tipo II. Esta análise envolve 3 princípios básicos: avaliação visual da cor, aspecto da
amostra (límpida, ligeiramente turva, turva, hemática) e a detecção de determinadas
substâncias através do uso de tiras teste.
O aparelho é capaz de determinar as características gerais da amostra, como a cor,
densidade e pH, e ainda elementos anormais, tais como proteínas, glucose, nitritos,
corpos cetónicos, urobilinogénio, bilirrubina, hemoglobina e leucócitos.
O aparelho automático identifica a amostra num primeiro passo, posteriormente
distribui automaticamente as tiras testes, seguindo-se a pipetagem das amostras e por fim
faz a leitura fotométrica. O controlo é feito uma vez por dia com um controlo patológico
e um normal.
Figura 1- Aparelho automático (ARKRAY®) para análise
de Urinas ocasionais e de 24 horas.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 34 Andreia Delgado Crisóstomo
1.3.2 – DIMENSION® EXL
O aparelho automático (Figura 2) usado para a determinação de parâmetros
bioquímicos foi o DIMENSION® EXL. Este aparelho é usado para o diagnostico de
doenças hepáticas, renais, metabólicas, pancreáticas, coronárias assim como fazer
rastreios de substâncias de abuso como anfetaminas e cocaína por exemplo.
Todos os parâmetros e respectivas técnicas estão indicados abaixo.
Figura 2- Aparelho automático
(DIMENSION® EXL) para análise de
amostras de soro e urina.
Teste de Absorvância (ABS) – Procedimento a efectuar para verificar o bom
funcionamento do equipamento.
• Utiliza uma solução estável certificada de sulfato de cobalto II como amostra e
reagente para verificar o funcionamento correcto dos sistemas de medição das
quantidades de fluído da amostra e do reagente, assim como do sistema de
medição fotométrico no sistema de química clínica do aparelho.
• A diferença na absorvância a 2 comprimentos de onda do sulfato de cobalto II
diluído como uma amostra e como um reagente é medida mediante uma técnica
de ponto final de 2 filtros (510, 405nm).
Glucose (GLUC)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de glucose
em soro, plasma (com EDTA ou heparinizado), urina e LCR humanos.
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• O método da hexoquinase é o método de referência geralmente aceite para a
medição de glicose.
• As medições de glucose são utilizadas no diagnóstico e tratamento de
distúrbios do metabolismo dos hidratos de carbono, tais como a diabetes
mellitus, a hipoglicémia neonatal e o insulinoma.
• A técnica consiste na hexoquinase (HK) que vai catalizar a fosforilação da
glucose na presença de adenosina-5’-trifosfato (ATP) e magnésio, formando
glucose-6-fosfato (G-6-P) e adenosinadifosfato (ADP). A G-6-P é entao
oxidada pela glucose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH) na presença de
NAD para produzir 6-fosfogliconato e NADH. Uma mole de NAD é reduzida
a uma mole de NADH (e, deste modo, a concentração de glucose) é
determinada utilizando uma técnica bicromática de ponto final (340 e 383
nm).
++ ++− →+
+→+
HNADHgliconatoPNADPG
ADPPGATPeglu
PDHG
HK
66
6cos
6
• Condições especiais: a glicólise diminui os níveis séricos de glucose em
aproximadamente 5-7% por hora em sangue normal coagulado não centrifugado,
à temperatura ambiente. Em soro esterilizado não hemolisado e separado, a
concentração de glucose geralmente, mantém-se estável durante períodos de até 8
horas a 25ºC e até 72 horas a 4ºC; observa-se uma estabilidade variável com
condições de conservação, por períodos mais prolongados. A glicólise pode ser
inibida e a glucose pode ser estabilizada por períodos de 3 dias, à temperatura
ambiente, através da adição de iodoacetato de sódio ou fluoreto de sódio (NaF) à
amostra.
Azoto Ureico (BUN)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de azoto
ureico em soro, plasma (com EDTA ou heparinizado) e urina humanos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 36 Andreia Delgado Crisóstomo
• A ureia constitui um produto metabólico com azoto resultante do catabolismo das
proteínas nos humanos.
• A utilidade principal da determinação do azoto ureico reside, em conjunto com a
determinação de creatinina em soro ou plasma, na discriminação entre a azotémia
pré-natal e pós-natal.
• As medições obtidas por este dispositivo são utilizadas no diagnóstico e
tratamento de certas doenças renais e metabólicas.
• O aumento do azoto ureico sérico pode dever-se a causas pré-renais, renais ou
pós-renais.
• O método do azoto ureico emprega uma ténica enzimática acoplada de
urease/glutamato em que a urease hidrolisa especificamente a ureia para formar
amónia e dióxido de carbono. A amónia é utilizada pela enzima glutamato
desidrogenase (GLDH) para aminar por redução o α-cetoglutarato (α-KG), com
oxidação simultânea da forma reduzida de NADH. A alteração na absorvância a
340nm devida ao desaparecimento de NADH é directamente proporcional à
concentração de BUN na amostra e é medida utilizando uma técnica cinética
bicromática (340 e 383nm).
++− →+−+
+ →+
NADglutamatoLNADHKGNH
CONHOHureia
GLDH
urease
α3
232 2
CREA (creatinina)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de creatinina
no soro, plasma (heparina de lítio) e urina humanos.
• A creatinina é considerada como sendo a substância endógena cuja medição é
mais útil para a avaliação da função renal.
• O método ocorre na presença de uma base forte como o NaOH, onde o picrato
reage com a creatinina para formar um cromóforo vermelho. A velocidade do
aumento de absorvância a 510 nm causada pela formação deste cromóforo é
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 37 Andreia Delgado Crisóstomo
directamente porporcional à concentração de creatinina na amostra e é medida
utilizando uma técnica cinética bicromática (510, 600 nm). A bilirrubina é
oxidada pelo ferricianeto de potássio para evitar interferências.
Colesterol (CHOL)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de colesterol
total em soro e plasma humanos.
• Os lípidos e as lipoproteínas em circulação têm sido fortemente associadas com a
doença coronária, distúrbios associados do metabolismo lipídico e aterosclerose,
uma causa de doença coronária.
• Este método usa a esterase do colesterol (CE) para catalizar a hidrólise dos ésteres
de colesterol para produzir colesterollivre que, juntamente com o colesterol livre
pré-existente, é oxidado numa reacção catalisada pela colesterol oxidase (CO)
para formar colest-4-eno-3-ona e peróxido de hidrogénio. Na presença de
peroxidase de rábano silvestre (HPO), o peróxido de hidrogénio formado desta
forma é utilizado para oxidar a N,N-dietilanilina-HCl/4-aminoantipirina (DEA-
HCl/AAP), produzindo um cromóforo que absorve a 540 nm. A absorvância
devida à DEA-HCl/AAP oxidada é directamente proporcional à concentração de
colesterol total e é medida utilizando uma técnica policromática de ponto final
(452, 540, 700 nm).
Triglicéridos (TGL)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de triglicéridos
em soro e plasma humanos.
• As medições são utilizadas no diagnóstico e tratamento de doentes com Diabetes
mellitus, nefrose, obstrução hepática, outras doenças envolvendo o metabolismo
dos lípidos ou vários distúrbios endócrinos.
• Os TGL são lípidos insolúveis em àgua, compostos por 3 ácidos gordos ligados a
uma molécula de glicerol; são transportados no sangue como componentes
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 38 Andreia Delgado Crisóstomo
nucleares de todas as lipoproteínas, mas a concentração mais elevada destas
moléculas ocorre nos quilomicra ricos em TGL e nas VLDL; através da acção das
lipases e ácidos biliares, eles são hidrolisados em glicerol e ácidos gordos que são
absorvidos pelo tecido adiposo para armazenamento ou poroutros tecidos que
necessitem de uma fonte de energia.
• A concentração máxima de TGL associados a quilomicra ocorre 3-6 horas após a
ingestão de um refeição rica em gorduras, no entanto, a taxa de absorção das
gorduras é alatamente variável, dependendo do indivíduo e da composição
dietética da gordura. Após a absorção, os TGL voltam a ser sintetizados nas
células epiteliais e combinados com colesterol e várias apolipoproteínas,
formando quilomicra.
• O método dos TGL baseia-se num procedimento enzimático no qual é empregue
uma combinação de enzimas para a medição dos TGL séricos ou plasmáticos. A
amostra é incubada com o reagente enzimático de lipoproteína lipase que converte
os TGL em glicerol livre e ácidos gordos. A glicerol quinase catalisa a
fosforilação do glicerol pelo ATP para glicerol-3-fosfato. A glicerol-3-fosfato-
oxidase oxida o glicerol-3-fosfato para fosfato de di-hidroxiactenoa e peróxido de
hidrogénio. A acção catalítica da peroxidase forma quinoneimina a partir de
peróxido de hidrogénio, aminoantipirina e 4-clorofenol. A variação na
absorvância devida à formação de quinoneimina é directamente proporcional à
quantidade total de glicerol e dos seus percursores e é medida utilizando uma
técnica bicromática de ponto final (510, 700 nm).
Colesterol ligado a HDL automático (AHDL)
• É um teste de diagnóstico in vitro destinado à medição quantitativa de colesterol
ligado a lipoproteínas de alta densidade (HDL-C) em soro e plasma(com EDTA
ou heparinizado) humanos.
• As medições de AHDL são utilizadas como um auxiliar no diagnóstico de
distúrbios lipídicos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 39 Andreia Delgado Crisóstomo
• As lipoproteínas plasmáticas (Figura 3) são partículas esféricas contendo
quantidades vasriáveis de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos e proteínas. Estas
partículas servem para solubilizar e transportar o colesterol e os triglicéridos na
corrente sanguínea. As proporções relativas de proteínas e lípidos determinam a
densidade das mesmas e proporcionam uma base para efectuar a respectiva
classificação. Estas classes são: quilomicron, lipoproteína de muito baixa
densidade (VLDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de
densidade intermédia (IDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína a
(Lp(a)).
Figura 3- Estrutura de uma lipoproteína plasmática.
• O principal papel das HDL no metabolismo dos lípidos é a captação e o transporte
do colesterol dos tecidos periféricos para o fígado, através de um processo
conhecido como transporte invertido de colesterol (proposto como mecanismo de
protecção cardíaca). Os níveis baixos de HDL-C estão associados a um rísco
aumentado de doença cardíaca e de doença coronária. Assim, a determinação do
nível sérico de HDL-C constitui uma ferramenta útil na identificação de doentes
de alto risco.
• O ensaio AHDL é um método homogéneo para a medição directa dos níveis de
HDL-C sem a necessidade de quaisquer passos de pré-tratamento exterior ou de
centrifugação. Este método baseia-se na aceleração da reacção da colestrol
oxidase (CO) com colesterol não esterificado não HDL e na dissolição selectiva
das HDL utilizando um detergente específico. No primeiro reagente, o colesterol
Fosfolípidos + colesterol + proteína
Esters de colesterol + triglicéridos
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 40 Andreia Delgado Crisóstomo
não HDL não esterificado é sujeito a uma reacção enzimática e o peróxido gerado
é consumido por uma reacção de peroxidase com DSBmT, originando um produto
incolor. O segundo reagente é composto por um detergente capaz de solubilizar as
HDL de forma específica. A reacção entre a colesterol esterase (CE) e um
acoplador cromogénico vai fazer com que haja o desenvolvimento de cor para a
determinação quantitativa de HDL-C. Esta pode ser referida como a metodologia
de Detergente Selectivo Acelerador
• Condições especiais: os resultados obtidos em plasma com EDTA devem ser
multiplicados por 1,03 para obter os resultados séricos equivalentes.
Colesterol ligado a LDL automático (ALDL)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de colesterol
ligado a lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C) em soro e plasma (com EDTA
ou heparinizado) humanos.
• As medições de LDL-C são utilizadas no diagnóstico e tratamento de distúrbios
lipídicos, tais como a Diabetes Mellitus, Aterosclerose e várias doenças hepáticas
e renais.
• As lipoproteínas plasmáticas são partículas esféricas contendo quantidades
vasriáveis de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos e proteínas. Estas partículas
servem para solubilizar e transportar o colesterol e os triglicéridos na corrente
sanguínea. As proporções relativas de proteínas e lípidos determinam a densidade
das mesmas e proporcionam uma base para efectuar a respectiva classificação.
Estas classes são: quilomicron, lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL),
lipoproteína de baixa densidade (LDL), lipoproteína de densidade intermédia
(IDL), lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína a (Lp(a)).
• A LDL é a partícula que contém maior quantidade de colesterol no plasma;
quando em quantidades excessivas, pode depositar-se na parede arterial
resultando em aterosclerose; quando elevado é o principal alvo da terapêtutica
para a diminuição do colesterol.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 41 Andreia Delgado Crisóstomo
• Os métodos para a medição de LDL-C assumem que o colesterol total é
constituído principalmente pelo colesterol nas VLDL, IDL, LDL, HDL e Lp. A
concentração de LDL-C é calculada através da equação de Friedewald (Equação
1), que se apresenta de seguida:
[ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] LpaHDLLDLIDLVLDLTOTAL
HDLTOTAL
CCCCCC
TGCCLDL
++++=
−−=5
Onde: [LDL] = concentrção de LDL
[CTOTAL] = Concentração de colesterol total (soma de todas as classes de
lipoproteínas - [CVLDL ], [CIDL], [CLDL] [CHDL] e [CLpa]
[TG] = Concentração de triglicéridos
Equação 1- Equação de Friedewald para o cálculo da concentração de LDL.
• O teste ALDL é um ensaio directo não dependente da fórmula e que é
referenciado para a determinação da [LDL] por β-quantificação.
• O ensaio AHDL é um método homogéneo para a medição directa dos níveis de
HDL-C sem a necessidade de quaisquer passos de pré-tratamento exterior ou de
centrifugação. O método encontra-se num formato de dois reagentes e depende
das propriedades do detergente 1 que solubiliza apenas as partículas que não
contêm LDL. O colesterol libertado é consumido pela colesterol esterase e pela
colesterol oxidase numa reacção que não produz cor. O detergente 2 solubiliza as
partículas de LDL restantes. O LDL-C solúvel é então oxidado pela acção da
Esta fórmula não deve ser usada:
• em amostras que possuam [TG]>400mg/dL;
• sempre que estejam presentes quilomicra (ou seja, amostras
colhidas fora do periodo de jejum);
• em doentes com hiperlipoproteinémia III
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 42 Andreia Delgado Crisóstomo
colesterol esterase e da colesterol oxidase, produzindo colestenona e peróxido de
hidrogénio. A acção enzimática da peroxidase sobre o peróxido de hidrogénio
produz cor na presença de N,N-bis (4-sulfobutil)-m-toluidina, sal dissódico
(DSBmT e 4-aminoantipirina (4-AA), que é medida utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (540, 700 nm). A cor produzida é directamente
proporcional À quantidade de LDL-C presente na amostra.
• Condições especiais: os resultados obtidos em plasma com EDTA devem ser
multiplicados por 1,03 para obter os resultados séricos equivalentes.
Fosfatase Alcalina (ALP)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
da fosfatase alcalina em soro e plasma (em heparina de lítio) humanos.
• As medições de fosfatase alcalina são utilizadas na investigação de doença
hepatobiliar e doença óssea.
• Neste ensaio, a fosfatase alcalina catalisa a transfosforilação do p-nitrofenilfosfato
(pNPP) em p-nitrofenol (pNP), na presença do tampão transfosforilante (AMP). A
reacção é melhorada através da utilização de iões de magnésio e zinco. A variação
da absorvância a 405nm causada pela formação de pNP é directamente
proporcional à actividade da ALP, uma vez que os outros reagentes estão
presentes em quantidades não limitantes, sendo medida utilizando uma técnica
bicromática (405, 510nm).
Alanina Aminotransferase (ALT)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
da alanina aminotransferase no soro e plasma (com EDTA ou heparinizados)
humanos.
• Observam-se elevações significativas de ALT em doenças hepáticas como a
hepatite, necrose, ictericia e cirrose. Os níveis podem apresentar-se elevados
mesmo antes do aparecimento clínico da icterícia.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 43 Andreia Delgado Crisóstomo
• O método usa a ALT que vai catalizar a transaminação da L-alanina em α-
cetoglutarato (α-KG), formando L-glutamato e piruvato. O piruvato é reduzido
para lactato pela lactato desidrogenase (LDH) com oxidação simultânea da forma
reduzida de NADH. A variação da absorvância é directamente proporcional à
actividade de ALT e é medida utilizando uma técnica cinética bicromática (340,
700nm).
++ + →+
+−→−+−
NADlactatoHNADHpiruvato
piruvatoglutamatoLKGalaninaL
LDH
ALT
)(
α
Aspartato Aminotransferase (AST)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
da aspartato aminotransferase no soro ou plasma humanos.
• Observam-se elevações significativas da AST em doenças hepáticas, como a
hepatite, necrose, icterícia e cirrose. Os níveis de AST podem apresentar-se
elevados mesmo antes do aparecimento da icterícia.
• O método utiliza a AST para catalizar a transaminação do L-aspartato em α-
cetoglutarato (α-KG), formando L-glutamato e oxalacetato. O oxalacetato
formado é reduzido para malato pela malato desidrogenase (MDH) com oxidação
simultânea da forma reduzida de NADH. A alteração na absorvância com o
tempo, devido à conversão de NADH em NAD+ é directamente proporcional à
actividade de AST e é medida utilizando uma técnica cinética bicromática (340 e
740nm).
++ →+
+−→−+−
NADmalatoNADHtooxaloaceta
tooxaloacetaglutamatoLKGaspartatoL
MDH
ASTα
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 44 Andreia Delgado Crisóstomo
Lactato Desidrogenase (LDI)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a medição quantitativa de LDH total
em soro e plasma heparinizado humanos.
• A lactato desidrogenase (LDI) está presente no citoplasma de todas as células
do organismo. A concentração de LDI nos tecidos é várias centenas de vezes
superior à do soro ou plasma, e mesmo em pequena quantidade de lesões nos
tecidos pode provocar um aumento na actividade da LDI. Isto torna-a
especialmente útil no diagnóstico e monitorização de estados da doença nos
quais a renovação dos tecidos é acelerada, como em doenças do fígado, do
músculo cardíaco, dos músculos esqueléticos, dos rins e eritrócitos.
• A LDI é elevada no enfarte pulmonar e do miocárdio, nas leucemias, anemias
hemolíticas, hepatite não viral, doença falciforme, linfoma, pancreatite aguda
e qualquer distúrbio que resulte no derrame de citoplasma. É moderadamente
elevada na cirrose, na icterícia obstrutiva, na doença renal, nas doenças dos
músculos esqueléticos, nas doenças neoplásicas e na insuficiência cardíaca
congestiva. A LDI é marcadamente elevada na anemia megaloblástica e
perniciosa, no carcinoma metastático, na hepatite viral, no choque, na hipoxia
e na hipertermina extrema.
• O método LDI utiliza L-lactato tamponado c um pH de 9,4 como substrato. A
LDI oxida o substrato na presença de NAD+ para formar piruvato e NADH
que absorve a 340 nm. A concentração de actividade da LDI é medida como
reacção de cinética a 340/700 nm, proporcional à quantidade de LDI na
amostra.
• Condições especiais: as flebotomias para obtenção de amostras para a
concentração de actividade de LDI devem ser efectuadas com cuidado para
evitar a hemólise, visto que a abundância de LDI nos glóbulos vermelhos
pode contaminar essas amostras.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 45 Andreia Delgado Crisóstomo
Lipase (LIPL)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a medição quantitativa de lipase em soro e
plasma heparinizado humanos.
• Lipase pancreática – degrada os triglicéridos provenientes da dieta em glicerol e
ácidos gordos livres, na presença de sais biliares.
• As medições de lipase são utilizadas no diagnóstico de doenças pancreáticas,
como por exemplo, pancreatite aguda e obstrução do canal pancreático.
• O método LIPL utiliza como substrato o éster de 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-
ácido glutárico-(6’-metilresorufina). Em pH alcalino, a lipase cataliza a hidrólise
deste substrato na presença de colipase, sais biliares e CaCl2. A hidrólise produz
1,2-O-dilauril-rac-glicerol e éster de ácido glutárico-6’-metilresorufina. Este
último é um composto intermédio da reacção, instável, que se fragmenta e produz
metilresorufina cromogénica livre proporcional à actividade da lipase na amostra.
A taxa de produção de metilresorufina é medida por uma taxa de reacção
bicromática a 577 e 700 nm.
Amilase (AMY)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
da amilase em soro, plasma e urinas humanos.
• O método AMY utiliza um substrato cromogénico, o 2-cloro-4-nitrofenol ligado a
maltotriose. A reacção directa da α-amilase com o substrato resulta na formação
de 2-cloro-4-nitrofenol, que é monitorizado espectrofotometricamente pela técnica
cinética bicromática (405, 577 nm). As medições da amilase são utilizadas
principalmente para o diagnóstico e tratamento de pancreatite. O método reage às
isoenzimas pancreáticas e salivares da amilase.
• Condições especiais: o tubos de colheita de sangue com EDTA e o citrato inibem
a actividade da α-amilase pelo que não devem ser utilizados.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 46 Andreia Delgado Crisóstomo
γ-Glutamil Transferase (GGT)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
de GGT em soro e plasma (com EDTA ou heparinizados) humanos.
• Este método usa a γ-glutamil transferase que vai catalizar a transferência da
metade glutamil da γ-glutamil-3-carboxi-4-nitranilida (GCNA) para a
glicilglicina, libertando desse modo 5-amino-2-nitrobenzoato que absorve a 405
nm. Esta alteração é proporcional à actividade da γ-glutamil transferase e é
medida utilizando uma técnica de cinética bicromática (405, 600 nm).
Creatinina quinase (CKI)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a medição quantitativa de creatinina
quinase em soro e plasma humanos.
• As medições de creatinina quinase são utilizadas no diagnóstico e tratamento de
enfarte agudo do miocárdio e doenças musculares. A CKI pode tembém
apresentar-se elevada após uma lesão muscular ou exercicio físico extenuante.
• Este método consiste numa reacção enzimática acoplada, em que a creatinina
quinase em amostras de doentes catalisa a transfosforilação do fosfato, do fosfato
de creatinina em difosfato de adenosina (ADP), produzindo trifosfato de
adenosina (ATP). A hexoquinase (HK) fosforila a glicose do ATP em fosforilato
de glicose. A glicose-6-fosfato resultante é oxidada pela glicose-6-fosfato
desidrogenase (G-6-PDH), com a redução simultânea do NADP. A taxa de
formação de NADPH é directamente proporcional à actividade de CK na amostra
e é medida bicromaticamente a 340 e 540 nm.
NADPHHtonagliconolacPNADPPG
PGADPegluATP
ATPcreatininaADPcreatininaP
PDHG
MgHK
EDTANACMgCK
++− →+
+ →+
+ →+−
++
+
+
66
6cos
6
,
,,,
2
2
• Considerações especiais: amostras hemolisadas não devem ser utilizadas.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 47 Andreia Delgado Crisóstomo
Massa de isoenzima creatinina quinase MB (MMB)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro que se destina à medição quantitativa da
isoenzima creatinina quinase MB em soro, plasma (com EDTA ou heparinizado)
humanos para confirmação do enfarte agudo do miocárdio.
• A isoenzima creatinina quinase MB (CKMB) é encontrada principalmente em
tecido cardíaco, com concentrações substancialmente mais baixas observadas
também no músculo esquelético. A quantificação de CKMB é solicitada
rotineiramente como parte do painel cardíaco e é útil no diagnóstico de enfarte
agudo do miocárdio (EAM). Tipicamente, em casos de EAM sem complicações,
determinações seriadas mostram um padrão em que os níveis de CKMB se
elevam após 4-8 horas do início da dor, com um máximo entre 12-24 horas,
descendo depois para os valores normais em 48 horas.
• A massa de CKMB constitui o marcador bioquímico de eleição para o
perioperatório de EAM durante as primeiras 48 horas após o início da dor. As
concentrações de CKMB têm sido utilizadas também para avaliar a extensão do
EAM e reenfarte subsequente. A sensibilidade, especificidade e eficiência de
diagnóstico da massa de CKMB é superior à das isoenzimas da CK por
electroforese.
• O método CKMB é um imunoensaio enzimático de um passo, baseado no
princípio da sandwich. A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio
revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a subunidade CKB e um
reagente de conjugado (anticorpos monoclonais específicos para a isoenzima
CKMB marcados com β-galactosidase). Forma-se uma sandwich de partícula-
CKMB-conjugado durante o período de incubação. O conjugado e a substância
analisada não ligados são removidos por separação magnética e lavegem. A β-
galactosidase ligada sandwich é combinada com um substrato cromogénico, o
vermelho de clorofenol-β-g-galactopiranósido (CPRG). A hidrólise deste último,
liberta um cromóforo (CPR). A concentração de CKMB presente na amostra do
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 48 Andreia Delgado Crisóstomo
doente é directamente proporcional à taxa de variação de cor devida à formação
de CPR medida a 577 nm. A quantidade de proteína CKMB é medida
imunologicamente e os resultados são apresentados em unidades de massa
(ng/mL).
Bilirrubina Directa (DBI)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de bilirrubina
directa (conjugada) no soro e plasma humanos.
• As medições de bilirrubina directa são utilizadas no diagnóstico e tratamento de
perturbações hepáticas, hemolíticas, hematológicas e metabólicas, incluindo
hepatite e doença da vesicula biliar.
• Existem pelo menos 4 fracções distintas de bilirrubina que constituem a
bilirrubina total no soro. As fracções de reacção directa são a bilirrubina mono e
di conjugada (β e γ-bilirrubina) e a fracção delta (δ-bilirrubina), que se encontra
fortemente ligada à albumina. A bilirrubina não conjugada (α-bilirrubina) é
insolúvel em água e reage apenas após a adição de um acelerador como a cafeína.
• Neste método ocorre a formação do ácido sulfanílico diazotado por combinação
de nitrito de sódio e ácido sunfanílico a pH reduzido. A amostra é diluída em HCl
0,5M. é efectuada uma leitura duma amostra em branco para eliminar a
interferência de outros pigmentos que não a bilirrubina. Com a adição de ácido
sulfanílico diazotado, a bilirrubina conjugada é convertida em diazo-bilirrubina,
um cromóforo vermelhor que absorve a 540 nm e que é medido utilizando uma
técnica bicromática de ponto final (540 e 700 nm).
• Condições especiais : a bilirrubina é fotossensível pelo que deverão ser tomadas
precauções no sentido de proteger a amostra da luz do dia e de fontes de luz
fluorescente, de modo a evitar a fotodegradação.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 49 Andreia Delgado Crisóstomo
Bilirrubina Total (TBI)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a medição quantitativa de bilirrubina total
em soro e plasma (com EDTA ou heparinizado) humanos.
• As medições de bilirrubina total são utilizadas no diagnóstico e tratamento de
perturbações hepáticas, hemolíticas, hematológicas, metabólicas incluindo
hepatite e doença da vesícula biliar.
• Existem pelo menos 4 fracções distintas de bilirrubina que constituem a
bilirrubina total no soro. As fracções de reacção directa são a bilirrubina mono e
di conjugada (β e γ-bilirrubina) e a fracção delta (δ-bilirrubina), que se encontra
fortemente ligada à albumina. A bilirrubina não conjugada (α-bilirrubina) é
insolúvel em água e reage apenas após a adição de um acelerador como a cafeína.
