recreixement en basses d‘emmagatzematge€¦ · provinent de l’edar de castell- platja d’aro...

Avaluació de la capacitat de recreixement de

diferents indicadors bacterians en basses

d’emmagatzematge d’aigua regenerada

provinent de l’EDAR de Castell- Platja d’Aro

INFORME FINAL

Grup d’Ecologia Microbiana Molecular Institut d’Ecologia Aquàtica

Universitat de Girona

Institut d’Ecologia Aquàtica, Universitat de GironaRecreixement en basses d‘emmagatzematge

2

Aquest informe correspon a la memòria final del treball “Avaluació de la

capacitat de recreixement de diferents indicadors bacterians en basses

d’emmagatzematge de l’aigua regenerada per l’Estació Depuradora

d’Aigües Residuals de Castell Platja d’Aro”, corresponent a l’acord de

col·laboració científica 057/07entre la Universitat de Girona i el Consorci de la

Costa Brava S.A.

En la realització d’aquest projecte han participat:

• Sílvia Quintana Cerrato (Cap de Laboratori de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro, EMACB SA.)

• Marta Segura Aliaga (Becària contractada a través de l’esmentat conveni)

• Dr. Carles Borrego (Supervisor, Professor Titular de Microbiologia de la UdG i membre del Grup de Microbiologia Microbiana Molecular de l’Institut d’Ecologia Aquàtica)

Girona, Agost de 2008

El Grup de Recerca del que en soc membre vol agrair a tot el personal de l’Estació Depuradora

d’Aigües Residuals de Castell-Platja d’Aro, i en especial al Sr. Pablo Bascu, la seva col·laboració i

total disponibilitat durant totes la realització d’aquest treball. Estem segurs que sense la seva ajuda

la feina a realitzar se’ns hagués fet més feixuga.


3

ÍNDEX

1. Introducció .................................................................................................... 4

Objectius ........................................................................................................ 6

2. Material i Mètodes ......................................................................................... 7

2.1 Disseny Experimental ............................................................................... 8

2.1.1 Preparació de las membranes de diàlisi ...................................... 8

2.1.2 Inoculació de les membranes ...................................................... 8

2.1.3 Col·locació del sistema d’incubació ............................................. 10

2.1.4 Mostratge ..................................................................................... 11

2.1.5 Anàlisis microbiològiques ............................................................. 12

2.1.6 Càlculs ......................................................................................... 13

3. Resultats ........................................................................................................ 14

3.1 Anàlisi microbiològica de l’inòcul .............................................................. 14

3.2. Experimental nº 1 (23–28/Juliol/2007) ..................................................... 15

3.2. Experimental nº 2 (3–10/Setembre/2007) ............................................... 18

3.2. Experimental nº 3 (21–31/Gener/2008) ................................................... 22

4. Conclusions .................................................................................................. 28

5. Referències .................................................................................................... 30

ANEX .................................................................................................................. 32


4

1. INTRODUCCIÓ

L’any 2006, Consorci de la Costa Brava (CCB) i el Grup d’Ecologia Microbiana

Molecular de l’Institut d’Ecologia Aquàtica de la UdG van signar un acord de col·laboració

científica per estudiar l’evolució de la qualitat microbiològica de l’aigua regenerada en sis-

temes d’emmagatzematge fora de la planta de depuració. Aquest projecte tenia com un dels

principals objectius el de determinar si en aquests sistemes artificials els diferents grups

bacterians utilitzats rutinàriament com indicadors de qualitat microbiològica d’aigües po-

dien sobreviure i créixer fins a superar els valors màxims admesos en la normativa. Aquest

projecte es va portar a terme durant els mesos de Juliol a Setembre de 2006 estudiant

diferents llacunes situades en tres camps de Golf (Golf d’Aro, Gols Serres de Pals i el Golf

Empordà) que s’abastien d’aigua regenerada produïda en tres EDAR gestionades pel CCB,

la de Castell-Platja d’Aro, la de Pals i la de Torroella, respectivament. El projecte va donar

lloc a un informe final (Mestre, 2007) que va proporcionar dades claus per entendre millor

el comportament de diferents microorganismes indicadors de contaminació fecal una

vegada aquests han superat el procés terciari de regeneració de l’aigua i són “alliberats” en

llacunes artificials on s’emmagatzema l’aigua regenerada abans del seu ús (en aquest cas

pel reg dels camps de golf).

Com sempre passa, el treball va tancar alguns interrogants però en va obrir molts d’altres.

Una de les qüestions que es va plantejar, i que en el seu moment va quedar pendent, fou

com discriminar la supervivència i/o creixement dels microorganismes aportats a la llacuna

per l’aigua regenerada de la d’aquells ja presents en l’ecosistema i que constituïen la seva

comunitat planctònica “natural”. Aquest fou un problema especialment greu ja que algunes

de les llacunes estudiades, entre elles la GdA2 del Golf d’Aro, rebien la visita de nombro-

ses aus aquàtiques (gavines, bàsicament) i mantenien també una població permanent

d’ànecs coll verd (Anas platyrhynchos) que aportaven una gran quantitat de microbiota fe-

cal a la llacuna a través de les seves femtes (Mestre, 2007). De fet, les concentracions de

Coliformes, Salmonella i Enterococs fecals en femtes d’aus aquàtiques i el seu impacte en

la qualitat microbiològica de l’aigua ha estat estudiat amb detall per diferents autors (Roll


5

& Fujioka, 1997; Gibbs et al., 1997; Muniesa et al., 1999; Ashbolt et al., 2001; Kuntz et

al., 2004; Murphy et al., 2005; Wither et al., 2005). No cal dir doncs que aquestes

aportacions de microbiota al·lòctona malmetien la qualitat de l’aigua emmagatzemada,

comprometien seriosament qualsevol analítica posterior i comportaven un risc sanitari que

no té perquè ser obviat.