• Neste método ocorre a formação do ácido sulfanílico diazotado por combinação
de nitrito de sódio e ácido sunfanílico a pH reduzido. A bilirrubina (não
conjugada) é solubilizada por diluição numa mistura de cafeína-acetato-EDTA.
Com a adição de ácido sulfanílico diazotado, a bilirrubina solubilizada, incluindo
as bilirrubinas conjugadas (mono e diglicurónidos) a e forma delta (biliproteína-
bilirrubina ligada covalentemente à albumina), é convertida em diazo-bilirrubina,
um cromóforo vermelho representativo da bilirrubina total e que absorve a 540
nm e é medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540 e 700 nm).
É utilizada uma correcção de branco de amostra.
• Condições específicas: a bilirrubina é fotossensível pelo que deverão ser tomadas
precauções no sentido de proteger a amostra da luz do dia e de fontes de luz
fluorescente, de modo a evitar a fotodegradação.
Albumina (ALB)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de albumina
no soro e plasma (com EDTA ou heparinizado) humanos.
• Os valores de albumina são utilizados no diagnóstico e tratamento de diversas
doenças que envolvem principalmente o fígado ou os rins.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 50 Andreia Delgado Crisóstomo
• A Albumina é a proteína de maior concentração no plasma; é formada
exclusivamente no fígado e serve como proteína de transporte e de ligação para o
cálcio, ácidos gordos, bilirrubina, hormonas, vitaminas, elementos vestigiais e
fármacos; é também muito importante na manutenção da pressão osmótica
coloidal tanto do espaço vascular como extravascular; a concentração de albumina
sérica baixa pode ter origem em doença hepática, pode também resultar de doença
renal (albumina escapa para a urina), má nutrição, dieta pobre em proteínas.
• Este método utiliza um corante púrpura de bromocresol (BCP) que, na presença
de um agente solubilizante, se vai ligar à albumina a um pH de 4,9. A quantidade
do complexo albumina-BCP é directamente proporcional à concentração de
albumina. O complexo absorve a 600nm e é medido utilizando uma técnica
policromática de ponto final (600, 540, 700nm).
Transferrina (TRNF)
• É um teste de diagnóstico in vitro que se destina à medição quantitativa da TRNF
em soro e plasma heparinizado humanos.
• A transferrina (siderolfilina) serve para transportar o ferro presente no sangue
para os depósitos de ferro no fígado, baço e medula óssea, assim como para os
órgãos que consomem ferro, especialmente os tecidos hematopoiéticos. A síntese
de TRNF no fígado é influenciada pelo metabolismo do ferro; a deficiência de
ferro resulta numa subida na síntese e, consequentemente, no aumento das
concentrações séricas, ao passo que em sistemas com excesso de ferro a síntese é
baixa. A determinação da TRNF sérica é, deste modo, utilizada para o diagnóstico
de deficiência de ferro, latente e manisfesta, e para a sobrecarga de ferro.
• O método TRNF é um ensaio quantitativo, turbidimétrico, utilizando a detecção
por ponto final, com base na precipitação da TRNF pelo seu anticorpo policlonal.
A TRNF do soro ou plasma reage com o seu anticorpo policlonal para formar
complexos imunitários. A adição de polietilenoglicol acelera a formação destes
complexos. A turvação resultante é medida através de medições bicromáticas de
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 51 Andreia Delgado Crisóstomo
ponto final a 340 e 700 nm. O aumento de turvação é proporcional à concentração
de TRNF na amostra.
• Condições especiais: amostras lipémicas que se apresentem turvas devem ser
centrifugadas a 15000 rpm durante 10 minutos antes do ensaio.
Ferritina (FERR)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de ferritina no
soro e plasma heparinizados humanos.
• As medições de ferritina auxiliam o diagnóstico de doenças que afectam o
metabolismo do ferro, tais como a hemocromatose, anemia por deficiência de
ferro.
• A ferritina é uma proteína de elevado peso molecular que funciona como principal
composto no armazenamento de ferro nos organismo. Os níveis de ferritina
circulante reflectem com exactidão os níveis de armazenamento do ferro no
organismo e são úteis em situações de suspeita de deficiência ou sobrecarga de
ferro.
• A proteína tem origem nas células reticuloendoteliais do fígado e do baço e nos
eritroblastos da medula óssea.
• A anemia por deficiência de ferro (IDA) é comum entre as mulheres em
menstruação e reprodutivamente activas, crinças, adultos idosos e vegetarianos.
• Um nível baixo de ferritina constitui um indicador precoce de IDA; ocorrendo
antes da diminuição dos níveis séricos de ferro e do aparecimento de anomalias
morfológicas nos glóbulos vermelhos. Os níveis normais de ferritina não podem
ser utilizados para exclusão de IDA no caso de existir uma condição hepática,
neoplásica ou inflamatória no doente (anemia de doença crónica, ACD). Os
doentes com ACD podem apresentar níveis de ferritina normais ou ligeiramente
aumentados devido a um aumento na ferritina, causado pela resposta de fase
aguda associada com a inflamação crónica, que se sobrepõe à diminuição da
ferritina associada com IDA.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 52 Andreia Delgado Crisóstomo
• O método FERR é um imunoensaio enzimático de um passo, baseado no princípio
da sandwich. A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio
revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a ferritina e um reagente
de conjugado (β-galactosidase marcada com anticorpo monoclonal específico
para um segundo local de ligação na ferritina) para formar uma sandwich de
partícula-ferritina-conjugado. O conjugado e a substância analisada não ligados
são removidos por separação magnética e lavegem. A β-galactosidase ligada
sandwich é combinada com um substrato cromogénico, o vermelho de clorofenol-
β-g-galactopiranósido (CPRG). A hidrólise deste último, liberta um cromóforo
(CPR). A concentração de FERR presente na amostra do doente é directamente
proporcional à taxa de variação de cor devida à formação de CPR medida a
577/700 nm.
Mioglobina (MYO)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro que se destina à medição quantitativa da
mioglobina no soro e plasma heparinizados humanos.
• As medições de mioglobina podem ser usadas no diagnóstico do enfarte do
miocárdio.
• A Mioglobina é uma proteína heme encontrada no músculo cardíaco e esquelético
e que é libertado no soro quando ocorrem danos nas células do músculo cardíaco
ou esquelético. Na ausência de traumatismo do músculo esquelético ou de outros
factores associados a um aumento de MYO circulante não relacionado com
alterações cardíacas, os níveis de MYO têm sido utilizados como um marcador
precoce para a medição de enfarte do miocárdio (EM). Após a necrose do
miocárdio associada a EM, a MYO é um dos primeiros marcadores a subir acima
dos níveis normais, aumentando em relação aos valores basais, de forma
mensurável, 1-3 horas após o enfarte, atingindo um pico às 6-12 horas e
regressando a valores basais num período de 24-36 horas. Vários relatórios
sugerem a medição da MYO como um auxiliar de diagnóstico para estratificação
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 53 Andreia Delgado Crisóstomo
de risco do EM com valores preditivos negativos de até 100% relatados em certos
períodos após o início dos sintomas.
• O método de MYO é um imunoensaio enzimático de dois passos, baseado no
princípio da sandwich. A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio
revestidas com anticorpos monoclonais específicos para a MYO, para formar um
complexo partúcula-MYO. As partículas são separadas magneticamente e o
sobrenadante é removido. Durante o segundo passo, o complexo partícula-MYO é
incubado com o reagente de conjugado (anticorpos monoclonais específicos para
a MYO marcados com β-galactosidase) para formar uma sandwich partúcula-
MYO-conjugado. O conjugado não ligado é removido por separação magnética e
lavegem. A β-galactosidase ligada sandwich é combinada com um substrato
cromogénico, o vermelho de clorofenol-β-g-galactopiranósido (CPRG). A
hidrólise deste último, liberta um cromóforo (CPR). A concentração de MYO
presente na amostra do doente é directamente proporcional à taxa de variação de
cor devida à formação de CPR medida a 577 nm.
Intervalo Alargado da Proteína C Reactiva (RCRP)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de CRP no
soro e plasma humanos (heparina de lítio).
• A medição da CRP é útil para a detecção e avaliação de infecções, lesões em
tecidos, distúrbios inflamatórios e doenças associadas.
• A CRP é uma das proteínas de “fase aguda”, cujos níveis séricos ou plasmáticos
sobem durante uma reacção genérica, não específica, a processos inflamatórios
infecciosos e não infecciosos, como a artrite reumatóide, a doença cardiovascular
e a doença vascular periférica; é sintetizada no fígado e normalmente está presente
em quantidade vestigial no soro e plasma.
• Visto que os valores elevados de CRP estão sempre associados a alterações
patológicas, o ensaio CRP proporciona informações úteis para o diagnóstico,
terapêutica e monitorização de processos inflamatórios e doenças associadas. Os
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 54 Andreia Delgado Crisóstomo
aumentos dos valores de CRP não são específicos e não devem ser interpretados
sem um histórico clínico completo.
• A medição de CRP por ensaio de alta sensibilidade pode contribuir para o valor
de previsão de outros marcadores utilizados para avaliar o risco de doença
cardiovascular e vascular periférica.
• O método RCRP baseia-se numa técnica de imunoensaio turbidimétrico
melhorado de partículas (PETIA). Partículas sintéticas revestidas com anticorpos
contra a CRP agregam-se na presença de CRP na amostra. O aumento de turvação
que acompanha a agregação (absoreve a 340 nm) é proporcional à concentração
de CRP.
Rastreio de Anfetaminas/Metanfetaminas (AMPH)
• É um método que contém reagentes para um ensaio de diagnóstico in vitro
destinado à determinação qualitativa e semiquantitativa de anfetaminas em urina
humana, utilizando um nível de cuttoff de 300, 500 ou 1000ng/mL.
• As medições obtidas com este método são utilizadas no diagnóstico e tratamento
do consumo ou sobredosagem de anfetaminas.
• Este método fornece apenas um resultado preliminar de teste analítico. Para obter
um resultado analítico confirmado deve utilizar-se um método químico alternativo
com maior especificidade. O método de confirmação preferencial é a
cromatografia gasosa/espectrofotometria de massa (GC/MS). Encontram-se
disponíveis outros métodos de confirmação química. A consideração clínica e a
avaliação profissional deverão ser utilizados em qualquer resultado de testes de
drogas de abuso, particularmente quando são resultados positivos preliminares.
• As Anfetaminas são substâncias estimuladoras do SNC que produzem um
estado de alerta, aumento de energia, redução da fome e uma sensação de bem
estar; podem ser administrados por via oral, IV, fumadas ou inaladas; são
prontamente absorvidas no TGI, sendo posteriormente desactivadas pelo fígado
ou excretadas inalteradas na urina. A importância relative destes modos de
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 55 Andreia Delgado Crisóstomo
eliminação depende do pH urinário. É metabolizada em metabolitos desaminados
e hidroxilados
• O método baseia-se na competição para locais de ligação dos Ac entre o fármaco
presente na amostra e o fármaco marcado com o enzima G6PDH.
• O controlo de qualidade deve ser feito pelo menos uma vez por dia de utilização,
analisar um controlo positivo e um controlo negativo relativamente à
concentração “cutoff”, utilizando um material de controlo à base de urina
adequado.
• Os resultados qualitativos são apresentados como Positivo e Negativos. Os
resultados postivos são apenas preliminares e sugerem somente que é provável
que a amostra contenha anfetaminas. Os resultados negativos indicam que a
amostra não contém anfetaminas ou que as mesma estão presentes em
concentrações inferiores ao nível de “cutoff”
• Os resultados semiquantitativos são apresentados com um valor expresso numa
concentração com unidade numérica (ng/mL) seguido da designação positivo ou
negativo. Os resultados de AMPH superiores ou iguais à concentração de cutoff
devem ser referidos como positivos. Os resultados de AMPH inferiores ao nível
de cutoff devem ser referidos como negativos. O intervalo de medição analítico é:
95-900 ng/mL (cutoff de 300 ou 500 ng/mL) ou 125-1800 ng/mL (cutoff de 100
ng/mL).
Rastreio de Benzodiazepinas na Urina (BENZ)
• É um método que contém reagentes para um ensaio de diagnóstico in vitro
destinado à determinação qualitativa e semiquantitativa de benzodiazepinas em
urina humana.
• As medições obtidas com este método são utilizadas no diagnóstico e tratamento
do consumo ou sobredosagem de benzodiazepinas.
• Este método fornece apenas um resultado preliminar de teste analítico. Para obter
um resultado analítico confirmado deve utilizar-se um método químico alternativo
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 56 Andreia Delgado Crisóstomo
com maior especificidade. O método de confirmação preferencial é a
cromatografia gasosa/espectrofotometria de massa (GC/MS). Encontram-se
disponíveis outros métodos de confirmação química. A consideração clínica e a
avaliação profissional deverão ser utilizados em qualquer resultado de testes de
drogas de abuso, particularmente quando são resultados positivos preliminares.
• As Benzodiazepinas são fármacos sedativo-hipnóticos estruturalmente
semelhantes e incluem fármacos de utilização generalizada como o
clorodiazepóxido, diazepam e oxazepam; as diferentes benzodiazepinas são
absorvidas a taxas diferentes e a temporização dos seus efeitos psicoactivos varia
com a taxa de absorção; podem ser administrados por via oral e são metabolizadas
no fígado; alguns metabolitos das benzodiazepinas são farmologicamente activos:
potenciam o efeito de outros depressivos so SNC, tal como o álcool etílico.
• O método baseia-se na competição para locais de ligação dos Ac entre o fármaco
presente na amostra e o fármaco marcado com o enzima G6PDH.
• O controlo de qualidade de ser feito pelo menos uma vez por dia de utilização,
analisar um controlo positivo e um controlo negativo relativamente à
concentração “cutoff”, utilizando um material de controlo à base de urina
adequado.
• Os resultados qualitativos são apresentados como Positivo e Negativos. Os
resultados postivos são apenas preliminares e sugerem somente que é provável
que a amostra contenha benzodiazepinas. Os resultados negativos indicam que a
amostra não contém benzodiazepinas ou que as mesma estão presentes em
concentrações inferiores ao nível de “cutoff”
• Os resultados semiquantitativos são apresentados com um valor expresso numa
concentração com unidade numérica (ng/mL) seguido da designação positivo ou
negativo. Os resultados de BENZ superiores ou iguais a 200 ng/mL devem ser
referidos como positivos. Os resultados de BENZ inferiores a 200 ng/mL devem
ser referidos como negativos. O intervalo de medição analítico é: 30-900 ng/mL.
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Rastreio de Metabolito da Cocaína na Urina (COC)
• É um método que contém reagentes para um ensaio de diagnóstico in vitro
destinado à determinação qualitativa e semiquantitativa de benzoilecgonina
(metabolito da cocaína) em urina humana, utilizando um nível de “cutoff” de 150
ou 300 ng/mL.
• As medições obtidas com este método são utilizadas no diagnóstico e tratamento
do consumo ou sobredosagem de cocaína.
• Este método fornece apenas um resultado preliminar de teste analítico. Para obter
um resultado analítico confirmado deve utilizar-se um método químico alternativo
com maior especificidade. O método de confirmação preferencial é a
cromatografia gasosa/espectrofotometria de massa (GC/MS). Encontram-se
disponíveis outros métodos de confirmação química. A consideração clínica e a
avaliação profissional deverão ser utilizados em qualquer resultado de testes de
drogas de abuso, particularmente quando são resultados positivos preliminares.
• A Cocaína é um estimulador do SNC que é extraído da planta de coca; como
droga de abuso é auto-administrada de diversas formas, incluindo inalação e
injecção intravenosa. A base da cocaína pode ser fumada, numa forma mais
frequentemente conhecida por “crack”; é absorvida rapidamente, especialmente
quando fumada; embora todas as formas sejnam potencialmente viciantes, o
“crack” tem uma probabilidade mais acentuada de conduzir à depedência, devido
ao seu efeito mais rápido e mais potente no consumidor;
• Os padrões da taxa de excreção variam com o modo de administração e de
indivíduo para indivíduo. A cocaína é quase totalmente metabolizada,
principalmente no fígado, sendo apenas cerca de 1% excretado pela urina na
forma inalterada. A maioria da cocaína é eliminada na forma de benzoilecgonina,
o principal metabolito da cocaína.
• Os metabolitos da cocaína podem ser detectados na urina durante cerca de 2 dias
após o consumo da mesma. A benzoilecgonina pode ser detectada na urina nas
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 58 Andreia Delgado Crisóstomo
primeiras 4 horas após a inalação da cocaína e permanece detectável em
concentrações superiores a 1000 ng/mL durante até 48 horas.´
• O método baseia-se na competição para locais de ligação dos Ac entre o fármaco
presente na amostra e o fármaco marcado com o enzima G6PDH.
• O controlo de qualidade de ser feito pelo menos uma vez por dia de utilização,
analisar um controlo positivo e um controlo negativo relativamente à
concentração “cutoff”, utilizando um material de controlo à base de urina
adequado.
• Os resultados qualitativos são apresentados como Positivo e Negativos. Os
resultados postivos são apenas preliminares e sugerem somente que é provável
que a amostra contenha benzoilecgonina. Os resultados negativos indicam que a
amostra não contém benzoilecgonina ou que as mesma estão presentes em
concentrações inferiores ao nível de “cutoff”
• Os resultados semiquantitativos são apresentados com um valor expresso numa
concentração com unidade numérica (ng/mL) seguido da designação positivo ou
negativo. Os resultados de COC superiores ou iguais a 150 ou 300 ng/mL devem
ser referidos como positivos. Os resultados de COC inferiores a 150 ou 300
ng/mL devem ser referidos como negativos. O intervalo de medição analítico é:
35-900 ng/mL (cutoff de 300 ng/mL).
Carbamazepina (CRBM)
• Trata-se de um teste de diagnóstico in vitro para a medição de carbamazepina, um
fármaco anticonvulsivo, em soro ou plasma humanos (com EDTA ou
heparinizado).
• Os resultados deste teste podem ser utilizados no diagnóstico e tratamento da
sobredosagem de carbamazepina e na monitorização dos níveis de carbamazepina,
para garantir uma terapêutica apropriada.
• A carbamazepina é um fármaco útil no controlo de determinados tipos de
epilepsia. Quimicamente, é diferente de outros agentes anticonvulsivos, podendo
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 59 Andreia Delgado Crisóstomo
alcançar um controlo das convulsões quando outros fármacos falharam. A
absorção intestinal e o metabolismo hepático são altamente variáveis.
• O ensaio dos níveis plasmáticos do fármaco é útil para estabelecer a dosagem de
manutenção, para determinar o cumprimento do tratamento e para avaliar
possíveis efeitos colaterais tóxicos.
• A carbamazepina é metabolizada no fígado para formar carbamazepina-10, 11-
epóxido que tem igualmente uma acção anticonvulsiva. A proporção de
carbamazepina e epoxicarbamazepina num doente submetido a uma terapêutica de
longo prazo é de cerca de sete para um, indicando que a maioria do fármaco no
plasma corresponde ao composto original. Tanto a carbamazepina como o seu
metabolito são polares e não são excretados em quantidades substanciais na urina
ou na bílis.
• A metodologia para a CRBM envolve uma técnica de imunoensaio de inibição
turbidimétrico melhorado de partículas homogéneas (PETINIA) que utiliza um
conjugado de partícula sintética-carbamazepina e um anticorpo monoclonal
específico da carbamazepina. A carbamazepina presente na amostra compete com
as partículas pelo anticorpo, diminuindo assim a taxa de agregação. Deste modo, a
taxa de agregação (medida utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a 340 e
700 nm) é inversamente proporcional à concentração de carbamazepina na
amostra.
Vancomicina (VANC)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a medição da vancomicina, um
glicopéptido antibiótico, em soro e plasma humanos.
• Os resultados do teste podem ser utilizados no diagnóstico e tratamento da
sobredosagem de vancomicina, e na monitorização dos níveis a mesma, para
garantir uma terapêutica apropriada.
• A vancomicina é um antibiótico activo contra a maioria das bactérias Gram
positivas. É especialmente importante no tratamento de infecções devidas a
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 60 Andreia Delgado Crisóstomo
organismos resistentes à meticilina e à cefalosporina. A utilização actual
encontra-se geralmente limitada às infecções nas quais outros antibióticos são
ineficazes ou estão contra-indicados e porque possui vários efeitos nocivos sobre
o metabolismo bacteriano.
• A vancomicina é eliminada do organismo por excreção renal. A semi-vida
plasmática varia com a idade e a função renal do doente e pode aproximar-se da
taxa de depuração da creatinina. Os efeitos tóxicos duradouros envolvem a função
do nervo auditivo e do rim. A ototoxicidade (perda de audição) tende a ser
permanente e dependente da dose. A ototoxicidade constitui uma preocupação
particular em doentes tratados concomitantemente com aminoglicosidos. A
nefrotoxicidade devida à vancomicina administrada individualmente é pouco
comum e normalmente reversível.
• O método VANC baseia-se numa técnica de imunoensaio de inibição
turbidimétrico melhorado de partículas homogéneas (PETINIA) que utiliza um
conjugado de partícula sintética-vancomicina e um anticorpo monoclonal
específico da vancomicina. A vancomicina presente na amostra compete com a
que está ligada às partículas pelo anticorpo disponível, diminuindo assim a taxa
de agregação. Deste modo, a taxa de agregação é inversamente proporcional à
concentração de vancomicina na amostra. A taxa de agregação é medida
utilizando leituras turbidimétricas bicromáticas a 340 nm e 700 nm.
Troponina I Cardíaca (TNI)
• É um ensaio de diagnóstico para a medição quantitativa de troponina I cardíaca
em soro e plasma humanos.
• As medições de TNI podem ser utilizadas como auxiliar no diagnóstico de enfarte
agudo do miocárdio (EAM) e na estratificação de risco em doentes com
sindromas coronários agudos relativamente ao risco relativo de mortalidade.
• A troponina é o complexo da proteína reguladora contráctil do músculo estriado.
Encontra-se periodicamente ao longo do filamento fino das miofibrilhas, em
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 61 Andreia Delgado Crisóstomo
conjunto com a proteína tropomiosina. O complexo da troponina é constituído por
3 componentes polipeptídicos distintos: Troponina C (elemento de ligação ao
cálcio); Troponina I (elemento inibidor da actiomiosina ATPase); Troponina T
(elemento de ligação à tropomiosina). O complexo serve para regular a interacção
dependente do cálcio, da miosina e da actina, desempenhando assim um papel
essencial na contracção muscular. A troponina I existe em 3 formas moleculares
distintas, que correspondem a isotipos específicos encontrados no músculo
esquelético de contracção rápida, no músculo esquelético de contracção lenta e no
músculo cardíaco, respectivamente.
• Vários relatórios existentes na literatura indicaram que a TNIé libertada para o
sangue algumas horas após o início dos sintomas de EM e que permanece elevada
durante város dias após um enfarte. Os dados cumulativos obtidos a partir destes
relatórios indicam que os níveis de troponina I se tornam anormais 4-8 horas após
o início da dor pré-cordial, atingem o pico às 12-16 horas e mantêm-se elevados
durante 5-9 horas após a ocorrência de um enfarte.
• Estudos clínicos sugerem igualmente uma especificidade cardíaca melhorada da
troponina I, quando comparada com o CKMB, para a detecção de lesões do
miocárdio na presença de lesões do músculo esquelético. A leitura dos níveis de
TNI proporciona uma determinação sensível e específica das lesões do miocárdio,
ao longo de uma larga janela de diagnóstico. As elevações nos níveis de TNI
foram observadas ao longo de um espectro de sintomas coronários agudos,
incluindo EM com ondas Q, EM sem ondas Q e angina instável.
• A TNI fornece um meio para a estratificação do risco em doentes com EM sem
ondas Q e angina instável. As troponinas cardíacas são marcadores de necrose
miocárdica e não apenas de EM. As elevações de troponinas cardíacas em
condições médicas que não EM devem ser tidas em conta devido ao elevado valor
de prognóstico relativamente à morbilidade e mortalidade. As condições que não
EM podem provocar a elevação dos valores de troponina incluem insuficiência
renal, cirúrgia cardíaca e não cardíaca, toxicidade cardíaca provocada por
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 62 Andreia Delgado Crisóstomo
fármacos, miocardite, embolismo pulmonar e doenças neurológicas agudas.
Embora o tratamento deva basear-se na causa subjacente primária, reconhece-se
que qualquer elevação de troponina é premonitória de resultados adversos, um
facto que é cada vez mais tido em conta durante o processo de decisão médica.
• O método TNI é um imunoensaio quimioluminescente homogéneo em sandwich.
O teste usa 2 reagentes sintéticos em forma de esfera e um fragmento de anticorpo
monoclonal anti-troponina I cardíaca biotinilado. O primeiro reagente em forma
de esfera (Sensibeads) é revestido com estreptavidina e contém um corante
fotossensibilizante. O segundo reagente em forma de esfera (Chemibeads) é
revestido com um segundo anticorpo monoclonal anti-troponina I cardíaca e
contém corante quimioluinescente. A amostra é incubada com o reagente
Chemibeads e anticorpo biotinilado para formar uma sandwich esfera-TNI-
anticorpo biotinilado. O reagente Sensibeads é adicionado e ligado à biotina para
formar imunocomplexos de pares de esferas. A iluminação do complexo a 680 nm
produz oxigénio singleto proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para
o reagente Chemibeads e desencadeia uma reacção quimioluminescente. O sinal é
medido a 612 nm e é uma função directa da concentração de TNI na amostra.
Proteínas Totais (TP)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de proteína
total em soro e plasma heparinizado humanos.
• As medições de proteína total são utilizados no diagnóstico e tratamento de uma
variedade de doenças que envolvem o fígado, o rim ou a medula óssea, assim
como perturbações metabólicas ou nutricionais.
• O método incorpora o tertarato com um agente de complexização para evitar a
precipitação de Cu(OH). A utilização de um branco de soro aumenta a
sensibilidade do métoso e minimiza a interferência espectral da lipémia. O ião
Cu2+ reage então com as ligações peptídicas da proteína numa solução básica. O
complexo proteico de cobre (II) azul assim formado é proporcional à
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 63 Andreia Delgado Crisóstomo
concentração de proteína total da amostra, sendo medido utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (540, 700 nm).
Proteína urinária/do LCR (UCFP)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da proteína
total em urina e LCR humanos.
• A medição do conteúdo proteico na urina é utilizada no giagnóstico e tratamento
de doenças renais. A medição do conteúdo proteico no LCR é utilizada no
diagnóstico e tratamento de doenças do SNC.
• Na sequência da reacção, o vermelhode pirogalol combina-se com o molibdato de
sódio para formar um complexo vermelho com uma absorvância máxima a 470
nm. A proteína presente na amostra reage com este complexo em solução ácida
para formar um complexo de cor azul arroxeada, que absorve a 600 nm. A
absorvância a 600 nm é directamente proporcional à concentração de proteína na
amostra. A concentração de substância a analisar é determinada por cálculo,
utilizando uma curva logarítmica sobre uma curva de calibração previamente
armazenada.
• Condições especiais: devem evitar-se amostras hemolisadas pois a hemólise
aumenta os resultados de UCFP.
Ferro (IRON)
• É um teste de diagnóstico in vitro destinado à medição quantitativa de ferro em
soro e plasma humanos.
• As medições de ferro são utilizadas no diagnóstico e tratamento de doenças como
a anemia por deficiência de ferro e outros distúrbios do metabolismo do ferro.
• O ferro encontra-se distribuído pelo organismo em compartimentos como a
hemoglobina, tecidos, mioglobina e uma fracção lábil, encontrando-se a maior
quantidade de ferro na hemoglobina dos glóbulos vermelhos ou nos seus
percursores, ne medula óssea; aproximadamente 2,5 mg do ferro fisiológico são
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 64 Andreia Delgado Crisóstomo
encontrados no plasma, em comparação com aproximadamente 2,5 g de ferro
contidos na hemoglobina.
• Os distúrbios do metabolismo do ferro incluem a anemia por deficiência de ferro
e as condições de sobrecarga de ferro, como a hemosiderose, a hemocromatose e
a anemia sideroblástica.
• O método ocorre em condições ácidas, onde o ferro (Fe3+) que se encontrava
ligado à transferrina é libertado. Na presença do agente redutor, ácido ascórbico, o
Fe3+ é reduzido a Fe2+. Este último forma um complexo de cor azul com o sal
dissódico do ácido 5,5’(3-(2-piridil)-1,2,4-triazina-5,6-diil)-bis-2-furano-sulfónico
(Ferene®). A absorvância do complexo, medida utilizando uma técnica
bicromática de ponto final (600, 700 nm), é directamente proporcional à
concentração de ferro no soro.
• Condições especiais: amostras hemolisadas podem produzir resultados de ferro
elevados e não devem ser utilizadas neste ensaio.
Cálcio (CA)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa do cálcio em
soro, plasma e urina humanos.
• No sangue, aproximadamente 50% do cálcio encontra-se na forma livre, 40%
encontra-se ligado às proteínas e 10% na forma de complexo. Cerca de 80% do
cálcio ligado às proteínas encontra-se associado à albumina, com os restantes 20%
associados às globinas.
• As medidas de cálcio são utilizadas no diagnóstico e tratamento de doença
paratiróide, um conjunto de doenças ósseas, doenças renais e tetania (contracções
ou espasmos musculares intermitentes).
• Este método utiliza o cálcio que vai reagir com a cálcio o-cresolftaleína
complexona (OCPC) para formar um complexo de cor púrpura. A quantidade de
complexo formado desta forma é porporcional à concentração de cálcio e é
medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (577, 540nm). Os iões
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 65 Andreia Delgado Crisóstomo
de magnésio, que também formam um complexo corado com OCPC, são
removidos da reacção por formação de complexo com 8-quinolinol.
Magnésio (MG)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
do magnésio em soro, plasma heparinizado e urina humanos.
• O método utiliza o azul de metiltimol (MTB) que vai formar um complexo azul
com o magnésio. A interferência do cálcio é minimizada através da formação de
um complexo entre o cálcio e o Ba-EGTA (agente quelante). A quantidade do
complexo MG-MTB formado é proporcional à concentração de magnésio e é
medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (600 e 510 nm).
Fósforo (PHOS)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
do fósforo em soro, plasma e urina humanos.
• O método do PHOS consiste na combinação do fosfato inorgânico com o
molibdato numa solução ácida para formar um complexo que é reduzido pelo
sulfato de p-etilaminofenol e pelo bissulfito. Absorvância a 340 nm da solução de
fosfomolibdato reduzido é proporcional à concentração de fósforo inorgânico e é
medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final.
N-Terminal Pro-Péptido Natriurético Cerebral (NTP)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de NT-
proBNP em soro e plasma (com EDTA ou heparinizado) humanos.
• Em indivíduos suspeitos de sofrerem de insuficiência cardíaca congestiva, as
medições de NT-proBNP são usadas como auxiliares do diagnóstico e na
avaliação da gravidade. O teste é também indicado para a estratificação de risco
em doentes com sindromas coronário agudos e insuficiência cardíaca.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 66 Andreia Delgado Crisóstomo
• A importância dos péptidos natriuréticos no controlo do funcionamento do
sistema cardiovasculae foi comprovada. Os estudos iniciais revelam que estes
podem ser utilizados para o diagnóstico de problemas clínicos associados a
disfunção ventricular esquerda. Foram relatados na literatura os seguintes
péptidos natriuréticos: péptido natriurético atrial (ANP), péptido natriurético
cerebral (BNP) e péptido natriurético tipo-C (CNP).
• O ANP e o BNP têm propriedades natriuréticas e diuréticas. Como antagonistas
do sistema renina-angiotensina-aldosterona, influenciam o equilíbrio
hidroelectrolítico de um organismo. Em indivíduos com disfunção no ventrículo
esquerdo, as concentrações séricas e plasmáticas de BNP aumentam, assim como
as concentrações da pro-hormona biologicamente inactiva, proBNP. A proBNP é
composta por 108 aminoácidos. É segregada principalmente pelo ventrículo
esquerdo do coração e, neste processo, é dissociada em BNP fisiologicamente
activa e no fragmento N-terminal NT-proBNP.
• Os estudos indicam que o fragmento NT-proBNP pode ser empregue para fins de
diagnóstico e prognóstico. A concentração do mesmo no plasma indica o
prognóstico para a disfunção do ventrículo esquerdo. É também útil na atribuição
de sintomas a causas cardíacas ou não cardíacas.
• A determinação do NT-proBNP ajuda a identificar indivíduos com disfunção no
ventrículo esquerdo. As alterações na concentração do mesmo podem ser usadas
para avaliar o sucesso do tratamento em pacientes com disfunção do centrículo
esquerdo. Existem algumas indicações de que o NT-proBNP, devido às suas
funções, é adequado para ser utilizado na remodelação vascular, contribuindo
assim para o estabelecimento de procedimentos de reabilitação individualizados.
• Verifica-se um aumento nos níveis de NT-proBNP em doentes com angina
instável e após EM. Embora não constituam forma de diagnóstico para estas
condições, vários estudos indicam que as medições de NT-proBNP proporcionam
informações de prognóstico para a estratificação de risco a curto e a longo prazo
de doentes com angina instável ou EM.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 67 Andreia Delgado Crisóstomo
Ácido Úrico (URCA)
• É um ensaio de diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da actividade
de ácido úrico em soro, plasma (com EDTA ou heparina de lítio) e urina
humanos.
• A medição do ácido úrico através da monitorização da perda de absorvância a 293
nm após o tratamento com uricase é geralmente reconhecido como sendo mais
específico e menos sujeito a a interferência do que outros métodos indirectos. O
ácido úrico que absorve a 293 nm é convertido pela uricase em alantoína, que não
absorve a 293 nm. A alteração na absorvância a 293 nm devida ao
desaparecimento de ácido úrico é directamente proporcional à concentração de
ácido úrico na amostra e é medida utilizando uma técnica bicromática de ponto
final (293, 700 nm).
Na+ /K+/Cl -
• Os métodos Na+ /K+/Cl- são testes de diagnóstico in vitro para a determinação
quantitativa de sódio, potássio e cloreto em soro e plasma heparinizado humanos.
Destinam-se também a ser utilizados para a medição quantitativa de Na+ /K+/Cl-
na urina.
• Os métodos utilizam a Tecnologia do Multisensor Integrado (IMT) de detecção
indirecta das amostras QuikLYTE® para desenvolver um potencial eléctrico
proporcional à actividade de cada ião específico presente na amostra.
• Existem 5 eléctrodos utilizados para medir electrólitos no aparelho. Três destes
eléctrodos são incorporados no QuikLYTE® Integrated Multisensor e são
selectivos para os iões de sódio, potássio e cloreto. No multisensor, é também
incorporado um eléctrodo de referência. Depois de uma amostra ser posicionada
no sensor, os iões Na+ /K+/Cl- estabelecem um equilíbrio com a superfície do
eléctrodo. É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da actividade
da substância a analisar na amostra. O potencial eléctrico gerado numa amostra é
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 68 Andreia Delgado Crisóstomo
comparado com o potencial eléctrico gerado numa solução padrão e a
concentração dos iões pretendidos é calculada utilizando a equação de Nernst
(Equação 2).
)log(0591,0 .0
estred
oxidest
a
a
nEE +=
Em que:
E = potencial observado
E0 = potencial padrão
n = número de electrões envolvidos (modificação no número de oxidação das
espécies químicas) ou número de electrões recebidos pelo agente oxidante ou
cedidos pelo agente redutor
aest oxid = actividade do estado oxidado do eléctrodo
aest red = actividade do estado reduzido do eléctrodo
Equação 2- Equação de Nernst.
• Condições especiais: as amostras hemolisadas podem produzir resultados de
potássio elevados incorrectos. A concentração de potássio intracelular é 30-50
vezes superior à do soro ou plasma extracelular.
Tabela 1– Valores de Referência para cada parâmetro analisado pelo aparelho automático
(DIMENSION® EXL).
Parâmetro Valores de Referência
AHDL 40-60 mg/dL
ALB 3,4-5,0 g/dL
ALDL <100 mg/dL
ALP 50-136 U/L
ALT 30-65 U/L
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 69 Andreia Delgado Crisóstomo
AMPH Qualitativo e semiquantitativo na
descrição do parâmetro
AMY Soro: 25-115 U/L
Urina: 59-401 U/L
AST 15-37 U/L
BENZ Qualitativo e semiquantitativo na
descrição do parâmetro
BUN Soro: 7-18 mg/dL
Urina: 7-20 g/24h
CA Soro: 8,5-10,1 mg/dL
Urina: 42-353 mg/dL
CHOL <200 mg/dL
CKI Homem: 39-309 U/L
Mulher: 26-192 U/L
COC Qualitativo e semiquantitativo na
descrição do parâmetro
CRBM 4,0-12,0 µg/mL
CREA
Soro:
Homem: 0,8-1,3 mg/dL
Mulher:0,6-1,0 mg/dL
Urina:
Homem: 0,6-2,5 g/24h
Mulher: 0,6-1,5 g/24h
DBI 0,0-0,2 mg/dL
FERR 8-388 ng/mL
GGT Homem: 5-55 U/L
Mulher: 15-85 U/L
GLUC Soro: 74-106 mg/dL
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 70 Andreia Delgado Crisóstomo
LCR: 40-70 mg/dL
Urina aleatória: 1-15 mg/dL
Urina: <0,5 g/24h
IRON Homem: 65-175 U/L
Mulher: 50-170 U/L
LDI Homens: 85-227 U/L
Mulheres: 81-234 U/L
LIPL 73-393 U/L
MG Soro:1,8-2,4 mg/dL
Urina: 24-255 g/24h
MMB 0-36 ng/mL
MYO 10-92 ng/mL
NTP <75 anos: 125 pg/mL
≥75 anos: 450 pg/mL
PHOS Soro: 2,5-4,9 mg/dL
Urina: 0,4-1,3 g/24h
RCRP 0,3 mg/dL
TBI 0,2-1,0 mg/dL
TGL <150 mg/dL
TNI 0,000-0,056 ng/mL
TP 6,4-8,2 g/dL
TRNF 202-364 mg/dL
UCFP
Urina: <11,9 mg/dL; <149,1
mg/dia
LCR: 15-45 mg/dL
URCA
Soro:
Homem: 3,5-7,2 mg/dL
Mulher: 2,6-6,0 mg/dL
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 71 Andreia Delgado Crisóstomo
Urina: 150-990 mg/24h
VANC 18-26 µg/mL
Na+/K+/Cl-
Soro:
Na+: 136-145 mmol/L
K+: 3,5-5,1 mmol/L
Cl-: 98-107 mmol/L
Urina:
Na+: 40-220 mmol/24h
K+: 25-125 mmol/24h
Cl-: 110-250 mmol/24h
Seguidamente, apresenta-se uma tabela (Tabela 2) que mostra o plano de controlo
interno para o aparelho automático (DIMENSION® EXL) usado nesta valência.
Tabela 2- Plano de Controlo Interno para os parâmetros abaixo indicados, determinados
pelo aparelho automático (DIMENSION® EXL).
Parâmetro Controlo Periodicidade Critério de
Aceitação Actuação
ALB, ALP, AMY,
ALT, AST, BUN,
CHOL, CA, CREA,
CKI, DBI, FERR,
GLUC, GGT,
ILYTE, IRON, MG,
AHDL, ALDL,
PHOS, RCRP,
TGL, TP, URCA
DADE® TRU-
Liquid® Moni-
Trol®
Diariamente
o nível 1 e 2
Intervalo
indicado na
tabela de
valores dos
respectivos
lotes
Se fora do intervalo:
1- repetir
2- repetir com
controlo novo
3- calibrar o
parâmetro
CA, CREA, LYTE,
PHOS, MG, GLUC,
DADE® TRU-
Liquid® Urine
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 72 Andreia Delgado Crisóstomo
URCA, BUN,
UCFP
TBI, DBI DADE®
Bilirubin
Diariamente
o nível 1 e 3
RCRP DADE®
Immunology
Diariamente
o nível 1, 2 e
3
1.3.3- Doseamento de Hemoglobinas A1c
O Bio-Rad D-10™ Dual Program (Figura 4) destina-se a determinar a
percentagem de hemoglobina A1c no sangue total humano utilizando a HPLC
(cromatografia líquida de alta resolução) por troca iónica. Um programa de 3 minutos
permite determinar a percentagem de área apenas da HbA1c.
A Diabetes mellitus é uma condição que se caracteriza por hiperglicemia
resultante da incapacidade do corpo de utilizar a glicose sanguínea para gerar energia. Na
diabetes de Tipo 1, o pâncreas já deixou de produzir insulina e, portanto, a glicose
sanguínea não consegue entrar nas células para ser utilizada para gerar energia. Na
diabetes de Tipo 2, o pâncreas não produz suficiente insulina ou o corpo não consegue
utilizar a insulina correctamente. As complicações da diabetes, envolvendo os olhos, rins,
nervos e os grandes vasos sanguíneos do coração, cérebro e extremidades, são comuns a
Figura 4- Aparelho automático (Bio-Rad D-10™ Dual
Program) para amostras de sangue total humano.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 73 Andreia Delgado Crisóstomo
ambas as formas da doença. A diabetes mellitus afecta mais de 5% da população
mundial.
A monitorização da terapêutica é indispensável pois o nível de glicose sanguínea
deve ser tão próximo do normal quanto possível, minimizando assim o risco de
consequências vasculares de longo prazo.
É possível estabelecer um índice exacto da média de concentração de glicose
sanguínea através da medição da hemoglobina A1c (Hb A1c) a cada dois ou três meses.
O nível de HbA1c é proporcional tanto à média da concentração de glicose como ao
período de vida do glóbulo vermelho na circulação. A medição da HbA1c tem portanto
assim um papel importante no controlo de rotina da diabetes.
O D-10 Dual Program baseia-se na separação cromatográfica dos analitos através
da HPLC por troca iónica. As amostras são automaticamente diluídas no D-10 e
injectadas na coluna analítica. O D-10 proporciona à coluna um gradiente programado de
tampão de crescente força iónica, sendo que, nesta as hemoglobinas são separadas com
base nas respectivas interacções iónicas com o material da coluna. As hemoglobinas
separadas passam então pela célula de fluxo do fotómetro de filtros, onde se medem as
alterações na absorvância a 415nm. Para cada amostra, é gerado um relatório e um
cromatograma.
Quanto ao controlo do aparelho este é feito diariamente, onde se faz a calibração
de dois níveis para quantificar os valores da Hb A1c. Quando não se obtêm os valores de
controlo previstos, é necessário efectuar uma nova execução. O intervalo de valores
reportáveis para a HbA1c são 3,8% - 18,5% no D-10 Dual. Os valores da HbA1c que
estiverem fora do intervalo anterior não devem ser reportados.
O quadro abaixo (Tabela 3) mostra qual o grau de controlo da glicose para valores
relativos (%) de hemoglobina A1c.
Tabela 3- Grau de controle da glicose para valores relativos (%) de hemoglobina A1c.
Hemoglobina A1c (%) Grau de controlo da glicose
> 8 Acção sugerida1
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< 7 Objectivo2
< 6 Nível não diabético 1Elevado risco de desenvolver complicações de longo prazo, tais como retinopatia,
nefropatia, neuropatia e cardiopatia. A “Acção sugerida” depende das circunstâncias
individuais de cada paciente. 2Algum perigo de reacção hipoglicémica nos diabéticos de Tipo I. Alguns indivíduos
intolerantes à glicose e diabéticos subclínicos” poderão demonstrar HbA1c (elevada)
nesta área.
1.3.4 – Testes Serológicos
1.3.4.1- Clearview® IM
• É um imunoensaio simples e rápido de detecção qualitativa de anticorpos IgM
heterófilos da mononucleose infecciosa em amostras de soro total, soro ou
plasma.
• A mononucleose infecciosa (IM) é uma infecção herpética aguda causada pelo
vírus de Epstein-Barr. Trata-se de uma doença de gravidade variável, sendo
caracterizada por um conjunto de sintomas que podem incluir letargia, faringite,
linfadenopatia, esplenomegália, hepatite e icterícia. Embora pouco frequentes, são
também consequências desta patologia a anemia hemolítica auto-imune, a ruptura
esplénica espontânea e a progressão para leucemia linfoblástica aguda. O
tratamento da doença é essencialmente sintomático incluindo, por um lado,
repouso absoluto no leito para prevenir a ocorrência de complicações graves
afectando o fígado ou o baço e, por outro, a administração de analgésicos para
controlo da dor.
• Durante a fase aguda da doença, ao anticorpos heterófilos IM (primariamente da
classe IgM) aparecem em 80-90% dos casos de IM. Os anticorpos heterófilos IM
são habitualmente evidenciáveis 1-12 semanas após o início da doença, tendo sido
porém demonstrado que podem persistir por um ano.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 75 Andreia Delgado Crisóstomo
• Os anticorpos heterófilos IM podem ser detectados pela aglutinação de eritrócitos
de mamíferos. Os antigénios obtidos a partir de membranas de eritrócitos bovinos
são mais específicos para os anticorpos heterófilos IM que aqueles obtidos a partir
de eritrócitos ovinos ou equinos.
• O clearview IM utiliza uma glicoproteína de eritrócitos bovinos sendo por isso
altamente específico, não requerendo pré-tratamento da amostra e produzindo
resultados claros e inequívocos.
• O método consiste na aplicação da amostra do doente na placa absorvente na
janela de amostra (S) do dispositivo. A placa absorvente contém microesferas
azuis ligadas a glicoproteína de eritrócitos bovinos. Quando a amostra é aplicada,
estas microesferas são mobilizadas e a amostr migra ao longo da tira-teste. Se a
amostra contém anticorpos heterófilos IM ocorrerá conjugação destes com as
glicoproteínas de eritrócitos bovinos ligadas às microesferas, formando assim um
complexo. Estes complexos são depois ligados pela região de glicoproteínas
imobilizadas de eritrócitos bovinos na região da linha de teste (T), constituindo
uma linha de teste azul. Caso os anticorpos heterófilos IM não estejam presentes,
não ocorrerá formação de uma linha na região da linha de teste (T).
• O Clearview® IM apresenta também uma função integrada de controlo. O
aparecimento de uma linha azul na região da linha de controlo (C) demonstra que
o teste foi processado correctamente.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 3 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• Apresentação do resultado (Figura 4):
- Resultado Positivo é indicado por uma linha azul na região da linha de teste
(T) e na região da linha de controlo (C), dentro do tempo especificado que são
5 minutos.
- Resultado Negativo é indicado pela formação de uma linha azul apenas na
região da linha de controlo (C).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 76 Andreia Delgado Crisóstomo
Figura 5- Apresentação do resultado do teste Clearview® IM.
1.3.4.2- AVITEX® ROSE WAALER
• É um teste rápido em lâmina para a detecção do factor reumatóide (FR). Este pode
ser encontrado no soro dos doentes com artrite reumatóide e supõe-se ser
constituido por anticorpos IgM anti-IgG animal. Devia à variedade de F não existe
nenhum teste capaz de detectar todos eles.
• O teste é constituido por uma suspensão de eritrócitos de ovelha, estabilizados
com IgG de coelho anti-ovelha. Quando o FR está presente na amostra observa-se
uma reacção de aglutinação.
• Não utilizar amostras hemolizadas, lipémicas ou contaminadas pois podem
interferir nos resultados.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 2 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• O método consiste em aplicar uma gota de soro do doente no cartão à qual se vai
adionar uma gota de reagente Rose Waaler. Posteriormente, homogeneiza-se e
aguardamos 2 minutos. Depois agitamos suavemente o cartão e aguardamos
novamente, 1 minuto. Por fim, lê-se o resultado do cartão.
• Apresentação do resultado:
- Resultado Positivo é indicação pela presença de aglutinação.
- Resultado Negativo é indicado pela ausência de aglutinação.
• O método semiquantitativo permite através de uma série de diluições calcular
aproximadamente a concetração de FR no soro.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 77 Andreia Delgado Crisóstomo
1.3.4.3- AVITEX® SLE
• O Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) foi definido como uma doença auto-imune
caracterizada por anticorpos contra o DNA.esta doença afecta 50 em 100.000
pessoas com uma taxa de incidência de 9:1 entre mulheres e homens. O grupo
etário onde prevalece é o das mulheres com idades entre os 25-30 anos. A
Associação Americana de Reumatismo publicou uma lista de critérios para
auxiliar o diagnóstico do LES, sendo uma destes critérios a detecção de
anticorpos anti-DNA contra DNA de origem.
• O AVITEX SLE é um teste rápido de aglutinação para a detecção presuntiva do
LES no soro humano, detectando e quantificando anticorpos anti-DNA de cadeia
dupla.
• Não utilizar amostras hemolizadas, lipémicas ou contaminadas pois podem
interferir nos resultados.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 2 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• O método consiste em aplicar uma gota de soro do doente no cartão à qual se vai
adionar uma gota de reagente de latex. Posteriormente, homogeneiza-se as 2
gotas. Depois agitamos suavemente o cartão durante 3 minuto, observando a
formação de aglutinação sob uma luz forte passados os 3 minutos.
• Apresentação do resultado:
- Resultado Positivo é indicado pela presença de aglutinação.
- Resultado Negativo é indicado pela ausência de aglutinação.
• O método semiquantitativo permite através de uma série de diluições calcular
aproximadamente a concetração de FR no soro.
1.3.4.4- Brucelloslide-Test
• A brucelose humana é uma antropozoonose, muito frequente no mundo,
provocada pela Brucella. Esta doença, de declaração obrigatória na maior parte
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 78 Andreia Delgado Crisóstomo
dos países, tem repercussões importantes tanto para a saúde pública como para a
economia dos países em vias de desenvolvimento.
• O homem é apenas um hospedeiro acidental para a Brucella, porém esta zoonose
pode atingir todos os animais (domésticos e selvagens), daí a razão da sua
dispersão mundial. Os animais doentes excretam as bactérias pelo leite, urina e
placenta, estando por isso explicada a contaminação inter-animal e humana, assim
como a disseminação importante do microrganismo.
• A doença pode apresentar-se sob 2 formas: aguda, acompanhada por síndrome
febril, ou crónica, carcterizada pelo síndrome da “fadiga crónica”. O diagnóstico
baseia-se em critérios bacteriológicos e em testes serológicos.
• O Brucelloslide-Test é um teste qualitativo de ajuda ao diagnóstico da brucelose
aguda por aglutinação em carta (antigénio Rosa Bengala) no soro humano. Sendo
assim, na presença de aglutininas específicas da Brucelose (Brucella melitensis,
abortus bovis e suis), o antigénio ácido tamponado, corado de Rosa Bengala, é
aglutinado.
• Não utilizar amostras hemolizadas, lipémicas ou contaminadas pois podem
interferir nos resultados.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 2 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• O método consiste em aplicar 30 µL de soro do doente no cartão à qual se vai
adionar 30 µL de antigénio. Posteriormente, homogeneiza-se. Proceder da mesma
forma com o controlo positivo R2. Depois agitamos suavemente o cartão durante
4 minuto, observando a formação de aglutinação sob uma luz forte passados os 4
minutos.
• Apresentação do resultado:
- Resultado Positivo é indicado pela presença de aglutinação.
- Resultado Negativo é indicado pela ausência de aglutinação.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 79 Andreia Delgado Crisóstomo
1.3.4.5- IMMUTHREP® TPHA
• A Sífilis é uma doença complexa geralmente transmitida sexualmente. O
Treponema pallidum é o agente causador da doença e não cresce por meios de
cultura convencionais ou mesmo em cultura de tecidos. A infecção é geralmente
diagnosticada através da detecção de anticorpos específicos para o T.pallidum no
sangue ou LCR dos doentes.
• Os anticorpos tornam-se detectáveis nas 3-4 semanas subsequentes ao contacto
com o microorganismo e podem permanecer em níveis detectáveis por longos
períodos após o tratamento. Formam-se 2 grupos de anticorpos, um que reage
com os antigénios não específicos do treponema usados nos testes VDRL/Carvão
e RPR e outro que reage com os antigénios específicos do T.pallidum. Os
anticorpos anti-antigénios não específicos do treponema encontram-se
(geralmente) no estado agudo da doença e os seus níveis diminuem após um
tratamento eficaz. Os anticorpos específicos persistem muito tempo após a
infecção ter sido tratada com sucesso. É necessário pesquisar ambos os grupos de
anticorpos visto que os não específicos do treponema podem ser originados por
outras infecções que não a Sífilis.
• O IMMUTREP TPHA é um teste específico, sensível por hemaglutinação passiva
para a detecção dos anticorpos anti- T.pallidum no soro ou LCR.
• Este teste é constituído por eritrócitos de aves sensibilizadas com antigénios
tratados com formol, um controlo com eritrócitos de aves (não sensibilizados),
diluente e um soro controle.
• Apresentação do resultado:
- Resultado Positivo - Quando as amostras positivas diluídas são misturadas
com os eritrócitos sensibilizados, os anticorpos reagem com os antigénios do
eritrócito sensibilizado provocando a aglutinação das células.
- Resultado Negativo - As células formam um padrão característico no fundo
do poço da placa de microtitulação. Na ausência de anticorpos, forma-se um
botão compacto no fundo do poço.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 80 Andreia Delgado Crisóstomo
• Não utilizar amostras hemolizadas, lipémicas ou contaminadas pois podem
interferir nos resultados.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 2 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• O método precisa de 4 poços de uma placa de microtitulação. Depois adiciona-se
diluente nas filas e a partir daí adiciona-se 25 µL de cada amostra num poço da
primeira fila, misturamos e começamos a fazer diluições sucessivas por filas.
Adiocionamos por fim 75 µL de células de controlo homogeneizadas à fila 3 e o
mesmo volume de células de teste homogeneizadas à fila 4. Homeogeneizar a
placa. As diluições finais na fila 3 e 4 são de 1/80. Tapar e deixar à temperatura
ambiente durante 45 minutos. No fim do tempo estipulado observamos os padrões
de aglutinação.
• A ocorrência de aglutinação com células controlo, também como em células teste,
é indicador da presença de anticorpos anti-célula. Neste caso, o teste não poderá
ser considerado válido e deverá ser repetido procedendo-se previamente à
absorção do soro.
• O método quantitativo permite através de uma série de diluições calcular
aproximadamente do título no soro.
1.3.4.6- MACRO-VUE RPR Card Test
• O Macro-Vue RPR (Reagina Rápida Plasmática) 18 mm Circle Card Test (teste
de cartão com círculo de 18 mm consiste num procedimento de teste não
treponémico para a detecção serológica de sífilis.
• O teste de Cartão com círculo de 18 mm RPR está recomendado quando se utiliza
colheita de sangue venoso e está disponível um grande volume de soro. Quando
uma amostra contém anticorpos, ocorre floculação com uma co-aglutinação de
partículas de carbono do antigénio do Cartão RPR, que aparecem como
aglomerações negras contra o fundo branco do cartão plastificado. Em
contrapartida, amostras não reactivas parecem ter uma cor cinzenta clara.
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• A suspensão de antigénio em Cartão RPR consiste num antigénio cardiolipina em
partícula de carbono que detecta “reagina”, uma substância semelhante a
anticorpo presente no soro ou plasma de indivíduos sifilíticos e ocasionalmente no
soro ou plasma de indivíduos com outras doenças agudas ou crónicas. A reagina
liga-se ao antigénio teste, que é constituído por partículas de colesterol revestidas
por cardiolipina-lecitina, originando floculação macroscópica.
• Não utilizar amostras hemolizadas, lipémicas ou contaminadas pois podem
interferir nos resultados.
• As amostras de soro ou plasma podem ser armazenadas por um período máximo
de 2 dias a temperaturas de 2-8ºC, ou congeladas a -20ºC até um mês.
• O método consiste em aplicar uma gota de soro do doente no cartão à qual se vai
adionar uma gota de antigénio. Posteriormente, homogeneiza-se as 2 gotas.
Depois agitamos suavemente o cartão durante 3 minuto, observando a formação
de aglutinação sob uma luz forte passados os 3 minutos.
• Apresentação do resultado:
- Resultado Positivo é indicação pela presença de aglutinação.
- Resultado Negativo é indicado pela ausência de aglutinação.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 82 Andreia Delgado Crisóstomo
1.4- Imunologia
A imunologia é uma valência importante num Laboratório de Análises Clínicas
pois trata da imunidade que não é mais que um conjunto de mecanismos através dos
quais o organismo é capaz de responder a antigénios, sem ou com lesão dos seus próprios
constituintes e, em que o desvio dos padrões normais da resposta imunitária, em
intensidade ou no objectivo, traduz-se por situações do domínio da imunopatologia. Há
dois tipos de imunidade, a inata caracterizada como uma resposta inespecífica e a
adaptativa, caracterizada como uma resposta específica para determinado antigénio.
Como componentes da resposta inata temos os fagócitos, as células NK, as citocinas e o
complemento, enquanto que, na resposta adaptativa temos os linfócitos, os anticorpos e
os órgão linfóides. A resposta inata tem como características a resposta rápida, ausência
de especificidade, expontânea, enquanto que a resposta adaptativa é caracterizada pelo
tempo de resposta, a especificidade, o reconhecimento e a memória.
Nesta valência são utilizados 2 aparelhos, o CENTAUR® XP e o ImmunoCAP
250, que vão permitir a determinação dos mais variados parâmetros, desde função
hormonal, a parâmetros de autoimunidade e alergias.
1.4.1- CENTAUR® XP
O ADVIA CENTAUR® XP (Figura 6) é
o aparelho usado para estudar: a função adrenal,
a fertilidade, as doenças infecciosas, os
marcadores tumorais e a função tiróideia.
O aparelho trata-se de um analisador
automático que utiliza como tecnologia a
quimioluminescência, pois mede a quantidade
de luz emitida durante a reacção
quimioluminescente desencadeada pela
Figura 6- Aparelho automático (ADVIA
CENTAUR® XP) para análise de soros/plasma
humanos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 83 Andreia Delgado Crisóstomo
alteração de pH devida à adição de um ácido e uma base na fase final da reacção.
Os ensaios utilizam a tecnologia de ligação competitiva, sandwich e captura de
anticorpo, com éster de acridínio (EA) como marcador e partículas paramagnéticas
(PMP) como fase sólida. A reacção de sandwich ocorre quando anticorpos ligados ao EA
adicionam-se à amostra, unindo-se ao analito (antigénio) que queremos medir,
posteriormente, adicionam-se as PMP unidas a anticorpos e incubamos. As PMP unem-se
aos complexos antigénio-anticorpo marcados com EA anteriormente formados, sendo que
o EA não ligado é separado e aspirado. O ácido e a base são adicionados para iniciar a
reacção quimioluminescente, que a seguir permite o cálculo da concentração de amostra,
obtendo-se o gráfico seguinte (Figura 7).
Figura 7- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em relação à concentração de
amostra para uma reacção de sandwich.
Em relação às reacções de competição estas podem apresentar duas variantes, ou é
o antigénio que se encontra marcado ou é o anticorpo. No caso de ser o antigénio
marcado o que acontece é o seguinte: o antigénio marcado com EA compete com o
antigénio da amostra por uma quantidade limitada de sítios de ligação ao anticorpo, o
qual está unido covalentemente a PMP, depois de incubar, a mistura de reacção é exposta
a um campo magnético e o EA não ligado é separado e retirado. O ácido e a base são
adicionados para iniciar a reacção quimioluminescente, que a seguir permite o cálculo da
concentração de amostra, obtendo-se o gráfico seguinte (Figura 7). Quando é o anticorpo
que está marcado dá-se o seuinte: o anticorpo unido a PMP compete com antigénio da
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 84 Andreia Delgado Crisóstomo
amostra por sítios limitados de ligação no anticorpo marcado com EA, após a incubação,
a mistura de reacção é exposta a um campo magnético e o EA não ligado é separado e
retirado. O ácido e a base são adicionados para iniciar a reacção quimioluminescente, que
a seguir permiote o cálculo da concentração de amostra, obtendo-se o gráfico seguinte
(Figura 8).
Figura 8- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em relação à concentração da
amostra para uma reacção de competição, seja ela de anticorpo marcado ou de antigénio
marcado.
Por última, temos a captura de anticorpo que só é utilizado quando o analito que
queremos medir é um anticorpo, usando para isso um anticorpo especificamente dirigido
ao analito (anticorpo) da amostra. A técnica consiste em adicionar à amostra, PMP unidas
a um anticorpo específico de IgM humana (anticorpo anti-IgM humana) que vão separar
o anticorpo da amostra das outras substâncias que possam interferir. Seguidamente,
adiciona-se o antigénio marcado com EA, que tem afinidade para os anticorpos da
amostra e tudo o que não se liga fica separado. A concentração tem uma relação directa
com a emissão de luz, obtendo-se o seguinte gráfico (Figura 9).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 85 Andreia Delgado Crisóstomo
Figura 9- Representação gráfica da luz emitida (RLUs) em relação à concentração de
analito para uma reacção de captura de anticorpo.
1.4.1.1- Testes para a Função Adrenal
Cortisol
• Indicado para uso em diagnóstico in vitro na determinação quantitativa de cortisol
no soro ou urina.
• O cortisol é uma hormona glicocorticóide primária sintetizada e secretada pelo
córtex adrenal sob controlo por parte da ACTH. Esta hormona é essencial para a
vida pois regula os hidratos de carbono, proteínas e o metabolismo dos lípidos,
mantendo a pressão senguínea normal e inibindo reacções alérgicas e
inflamatórias.
• Níveis circulantes deste parâmetro seguem um ciclo diurno em indivíduos
saudáveis. O decréscimo destes níveis são induzidos pela insuficiência adrenal
primária, que leva à Doença de Addison devido a erros metabólicos ou à
destruição do córtex adrenal, e secundária que é causada pela destruição ou
falência da pituitária, resultando na perda do estímulo da ACTH pela glândula
adrenal. O Síndrome de Cushing deve-se ao aumento dos níveis de cortisol devido
a hiperfunção adrenal primária (tumores) ou secundária (superprodução de ACTH
pela pituitária). Os aumentos dos níveis são também devidos à gravidez e ao
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 86 Andreia Delgado Crisóstomo
stresse devido à depressão, trauma, procedimento cirúrgico, hipoglicémia,
alcoolismo, diabetes não controlada.
• A quantificação de cortisol urinário por 24h é o método preferido no teste inicial
para a detecção da Doença de Cushing porque o mesmo fornece a melhor análise
da produção de cortisol. O cortisol urinário não está sujeito ao ciclo diário de
secreção e diferencia correctamente indivíduos saudáveis daqueles com Síndrome
de Cushing.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 20µL de soro
ou urina.
1.4.1.2- Testes para a Fertilização
Hormona Estimulante do Folículo (FSH)
• Usado no diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da hormona
estimulante do folículo (FSH) no soro.
• A FSH é uma hormona glicoproteica com duas subunidades, uma α e uma β,
sendo que a primeira é semelhantes à hormona luteínizante (LH), da
gonadotropina coriónica humana (HCG) e da hormona estimulante da tiróide
(TSH). A subunidade β é diferente em comparação com as outras hormonas
glicoproteicas e confere a sua própria especificidade bioquímica.
• A FSH é secretada pela pituitária anterior como resposta à hormona libertadora de
gonadotropina (GnRH) secretada pelo hipotálamo. Tanto nos homens como nas
mulheres, a secreção de FSH é regulada por um equilíbrio dos mecanismos de
feedback positivo e negativo, em que estão envolvidos o eixo hipotálamo-
pituitária, os órgãos sexuais e as hormonas esteróides sexuais e pituitárias.
• A FSH e a LH desempenham um papel crítico na manutenção da função normal
dos sistemas reprodutores masculino e feminino.
• Nas mulheres, a FSH tem como tecido-alvo os folículos ováricos onde vai
estimular o desenvolvimento de folículos e a produção de estradiol e de outos
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 87 Andreia Delgado Crisóstomo
estrogénios durante a fase folicular do ciclo menstrual, actuando também em
sinergismo com a LH para provocar a ovulação.
• Nos homens, a FSH tem como tecido-alvo as células de Sertoli nos túbulos
seminíferos dos testículos onde vai estimular a espermatogênese.
• Níveis aumentados de FSH estão associados à menopausa e à hipofunção ovárica
primária nas mulheres e ao hipogonadismo primário nos homens. Níveis
diminuídos de FSH estão associados à hiperfunção ovárica primária nas mulheres
e ao hipergonadismo primário nos homens. Níveis normais ou diminuídos estão
associados, por seu lado, à doença dos ovários poliquísticos nas mulheres.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 100µL de
soro.
• Os valores de referência para este parâmetro estão apresentados no Tabela (Tabela
4) abaixo.
Tabela 4- Valores de Referência para Homens dos 13 aos 70 anos e Mulheres
menstruadas normalmente, grávidas ou em pós-menopausa.
Mulheres
Menstruadas
normalmente
Fase folicular 2,5 – 10,2 UI/L
Pico do ciclo 3,4 – 33,4 UI/L
Fase luteínica 1,5 – 9,1 UI/L
Grávidas <0,3 UI/L
Pós-menopausa 23,0 – 116,3 UI/L
Homens 13-70 anos 1,4 – 18,1 UI/L
Hormona Luteinizante (LH)
• Usado no diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa da hormona
luteínizante (LH) no soro.
• A LH é uma hormona constituída por duas subunidades, uma α e uma β, sendo
que a primeira é semelhantes à hormona estimulante do folículo (FSH), da
gonadotropina coriónica humana (HCG) e da hormona estimulante da tiróide
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 88 Andreia Delgado Crisóstomo
(TSH). A subunidade β é diferente em comparação com as outras hormonas
glicoproteicas e confere a sua prórpia especificidade bioquímica.
• A LH é secretada pela pituitária anterior como resposta à hormona libertadora de
gonadotropina (GnRH) secretada pelo hipotálamo. Nos homens, a LH é também
denominada como hormona estimulante das células intersticiais (ICSH). Tanto
nos homens como nas mulheres, a secreção de LH é regulada por um equilíbrio
dos mecanismos de feedback positivo e negativo, em que estão envolvidos o eixo
hipotálamo-pituitária, os órgãos sexuais e as hormonas esteróides sexuais e
pituitárias.
• A LH e a FSH desempenham um papel crítico na manutenção da função normal
dos sistemas reprodutores masculino e feminino.
• Nas mulheres, a LH tem como tecido-alvo as células da Teca dos folículos
ováricos pois vai estimular a produção de androgéneos que o FSH converte em
estradiol durante a fase folicular; o folículo De Graaf visto que actua em
sinergismo com o FSH para provocar a ovulação durante o pico do ciclo; o corpo
lúteo porque vai estimular tanto a formação do corpo lúteo após a ovulação com
a secreção de progesterona durante a fase luteínica.
• Nos homens, a LH tem como tecido-alvo as as células de Leydig no tecido
intersticial dos testículos.
• Níveis aumentados de LH estão associados à menopausa e à hipofunção ovárica
primária nas mulheres e ao hipogonadismo primário nos homens. Níveis
diminuídos de LH estão associados à hiperfunção ovárica primária nas mulheres e
ao hipergonadismo primário nos homens. Níveis normais ou diminuídos estão
associados, por seu lado, à doença dos ovários poliquísticos nas mulheres.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 50µL de soro.
• Os valores de referência para este parâmetro estão apresentados na Tabela 5.
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Tabela 5- Valores de Referência para Homens dos 20 aos 70 anos e os maiores de 70
anos, para Mulheres menstruadas normalmente, grávidas, em pós-menopausa ou que
usem métodos contraceptivos e ainda para Crianças.
Mulheres
Menstruadas
normalmente
Fase folicular 1,9 – 12,5 UI/L
Pico do ciclo 8,7 – 76,3 UI/L
Fase luteínica 0,5 – 16,9 UI/L
Grávidas <0,1 – 1,5 UI/L
Pós-menopausa 15,9 – 54,0 UI/L
Usando mét. contraceptivos 0,7 – 5,6 UI/L
Homens 20-70 anos 1,5 – 9,3 UI/L
>70 anos 3,1 – 34,6 UI/L
Crianças <0,1 – 6,0 UI/L
Progesterona
• Usado para o diagnóstico in vitro na determinação quantitativa de progesterona no
soro.
• A progesterona, juntamente com os estrogéneos, regula as funções do tracto
reprodutivo durante o ciclo menstrual. Esta é essencial na preparação do
endométrio para a implantação do blastocisto e para a sustentação da gravidez.
• As fontes principais de progesterona na mulher são o corpo lúteo e a placenta.
Também ser encontrada no córtex adrenal tanto das mulheres como dos homens e
nos testículos dos mesmos.
• Os níveis baixos de progesterona acontecem durante a fase folicular do ciclo
menstrual. Após a ovulação, a produção de progesterona pelo corpo lúteo aumenta
rapidamente, atingindo uma concentração máxima de 4 a 7 dias após a dita
ovulação. Esses níveis são mantidos durante 4 a 6 dias, quando os mesmos
decaem a níveis básicos, induzindo a mesntruação. Durante a gravidez, os níveis
de progesterona elevam-se constantemente até atingir o seu nível máximo no 3º
trimestre.
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• A avaliação clínica da progesterona confirma as funções normais do ovário e
lúteas em mulheres não grávidas.
• A produção inadequada de progesterona pelo corpo lúteo pode indicar uma
deficiência da fase luteínica (LPD), que está associada com infertilidade e aborto
espontâneo precoce.
• Mulheres que estejam a tomar anticoncepcionais orais apresentam níveis de
progesterona suprimidos.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 20µL de soro.
• Os valores de referência para este parâmetro estão apresentados na Tabela 6.
Tabela 6- Valores de Referência para Homens e para Mulheres menstruadas
normalmente, em pós-menopausa ou gestantes.
Mulheres
Menstruadas
normalmente
Fase folicular 0,15 – 1,40 ng/mL
Pico do ciclo 4,44 – 28,03 ng/mL
Fase luteínica 3,34 – 25,56 ng/mL
Pós-menopausa ND* – 0,73 ng/mL
Gestantes
1º Trimestre 11,22 – 90,00 ng/mL
2º Trimestre 25,55 – 89,40 ng/mL
3º Trimestre 48,40 – 422,50 ng/mL
Homens 0,28 – 1,22 ng/mL
*ND: Não Detectável
Prolactina
• Usado para o diagnóstico in vitro na determinação quantitativa de prolactina no
soro.
• A prolactina é uma hormona polipeptídica secretada pela pituitária anterior sob o
controlo de factores inibidores e libertadores de prolactina que são secretados pelo
hipotálamo. A prolactina é também sintetizada pela placenta e está presente no
líquido amniótico.
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• A prolactina inicia e mantém a lactação nas mulheres. Esta também está
envolvida na regulação da função gonadal em homens e mulheres. Durante a
gravidez e a lactação pós-parto, a prolactina sérica pode aumentar de 10 a 20
vezes, podendo o exercício, o stresse e o sono causar também aumentos
transitórios nos níveis de prolactina.
• Níveis consistentemente elevados na ausência de gravidez e lactação pós-parto
são indicativos de hiperprolactinémia (resulta em galactorreia, amenorreia e
infertilidade em mulheres, e em impotência e hipogonadismo em homens), que é a
disfunção hipotalâmica-pituitária mais comum encontrada no campo da
endocrinologia clínica. Falência renal, hipotiroidismo e adenomas pituitários
secretores de prolactina também são causas comuns de níveis elevados anormais
de prolactina.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 25µL de soro.
• Os valores de referência para este parâmetro estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7- Valores de Referência para homens e para mulheres não grávidas, grávidas ou
em pós-menopausa.
Mulheres
Não grávidas 2,8 – 29,2 ng/mL
Grávidas 9,7 – 208,5 ng/mL
Pós-menopausa 1,8 – 20,3 ng/mL
Homens 2,1 – 17,7 ng/mL
Estradiol
• Usado no diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de estradiol no
soro.
• A medição dos níveis circulantes de estradiol é importante para a avaliação da
função ovárica e na monitorização do desenvolvimento folicular para protocolos
de reprodução assistida.
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• Em mulheres normais, em estado não gestacional, o estradiol é secretado
principalmente pela função combinada das células tecais e granulosas do folículo
em desenvolvimento e do corpo lúteo. Durante a gravidez, a placenta torna-se
fonte de secreção de estradiol.
• O estradiol entra na circulação na forma de: 1-3% não ligado à proteína, 40% está
ligado às globulinas ligantes das hormonas sexuais (SHBG) e a restante
percentagem encontra-se ligada à albumina.
• O estradiol tem como função principal o estímulo para o crescimento dos órgãos
sexuais femininos e o desenvolvimento das características sexuais secundárias, daí
ter um papel tão importante no ciclo menstrual humano.
• Níveis elevados de estradiol em mulheres podem resultar da hiperfunção ovárica
primária ou secundária. Níveis extremamente altos são encontrados durante a
indução da ovulação na terapia de reprodução assistida ou durante a gravidez.
Níveis baixos em mulheres podem resultar de uma redução da síntese a nível dos
ovários (hipofunção ovárica primária e menopausa) ou de uma lesão no eixo
hipotálamo-pituitária (hipofunção ovárica secundária). Os níveis de estradiol são
normalmente baixos em homens, e quando estes os têm aumentados podem ser
devidos à aromatização aumentada de androgéneos, resultando em ginecomastia.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 75µL de soro
ou urina.
• Os valores de referência para este parâmetro estão apresentados na Tabela 8.
Tabela 8- Valores de Referência para homens e para mulheres menstruadas normalmente
ou em pós-menopausa.
Mulheres
Menstruadas
normalmente
Fase folicular 18,9 – 246,7 pg/mL
Pico do ciclo 35,5 – 570,8 pg/mL
Fase luteínica 22,4 – 156,0 pg/mL
Pós-menopausa ND* - 44,5 pg/mL
Homens 13-70 anos
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*ND: Não Detectável
1.4.1.3- Testes para a Doenças Infecciosas
Antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg)
• É um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa do
antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg) no soro ou plasma (com EDTA ou
heparinizado).
• O ensaio pode ser utilizado em conjunto com outras informações serologicas e
clínicas para diagnosticar indivíduos com hepatite B aguda ou crónica. Também
pode ser usado no rastreio da infecção pela hepatite em mulheres grávidas, para
identificar os recém-nascidos em risco de adquirir hepatite B durante o período
perinatal.
• O vírus da Hepatite B (VHB) é endémico em todo o mundo e é a principal causa
da doença hepática. As principais formas de transmissão incluem: transfusões
sanguíneas, uso de agulhas, contacto directo com ferimentos, contacto sexual e o
contacto mãe-neonato durante o parto. O período de incubação médio da infecção
provocado pelo VHB é de 6-8 semanas e os sintomas clínicos mais comuns
incluem: mal-estar, febre, gastroenterite e icterícia. A infecção pelo VHB pode
resultar em hepatite ictérica típica, hepatite fulminante ou hepatite crónica ou
persistente.
• Nos adultos, 90-95% dos doentes com infecção pelo VHB recuperam
completamente da doença aguda e o vírus desaparece, nos restantes 5-10% dos
doentes tornam-se portadores crónicos.
• Os recém-nascidos infectados com VHB têm uma grande probabilidade (90%) de
desenvolverem hepatite B crónica.
• A infecção pelo VHB, especialmente em casos de infecção crónica, está
claramente associada ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 94 Andreia Delgado Crisóstomo
• O HBsAg é um marcador serológico distintivo da Hepatite B aguda ou crónica,
sendo o primeiro antigénio a aparecer após a infecção com o VHB que é
geralmente detectado entre 1-10 semanas antes do início dos sintomas clínicos.
• Os ensaios HBsAg são regularmente utilizados para diagnosticar infecções pelo
VHB e para monitorizar o estado dos indivíduos infectados, com o intuito de
determinar se a infecção desapareceu ou se o doente se tornou num portador
crónico do vírus.
• Nos doentes que recuperam da infecção pelo VHB, os níveis de HBsAg
desaparecem entre 3-5 meses após o início da infecção. Nos doentes com infecção
crónica pelo VHB, os níveis do HBsAg são detectáveis durante toda a vida.
• Os ensaios HBsAg são também utilizados para avaliação da eficácia de fármacos
antivíricos através da monitorização dos níveis de HBsAg no soro ou plasma do
doente.
• O rastreio pré-natal do HBsAg tem sido recomendado para que os recém-nascido
de mães portadores do VHB possam obter tratamento profilático.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 100µL de soro
ou plama (com EDTA ou heparinizado).
Anticorpos totais do Antigénio de superfície da Hepatite B (aHBs2)
• É um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa e
quantitativa de anticorpos totais do antigénio de superfície da Hepatite B no soro
ou plasma (com EDTA ou heparinizado).
• Os resultados do ensaio podem ser utilizados como um meio auxiliar na
determinação da susceptibilidade à infecção pelo VHB em indivíduos antes ou
após a vacinação contra o VHB ou no caso de o estado de vacinação ser
desconhecido. Os mesmos resultados também poderão ser utilizados com outros
marcadores serológicos do VHB para o diagnóstico laboratorial da doença
associada à infecção pelo VHB. Um resultado reactivo irá permita um
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 95 Andreia Delgado Crisóstomo
diagnóstico diferencial em indivíduos que apresentem sinais e sintomas de
hepatite cuja etiologia seja desconhecida.
• A presença do anticorpo do antigénio de superfície da hepatite B (aHBs) é
utilizado para determinar o estado imunitário relativamente ao VHB ou a
progressão da doença em indivíduos infectados pelo VHB.
• Um aumento nos níveis de aHBs, juntamente com a perda de HBsAg detectável
em circulação, denota a convalescência nas infecções de hepatite B.
• Os níveis de aHBs podem ser medidos para determinar se é necessária a
vacinação ou, após um regime de vacinação, para determinar se a imunidade
protectora foi alcançada.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 100µL de soro
ou plama (com EDTA ou heparinizado).
Anticorpos totais para o Antigénio central do virus da Hepatite B (HBcT)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa de anticorpos
totais para o antigénio central do VHB no soro humano ou plasma com EDTA.
• O antigénio central da hepatite B (HBcAg), encontrado em células hepáticas, não
circula no sistema vascular. Contudo, os anticorpos IgM e IgG para o HBcAg
podem ser detectados serologicamente em indivíduos infectados pelo VHB. O
aHBc IgM é o primeiro a ser detectado e permanece assim durante
aproximadamente 6 meses. Pouco tempo após a resposta do IgM, o aHBc IgG
aparece e pode permanecer detectável indefinidamente. A presença de aHBc IgM
é característica da infecção aguda, enquanto que a presença de aHBc IgG é
característica de estados crónicos ou de recuperação da infecção pelo VHB.
• Os ensaios HBc total detectam as respostas do IgM e IgG aHBc. Frequentemente,
os níveis de aHBc irão coincidir com os níveis detectáveis de outros marcadores
do VHB. Raramente, o aHBc pode constituir o único marcador do VHB
detectável. Isto pode acontecer durante um curto período em que o HBsAg foi
eliminado do sistema vascular e por isso os anticorpos para o HBsAg tornaram-se
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 96 Andreia Delgado Crisóstomo
detectáceis. Por este motivo, não se recomenda a utilização de ensaios aHBc total
para detectar infecções agudas, estes devem sim, ser usados em conjunto com
outros ensaios de marcadores para avaliar a exposição actual ou anterior ao VHB.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 50µL de soro
ou plama (com EDTA).
Antigénio e da Hepatite B (HBeAg)
• É um imunoensaio para diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa do
HbeAg no soro e plasma humanos. Quando em combinação com outros ensaios
de marcadores do vírus da hepatite B (VHB) para definir o estado clínico dos
doentes infectados pelo mesmo.
• A detecção do HbeAg no soro e no plasma é um indicador de infecção activa e
vírus em replicação. O desaparecimento do HbeAg e o aparecimento do anti-HBe,
em conjunto com outros marcadores do VHB, permitem ao clínico determinar um
prognóstico e acompanhar a progressão da doença, do estado agudo ao crónico ou
ao estado recuperado, bem como monitorizar a terapia antiviral.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 100µL de soro
ou plama (com EDTA ou heparinizado).
Anticorpo do Antigénio e da Hepatite B (aHBe)
• É um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa da
resposta dos anticorpos ao antigénio e do VHB no soro e plasma humanos.
• O aHBe aparece pouco tempo depois do fim da fase aguda da infecção pelo VHB
e está presente à medida que o doente vai recuperando ou se vai tornando um
portador crónico, mas ao terminar a recuperação da infecção, o anticorpo já não
está presente.
• Embora, o aHBe possa estar presente com o HBsAg em portadores crónicos, a
presença de aHBe e na ausência de HBsAg contitui uma indicação de recuperação
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 97 Andreia Delgado Crisóstomo
precoce ou contínua. O aparecimento do aHBe é indicador da eficácia do
tratamento no caso de portadores crónicos do VHB sujeitos a tramento antivirais.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 100µL de soro
ou plama (com EDTA ou heparinizado).
Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1, incluindo subtipo O e/ou tipo 2 (EHIV)
• O ensaio HIV 1/O/2 Enhanced é um imunoensaio para o diagnóstico in vitro
utilizado na determinação qualitativa de anticorpos contra o vírus da
imunodeficiência humana tipo 1, incluindo o grupo O e/ou o tipo 2, no soro ou
plasma (heparinizado ou com EDTA).
• O vírus da imunodeficiência humana é o agente causador do síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA). Esta última foi descrita pela primeira vez nos
Estado Unidos, em 1981, e tornou-se uma das principais causas de morte em todo
o mundo.
• O vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV 1) foi identificado como a
causa principal do síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA). Este
retrovírus, pertencente à subfamília dos Lentivírus, é disseminado por contacto
sexual, exposição a sangue ou produtos de sangue infectados e transmissão
perinatal.
• Em 1986, foi isolado o vírus da imunodeficiência humana do tipo 2 (HIV 2) de
pacientes com SIDA na África Ocidental. Estes vírus partilham epítopos das
proteínas do núcleo mas exibem pouca ou nenhuma reactividade cruzada entre as
glicoproteínas do envelope.
• As vias de transmissão do HIV 1 e do HIV 2 são as mesmas. Mas nas infecções
pelo HIV 2, as taxas de transmissão e de replicação viral são inferiores. Estudos
demonstram que as infecções por HIV 2 progridem de maneira mais lenta pois a
taxa de declínio das células CD4 T é mais lenta e a virémia é menor, que no cado
das infecções por HIV 1. Sendo por isso que indivíduos com HIV 2 têm um
resultado clínico melhor.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 98 Andreia Delgado Crisóstomo
• O ensaio usa antigénios recombinantes derivados de levedura correspondentes às
proteínas nucleares e envelope viral, sendo elas, uma proteína do envelope do
HIV 1, uma proteína nuclear do HIV 1 e outra do envelope do HIV 2. Um péptido
sintético é adicionado para a detecção de anticorpos contra o HIV 1 do grupo O.
• A finalidade principal do ensaio é auxiliar no diagnóstico da infecção pelo HIV e
da SIDA. As amostras que forem inicialmente reactivas devem ser testadas
novamente (pelo mesmo ensaio e/ou por Western-blot para HIV 1). A
reactividade repetida é altamente indicativa da presença de anticorpos contra o
HIV 1 e/ou HIV 2 em pessoas com risco de infecção por HIV.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 50µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
Anticorpos IgG para o vírus da Hepatite C (HCV)
• É um teste de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa de anticorpo
IgG para o vírus da Hepatite C (VHC) no soro humano ou plasma com EDTA ou
com heparina.
• O ensaio deve ser usado em conjunto com outros ensaios serológicos e
informação clínica para o diagnóstico de indivíduos com sintomas de Hepatite e
indivíduos com risco de terem infecções pelo VHC.
• O VHC é o maior agente etiológico da Hepatite crónica, não-A, não-B. A
presença de anticorpos para o VHC indica que o indivíduo pode ter sido infectado
com VHC ou pode ser capaz de transmitir a mesma infecção.
• A infecção pelo VHC é muitas vezes assintomática, embora a maioria dos
indivíduos expostos ao VHC desenvolvam infecções crónicas. Em 20% destes
casos, a doença pode propagar para cirrose, falhar renal e carcinoma
hepatocelular.
• As vias de transmissão do VHC incluem transfusões sanguíneas, técnicas de
reprodução assistida, transmissão mãe-bebé durante a gravidez, parto e período
pós-parto.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 99 Andreia Delgado Crisóstomo
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 10µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
Anticorpos IgM para o vírus da Hepatite A (HAV IgM)
• É um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a determinação qualitativa da
resposta de IgM ao vírus da Hepatite A (HAV) no soro ou plasma humanos.
• Este ensaio deve ser utilizado como uma ajuda no diagnóstico de infecção aguda
ou recente (normalmente 6 meses ou menos) pelo HAV.
• A Hepatite A é causada pela infecção com o HAV, sendo este um vírus de RNA,
sem envelope, de cadeia simples que é classificado como um Picornavírus. A
transmissão da Hepatite A é feita via fecal-oral e a infecção ocorre principalmente
devido à ingestão de alimentos contaminados ou a fracas condições sanitárias.
• O HAV é replicado no fígado, excretado pela bílis e transportado nas fezes. O seu
período médio de incubação para a infecção é de 30 dias com intervalo de 15-40
dias.
• Os sintomas duram aproximadamente 2 semanas e incluem hepatomegália,
icterícia, urina escura, fadiga e perturbações gastrointestinais, designadamente
anorexia, náuseas, vómitos e dores abdominais.
• O anticorpo para o HAV é detectado após o aparecimento dos sintomas
resultantes da infecção pelo HAV. A resposta precoce do anticorpo inclui de
forma substancial a subclasse do anticorpo IgM, o qual é detectado normalmente
durante 3-6 meses após os sintomas da doença, apesar do anti-HAV IgG poder
persistir indefinidamente. Devido à produção transitória do anti-HAV IgM, a sua
presença no soro indica a existência de uma infecção ou infecção recente e é o
marcador serológico mais útil para o diagnóstico da infecção aguda pelo HAV.
• Uma vez que as infecções virais sintomáticas pela hepatite A podem ser
clinicamente iguais às infecções virais pela Hepatite B ou C, o teste serológico é
importante para um diagnóstico correcto.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 100 Andreia Delgado Crisóstomo
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 20µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
Rubéola IgG/M
• Usado no diagnóstico in vitro para a detecção quantitativa e qualitativa de
anticorpos IgG/M contra o vírus da Rubéola em soro ou plasma (heparinizado ou
com EDTA).
• A Rubéola é um membro da família Togaviridae.
• As infecções primárias causadas por este vírus são geralmente leves, com
sintomas como febre baixa, leve “rash” e linfodenopatia. Em contraste, as
infecções primárias durante o período de gestação podem passar para o feto
através da placenta podendo levar à morte do mesmo ou ao Síndrome de Rubéola
Congénita (CRS). O risco fetal é mais alto durante o 1º trimestre de gestação. Os
bebés nascidos com CRS exibem baixo peso ao nascer, surdez, anomalias visuais,
retardamento mental e anomalias cardíacas.
• Uma infecção primária induz a uma resposta da IgM e da IgI. Dentro de 4 a 6
meses, os níveis de IgM tornam-se não detectáveis ou muito baixos enquanto que
a IgG atinge níveis baixos mas o seu efeito prolonga-se indefinidamente e oferece
imunidade durante toda a vida. Uma infecção secundária exibe um anticorpo IgG
crescente sem níveis significativos de IgM.
• Só há um serotipo de vírus da Rubéola na população. Desde a introdução da
vacina contra a mesma, a incidência de CRS caiu drasticamente. Entretanto, casos
de Rubéola ainda ocorrem e representam um risco potencial para mulheres em
idade reprodutiva. A imunidade proveniente da vacina persiste por mais de 16
anos.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 10µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 101 Andreia Delgado Crisóstomo
Toxoplasma IgG/M
• Este teste é indicado para a detecção quantitativa de anticorpos IgG/M contra
Toxoplasma gondii em soro ou plasma (heparinizado cou com EDTA).
• O Toxoplasma gondii é um protozoário parasita intracelular que afecta aves e
mamíferos, tendo gatos como seus principais hospedeiros. A infecção é propagada
pela ingestão de carne crua ou mal cozida contendo quistos ou através do contacto
com fezes de gato infestadas com oocistos. A prevalência do Toxoplasma gondii
pode variar consideravelmente de acordo com a localização geográfica e a idade.
• Em indivíduos imunocompetentes saudáveis, as infecções são geralmente
assintomáticas ou subclínicas. Se a Toxoplasmose for diagnosticada durante os
estágios iniciais da infecção, a doença pode ser tratada de maneira eficaz com
terapia antibiótica.
• Em grávidas, a infecção por Toxoplasma gondii representa uma ameaça ao feto
pois o risco de transmissão mãe-feto é aproximadamente 25% no primeiro
trimestre e aumenta até aproximadamente 65% no terceiro trimestre. Quanto mais
cedo na gestação a mãe for infectada, maior será a gravidade potencial de
Toxoplasmose Congénita.
• Em populações imunosuprimidas, como pacientes com cancro que estão a fazer
quimioterapia, pacientes transplantados e pacientes com HIV, o Toxoplasma
gondii torna-se num patogéneo oportunista importante que leva a cabo infecções
graves ou fatais.
• O uso destes testes de IgG contra Toxoplasma gondiii mostrou-se um método
confiável para estabelecer o status imunitário e avaliar a susceptibilidade à
infecção por Toxoplasma gondii. A presença de anticorpos IgG indica que o
indivíduo foi infectado com Toxoplasma gondii no passado, mas o nível de
reactividade não indica quando ocorreu a infecção. Na maioria dos pacientes com
HIV, a resposta do IgG à infecção primária de Toxoplasma gondii geralmente não
apresenta um aumento significativo nas titulações de IgG.
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 102 Andreia Delgado Crisóstomo
• Os testes de IgM contra Toxoplasma gondii são usados em conjunto com
informações clínicas no diagnóstico da infecção pelo parasita. Em pacientes
infectados pelo mesmo, o anticorpo IgM aumenta durante a fase aguda da
infecção, porém pode permanecer presente por vários meses. Um resultado
positivo para IgM supõe uma infecção actual ou recente.
• O volume de amostra necessária para a realização desta técnica são 10µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
1.4.1.4- Testes para Marcadores Tumorais
CA 15-3
• Este teste é um ensaio in vitro para a quantificação seriada do antigénio marcador
de cancro CA 15-3 em soro humano. A execução seriada do teste CA 15-3,
quando aplicada em conjunto com outros procedimentos clínicos e diagnósticos, é
útil na monitorização do decurso da doença e da terapia de pacientes com cancro
da mama metástico. Também é útil para a detecção de recorrência em pacientes
previamente tratados para cancro da mama em estadio II, com mais de 2 nódulos
linfáticos positivos, ou em estadio III.
• CA 15-3 é uma glicoproteína polimórfica e é produto do gene MUC-1.
• As quantificações seriadas de CA 15-3 são particularmente úteis para monitorizar
tanto o decurso da doença como a resposta à terapia devido à correlação directa
entre as alterações nos níveis de CA 15-3 e o estado clínico.
• Em pacientes com metástases conhecidas, uma redução dos níveis deste marcador
indica uma resposta favorável ao tratamento, enquanto que um aumento dos
níveis indica resistência à terapia e progressão da doença, justificando uma
avaliação clínica mais profunda e monitorização mais regular.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 20µL de soro.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 103 Andreia Delgado Crisóstomo
CA 19-9
• Este teste é um ensaio in vitro para a quantitativa em série de CA 19-9 em soro
humano e para auxilar no tratamento de pacientes com carcinoma gastro-intestinal
(GI).
• O CA 19-9 é um antigénio associado a tumor que reage com um anticorpo
produzido em resposta à imunização com uma linhagem de células do cancro do
cólon humano. Embora, alguns testes demonstrem que este marcador é mais útil
no diagnóstico e no tratamento de pacientes com neoplasia pancreática, pois foi
demonstrado que é mais sensível e específico que outros marcadores serológicos,
do que com a neoplasia do cólon.
• Este marcador é encontrado em níveis mínimos em indivíduos saudáveis ou com
distúrbios benignos. Níveis elevados são característicos de pacientes com cancro
do pâncreas.
• O possível sucesso da regreção pancreática e o prognóstico após a cirúrgia podem
ser avaliados utilizando os níveis séricos do CA 19-9, e quando usados em série
podem servir de prognóstico sobre a recorrência da doença antes de qualquer
indício nos achados radiográficos ou clínicos.
• O CA 19-9 também detecta, com menor frequência, cancro do ducto biliar,
hepatocelular, gástrico, do cólon, do esófago e cancro não gastro-intestinal.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 75µL de soro.
CA 125 II
• Este teste é um ensaio in vitro para quantificação em série de CA 125 em soro
humano e para auxiliar no tratamento de pacientes com cancro do ovário.
• O CA 125 é uma glicoproteína, sendo também um antigénio de superfície
associado ao cancro do ovário epitelial não mucinoso. A proteína é eliminada ou
secretada pela superfície das células cancerosas do ovário nos soro.
• Trata-se de um marcador tumoral útil na avaliação da terapia e monitorização do
status da doença em pacientes sob tratamento. No pós-operatório, o nível de CA
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 104 Andreia Delgado Crisóstomo
125 correlaciona-se com o tamanho do tumor e é um indicador prognóstico do
resultado clínico.
• Os níveis deste marcador medidos em série correspondem à progressão ou
regressão da doença. A rápida dimunição do nível deste indica uma resposta
positiva ao tratamento. Níveis elevados do mesmo após o 3º ciclo de
quimioterapia primária são preditivos de um resultado insatisfatório.
• Pacientes com determinadas condições benignas, tais como cirrose hepática,
pancreatite aguda, endometriose, doença inflamatória pélvica, menstruação e 1º
trimestre de gravidez, apresentam níveis elevados de CA 125.
• Como ferramenta de diagnóstico, o nível de CA 125 só por si não é suficiente
para determinar a presença ou a extensão da doença. Os níveis pré-operatórios de
CA 125 em pacientes com massas pélvicas malignas não oferecem informações
relativas ao grau histológico ou ao diâmetro da massa tumoral. Mas, no caso de
mulheres na pós-menopausa, o nível de CA 125 combinado com o exame de
ultra-sonografia pode permitir a distinção entre massas pélvicas benignas e
malignas.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 50µL de soro.
Antigénio Carcino-Embrionário (CEA)
• Ensaio usado para quantificação do antigénio carcino-embrionário (CEA) no soro
para auxiliar no tratamento de pacientes com cancro nos quais se observa
variações nas concentrações de CEA.
• O CEA é uma glicoproteína, e pertence ao grupo de marcadores tumorais
conhecidos como proteínas oncofetais.
• Níveis elevados de CEA sérico foram detectados em indivíduos com cancro colo-
rectal primário e em pacientes com outras doenças malignas incluindo cancro do
tracto GI, da mama, do pulmão, do ovário, da próstata, do fígado e do pâncreas.
Também são encontrados níveis elevados no soro de pacientes com doenças não
malignas, especialmente em pacientes idosos ou fumadores.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 105 Andreia Delgado Crisóstomo
• Os níveis de CEA fornecem informação importante sobre o prognóstico do
paciente, a recorrência de tumores após remoção cirúrgica e a eficácia da
terapêutica.
• Quanto aos níveis de CEA no soro são úteis na monitorização da progressão da
doença. Os níveis geralmente decaem para níveis normais ou próximos do normal
dentro de 1 a 4 meses após remoção cirúrgica do tecido cancerígeno. Um aumento
nos níveis deste marcador pode ser a primeira indicação de recorrência e pode
preceder sinais físicos e sintomas. Os níveis séricos de CEA são também úteis na
avaliação da eficácia da quimioterapia ou da radioterapia. Níveis constantemente
altos podem indicar que a terapia não está a surtir o efeito desejado ou uma
posível metástase.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 50µL de soro.
1.4.1.5- Testes para a Função Tiróideia
Triiodotironina (T3)
• Este ensaio deve ser utilizado no diagnóstico in vitro na determinação quantitativa
de triiodotironina (T3) no soro.
• A T3 é uma hormona que é produzida através da secreção e síntese directa da
tiróide (cerca de 20%) e da conversão periférica de T4 a T3 (cerca de 80%). A T3
é então secretada em resposta à hormona estimuladora da tiróide (TSH) e regulada
por um mecanismo de “feedback” negativo que envolve as glândulas tiroideia,
pituitária e o hipotálamo.
• Na cicrulação, 99,7% da T3 está ligada reversivelmente a proteínas de transporte,
principalmente à globina transportadora de tiroxina (TBG) e em menor
quantidade à albumina. A T3 não ligada ou livre é metabolicamente activo,
enquanto que a T3 ligada é metabolicamente inactivo, servindo pois, como uma
reserva para a T3 livre.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 106 Andreia Delgado Crisóstomo
• As concentrações de TBG permanecem relativamente constantes em indivíduos
saudáveis, mas a gestação, o excesso de estrogénios, androgénios, esteróides
anabólicos e glicocorticóides podem alteram os níveis das TBG resultando em
falsos valores nos testes para a função da tiróide. Os níveis de T3 nestas situações
pode não refletir o verdadeiro estado da tiróide.
• A disfunção primária da tiróide pode provocar uma libertação excessiva ou baixa
em relação ao normal, tanto de T3 como de T4, assim sendo, a ocorrência de
doenças em qualquer porção do sistema tiróide-pituitária-hipotálamo pode
influenciar os níveis de T3 e T4 no sangue.
• A concentração de T3 é mais sensível para certos Tabelas da tiróide que a T4.
Enquanto, os níveis de T4 são indicadores sensíveis (e superiores) de
hipotiroidismo, os níveis sanguíneos de T3 definem melhor o hipertiroidismo.
• A concentração de T3 no soro está sujeita a mudanças mais rápidas e marcantes
que a T4, o nível da primeira é também um excelente indicador da capacidade da
tiróide em responder a testes estimulatórios ou supressivos. Sob condições de
forte estímulo da tiróide, o nível de T3 também oferece uma boa estimativa da
reserva tiroidal.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 50µL de soro.
Tiroxina (T4)
• Este ensaio deve ser utilizado no diagnóstico in vitro na determinação quantitativa
de tiroxina (T4) no soro.
• A T4 é uma hormona sintetizada e secretada pela glândula tiroideia e possui uma
importante função na regulação do metabolismo. A T4 é regulada por um
mecanismo de “feedback” negativo que envolve as glândulas tiroideia, pituitária e
o hipotálamo.
• Na cicrulação, 99,95% da T4 está ligada reversivelmente a proteínas de
transporte, principalmente à globina transportadora de tiroxina (TBG) e em menor
quantidade à albumina. A T4 não ligada ou livre é metabolicamente activo,
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 107 Andreia Delgado Crisóstomo
enquanto que a T4 ligada é metabolicamente inactivo, servindo pois, como
reserva.
• As concentrações de TBG permanecem relativamente constantes em indivíduos
saudáveis, mas a gestação, o excesso de estrogénios, androgénios, esteróides
anabólicos e glicocorticóides podem alteram os níveis das TBG resultando em
falsos valores nos testes para a função da tiróide. Os níveis de T4 nestas situações
pode não refletir o verdadeiro estado da tiróide.
• A disfunção primária da tiróide pode provocar uma libertação excessiva ou baixa
em relação ao normal, tanto de T3 como de T4, assim sendo, a ocorrência de
doenças em qualquer porção do sistema tiróide-pituitária-hipotálamo pode
influenciar os níveis de T3 e T4 no sangue.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 25µL de soro.
Hormona Estimulante da Tiróide (TSH3-Ultra)
• Este ensaio deve ser usado em diagnóstico in vitro na determinação quantitativa
da hormona estimulante da tiróide (TSH) no soro, plasma (heparinizado ou com
EDTA).
• A TSH é uma glicoproteína com duas subunidades não ligadas por covalência. A
subunidade α é semelhante às da FSH, HCG e LH enquanto que a subunidade β é
única, que confere as propriedades bioquímicas e imunológicas específicas desta
hormona.
• A TSH é sintetizada e segregada pela pituitária anterior em resposta a um
mecanismo de “feedback” negativo que envolve concentrações de FT3 (T3 livre)
e de FT4 (T4 livre), além disso, a hormona libertadora de tiritropina (TRH)
estimula directamente a produção de TSH.
• A TSH interage com receptores de célula específicos na superfície da célula da
tiróide e exerce duas funções principais: estimula a reprodução de células e a
hipertrofia e ainda estimula a glândula da tiróide a sintetizar e segregar T3 e T4.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 108 Andreia Delgado Crisóstomo
• A capacidade para quantificar os níveis de TSH em circulação é importante na
avaliação do funcionamento da tiróide. É especialmente útil no diagnóstico
diferencial entre o hipotiroidismo primário (tiróide), o secundário (pituitária) e o
terciário (hipotálamo). No primeiro caso, os níveis de TSH são muito elevados,
enquanto que nos outros dois os níveis são baixos, sendo diferenciados pela
estimulação da TRH. A resposta da TSH à estimulação da TRH está ausente nos
casos de hipotiroidismo secundário e é normal a exagerada no hipotiroidismo
terciário.
• A estimulação da TRH tem sido utilizada para confirmar o hipertiroidismo
primário, indicado pelos níveis elevados de T3 e de T4 e níveis baixos ou não
detectáveis de TSH. Os ensaios de TSH com sensibilidade e especificidade
acrescidas proporcionam uma ferramenta de diagnóstico primária para diferenciar
doentes com hipertiroidismo dos que sofrem de eutiróide.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 100µL de soro,
plasma (heparinizado ou com EDTA).
Triiodotironina livre (FT3)
• Este ensaio deve ser utilizado no diagnóstico in vitro na determinação quantitativa
de triiodotironina livre (FT3) no soro.
• A T3 é uma hormona sintetizada e secretada pela tiróide e é formada pela
conversão periférica de T4 a T3. A T3 é então secretada em resposta à hormona
estimuladora da tiróide (TSH) e regulada por um mecanismo de “feedback”
negativo que envolve as glândulas tiroideia, pituitária e o hipotálamo.
• Na cicrulação, 99,7% da T3 está ligada reversivelmente a proteínas de transporte,
principalmente à globina transportadora de tiroxina (TBG) e em menor
quantidade à albumina. A quantidade remanescente de T3 não se liga às proteínas
de transporte e permanece livre na circulação. Essa fracção não ligada da
concentração total de T3 é a triiodotironina livre (FT3). O T3 não ligado é
metabolicamente inactivo.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 109 Andreia Delgado Crisóstomo
• Os níveis de T3 livre correlacionam-se com a secreção e o metabolismo de T3.
Tanto nos casos de hipotiroidismo como de hipertiroidismo, as mudanças nos
níveis de T3 livre ocorrem em paralelo com as mudanças nos níveis de T3 total.
Entretanto, a quantificação de T3 livre é útil quando ocorre alteração nos níveis de
T3 total devido a variações nas proteínas de transporte da T3, especialmente da
TBG. Os níveis de TBG permanecem relativamente constantes em indivíduos
saudáveis, porém em certos Tabelas clínicos, tais como gestação normal e a
terapia com esteróides, podem alterar esses níveis. Nestes casos, não há mudanças
nos níveis de T3 livre, enquanto que os níveis de T3 total apresentam mudanças
que ocorrem em paralelo às TBG.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 50µL de soro.
Tiroxina livre (FrT4)
• Este teste é usado no diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de
tiroxina livre (FT4) no soro.
• A T4 é uma hormona sintetizada e secretada pela tiróide e tem um papel
importante na regulação do metabolismo. A T3 é então secretada em resposta à
hormona estimuladora da tiróide (TSH) e regulada por um mecanismo de
“feedback” negativo que envolve as glândulas tiroideia, pituitária e o hipotálamo.
• Na cicrulação, 99,95% da T4 está ligada reversivelmente a proteínas de
transporte, principalmente à globina transportadora de tiroxina (TBG) e em menor
quantidade à albumina. A quantidade remanescente de T4 não se liga às proteínas
de transporte e permanece livre na circulação. Essa fracção não ligada, ou T4 livre
(FT4) é metabolicamente activo e é um precursor da T3.
• Os níveis de T4 livre correlacionam-se com a secreção e o metabolismo de T4.
Tanto nos casos de hipotiroidismo como de hipertiroidismo, as mudanças nos
níveis de T4 livre ocorrem em paralelo com as mudanças nos níveis de T4 total.
Entretanto, a quantificação de T4 livre é útil quando ocorre alteração nos níveis de
T4 total devido a variações nas proteínas de transporte da T4, especialmente da
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 110 Andreia Delgado Crisóstomo
TBG. Os níveis de TBG permanecem relativamente constantes em indivíduos
saudáveis, porém em certos Tabelas clínicos, tais como gestação normal e a
terapia com esteróides, podem alterar esses níveis. Nestes casos, não há mudanças
nos níveis de T4 livre, enquanto que os níveis de T4 total apresentam mudanças
que ocorrem em paralelo às TBG.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 25µL de soro.
Auto-anticorpos contra a Peroxidase Tiroidiana (Anti-TPO)
• Este teste de diagnóstico in vitro é usado para determinar quantitativamente os
auto-anticorpos contra a peroxidade tiroidiana no soro ou plasma (heparinizado ou
com EDTA).
• A peroxidade tiroidiana (TPO) consiste num heme glicosilado ligado à membrana
contendo proteínas que são encontradas na membrana apical das células
foliculares da tiróide. É esta mesma TPO que cataliza a iodinação dos grupos
tirosil na tiroglobulina resultando na síntese das hormonas da tiróide T3 e T4.
• A doença tiroidiana auto-imune está caracterizada pela presença de auto-
anticorpos contra o TPO. A quantificação dos mesmos auto-anticorpos é útil na
identificação de pacientes com doença tiroidiana auto-imune, pois apresentam
níveis aumentados. Níveis baixos de anticorpos anti-TPO podem ser detectados
em indivíduos saudáveis com função tiroideia normal. Os níveis destes anticorpos
também podem estar elevados em caso de mulheres com tiroidite pós-parto.
• A quantificação dos anticorpos anti-TPO são muito úteis no diagnóstico da
Doença de Graves Materna ou da Tiroidite de Hashimoto.
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 30µL de soro
ou plasma (heparinizado ou com EDTA).
Auto-anticorpos contra a Tireoglobulina (anti-Tg)
• É o teste indicado no diagnóstico in vitro para a determinação quantitativa de
auto-anticorpos contra a tireoglobulina no soro ou plasma com EDTA. O uso
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 111 Andreia Delgado Crisóstomo
deste teste destina-se a auxiliar no diagnóstico das Doenças de Hashimoto e de
Graves, doenças auto-imunes que afectam a glândula da tiróide.
• A tireoglobulina (Tg) é uma glicoproteína grande e heterogénia encontrada nas
células foliculares da tiróide, que tem um papel importante na biossíntese das
hormonas T3 e T4 da tiróide.
• A quantificação de auto-anticorpos contra a Tg é útil para identificar pacientes
com doenças auto-imunes da tiróide. Níveis aumentados destes anticorpos são
encontrados em pacientes com Tiroidite de Hashimoto ou com Tiroidite Crónica
(cerca de 80 a 100%), em pacientes com Doença de Graves (60 a 70%) em
pacientes com Tiroidite Aguda (10 a 20%).
• O volume de amostra necessária para a realização deste ensaio são 40µL de soro
ou plasma (com EDTA).
Seguidamente, apresenta-se uma Tabela (Tabela 9) com as técnicas usadas, o plano
de controlo interno e os valores de referência para cada parâmetro determinado pelo
aparelho automático.
Tabela 9- Técnicas usadas, o plano de controlo interno e os valores de referência para
cada parâmetro determinado pelo aparelho automático (CENTAUR® XP).
Parâmetro Técnica Controlo de Qualidade*
Periocidade Valores de Referência
T3
Imunoensaio
competitivo
3níveis
(alto, médio,
baixo)
Sempre que se
calibra um
parâmetro
fazer os 3
níveis de
controlo
0,6 – 1,81 ng/mL
T4 4,50 – 10,9 µg/dL
TSH3-UL
2-12anos: 0,64 – 6,27
µIU/mL
12-18anos: 0,51 – 4,94
µIU/mL
≥18anos: 0,55 – 4,78
µIU/mL
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 112 Andreia Delgado Crisóstomo
FT3 2,3 – 4,2 pg/mL
FrT4
Semanalmente
e em dias
diferentes os 3
níveis do
cotrolo
0,89 – 1,76 ng/dL
FSH Imunoensaio
tipo
sandwich
--
LH --
Estradiol Imunoensaio
competitivo --
Prolactina
Imunoensaio
tipo
sandwich
--
Progesterona Imunoensaio
competitivo
--
Cortisol --
HBsAg
Imunoensaio
tipo
sandwich Controlo
positivo
Controlo
negativo
Semanalmente
em dias
diferentes o
controlo
positivo e o
negativo
<1,0 Não Reactivo
≥50,0 (?) Reactivo
aHBs2
<8mIU/mL Não
Reactivo
≥12,0 mIU/mL
Reactivo
HBc Total <0,50 Não Reactivo
≥0,50 Reactivo
HbeAg <0,8 Não Reactivo
≥10,0 Reactivo
aHBe Imunoensaio
competitivo
<0,80 Não Reactivo
≥1,20 Reactivo
EHIV Imunoensaio
tipo
sandwich
<1,0 Não Reactivo
≥1,0 Reactivo
HCV <0,8 Não Reactivo
≥1,0 Reactivo
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 113 Andreia Delgado Crisóstomo
HVA M
Imunoensaio
de captura
de anticorpo
<0,80 S/CO Não
Reactivo
≥1,2 S/CO Reactivo
Rub. G
Imunoensaio
tipo
sandwich
<5,0 IU/mL Não
Reactivo
≥10,0 IU/mL Reactivo
Rub. M <0,8 Não Reactivo
≥1,0 Reactivo
Toxo. G
<6,4 UI/mL Não
Reactivo
≥10,0 UI/mL Reactivo
Toxo. M <0,9 Não Reactivo
≥1,0 Reactivo
Ca 19.9
3 Níveis
(alto, médio,
baixo)
Semanalmente
em dias
diferentes,
controlo 1,2 e 3
0 – 37 U/mL
Ca 125 II 0 – 30,2 U/mL
Ca 15.3 0 – 32,4 U/mL
CEA
0 – 5 ng/mL (Ñ
Fumadores)
0 – 10 ng/mL
(Fumadores)
Anti-TPO Imunoensaio
competitivo
QC anti-
TPO1,2
Semanalmente
em dias
diferentes,
control 1 e 2
0 – 60 U/mL
Anti-Tg QC anti-
TG1,2 0 – 60 U/mL
* Critérios de Aceitação: ≤±2SD. Se controlo > ±2SD: Repetir o nível com controlo
novo; se voltar a falhar os critérios de aceitação: calibrar e repetir o controlo ou poder-se-
á fazer logo a calibração.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 114 Andreia Delgado Crisóstomo
1.4.2- ImmunoCAP 250
O aparelho ImmunoCAP 250 (Figura 6) realiza testes relacionados com
autoimunidade e com alergias. Este aparelho utiliza ImmunoCAP (são polímeros
hidrofílicos e flexíveis de um derivado activado de celulose contido numa cápsula) / Elia
Wells (são poços em poliestireno revestidos com antigénios ou anticorpos) como fase
sólida para determinar quantitativamente a presença de anticorpos contra determinados
parâmetros como é o caso do dsDNA, MBG, Cardiolipina IgM/G, β2-glicoproteína
IgM/G, PR3, MPO, Gliadina IgG/A, CCP e Transaminase IgG/A.
O método ELISA consiste em 4 passos chave: uma reacção antigénio anticorpo
usando amostras diluídas dos doentes, calibradores e controlos (positivo e negativo),
seguida da formação do complexo antigénio-anticorpo-conjugado, posteriormente
adiciona-se enzima e substrato ocorrendo uma reacção em que é lida a emissão de
fluorescência.
dsDNA (DNA de cadeia dupla)
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa por diagnóstico in vitro de
anticorpos IgG específicos do antigénio dsDNA, no soro ou plasma humanos,
como meio auxiliar no diagnóstico clínico do Lúpus Eritematoso Sistémico
(LES).
Figura 10- Aparelho automático (ImmunoCAP 250) para
estudo de parâmetros de autoimunidade e alergias em
soros humanos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 115 Andreia Delgado Crisóstomo
• A determinação dos anticorpos antinucleares (ANA) é de extrema importância
para o diagnóstico clínico das doenças do tecido conjuntivo.
• Para o diagnóstico do LES, os anticorpos dsDNA são considerados um marcador
altamente específico, representando um dos critérios de diagnóstico do LES
(critérios ACR). A determinação destes anticorpos também são importantes na
monitorização da evolução clínica de um doente com LES, na medida em que
existe uma relação óbvia entre o título de anti-dsDNA e a actividade da doença,
mais especificamente um envolvimento renal.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma. Amostras lipémicas, hemolizadas
ou contaminadas microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que
não devem ser utilizadas. As amostras devem ser mantidas em alíquotas a -20ºC
para determinações repetidas.
• O resultado apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <10 IU/mL
- Clinicamente duvidoso: 10-15 IU/mL
- Positivo: >15 IU/mL.
MBG (Membrana Basal Glomerular)
• Este teste destina-se à determinação quantitativa in vitro dos anticorpos IgG para
a cadeia α3 de colagénio tipo IV em soro e plasma humanos, funcionando como
um meio auxiliar no diagnóstico clínico da Síndrome de Goospasture e na Doença
MBG.
• Os anticorpos MGB são detectados em doentes com a Síndrome de Goospasture,
doença anti-MBG e vasculite associada à ANCA. A Síndrome de Goospasture é
definida pela ocorrência combinada de glomerulonefrite progressiva, hemorragias
pulmonares e anticorpos da membrana basal glomerular (MBG). A doença MBG
é uma forma mais limitada que envolve apenas os rins ou os pulmões. Para o
diagnóstico de ambas é necessária a presença de anticorpos MBG. Além disso, até
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 116 Andreia Delgado Crisóstomo
10% dos pacientes ANCA-positivos apresentam anticorpos MBG, o que indica
uma evolução mais grave das lesões renais.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma.
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 EliA IU/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 EliA IU/mL
- Positivo: >10 EliA IU/mL.
Cardiolipina IgM/G
• Este teste destina-se à determinação quantitativa de anticorpos IgM/G anti-
cardiolipina no soro ou plasma humanos, como apoio ao diagnóstico da Síndrome
Anti-Fosfolipídica (SAF) e para avilar o risco trombótico em doentes com LES.
• Os anticorpos anti-cardiolipina (ACA) pertencem ao grupo dos anticorpos anti-
fosfolípido (aPL), tendo sido detectado inicialmente no soro de doentes com
Sífilis, mas recentemente foram descritos como comuns em doentes com LES
(prevalência de 30-40%) e outras doenças reumáticas.
• A Síndrome Anti-Fosfolipídica (SAF) é caracterizada por sintomas clínicos
típicos, tais como tromboses arteriais/venosas, ou abortos recorrentes, em
simultâneo com resultados positivos persistentes para os aPL.
• Os anticorpos anti-cardiolipina das doenças infecciosas e da SAF podem ser
distinguidos pela sua dependência de co-factores: enquanto que os ACA de
doentes com doenças infecciosas reconhecem o fosfolípido puro do antigénio, a
ligação entre ACA de doentes com SAF requer β2-glicoproteína I como co-factor.
• O anticoagulante lúpico (LA) também descreve um fenómeno que está
relacionado com a presença de anticorpos anti-fosfolípido e que é definido pela
determinação da inibição in vitro da coagulação dependente de anticorpos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 117 Andreia Delgado Crisóstomo
• Considera-se que ACA/LA tem relevância diagnóstica uma vez que se descobriu
que existe uma correlação entre estes anticorpos e a tendência para tromboses.
Este facto origina um aumento de incidência de tromboses arteriais/venosas,
trombocitopénia, aborto recorrente e manifestações neurológicas em doentes
ACA/LA positivos.
• Neste teste podem ser usadas amostras de soro e plasma (com EDTA ou com
Citrato).
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado para a cardiolipina IgM apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <10 MPL-U/mL
- Clinicamente duvidoso: 10-40 MPL-U/mL
- Positivo: >40 MPL-U/mL.
• O resultado para a cardiolipina IgG apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <10 GPL-U/mL
- Clinicamente duvidoso: 10-40 GPL-U/mL
- Positivo: >40 GPL-U/mL.
β2-glicoproteína IgM/G
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa de anticorpos IgM anti-β2-
glicoproteína I no soro ou plasma humanos, como apoio ao diagnóstico da SAF e
para avaliar o risco trombótico em doentes com LES.
• A SAF tem como características particulares a trombose arterial/venosa, abortos
recorrentes, a par de testes persistentemente positivos para os anticorpos anti-
fosfolipídicos. Além dos critérios existem disponíveis 3 testes diferentes de
laboratório: anticoagulante lúpico, anticorpos anti-cardiolipina (IgM e IgG) e
anticorpos anti-β2-glicoproteína I (IgM e IgG). O teste do anticorpo β2-
glicoproteína I apresentam maior especificidade do que os testes anti-cardiolipina.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 118 Andreia Delgado Crisóstomo
Em 3-10% de doentes com SAF, os anticorpos β2-glicoproteína I podem ser o
único teste positivo. A associação de anticorpos β2-glicoproteína I com pré-
eclampsia e/ou eclampsia em mulheres grávidas não seleccionadas que
apresentaram um resultado negativo para os anticorpos anti-cardiolipina sugere
que a inclusão de anticorpos β2-glicoproteína I pode também ajudar a esclarecer
este tipo de morbidade na gravidez.
• Os testes para os anticorpos β2-glicoproteína I podem ser úteis no diagnóstico de
SAF, em particular, quando os anticorpos anti-cardiolipina e o anticoagulante
lúpico são negativos e existe uma forte suspeita de SAF.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma.
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado para a β2-glicoproteína I IgM/IgG apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 U/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 U/mL
- Positivo: >10 U/mL.
PR3 (Proteinase 3)
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa in vitro dos anticorpos IgG
para a proteinase 3 (PR3) em soro e plasma humanos, funcionando como um meio
auxiliar no diagnóstico clínico da Granulomatose de Wegener (WG).
• Os anticorpos PR3 são extremamente sensíveis (81%) e específicos (97%) para a
WG, esta sensibilidade depende da fase e da actividade da doença. Apesar da
forte associação entre os anticorpos PR3 e a WG, existem outras patologias que
também são positivos para estes anticorpos, sendo elas, a Poliangite Microscópica
(MPA), a Síndrome de Churg-Strauss e a Glomerulonefrite Necrosante.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 119 Andreia Delgado Crisóstomo
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <2,0 IU/mL
- Clinicamente duvidoso: 2,0-3,0 IU/mL
- Positivo: >3,0 IU/mL.
MPO (Mieloperoxidase)
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa in vitro dos anticorpos IgG
para a mieloperoxidase (MPO) em soro e plasma humanos, funcionando como um
meio auxiliar no diagnóstico clínico da Poliangite Microscópica (MPA).
• Descrita pela primeira vez em doentes com Glomerulonefrite Crescêntica
Necrosante (NCGN) sem depósitos imunes, o espectro clínico associado aos
anticorpos-MPO inclui também a NCGN associada à vasculite sistémica, tanto a
WG como a MPA. Na verdade, os anticorpos-MPO são detectáveis em 65% dos
doentes com NCGN idiopática, 45% dos doentes com MPA e entre 20-30% dos
doentes com WG. Além disso, também estão presentes em cerca de 60% dos
doentes com a Síndrome de Churg-Strauss.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma.
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 EliA U/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 EliA U/mL
- Positivo: >10 EliA U/mL.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 120 Andreia Delgado Crisóstomo
CCP (Péptido Cíclico Citrulinado)
• Este teste destina-se à determinação quantitativa por diagnóstico in vitro de
anticorpos IgG específicos do antigénio péptido cíclico citrulinado (CCP), no soro
ou plasma humano (com EDTA ou citrato).
• A presença de anticorpos anti-CCP pode ser utilizada juntamente com as
observações clínicas e outros testes laboratoriais como auxiliar no diagnóstico
clínico da artrite reumatóide (AR).
• A AR é uma das doenças auto-imunes sistémicas mais comuns caracterizando-se
pela inflamação crónica das articulações e pode levar à erosão progressiva e
destruição das cartilagens. Até recentemente, o diagnóstico precoce da AR tinha
como base as manifestações clínicas e no factor reumatóide (FR) como marcador
serológico. Apesar da determinação do FR ser muito sensível para a AR (50-90%)
tem uma especificidade limitada (70-90%). Em 1998, foram descritos anticorpos
altamente específicos da AR dirigidos contra péptidos citrulinados. Este já foram
desenvolvidos havendo agora CCP de segunda geração que têm uma sensibilidade
de 68% e uma especificidade de pelo menos 96%. Daqui podemos concluir que os
anticorpos anti-CCP são quase tão sensíveis quanto o FR mas é indiscutivelmente
mais específico. Não esquecendo o facto que os mesmos anticorpos anti-CCP
podem ter um valor prognóstico no que se refere à observação radiográfica da
deterioração das articulações.
• Condições especiais: Amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 EliA U/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 EliA U/mL
- Positivo: >10 EliA U/mL.
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Gliadina IgG/A
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa por diagnóstico in vitro de
anticorpos gliadina (IgG/A) no soro ou plasma humanos, como apoio ao
daignóstico de Doença Celíaca.
• A Doença Celíaca consiste numa patologia a longo prazo, na qual a ingestão de
glúten, gliadina do trigo insolúvel em água e prolaminas em centeio e cevada
provocam uma inflamação crónica, causando lesões na mucosa do intestino
delgado. Trata-se de uma doença de natureza multifacetada, com uma
apresentação clínica que varia entre manifestações gastrointestinais e formas
assintomáticas, silenciosas e extraintestinais.
• O termo glúten refere-se a um grupo de proteínas do endosperma, o tecido
nutritivo dos grãos de trigo, centeio, aveia e cevada. Os polipéptideos do glúten
solúveis em álcool, as gliadinas, são as únicas responsáveis pelos efeitos tóxicos
na mucosa intestinal.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma.
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado para a gliadina IgG/A apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 EliA U/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 EliA U/mL
- Positivo: >10 EliA U/mL.
Transaminase IgG/A
• Este ensaio destina-se à determinação quantitativa por diagnóstico in vitro de
anticorpos IgG/A da transglutaminase (tTG) anti-tecidular em soro e plasma
humanos. O ensaio Celikey IgG/A baseia-se na transglutaminase recombinante de
tecido humano como antigénio, sendo útil como apoio ao diagnóstico clínico de
doentes com Doença Celíaca.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 122 Andreia Delgado Crisóstomo
• A transglutaminase tecidular foi identificada como o principal auto-antigénio na
doença celíaca. Os anticorpos IgA contra a tTG (IgA) são marcadores serológicos
altamente específicos para a doença celíaca e a dermatite herpetiforme. Os
anticorpos tTG IgG são menos específicos para estas patologias mas são
marcadores úteis em doentes com deficiência em IgA.
• A Doença Celíaca consiste numa patologia a longo prazo, na qual a ingestão de
glúten, gliadina do trigo insolúvel em água e prolaminas em centeio e cevada
provocam uma inflamação crónica, causando lesões na mucosa do intestino
delgado.
• Podem ser utilizadas amostras de soro e plasma (EDTA, Citrato).
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado para a transglutaminase IgG/A apresenta-se da seguinte forma:
- Negativo: <7 EliA U/mL
- Clinicamente duvidoso: 7-10 EliA U/mL
- Positivo: >10 EliA U/mL.
Specific IgE (Conjugado IgE específica)
• o Specific IgE corresponde a um teste in vitro que mede a concentração de IgE
circulante no soro ou plasma humano específica para determinado alergérnio.
Pretende-se da sua utilização para o auxílio no diagnóstico de doenças alérgicas
IgE-mediadas, em associação com outros dados clínicos.
• Nos doentes com asma extrínseca, febre dos fenos ou eczema atópico, os sintomas
desenvolvem-se imediatamente após exposição a alergénios específicos. Este tipo
de alergia imediata (atópica e anafilática) é função de um tipo especial de
anticorpos séricos pertencentes à classe IgE das imunoglobulinas.
• Podem ser usadas amostras de soro e plasma (EDTA ou heparina).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 123 Andreia Delgado Crisóstomo
• Condições especiais: amostras lipémicas, hemolizadas ou contaminadas
microbiologicamente podem originar resultados baixos, pelo que não devem ser
utilizadas.
• O resultado para IgE específica vem apresentados na seguinte forma para uma
mistura de alergénios acoplados ao multi-alergénio:
- Valores ≥≥≥≥0,35 kU/L – indicam anticorpos específicos IgE para um
ou mais dos alergénios
- Valores <<<<0,35 kU/L – níveis muitos baixos ou não detectáveis de
anticorpo IgE, alergénio específicos.
Seguidamente, apresenta-se uma Tabela (Tabela 10) com o plano de controlo interno
para cada parâmetro determinado pelo aparelho automático.
Tabela 10- Plano de Controlo Interno para cada parâmetro determinado pelo aparelho
automático (ImmunoCAP 250).
Parâmetro Controlo Periodicidade Critérios de
Aceitação Actuação
IgE
específica
Pharmacia Specific
IgE Control
1
Alergeno/série
CC validados
pelo
equipamento
Se Controlos
de Curva (CC)
fora:
Repetir a série
com nova
calibração
Specific IgE CC Em todas as
séries
Gliadina
IgA;
Transglutami
nase IgA
IgA CC 1 nível/série
Control Celiac
Positive Control
1
controlo/Curva
IgA, alternando
os controlos
IgG/IgM/IgA
Negative Control
DNA,
ANCA, IgG CC 1 nível/série
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 124 Andreia Delgado Crisóstomo
MBG, CCP,
Gliadina
IgG,
Cardiolipina
IgG, β2-
microglobuli
na IgG
ANA, ANCA,
CCP, Celiac, APS
Positive Control 1
controlo/Curva
IgG, alternando
os controlos IgG/IgM/IgA
Negative Control
Cardiolipina
IgM, β2-
microglobuli
na IgM
IgM CC 1 nível/série
APS Positive
Control
1
controlo/Curva
IgM,
alternando os
controlos
IgG/IgM/IgA
Negative Control
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 125 Andreia Delgado Crisóstomo
1.5 - Hematologia
A Hematologia trata-se duma valência obrigatória das Análises Clínicas que
estuda o sangue e os órgão hematopoiéticos em situações fisiológicas e patológicas, bem
como os mecanismo de hemostase.
Para esta valência foram utilizados contadores automáticos (ADVIA® 120) que
faziam hemogramas completos, ou seja, eritrograma, leucograma e contagem de
plaquetas.
1.5.1 – Eritrograma
A técnica usada pelo contador automático baseia-se no princípio da impedância
eléctrica (princípio de Coulter), mas também pode ser utilizado um processo de deteção
óptica (citometria de fluxo) que é o utilizado pelo contador automático disponível
(ADVIA ® 120)
O resultado do eritrograma dava os seguintes parâmetros, entre outros:
• Hematócrito (HCT) – consiste no volume relativo ocupado pelos eritrócitos,
num dado volume de sangue total, o qual foi centrifugado em condições
padronizadas (2500 rpm, 5min); e o seu interesse tem a ver com a detecção de
anemias e poliglubulias, informações sobre o aspecto do plasma e a
determinação dos índices globulares; a Tabela seguinte (Tabela 11) apresenta os
valores de referência para homens, mulheres e crinaças de 1 ano.
Tabela 11- Valores de Referência de Hematócrito para Homens, Mulheres, Crianças de 1
ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120).
Unidades (L/L)
Homem 0,47 ±0,07
Mulher 0,42 ±0,05
Criança (1ano) 0,40 ±0,04
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 126 Andreia Delgado Crisóstomo
Recém-Nascido 0,53 ±0,09 L/L
NOTA: Como causas de erro nesta determinação temos a má homogeneização da
amostra de sangue e o sangue hemolisado (erro por defeito).
• Concentração de Hemoglobina (HC) – tem como método de referência:
cianometahemoglobina que se traduz numa reação de lise dos eritrócitos com
consequente oxidação do ião ferro do heme (Fe3+), que por último se liga ao ião
cianeto formando a cianometahemoglobina (Fe3+.CN) que sendo estável pode
ser doseada espectrofotometricamente no aparelho; o seu interesse ao ser
doseado deve-se ao facto de detectar anemias, avaliar o grau da mesma e fazer a
apreciação do efeito do tratamento da anemia; a Tabela seguinte (Tabela 12)
apresenta os valores de referência para homens, mulheres, crianças de 1 ano e
recém-nascidos.
Tabela 12- Valores de Referência de Concentração de Hemoglobina para Homens,
Mulheres, Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120).
Unidades (g/dL)
Homem 16 ±2
Mulher 14 ±2
Criança (1ano) 13 ±2
Recém-Nascido 19 ±2
• Número de eritrócitos circulantes (RBC) – quando calculados em sistemas
automáticos apresentam um valor mais exacto e preciso que um valor calculado
por métodos manuais (contagem em câmara); a Tabela seguinte (Tabela 13)
apresenta os valores de referência para homens, mulheres, crinaças de 1 ano e
recém-nascidos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 127 Andreia Delgado Crisóstomo
Tabela 13- Valores de Referência do Número de Eritrócitos Circulantes para Homens,
Mulheres, Crianças de 1 ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120).
Unidades (x10 12/L)
Homem 5,9 ±0,5
Mulher 4,5 ±0,5
Criança (1ano) 4,5 ±0,6
Recém-Nascido 6,0 ±1,0
• Índices eritrocitários – estão apresentados na Tabela abaixo (Tabela 14).
Tabela 14- Índices eritrocitários com respectivas unidades, valores de referência e
classificação de eritrócitos (ADVIA® 120).
Unidades Valores de
referência
Classificação
de Eritrócitos
VGM
(Volume Globular médio)
fL
(=10-15L) 80 – 961 Normocíticos
HGM
(Hemoglobina Corpuscular
Média)
Pg
(=10-12L) 27 – 32 __________
CHGM
(Concentração de
Hemoglobina Globular
Média)
g/dL 32 – 36 Normocrómicos
RDW
(Coeficiente de dispersão
eritrocitária)
% 11,5 – 143
1abaixo do valor de referência, os eritrócitos são classificados como microcíticos,
acima do mesmo valor são macrocíticos.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 128 Andreia Delgado Crisóstomo
2abaixo do valor de referência, os eritrócitos são classificados como hipocrómicos,
acima do mesmo valor são esferócitos. 3um RDW superior a 15% temos uma anisocitose.
1.5.2- Leucograma
Em termos de leucograma, o que vamos obter do aparelho é a contagem de
leucócitos (WBC) e a respectiva fórmula leucocitária. Isto é possível devido a uma
tecnologia que faz a medição a actividade da Peroxidase de cada tipo de célula
(leucócitos e percursores), dando o resultado em cruzes (sendo que quantas mais cruzes,
mais actividade de peroxidase. E o que se concluí é que todos os leucócitos à excepção
do mieloblasto e do basófilo, apresentam actividade peroxidásica. No caso dos basófilos
utiliza-se outra tecnologia que usa calor, ácido ftálico e surfactante, podendo assim fazer-
se a contagem em termos de blastos, células mononucleadas, polimorfonucleares e
basófilos.
Seguidamente, apresenta-se uma Tabela (Tabela 15) com os valores de referência
para contagem de Leucóctios em adultos, as crianças (1 ano; 2-12 anos) e recém-
nascidos.
Tabela 15- Valores de Referência para contagem de Leucóctios em Adultos, as Crianças
(1 ano; 2-12 anos) e Recém-Nascidos (ADVIA® 120).
Unidades (x10 9/L)
Adulto 4,0 – 11,0
Criança (2 – 12anos) 5,0 – 15,0
Criança (1ano) 6,0 – 16,0
Recém-Nascido 10,0 – 26,0
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 129 Andreia Delgado Crisóstomo
1.5.3- Contagem de Reticulócitos
Na Contagem de Reticulócitos usando a contador automático é mais preciso, exacto
e rápido do que fazendo por métodos manuais, a técnica é baseada no princípio da
citometria de fluxo, sendo utilizado um corante fluorescente (acridina laranja, auramina
O, tiazol laranja ou CD4K 530) que se liga ao RNA dos reticulócitos, sendo também
baseada numa tecnologia combinada, como a VCS (Volume, Condutividade e Laser), em
que se podem utilizar corantes não-fluorescentes (oxazina 750) para evidenciar o RNA
dos reticulócitos; o interesse desta contagem serve para apreciar a actividade
eritropoiética da medula – diagnosticar se uma anemia é regenerativa ou arregenerativa,
monitorização do tratamento de anemias (anemia ferropénica, perniciosa, por deficiência
em ácido fólico) e verificar se há regeneração sanguínea após uma grande perda globular
(hemorragia ou hemólise); a Tabela seguinte (Tabela 16) apresenta os valores de
referência para contagem de reticulócitos em adultos, crianças de 1-12 anos, crianças de 1
mês e recém-nascidos.
Tabela 16- Valores de Referência para Contagem de Reticulócitos em Adultos, Crianças
de 1-12 anos, Crianças de 1 mês e Recém-Nascidos (ADVIA ® 120).
Unidades
% x109/L
Adulto 0,5 – 2,5 50 – 100
Criança (1-12anos) 0,3- 2,5 30 -100
Criança (1mês) 0,2 – 1,5 20 – 60
Recém-Nascido 2,5 – 6,5 120 – 400
1.5.4- Velocidade de Sedimentação
Quanto à Velocidade de Sedimentação (VS) consiste na velocidade da queda
espontânea dos elementos figurados do sangue em suspensão no plasma; o mecanismo
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 130 Andreia Delgado Crisóstomo
resulta da diferença da gravidade específica existente entre os eritrócitos (mais densos) e
o plasma, da atracção electrostática que se gera entre as cargas negativas prentes na
membrana dos eritrócitos e as cargas positivas de certas proteínas plasmáticas que levam
à formação de rouleaux, e ainda da contra-corrente plasmática; para medir este parâmetro
usámos um sistema automático (VES-MATIC 30) que usa um sistema equivalente ao
método de Westergreen e que tem vantagens como a rapidez, precisão e menor risco de
contaminação comparativamente ao método manual e que é controlado todos os dias, um
nível alternado, através do controlo normal (nível 1) ou do anormal (nível 2). Os critérios
de aceitação são os que vêm nas bulas e se obtivermos resultados fora dos indicados,
repetimos novamente com o mesmo tubo, se não der novamente bem reptetimos com
nova amostras. Só depois de estar satisfeita esta premissa é que se passa às amostras dos
pacientes; a Tabela seguinte (Tabela 17) apresenta os valores de referência para a
velocidade de sedimentação em homens e mulheres com idades até aos 50 anos e depois
dos 50 anos.
Tabela 17- Valores de Referência para a Velocidade de Sedimentação em homens e
mulheres com idades até aos 50 anos e depois dos 50 anos (VES-MATIC 30).
Até aos 50anos Depois dos 50anos
Homem Até 10mm/1h Homem Até 13mm/1h
Mulher Até 13mm/1h Mulher Até 20mm/1h
NOTA: Podem ocorrer variações fisiológicas dos valores normais devido à idade, ao
tratar-se de uma pessoa do sexo feminino, se está menstruada, ou se está grávida.
1.5.5- Esfregaço de sangue
Sempre que há duvidas na fórmula dada pelo aparelho automático, deve fazer-se
um esfregaço para contagem de células. Este é feito através de uma gota de sangue numa
das extremidades da lâmina e com a ajuda de outra, num ângulo de 45º, tocar o rebordo
da lâmina contra a gota de sangue. Seguidamente, num só movimento uniforme e firme,
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 131 Andreia Delgado Crisóstomo
fazer deslizar a lâmina. Deixamos secar ao ar, identificando a lâmina 1 com o número do
doente e por último, corar a lâmina pelo método de May-Grunwald-Giemsa*.
Seguidamente, apresenta-se uma Tabela (Tabela 18) com o plano de controlo interno
para o hemograma e as plaquetas para o contador automático.
Tabela 18- Plano de controlo interno para o Hemograma e Plaquetas para o contador
automático (ADVIA® 120).
Parâmetro Controlo Periodicidade Critério de
Aceitação Actuação
Hemograma
e
Plaquetas
Nível alto
Nível baixo
Diariamente
os 2 níveis
≤ ±2SD
Se os valores forem >2SD:
4- repetir
5- repetir com controlo
novo
6- calibrar o parâmetro
1.5.6- Coagulação
A hemostase é um processo complexo que permite a normal funcionalidade da
circulação e também assegurar permanentemente a prevenção de hemorragias resultantes
de qualquer lesão vascular.
A hemostase primária é contituída pelo tempo vascular – vasoconstricção e o
tempo plaquetário. Este último sendo constituído por cinco acontecimentos: adesão ao
local da lesão vascular, activação e secreção dos conteúdos granulares, agregação (de
plaquetas que levam à formação do rolhão plaquetário), actividade coagulante que
fornece uma superfície da membrana celular para a activação dos complexos da
coagulação e por fim a retracção do coágulo através da activação actina-miosina. Certos
defeitos em qualquer uma das cinco etapas anteriores vão dar origem a diferentes
patologias, como por exemplo, um defeito da adesão plaquetária vai levar à Doença de
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 132 Andreia Delgado Crisóstomo
von Willebrand (que se trata de uma discrasia hemorrágica causada por
deficiêcia/anomalia na quantidade do factor de von Willebrand com carácter autossómico
dominante ou, menos frequente, recessivo; é a alteração hemorrágica mais frequente) ou
ao Sindrome de Bernard-Soulier (que não é mais que a ausência/disfunção da GpIIb/IX).
Em relação às provas laboratoriais da hemostase primária temos: a contagem de plaquetas
e o tempo de hemorragia (3-8 minutos).
Quanto à hemostase secundária (coagulação) é um processo multifactorial e
dinâmico com proteólise limitada que acaba com a formação de trombina em quantidades
suficientes para conversão do fibrinogénio em fibrina. Na figura abaixo (Figura 11)
encontra-se o novo conceito de Coagulação.
Figura 11- Novo conceito de Coagulação (adaptado de Essential Biochemistry for
Medicine, por Dr. Mitchell Fry, 2010, wiley-blackwell, 154-157).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 133 Andreia Delgado Crisóstomo
Aqui temos como provas laboratoriais: o tempo de tromboplastina parcial (TTP)
e o tempo de trombina (TP).
Por último temos a hemostase terciária (Fibrinólise) em que os sistema
fibrinolítico é a principal defesa contra a oclusão dos vasos sanguíneos, pois remove os
depósitos de fibrina, ajuda a reparar os vasos danificados e é constituído por uma série de
proteínas (activadores e inibidores). No meu local de estágio a medição do fibrionogénio
é feita através da curva de calibração do Tempo de Protrombina pelo TP-Fibrinogénio HS
PLUS.
Quanto ao controlo do aparelho automático (ACL ELITE PRO – Figura 10), ele é
feito todos os dias usando ora um controlo (normal, por exemplo) ora o outro (patológico,
por exemplo). E se estiver tudo conforme os critérios de aceitação, o aparelho está apto
para começar a analisar as amostras dos doentes.
1.5.6.1- Provas Laboratoriais da Hemostase Primária
No que toca à Contagem de Plaquetas, a técnica geralmente baseia-se no
princípio da impedância eléctrica (princípio de Coulter), mas também pode ser utilizado
um processo de deteção óptica (citometria de fluxo) que é o utilizado pelo contador
automático disponível (ADVIA® 120); usando o aparelho torna-se mais exacto, preciso e
rápido em comparação ao método manual (contagem em câmara de Neubauer improved);
a Tabela seguinte (Tabela 19) apresenta os valores de referência para contagem de
plaquetas em adultos, crianças de 1 ano e recém-nascidos.
Tabela 19- Valores de Referência para Contagem de Plaquetas em Adultos, Crianças de 1
ano e Recém-Nascidos (ADVIA® 120).
Unidades (x10 9/L)
Adulto 150 – 400
Criança (1ano) 200 – 450
Recém-Nascido 150 – 450
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NOTA: As plaquetas gigantes são incluídas nas contagens mas os fragmentos de
eritrócitos são excluídos.
1.5.6.2- Provas Laboratoriais da Hemostase Secundária e Terciária
• Tempo de Protrombina (TP) e Fibrinogénio – a tromboplastina cálcica de alta
sensibilidade é utilizada para a determinação simultânea destes parâmetros, para
avaliação da via extrínseca da coagulação (é sensível aos factores II, V, VII e
X) e para o controlo da terapêutica anticoagulante oral em plasma humano
citratado. Os controlos adequados para este programa são o controlo normal, o
controlo anormal baixo, o controlo anormal alto e o fibrinogénio controlo baixo
e devem ser analisados de 8 em 8 horas.
• Tempo de Tromboplastina Parcial Activada – é usado como teste de
screening geral na avaliação da vía intrínseca da coagulação (é sensível a
deficiências em factores II, V, VIII, IX, X, XI e XII) e para a monitorização de
doentes que se encontram sob terapêutica anticoagulante com heparina. Os
controlos adequados para este programa são o controlo normal, o controlo
anormal baixo, o controlo anormal alto e o controlo heparina baixo e controlo
heparina alto, estes devem ser analisados de 8 em 8 horas.
Seguidamente, apresenta-se uma Tabela (Tabela 20) com os valores de referência
para os parâmetros da hemostase secundária e terciária.
Tabela 20- Valores de Referência para os parâmetros da Hemostase Secundária e
Terciária.
Parâmetro Valores de Referência
TP1 11,8 – 15,1 seg
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Fibrinogénio 169 – 515 mg/dL
APTT2 24,3 – 35,0 seg 1o resultado também pode vir em actividade (%), INR (é o quociente entre o tempo de
reacção da amostra e o tempo do plasma controlo normal elevado a ISI (índice de
sensibilidade internacional) – consiste no valor numérico entre a tromboplastina de
referência e a comercializada, o valor ideal deve ser 1); 2o resultado também pode vir na forma de ratio.
1.5.7- Electroforese de Hemoglobinas e Proteínas
Ambas as electroforeses são realizadas num so aparelho chamado CAPILLARYS
(Figura 11), que depois especifica para o caso das Hemoglobinas (CAPILLARYS
HEMOGLOBIN(E)) e para o caso das Proteínas (CAPILLARYS PROTEIN(E)).
1.5.7.1- Electroforeses de Hemoglobinas
Em relação ao CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E), este foi concebido para a
separação das hemoglobinas normais (A, F, A2) e para a detecção da maioria das
variantes de hemoglobina (particularmente a S, C, E ou D) por electroforese em tampão
alcalino (pH 9,4). Este sistema efectua automaticamente todas as sequências para
obtenção de um perfil de hemoglobina completo para a análises qualitativa e quantitativa
de hemoglobina. O ensaio é feito com eritrócitos precipitados, por centrifugação
(5minutos a 5000rpm) ou lavados. As hemoglobinas separadas em capilares de sílica são
directamente e especificamente detectadas por absorvância a 415nm, o qual é específico
das hemoglobinas. A detecção directa permite então uma quantificação relativa exacta da
fracção de hemoglobina individual com interesse, tal como a hemoglobina A2 para o
diagnóstico da β-talassémia. Adicionalmente, a alta resolução deste procedimento
permitirá confirmar a identificação das variantes de hemoglobina, em particular, para
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 136 Andreia Delgado Crisóstomo
diferenciar as hemoglobinas S da D e E da C. Pode também ser quantificada a
hemoglobina A2 na presença de hemoglobina E.
Esta técnica tem como fundamento a electroforese capilar em solução livre, em
que as moléculas carregadas são separadas pela sua mobilidade electroforética, num
tampão alcalina com um pH específico. A separeção também ocorre em função do pH do
electrólito e do fluxo electro-osmótico. O sistema tem 7 capilares a funcionar em
paralelo, permitindo assim realizar 7 análises em simultâneo, para quantificação de
hemoglobina. É preparada uma diluição da amostra com solução hemolisante e injectada,
por aspiração, na extremidade anódica do capilar. A separação da proteína é efectuada
aplicando alta voltagem e a detecção directa das hemoglobinas é feita a 415nm, na
extremidade catódica do capilar. Antes de casa análises, os capilares são lavados com
solução de lavagem e preparadas para a próxima análise com tampão.
Utilizando um tampão alcalino, são detectadas pela seguinte ordem, do cátodo ao
ânodo, as hemoglobinas normais ou variantes: A’2, C, A2/O-Arab, E, S, D, G-Filadélfia,
A, Hope, Bart, J, N-Baltimore e H.
A anidrase carbónica não é visualizada nos perfis electroforéticos da
hemoglobina, o que permite a identificação das variantes de hemoglobina A2 nesta zona
da migração.
Esta técnica utiliza um controlo Hemoglobina A2 Normal (controlo Hb A2 N) que
se destina ao controlo da migração, antes de lançar uma nova série de análises, assim
como controlo de qualidade do método de quantificação da hemoglobina A2. Nesta
situação, a fracção A do controlo Hb A2 N tem que apresentar uma densidade óptica de
0,12. Se o valor for inferior a este, a centragem do padrão não se fará correctamente. Na
análise das amostras, a identificação das fracções da hemoglobina A, F, A2 e C, bem
como a determinação da zona de migração de outras variantes, poderão não ser possíveis
ou dar resultados incorrectos. Também se usa o controlo Hb AFSC que se destina ao
controlo de qualidade das separações electroforéticas das hemoglobinas humanas, e que
como o anterior se deve fazer antes de se iniciar as análises dos doentes.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 137 Andreia Delgado Crisóstomo
Após o fim da análise, a quantificação relativa das fracções é automaticamente
efectuada e os perfis podem ser interpretados. Os picos da hemoglobina A, F e A2 são
identificados de forma automática, e o pico da hemoglobina A é posicionado no centro da
janela. As posições teóricas das diferentes variantes de hemoglibinas (identificadas pelas
zonas Z1-Z15) ficam referenciadas ao ecrã do sistema e no relatório dos resultados.
Os valores normais para as zonas electroforéticas de hemoglobina individuais
principais são as que estão apresentadas na Tabela abaixo (Tabela 21).
Tabela 21- Valores normais para as zonas electroforéticas de hemoglobina individuais
principais no caso do Adulto e do Recém-Nascido.
Hemoglobina Adulto Recém-Nascido
A 96 – 99% 10 – 20%
A2 1,0 – 3,5% Vestígios
F 0 – 1% 60 – 90%
O perfil electroforético de hemoglobinas para uma amostra de sangue normal é
como está demonstrado na figura abaixo (Figura 12).
Figura 12- Perfil Electroforético de Hemoglobinas para uma amostra de sangue normal.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 138 Andreia Delgado Crisóstomo
1.5.7.2- Electroforese de Proteínas
O sistema CAPILLARYS PROTEIN(E) foi concebido para a separação de
proteínas de urina e soro humanos em tampão alcalino (pH9,9) através de electroforese
capilar. As proteínas normais do soro são separadas em 6 fracções principais: albumina,
α1 e α2- globulina, β1 e β2-globulina, γ-globulina.
O CAPILLARYS efectua todas as sequências automaticamente, obtendo o perfil
proteico para análise qualitativa e quantitativa. As proteínas separadas em capilares de
sílica são directamente detectadas por absorvância a 200nm e os perfis electroforéticos
podem ser interpretados visualmente para detecção de qualquer anomalia. O sistema
neste caso tem 8 capilares a funcionar em paralelo, permitindo 8 análises em simultâneo.
Inicialmente, é preparada uma diluição da amostra com tampão e injectada, por
aspiração, na extremidade anódica do capilar. A separação é efectuada aplicando alta
voltagem aos bornes de cada capilar. A detecção directa das proteínas é feita a 200nm, na
extremidade catódica do capilar. Os capilares são imediatamente lavados com solução de
lavagem e preparados para a análise com tampão.
Para termos este aparelho controlado usamos um soro de controlo normal que se
destina a controlar o doseamento das proteínas séricas no CAPILLARYS. É utilizado
como “marcador” para a identificação das diferentes isoenzimas, separadas por
electroforese.
As proteínas são detectadas pela seguinte ordem: γ-globulina, β2-globulina, β1-
globulina, α2- globulina, α1- globulina e albumina, cada zona contendo uma ou mais
proteínas, como mostra a figura seguinte (Figura 13).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 139 Andreia Delgado Crisóstomo
Figura 13- Perfil proteico para uma amostra de soro normal.
Os valores normais para as principais fracções individuais de proteínas do soro
são os que estão apresentados na Tabela abaixo (Tabela 22).
Tabela 22- Valores normais para as principais fracções individuais de proteínas no soro.
Proteínas Valores Normais (%)
albumina 55,8 – 66,1%
α1- globulina 2,9 – 4,9%
α2- globulina 7,1 – 11,8%
β1-globulina 4,7 – 7,1%
β2-globulina 3,2 – 6,5%
γ-globulina 11,1 – 18,8%
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 140 Andreia Delgado Crisóstomo
Nota: Amostras envelhevidas e não conservadas nas condições apropriadas (2 – 8ºC) não
devem ser utilizadas em qualquer um dos tipos de de electroforese acima descritos:
• no primeiro caso pode haver produtos de degradação (como artefactos) que
podem alterar o perfil electroforético das hemoglobinas em amostras
envelhecidas e indevidamente conservadas
• no última caso, a hemólise induz a duplicação da zona α2 enquanto que amostras
antigas e indevidamente conservadas a fracção β2 seria fortemente modificado.
1.5.8- Grupagem ABO / D
Para detectar a presença ou ausência dos antigénios (Ag) A/B nos ertitrócitos, são
utilizados anticorpos (Ac) anti-A, anti-B e anti-AB conta os Ag correspondentes, que
podem ser de origem humana ou monoclonal. A grupagem ABO não deve ser
considerada completa sem a prova sérica, na qual o soro do doente é testado contra os
eritrócitos conhecidos A1, A2, B e O.
A expressao “Rh D positivo” ou “Rh negativo” baseia-se na presença ou ausência
do Ag Rh D nos eritrócitos. Para detectar a presença ou ausência dos Ag Rh D nos
eritrócitos, é utilizado um soro-teste anti-D, que pode ser de origem humana ou
monoclonal.
A sensibilidade do teste usado (ID-System) permite a detecção directa do D fraco.
1.5.8.1- Prova Directa
O Card-ID “ABO/Rh D” permite a determinação do perfil ABO/Rh D num único
procedimento, incluindo a confirmação do Rh D.
Num passo inicial, as amostras são centrifugadas a 1500g, durante 10minutos.
Posteriormente faz-se uma suspensão com o Diluente (solução de bromelina modificada)
pipetando 500µL do mesmo para um tubo de hemólise e juntar 25µL de eritrócitos.
Seguidamente homogeineiza-se a suspensão e deixamos a incubar, à temperatura
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 141 Andreia Delgado Crisóstomo
ambiente, durante 10minutos. Por fim, dispensamos 10µL de suspensão globuar em cada
microcoluna de ID-Card ABO/D e vai a centrifugar na ID-Centrifuge durante 10minutos,
ao fim dos quais se pode ler o resultado. Os resultados são interpretados da seguinte
maneira:
• Princípios:
Positivo – eritrócitos aglutinados formando uma linha vermelha à superfície
da geleia.
Negativo – botão compacto de células no fundo do microtubo.
• Reacções para os grupos sanguíneos ABO estão apresentadas na Tabela seguinte
(Tabela 23).
Tabela 23- Reacções para os grupos sanguíneos ABO.
Anti-A Anti-B Anti-AB Grupo sanguíneo
+ - + A
- + + B
+ + + AB
- - - O
• Reacções para Rh D estão apresentadas na Tabela abaixo (Tabela 24).
Tabela 24- Reacções para Rh D.
Anti-D policlonal Anti-D monoclonal Grupo sanguíneo
+ - A
- + B
+ + AB
- - O
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 142 Andreia Delgado Crisóstomo
1.5.8.2- Prova Reversa
Para esta prova vamos usar plasma de EDTA.
Começamos por homogeneizar suavemente as suspensões celulares A1 e B, depois
dispensamos uma gota de células A1 numa microcoluna e uma gota de células B noutra
microcoluna. Seguidamente, juntamos 50µL de plasma de EDTA às células A1 e B nas
suas respectivas microcolunas. Posteriomente deixamos incubar o ID-Card NaCl durante
10 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, o ID-Card vai a centrifugar na ID-
Centrifuge durante 10 minutos, ao fim dos quais se pode ler o resultado. Os resultados
são interpretados da seguinte maneira:
• Princípios:
Positivo – eritrócitos aglutinados formando uma linha vermelha à superfície
da geleia.
Negativo – botão compacto de células no fundo do microtubo.
• Reacção com eritrócitos testes estão apresentados na Tabela abaixo (Tabela 25).
Tabela 25- Reacção com eritrócitos teste.
Eritrócitos-teste Grupo ABO da amostra
A1 B
- + A
+ - B
- - AB
+ + O
Quanto ao controlo interno, estes Cards tem um microtubo ctl (para o teste ABO e
para o Rh D) que se trata do controlo negativo e basta este não dar o resultado esperado
para inviabilizar a determinação.
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1.5.9- Teste de Coombs
Este teste é feito em Card-ID “LISS/Coombs” que contém antiglobulina humana
(AGH) poli-específica que tem como principal função detectar a presença de IgG não
sendo por isso específica para as cadeias pesadas, podendo ser também capaz de reagir
com cadeias leves (k) e lamba (l) das moléculas IgA e IgM.
1.5.9.1- Teste de Coombs Directo (TCD)
De um modo geral, um TCD positivo indica que os eritrócitos estão revestidos in
vivo com imunoglobulinas e/ou complemento.
Num passo inicial, as amostras são centrifugadas a 1500g, durante 10 minutos.
Posteriormente faz-se uma suspensão com soro fisiológico pipetando 1000µL do mesmo
para um tubo de hemólise e juntar 10µL de eritrócitos. Seguidamente homogeineiza-se a
suspensão e esta fica pronta a usar. Por fim, dispensamos 50µL de suspensão globuar em
cada microcoluna de ID-Card “LISS/Coombs” e vai a centrifugar na ID-Centrifuge
durante 10 minutos, ao fim dos quais se pode ler o resultado. Os resultados são
interpretados da seguinte maneira:
• Princípios:
Positivo – eritrócitos aglutinados formando uma linha vermelha à superfície
da geleia.
Negativo – botão compacto de células no fundo do microtubo.
1.5.9.2- Teste de Coombs Indirecto (TCI)
No que se refere ao TCI foram eliminados os procedimentos de lavagem que
necessitavam de mais mão de obra, pois a adição da suspensão de eritrócitos ao
microtubo antes do plasma/soro cria uma barreira por cima da suspensão do gel, evitando
assim a neutralização as AGH pelas proteínas do soro IgG.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 144 Andreia Delgado Crisóstomo
A amostra a usar para este teste é o plasma de EDTA.
Começamos por homogeneizar suavemente as suspensões celulares I e II,
seguidamente dispensamos uma gota de células I numa microcoluna e uma gota de
células II noutra. Juntamos 25µL de plasma de EDTA às células I e II nas suas
respectivas microcolunas. Deixamos o ID-Card “LISS/Coombs” a incubar durante 15
minutos a 37ºC, seguindo para a ID-Centrifuge durante 10 minutos, ao fim dos quais se
pode ler o resultado. Os resultados são interpretados da seguinte maneira:
• Princípios:
Positivo – eritrócitos aglutinados formando uma linha vermelha à superfície
da geleia.
Negativo – botão compacto de células no fundo do microtubo.
1.5.10- Pesquisa de D fraco
Para esta pesquisa a amostra apropriada é o tubo de hemograma.
A técnica começa pela lavagem dos eritrócitos em estudo 3 vezes com soro
fisiológico, seguindo-se uma preparação de uma suspensão de eritrócitos lavados
(juntamos uma gota de eritrócitos com 19 gotas de soro fisiológico). Colocamos num
tubo 100µL da suspensão anterior e adicionamos 100µL de anti-D e agitamos
suavemente o tubo. Segue-se uma incubação durante 30 minutos a 37ºC e posteriormente
vai a centrifugar durante 1 minuto a 1500rpm. Após a incubação, faz-se a primeira
leitura:
• Se houver aglutinação – Amostra Rh+
• Se não houver aglutinação – continuamos a técnica
Vamos lavar então a suspensão 3 vezes com soro fisiológico, e juntamos 2 gotas
de soro de Coombs ao tubo. Homogeneiza-se e volta a ser centrifugado nas mesmas
condições que anteriormente foram descritas. No fim, faz-se uma segunda leitura dos
resultados:
• Se houver aglutinação – Amostra Rh+
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 145 Andreia Delgado Crisóstomo
• Se não houver aglutinação – Amostra Rh-.
*Coloração de May-Grunwald-Giemsa
Colocar as lâminas com os esfregaços em suporte apropriado;
• Mergulhar o suporte na tina contendo a solução de May-Grünwald durante 3 - 5
minutos.
• Escorrer o excesso de corante;
• Mudar o suporte com as lâminas para uma 2ª tina contendo May-Grünwald e
tampão de fosfatos em partes iguais durante 3 - 5 minutos.
• Escorrer muito bem o excesso de corante;
• Mergulhar o suporte numa 3ª tina contendo sol. de Giemsa diluída durante 15
minutos. Escorrer;
• Lavar com água corrente;
• Limpar a face da lâmina oposta ao esfregaço;
• Deixar secar ao ar.
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1.6- Microbiologia
A valência de microbiologia compreende várias áreas, entre elas, a bacteriologia,
a parasitologia, a virologia e a micologia. É uma valência vastíssima em que o trabalho é
quase na sua totalidade manual.
O objectivo desta valência consiste na identificação e valorização do
microrganismo e se possível, fornecer ao médico as resistências e sensibilidades aos
antibióticos do microrganismo identificado anteriormente.
1.6.1- Urina (A infecção urinária aguda é geralmente causada por bactérias da flora
intestinal saprófita, que invade o aparelho urinário por via ascendente através da uretra.
Os agentes etiológicos mais frequentes nas crianças e adultos, sem outras doenças
associadas, são as Enterobactereáceas com grande destaque para a Escherichia coli. Já no
caso de doentes internados e com factores de risco como algaliação permanente, por
exemplo, o leque de agentes etiológicos alarga-se a outros microrganismos, como
Pseudomonas spp, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa,
Enterococcus spp e fungos, estes últimos particularmente em doentes que estão sob
terapêutica antibiótica.)
1.6.1.1- Urocultura
• Exame directo a fresco (objectiva de 40X):
� Avaliação semi-quantitativa (raros, alguns ou muitos) de células epiteliais,
leucócitos e eritrócitos;
� Presença de Trichomonas ou Leveduras;
� Gram* (objectiva de 100X): avaliação morfologia e coloração do
microrganismo presente;
� Ziehl-Nelsen** (objectiva 100X): avaliar a presença de Bacilos Álcool
Ácido Resistentes (BAAR).
** Não são feitos por rotina.
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• Exame cultural:
� Avaliação do número e tipo de colónias. Valorizar sempre que houver
>105 ufc/mL, havendo excepções como por exemplo uma colheita por
punção supra-púbica.
Tabela 26- Avaliação do número de colónias e respectivo valor em unidades formadoras
de colónias por mL. Sementeira com ansa de 1µL.
Nº colónias ufc/mL
1 103
10 104
100 105
� Meio CPS: permite uma detecção espontânea da desaminase dos Proteae
(Proteus, Providencia e Morganella) e um melhor crescimento das bactérias
Gram positivas e das leveduras; este meio deve ser incubado a 37ºC durante 24
horas; o resultado que se pode encontrar está indicado na Tabela abaixo (Tabela
287) juntamento com a carta que identifica o microrganismo e com o
antibiograma.
Tabela 27- Bactérias mais frequentes que se conseguem identificar neste meio através da
coloração/características das colónias assim como carta de identificação e antibiograma
(TSA) mais indicado para as mesmas.
Bactéria Cor/Características das
colónias Identificação+TSA
Escherichia coli Rosa/vermelho escuro Carta 113
Proteus Castanha/beje Carta GN+113
KES
(Klebsiella,
Enterobacter,
Mucóides verdes (maiores) Carta GN+113
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 148 Andreia Delgado Crisóstomo
Serratia)
Enterococcus Verdes pequenas Carta GP+586
Pseudomonas
Beje, acastanhadas, brilho
metálico, aspecto de vidro
partido
Carta GP+93
Streptococcus
agalactiae2 Azul violeta Carta GP+586
1.6.1.2- Pesquisa de Antigénios: Streptococcus pneumoniae/Legionella (Figura 15) (Este
teste tem como objectivo a detecção de antigénio na urina, sendo um dado auxiliar no
diagnóstico de infecções.)
• Deitar 10 mL de urina para um tubo com tampa e centrifugar 2000 rpm durante 10
minutos;
• Decantar o sobrenadante;
• A ansa do teste mergulha no sedimento da
urina, tendo o cuidado de limpar o excesso
às paredes do tubo;
• Introduzir a mesma no local indicado do
“cartão”;
• Adicionar 3 gotas de reagente A;
• Deixar incubar 15min;
• Ler o resultado;
• Resultado: Negativo: 1 linha;
Positivo: 2 linhas;
Inválido : 0 linhas.
1.6.2- Fezes (Despiste por rotina de Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter
jejunii/coli. Em certos casos, e após contacto com o laboratório: Yersinia
enterocolítica e E.coli enterotoxigénica).
Figura 14- Kits para pesquisa de antigénio na urina
para Streptococcus pneumoniae/Legionella.
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1.6.2.1- Coprocultura
• Mergulhar uma ansa de 10 µL nas fezes e semear em cada um dos meios (HEKT,
YER, CAMP e Selenito) e seguir as condições especificadas na Tabela abaixo
(Tabela 28), assim como o que se espera obter em cada um dos meios.
Tabela 28- Condições de incubação e resultado esperado (coloração/características das
colónias) para os meios HEKT, MCK, YER, CAMP e Selenito.
Meios Condições Cor/Características das colónias
HEKT 1 37ºC, 24h
Esverdiadas, transparentes, com ou sem
produção de H2S (Salmonella e Shigella,
respectivamente)
YER2 30ºC, 48h Rosa com halo mais escuro no interior
CAMP 3 37ºC, 48h, microaerofilia Pequeninas e transparentes
Selenito4 37ºC, 24h _ 1meio selectivo para Salmonella e Shigella; 2para identificar a Yersinia faz-se uma carta de identificação GN; 3das colónias isoladas faz-se uma coloração de Gram para o diagnóstico de
Campylobacter (bactéria Gram negativa; Bastonetes curvos em forma de “~”; Oxidase
positiva); 4serve como meio de enriquecimento para Salmonella e Shigella pois ao fim das 24h
inibe o crescimento de outras bactérias e faz-se então uma passagem de meio líquido
(PML) para HEKT.
1.6.2.1.1- Tipagem de Salmonella:
o Salmonella+soro fisiológico – controlo negativo
o Salmonella+Ag O – Salmonella (confirmação)
o Salmonella+Ag Vi – Salmonella typhi
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o Se Ag O (negativo) e Ag Vi (positivo) – presença de cápsula (requer aquecimento
a 100ºC durante 30minutos)
1.6.2.2- Exame Parasitológico de Fezes (usado para identificar ovos de helmintas e ou
vermes)
• Colector da amostra (tirar fezes do recipiente original);
• Colocar no tubo A (Figura 15 esquerda);
• Agitar no vótex;
• Adicionar 1,25mL de acetato de etilo ao conservante;
• Conectar os tubos A e B (Figura 15 direita) e inverter;
• Deixar filtrar completamente;
• Repousar 5 minutos;
• Centrifugar 1500rpm durante 10 minutos;
• Separar as diferentes fases (descantar o sobrenadante com pipeta);
� Colocar uma gota de sedimento entre lâmina e lamela com uma gota de lugol.
1.6.2.3- Pesquisa de Rotavírus (o Rotavírus é o principal agente causal de diarreias graves
em crianças com menos de 5 anos; a sua taxa de incidência ocorre na faixa etária entre os
6-24 meses; estas pesquisas são mais pedidas nos meses de Novembro a Abril pois trata-
se de uma infecção sazonal.)
• Colocar 0,5mL solução tampão num tubo;
• Amostras líquidas: 2 ansas de 10µL;
• Amostras sólidas: 1 ansa de 10µL;
• Homogeneizar a solução e deixar repousar 2 minutos;
• Retirar a ansa e mergulhar tira sensibilizada no sentido indicado pela seta azul;
• Deixar incubar 10 minutos;
• Leitura do resultado deverá ser feita 10 minutos após a incubação. Verifique que a
tira esteja húmida! Este detalhe é muito importante pois uma tira seca poderá
indicar um falso resulatdo.
Figura 15- Tubo A e
tubo de filtração cónico
(B), respectivamente.
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• Resultado: Negativo: 1 linha;
Positivo: 2 linhas;
Inválido : 0 linhas.
1.6.3- LCR (tem como objectivo o despiste de uma possível meningite bacteriana
causada por determinado agente etiológico; é uma situação clínica grave e
potencialmente mortal se não tratada atempadamente. Geralmente são as bactérias
aeróbias que causam esta infecção, mas na presença de abcesso cerebral o agente
etiológico pode ser uma bactéria anaeróbia.)
• V(amostra) >1mL – centrifugar a 2000rpm, durante 20 minutos;
• V(amostra) <1mL – usar o vórtex para homogeneizar a amostra;
• Aspirar o sobrenadante deixando 0,5 – 1mL de sedimento e guardar aquele para
estudos adicionais, durante uma semana;
• Ressuspender o sedimento agitando vigorosamente;
• Preparar lâminas, uma para Gram*, outra para Ziehl-Nelsen**;
• Com uma pipeta esterilizada, colocar 1 – 2 gotas do sedimento nos meios que se
encontram descritos na Tabela abaixo (Tabela 29) juntamente com as condições
de incubação dos mesmos.
Tabela 29- Meios usados para amostras de LCR e condições de incubação dos mesmos.
Meios Condições
COS1 37ºC, 5% CO2, 48h
HAEM 37ºC, 5% CO2, 48h
VCA2 37ºC, 5% CO2, 48h
BHI 3 37ºC, aerobiose, 48h 1meio usado para isolar e detectar hemólise de bactérias fastidiosas (sem hemólise: o
meio não muda de cor; α-hemólise: presença de um halo verde à volta da colónia; β-
hemólise: presença de um halo claro à volta da colónia);
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2gelose de chocolate+Antibiótico (Bacitracina); selectivo para a pesquisa de N.
meningitidis e N. gonorrhoeae; 3com passagem para COS se apresentar turvação.
1.6.4- Hemoculturas (A grande maioria das doenças infecciosas podem decorrer com
bacteriémia transitória, intermitente, ou persistente (ex. endocardite). Como o sangue é
um produto biológico estéril, o isolamento de um microrganismo a partir duma
hemocultura é geralmente o agente etiológico da infecção.)
1.6.4.1- Hemoculturas Positivas
• Desinfectar o topo da garrafa com betadine;
• Espetar uma agulha;
• Deitar 3 gotas de amostra na placa (COS – 37ºC, 5% CO2, 48h) e semear pela
técnica dos quadrantes;
• Deitar 1 gota na lâmina para corar (Gram* e/ou Ziehl-Nelson**).
1.6.5- Secreções Brônquicas, Expectoração, Lavado Bronco-Alveolar
• Tirar com uma ansa de 10µL amostra e pôr na zona de inóculo dos meios
indicados na Tabela abaixo (Tabela 30) e depois fazer a sementeira pela técnica
dos quadrantes.
Tabela 30- Meios usados para amostras respiratórias (Secreções Brônquicas,
Expectoração e Lavado Bronco-Alveolar) e condições de incubação dos mesmos.
Meios Condições
COS 37ºC, 5% CO2, 48h
HAEM 37ºC, 5% CO2, 48h
MCK 37ºC, 24h
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• Pôr um pouco de amostra numa lâmina e virar a outra e juntá-las de modo a
esmagar o produto entre ambas;
• Estirar até o produto estar bem espalhado e esmagado;
• Secar durante a noite;
• Fazer coloração de Gram* e Ziel-Nelsen**;
• No exame directo é que vamos saber se a amostra é de boa qualidade, e para isso
ser a amostra tem de apresentar, na objectiva de 10x, < 10 células epiteliais e > 25
leucócitos/campo (isto não incluí os LBA, visto que, se o produto for colhido tal e
qual como é descrito, não apresenta contaminação).
1.6.6- Líquidos Pleurais, Ascíticos, Pericárdicos (Os líquidos orgânicos são
normalmente estéreis e qualquer microrganismo encontrado deve ser investigado. A
interpretação final deve ter em conta o estado clínico do doente e o
microrganismo isolado.)
• Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação a 1500rpm,
durante 10 minutos, enquanto as amostras purulentas podem ser inoculadas
directamente nos meios de cultura indicados na Tabela 32;
• Tiramos o sobrenadante até aos 2mL para tubo limpo e identificado;
• Homogeneizamos (tiramos 1mL com uma pipteta);
• Colocamos então 1 gota nos meios descritos na Tabela seguinte (Tabela 31) e em
cada lâmina (uma para Gram* e outra para Ziel-Nelsen**).
Tabela 31- Meios usados para amostras de Líquidos Pleurais, Ascíticos, Auriculares e
Pericárdicos e condições de incubação dos mesmos.
Meios Condições
COS 37ºC, 5% CO2, 48h
CNA 37ºC, 5% CO2, 48h
MCK 37ºC, 24h
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• Restante produto na pipeta vai para o BHI e homogeneizamos;
• Com uma ansa de 10µL faz-se a sementeira, pela técnica dos quadrantes, e com a
mesma ansa espalhamos as gotas nas lâminas, de modo a facilitar a técnica de
coloração, visto que a fibrina dificulta a visualização.
1.6.7- Exsudados Purulentos
• Por espalhamento com zaragatoa na zona de inóculo dos meios descritos na
Tabela abaixo (Tabela 32), e com uma ansa de 10 µL vamos semear pela técnica
dos quadrantes;
• Depois vamos introduzir a mesma zaragatoa no BHI (Tabela 33);
Tabela 32- Meios usados para amostras de Exsudados Purulentos e condições de
incubação dos mesmos.
Meios Condições
COS 37ºC, 5% CO2, 48h
CNA 37ºC, 5% CO2,48h
MCK 37ºC, 24h
BHI 37ºC, 24h
• Com a outra zaragatoa vamos fazer o esfregaço nas lâminas (uma para corar pelo
Gram* e outra pelo Ziehl-Nelsen**).
1.6.8- Catéter Intravascular
• Retira-se o catéter com a ajuda da ansa e semeia-se em COS (37ºC, 5% CO2, 48h)
pela técnica de Macki.
1.6.9- Exsudados Vaginais
• Introduzir o espéculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiológico
estéril.
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• Colher o exsudado do fundo de saco posterior e/ou paredes vaginais com
zaragatoa de alginato de cálcio ou dacron.
• Repetir a operação com uma 2ª zaragatoa e efectuar esfregaço após o acto da
colheita (2 lâminas para Gram*).
1.6.10- Exsudados Vaginais/Anais (Pesquisa de Streptococcus agalactiae).
(Quanto ao exsudado anal)
• Introduzir uma zaragatoa suavemente através do esfíncter anal.
• Rodar contra as criptas rectais, deixar 10-30 segundos para fixar os
microrganismos e retirar.
• Evitar o contacto com matéria fecal. Quando a zaragatoa ficar contaminada com
fezes, deve obter-se nova amostra.
• Introduzir a amostra em meio de transporte com carvão, que se deve manter à
temperatura ambiente.
� Exame DIRECTO:
- A fresco - observar a presença presença de leucócitos, hemácias,
Trichomonas vaginalis, formas leveduriformes, “clue-cells” e
células epiteliais.
- Após coloração - corar o esfregaço pelo método de Gram para semi-
quantificar bacilos Doderlein, visualizar a presença de
Gardnerella vaginalis e formas leveduriformes (Figura
16 Direita) apresentadas abaixo.
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- Streptococcus agalactiae - valorizar em grávidas.
1.6.11- Exsudado Faríngeo (A principal causa de faringite é viral. Na faringite
bacteriana a principal causa é o Streptococcus β-hemolítico do grupo A.)
• Zaragatoa: esta deve colher o exsudado do local purulento. Se não se observar pús, a
zaragatoa deve tocar e rodar nas duas amígdalas e na parede posterior da faringe.
Enviar em meio de transporte;
• Sementeira em meio gelose-sangue;
• Observar às 24 e 48 horas.
Para a pesquisa de antigénio o procedimento aconselhado é o seguinte:
• Deitar 4 gotas do reagente para um tubo e introduzir a zaragatoa;
• Deixar a zaragatoa mergulhada cerca de 5 minutos;
• Posteriormente, tendo o cuidado de limpar o excesso às paredes do tubo, a
zaragatoa é dispensada e vertemos a suspensão para o poço indicativo para a
amostra (Kit);
• Deixar incubar 10 minutos;
• Ler o resultado;
• Resultado: Negativo: 1 linha
Positivo: 2 linhas
Inválido : 0 linhas
1.6.12- Técnicas de apoio à identificação do microrganismo
1.6.12.1- Coloração de Gram*
1) Fixar a lâmina durante 1 minutos em metanol e deixar secar;
2) Cobrir o esfregaço com cristal de violeta e deixar actuar 1 minutos;
3) Passar por água corrente;
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4) Cobrir com lugol e deixar actuar também 1 minutos;
5) Lavar novamente com água;
6) Cobrir com fucsina, deixando actuar durante 1 minutos;
7) Passar bem por água e deixar secar;
8) Observar ao microscópio a 100X;
9) Gram positivo: violeta (mais peptidoglicano)
Gram negativo: vermelho/rosa
1.6.12.2- Coloração de Ziehl-Nelsen**
1) Fixar a lâmina durante 1 minuto em metanol e deixar secar;
2) Cobrir o esfregaço com fucsina e aquecer até à emissão de vapores. Não deixar
ferver;
3) Deixar actuar durante 10 minutos;
4) Lavar com água;
5) Cobrir com álcool-ácido e deixar actuar cerca de 1min (se necessário passar mais
álcool-ácido até não sair mais cor vermelha);
6) Lavar com água;
7) Cobrir com azul de metileno e deixar actuar 1 minuto;
8) Lavar com água e deixar secar;
9) Observar ao microscópio a 100X;
10) Micobactérias (bacilos álcool-ácido resistentes): vermelho;
Fundo contraste azul.
1.6.12.3- Gram de colónias
• Colocamos 1 gota de soro sobre a lâmina;
• Com uma ansa de 10µL, retiramos 4 colónias do meio e homogeneizamos ao lado
da gota de soro;
• Depois puxamos o soro em direcção da colónia e homogeneizamos tudo muito
bem e deixamos secar;
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 159 Andreia Delgado Crisóstomo
• Seguidamente realiza-se a coloração de Gram*.
1.6.12.4- Teste da Potassa
• A parede das bactérias Gram negativo é facilmente rompida por uma solução
alcalina diluída e os restos de DNA libertados permanecem agregados na
suspensão, apresentando a formação de um filamento. Nas bactérias Gram
positivo, por a parede celular ser mais resistente, não apresentam este aspecto.
• Coloca-se uma gota de KOH a 3% numa lâmina e faz-se uma suspensão,
bem homogeneizada, com uma ansa, elevando-se várias vezes 1- 2 cm. Se, ao
elevar a ansa, se observa a formação de um fio a reacção é positiva, indicando a
presença de um microrganismo Gram negativo. (Reacção positiva)
1.6.12.5- Teste de Oxidase
• Permite distinguir as bactérias pertencentes à Família Pseudomonadeceae
(oxidase positivo) das bactérias pertencentes à Família Enterobacteriaceae
(oxidase negativa).
• Este teste coloca em evidência a actividade citocromo oxidase, a qual cataliza a
reacção de oxidação do citocromo c pelo oxigénio molecular e intervem na cadeia
respiratória da bactéria. Na presença de oxigénio na atmosfera e de citocromo c,
esta enzima oxida o reagente fenilenodiamina, para formar um composto colorido
violeta, o indofenol. O ácido ascórbico, incorporado no reagente, age enquanto o
agente redutor para limitar a auto-oxidação e melhorar a estabilidade do reagente.
1.6.12.6- Teste da Catalase
• A enzima catalase desdobra o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio. Esta
característica permite fazer a distinção entre Staphylococcus spp., catalse positiva,
e os Streptococcus spp., catalase negativo e assim consegue-se uma identificação
definitiva.
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1.6.12.7- Teste de Optoquina
• A optoquina inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae, provocando um
halo de inibição da cultura na placa de COS.
1.6.12.8- Slidex® Strepto Plus (Grupagem Streptococcus):
1) Num tubo vamos colocar 3 colónias + 4 gotas de enzima de extracção geral;
2) Incubar na estufa a 37ºC durante 10 minutos;
3) Num cartão descartável do Kit (apresentado na figura abaixo - Figura 17), colocar
1 gota de suspensão + 1 gota de anticorpo (da grupagem);
4) Homogeneizar com bastonete descartável, com um ligeiro movimento rotativo,
durante 2 minutos;
5) Ler o resultado: Positivo – aglutina;
Negativo – não há aglutinação.
Figura 17- Slidex® Strepto Plus (Grupagem de Streptococcus; esquerda – embalagem;
direita – mostra o conteúdo da embalagem).
1.6.12.9- Slidex® STAPH PLUS (diferencia Staphylococcus aureus das outras espécies
de Staphylococcus, maioritariamente, Coagulase negativa – Figura 18):
• Deixar os reagente à temperatura ambiente antes de utilizar;
• Efectuar correctamente a suspensão dos reagentes, eliminar as bolhas de ar ou
retidas no conta-gotas;
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• Numa carta descartável ou lâmina de vidro limpa:
- 1 gota de R1 (Reagente anti- Staphylococcus aureus);
- 1 gota de R2 (Reagente controlo);
(ter o cuidado de segurar os frascos com conta-gotas verticalmente quando
dispensar as gotas).
• Com uma ansa ou um bastonete descartável, homogeneizar cuidadosa e
completamente durante 10 segundos, 1 ou 2 colónias suspeitas de tamanho médio
provenientes de uma gelose não-selectiva ou 3 a 6 colónias muito pequenas
provenientes de uma gelose selectiva;
• Girar a lâmina com um ligeiro movimento rotativo durante 20 segundos e ter a
reacção sob luz normal;
• Ler o resultado: Positivo – aglutinação;
Negativo – não há aglutinação.
Figura 18- Embalagem Slidex® STAPH PLUS.
1.6.12.10- VITEK2
É um equipamento, apresentado na figura abaixo (Figura 19), que mede a
densidade óptica (DO) da suspensão (colónia pura + solução salina de VITEK2) sendo
capaz de identificar o microrganismo presente na mesma e, quando adicionada a carta de
TSA faz o antibiograma. Cada carta de identificação tem um intervalo de DO, quando a
DO medida é inferior ao intervalo adiciona-se mais colónias até o valor estar dentro do
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• São imóveis, não formam esporos e habitualmente são catalase positiva e
desprovidos de cápsula. A maioria das espécies é anaeróbia facultativa.
• O género Staphylococcus existe em abundância na natureza, encontrando-se
principalmente na pele e mucosas dos mamíferos e aves.
GÉNERO STREPTOCOCCUS e outros COCOS GRAM POSITIVO e CATALASE
NEGATIVA:
• Streptococcus β-hemolítico do Grupo A de Lancefield (S. pyogenes): Significado
CLÍNICO - É a causa mais frequente da amigdalite bacteriana nas crianças dos 5
aos 10 anos de idade.
• Streptococcus β-hemolítico do Grupo B de Lancefield (S. agalactiae): A
importância do Streptococcus do grupo B advém do seu potencial
infeccioso no recém-nascido.
• Streptococcus pneumoniae: Fazendo parte da flora indígena da orofaringe é a
principal causa de pneumonia da comunidade e frequente causa de otite média,
sinusite e meningite.
• Enterococcus spp: Dentro dos cocos Gram positivo é o agente mais
frequentemente associado a infecção urinária. Está também muitas vezes
associado à Infecção Hospitalar.
1.6.13.2- Identificação de Cocobacilos Gram Negativos
GÉNEROS NEISSERIA:
• Estes microrganismos são cocos Gram negativo. Organizam-se em pares ou
pequenas cadeias, sendo que os pares apresentam os lados adjacentes achatados
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 164 Andreia Delgado Crisóstomo
com a forma de grão de café ou de rim. A divisão celular é em dois planos em
ângulo recto por vezes com a formação de tetradas.
• As células individuais variam em tamanho de 0,6 a 1,5 mm dependendo da
espécie, local de isolamento e idade da cultura.
• São imóveis e não produzem esporos.
• As espécies patogénicas para o Homem são, geralmente, exigentes nas
necessidades de crescimento, com um desenvolvimento óptimo a 35º C e
metabolizam poucos ou nenhuns hidratos de carbono. São capnofilicas e
desenvolvem-se melhor em atmosfera húmida.
• Todas as espécies são oxidase positiva e catalase positiva (excepto a N. elongata
que é catalase negativa).
• O habitat natural destas bactérias são as membranas mucosas dos animais de
sangue quente.
GÉNERO HAEMOPHILUS: Este género inclui várias espécies:
- H. .influenzae
- H. parainfluenzae
- H. haemolyticus
- H. parahaemolyticus
- H. aphrophilus
- H. paraphrophilus
- H. segnis
- H. ducreyi
• As espécies deste género fazem parte da flora habitual do aparelho
respiratório superior humano e dos animais (com excepção do H. ducrey).
As espécies consideradas patogénicas para o homem são: H. influenzae, H.
parainfluenzae, H. aphrophilus e H. ducreyi.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 165 Andreia Delgado Crisóstomo
• As infecções humanas variam desde as não complicadas e facilmente
tratáveis (conjuntivite, otite média aguda, sinusite, etc.) até às invasivas e
potencialmente mortais (pneumonia, meningite, pericardite, endocardite, etc.) –
geralmente causadas pela espécie H. influenzae.
1.6.13.3- Identificação das Enterobacteriáceae
• As bactérias da família das Enterobacteriaceae são agentes comuns de infecção no
Homem.
• Estas estirpes bacterianas são das mais frequentemente isoladas no
Laboratório de Microbiologia, do ambiente ou colonizadores de outros animais.
• Todos os membros das Enterobacteriaceae são:
- Bacilos Gram negativo
- Oxidase NEGATIVA
- Fermentam a glicose
- Crescem em gelose de MacConkey
- A maior parte também reduz os nitratos a nitritos
• As Enterobacteriaceae clinicamente relevantes podem ser consideradas em 2
grupos:
· Bactérias patogénicas oportunistas (os mais comuns)
- E. coli.
- Klebsiella spp.
- Proteus spp.
- Enterobacter spp.
- Serratia spp.
- Citrobacter spp.
· Bactérias patogénicas obrigatórias
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 166 Andreia Delgado Crisóstomo
- Salmonella spp
- Shigella spp.
- Yersinia pestis, Y. enterocolítica, Y. pseudotuberculosis
1.6.13.4- Bacilos Gram Negativo não fermentativos
GÉNERO PSEUDOMONAS:
• Grupo de bacilos Gram negativo, aeróbios estritos, oxidase positiva, não
fermentativos, móveis por 1 flagelo polar, que utilizam uma variedade de carbohidratos,
álcoois e aminoácidos como fontes de energia. São bacilos com 1 a 5 mm de
comprimento e 0,5 a 1 mm de largura.
• São bactérias mesofílicas: têm uma temperatura óptima de crescimento entre
30 e 37º C, mas podem sobreviver a baixas temperatura (4º C), ou crescer a 42º
C.
• As Pseudomonas são bactérias patogénicas oportunistas, responsáveis por
infecções nosocomiais, sendo as mais frequentes: P. aeruginosa, P. fluorescens,
P. putida, P. stutzeri.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 167 Andreia Delgado Crisóstomo
1.7- Controlo de Qualidade
1.7.1- Controlo Interno
Chama-se Controlo Interno ao conjunto de métodos usados no laboratório com
vista a controlar todos os resultados obtidos antes de chegarem ao médico.
Em relação aos aparelhos automáticos normalmente são usados 2 controlos (um
normal e um patológico) que são inseridos no ínicio de cada dia de trabalho, para se ter a
certeza que todos os resultados desse dia são os verdadeiros para cada doente.
Em relação a técnicas manuais como as serologias, o controlo faz-se na abertura de
cada lote e sempre que houver dúvidas em relação a determinado teste.
Por último, temos de controlar os meios usados na microbiologia pois temos que
assegurar que estão em perfeitas condições para que não apresentem microorganismos
que não estão presentes na amostra do doente. Para isso temos de fazer o teste da
esterilidade para ver se ocorre ou não crescimento bacteriano, no qual a placa fica a 37ºC
durante 48h. Na microbiologia são também usados microrganismos de referência
(estirpes ATCC).
1.7.2- Controlo Externo
O Controlo Externo consiste numa avaliação dos resultados do laboratório por um
organismo exterior. Este fornece amostras aos laboratórios participantes, em determinado
programa de controlo externo, que têm de ser tratadas como amostras normais,
apresentando no final um relatório no qual se introduz os resultados. O organismo
exterior recebe todos os relatórios e avalia a qualidade dos resultados. Esta é uma boa
maneira de controlar determinados parâmetros e ajuda a perceber se os participantes têm
ou não de reformular certos métodos de modo a melhorar.
O controlo externo a nível dos laboratórios onde passei neste estágio eram o
NEKAS (United Kingdom National External Quality Assessment Services) e um
Programa de Qualidade Espanhol de Bioquímica (SEQC).
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 168 Andreia Delgado Crisóstomo
1.7.3- Cálculo e utilização dos valores estatísticos no Controlo de Qualidade
Tanto para o controlo interno como para o externo são necessários dados
estatísticos que nos mostrem que para cada parâmetro há um intervalo específico para
cada nível de controlo. Os valores estatísticos mais importantes num Laboratório de
Análises Clínicas são a Média e o Desvio padrão, equações apresentadas de seguida
(Equação 3 e 4, respectivamente).
∑=n
xx n~
Onde: �� = Média
Σ = somatório
�n = cada valor da série de dados
n = número de valores da série de dados
∑��� � ���� = somatório dos quadrados das diferenças entre os valores individuais
e a Média
Equação 3- Fórmula para cálculo da Média.
1
)~( 2
−−
= ∑n
xxDP n
Onde: DP = Desvio Padrão
Σ = somatório
�n = cada valor da série de dados
n = número de valores da série de dados
∑��� � ���� = somatório dos quadrados das diferenças entre os valores individuais
e a Média
Equação 4- Fórmula para cálculo do Desvio Padrão.
Os gráficos de Levey-Jennings são usados para reportar os valores de qualidade
sucessivos (dia a dia, corrida a corrida). O gráfico é criado para cada teste e nível de
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 169 Andreia Delgado Crisóstomo
controle. A primeira etapa é calcular os limites de aceitação (±1DP, ±2DP e ±3DP da
média). Os resultados que se encontram dentro de ±1DP são os esperados, resultados
dentro de ±2DP são aceitáveis e dentro de ±3DP têm de ser controlados mais de perto.
Pois valores superiores a 3DP não devem ser reportados.
É atraves destes gráficos que o operador deve procurar por erros sistemáticos e
erros aleatórios:
• Erros sistemáticos são evidenciados por uma mudança na Média dos valores de
controle. A mudança na Média pode ser gradual e demonstrar uma tendência ou
pode ser abrupta e demonstrar uma mudança.
• Erros aleatórios são qualquer desvio que afaste dos resultados esperados. Aceita-
se (ou espera-se) que estes erros sejam definidos e quantificados pelo desvio
padrão. Não se aceita (não se espera) que um erro destes seja um ponto fora dos
dados esperados da população, isto é, pontos fora do limite ±3DP.
Existem também as 6 regras básicas no esquema de Westgard que são utilizadas
individualmente ou em combinação para avaliar a qualidade das corridas analíticas.
Westgard criou uma notação específica para expressar as regras de controle da
qualidade e a forma foi a seguinte: NL, onde N representa o número de observações do
controle a ser avaliado e L representa o limite estatístico para avaliação das observações.
As regras de Westgard mais vulgarmente utilizadas são as seguintes:
• 12DP – é uma regra de advertência; quer dizer que um único controle está fora
dos limites de 2DP.
• 13DP – é uma regra que identifica erros ao acaso ou a possibilidade do início
de um grande erro sistemático; quer dizer que um único controle está fora dos
limites de 3DP.
• 22DP – é uma regra que identifica somente erros sistemáticos; quer dizer que 2
resultados de CQ consecutivos estão fora dos limites de 2DP.
• R4DP – é uma regra que identifica somente erros ao acaso e é aplicada
somente em corridas intra-ensaio; quer dizer que uma diferença de 4DP entre
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 170 Andreia Delgado Crisóstomo
os valores do controle de uma única corrida intra-ensaio, a regra é violada
para erro aleatório.
• 31DP – quer dizer que há 3 resultados consecutivos que estão fora dos limites
de 1DP.
• 41DP – quer dizer que há 4 resultados consecutivos que estão fora dos limites
de 1DP.
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO 171 Andreia Delgado Crisóstomo
1.8- Conclusão
Este estágio permitiu-me colocar em prática conhecimentos adquiridos na
componente curricular do mestrado, assim como realizar outras e novas aprendizagens.
Pude compreender tudo o que se passa desde a colheita das várias amostras, ao
seu processamento de modo a dar resultados que são posteriormente validados.
Também tive a possibilidade de participar em formações que me foram muito
úteis para compreender melhor o manipulação de certos aparelhos, como o
DIMENSION® EXL, ADVIA ® 120 e o ImmunoCAP 250.
Para concluir, considero essencial ressalvar a importância que este estágio teve no
culminar deste mestrado, uma vez que me proporcionou experienciar situações que eu
nunca tinha vivenciado e que considero terem sido fundamentais para uma prática
profissional de maior qualidade.
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BIBLIOGRAFIA
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Ricardo Jorge, Observatório Nacional da Saúde (ONSA), Orientações para a Elaboração
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Ed, 2008.
MacPhee S.J, Ganong W.F. Fisiopatologia da Doença – Uma Introdução à Medicina. 5th
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Stites D.P., Stobo J.D., Fudenberg H. H., Wells J.V. Basic & Clinical Immunology, 5th Ed
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II Mestrado em Análises Clínicas
RELATÓRIO DE ESTÁGIO 173 Andreia Delgado Crisóstomo
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