Tot plegat va portar a plantejar-nos la necessitat d’establir una nova col·laboració científica

per tal de determinar en quina mesura aquells microorganismes presents en l’aigua

regenerada i que havien sobreviscut al procés de regeneració (tractament combinat de radi-

ació ultraviolada i addició de clor en el cas de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro) podien revi-

far i créixer una vegada “alliberats” a la llacuna. Un altra possibilitat, potser més interes-

sant, era la de determinar si aquests microorganismes desapareixien a mesura que passava

el temps i si aquesta desaparició estava en funció de les condicions físico-químiques de la

pròpia llacuna, i per tant, de les condicions atmosfèriques. Si fos així, la desaparició pro-

gressiva d’aquests microorganismes indicadors en el seu hàbitat no natural (la llacuna)

permetria mantenir una bona qualitat microbiològica de l’aigua regenerada encara que

s’emmagatzemés durant períodes de temps prou llargs i sempre que s’evités la contamina-

ció fecal d’origen extern.

És en aquest context en el que s’emmarca el present projecte. S’ha pres especial cura en el

disseny experimental per tal d’evitar, o minimitzar, la interferència de la microbiota

al·lòctona (d’origen animal o altri) en els recomptes i en la determinació de les cinètiques

de creixement/mort dels diferents indicadors bacterians. Tot i que ara per ara la normativa

no contempla les anàlisis microbiològiques de l’aigua regenerada posteriors a la seva en-

trega, hem cregut adient avançar-nos i esbrinar l’efecte que poden tenir les condicions

d’emmagatzematge d’aquesta aigua en la seva qualitat microbiològica i com els microorga-

nismes responen una vegada “alliberats” en l’ambient. Hem d’esperar que tant els resultats

d’aquest estudi com els d’altres passats o futurs ajudin a gestionar millor no només la pro-

ducció d’aigua regenerada sinó també la seva posterior distribució, emmagatzematge i ús.


6

Objectius

Els objectius del present treball han estat:

• Determinar en quina mesura diferents indicadors bacterians de contaminació fecal

(Coliformes Totals, Escherichia coli, Enterococs Fecals i Clostridis Sulfit Reductors)

són capaços de sobreviure en llacunes d'emmagatzematge d'aigua regenerada o bé pa-

teixen una disminució en el seu número inicial a mida que passa el temps,

• Determinar les taxes de creixement/mort dels diferents indicadors bacterians seleccio-

nats així com d’altres paràmetres relacionats que serveixin per modelar el seu compor-

tament durant l’emmagatzematge en les basses i poder-lo comparar entre diferents sis-

temes, i

• Establir si les condicions ambientals del ecosistema, influenciades per les condicions

atmosfèriques imposades per l’estacionalitat, tenen algun efecte en la supervivència

dels diferents indicadors en aquests hàbitats artificials.

Per assolir aquests objectius s’han platejat una sèrie d'experiments basats en la incubació

“in situ” de mostres inoculades a una concentració coneguda dels diferents indicadors i que

s’han analitzat a intervals regulars de temps per determinar el nombre de supervivents i

establir les cinètiques de desaparició o, si s’escau, de creixement i calcular-ne les taxes cor-

responents. Aquestes s’han comparat i relacionat en funció de les condicions ambientals

dominants en l’ecosistema estudiat durant els dos períodes d’estudi (estiu/hivern).


7

2. MATERIAL i MÈTODES

En tots els experiments realitzats, el treball experimental va consistir en la incubació

d’una sèrie de mostres, prèviament inoculades amb una concentració coneguda dels

microorganismes indicadors, en la llacuna artificial GdA2 del Golf d’Aro (Fig. 2.1). Les

mostres consistien en un número conegut (entre 15 i 20) de sacs de diàlisi que contenien

una suspensió homogeneïtzada de microorganismes realitzades a partir d’una dilució de

l’efluent primari de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro. Una vegada preparades, els sacs de

diàlisi es dipositaven dins d’una gàbia protectora i s’incubaven a mig metre de profunditat

en la llacuna mitjançant un sistema d’ancoratge que n’evitava el moviment i la deriva. A

interval coneguts de temps (aproximadament cada 24 hores durant 7–10 dies) es retiraven

una o dues mostres i es realitzava una analítica microbiològica per determinar el nº de

microorganismes indicadors supervivents i poder calcular així les taxes de mort i establir

les cinètiques de desaparició dels diferents indicadors bacterians en funció del temps. Els

mostratge es van realitzar tant a l’estiu com a l’hivern per poder comparar l’efecte de la

temperatura en la supervivència dels diferents indicadors i estimar el comportament

d’aquests microorganismes en les basses d’emmagatzematge en diferents èpoques de l’any.

Fig. 2.1. Vista general del camp de golf d’Aro. S’hi poden distingir les dues basses GDA1 i GDA2. En aquesta darrera (dreta) és on s’ha realitzat el treball experimental.

Font: http://www.golfdaro.com

http://www.golfdaro.com/


8

2.1. Disseny experimental

A continuació es comenta breument el protocol experimental portat a terme i les

principals anàlisis realitzades.

2.1.1. Preparació dels sacs de diàlisi: Es van utilitzar membranes de diàlisi marca

Visking (Visking Dyalisis Tubing, 31,7 mm: 15M; 12–14000 Da, Medicell

International Ltd.). Aquest material es tallava en porcions d’aproximadament

30–40 cm que es bullien 10 minuts en una solució de rentat (veure Annex).

Passat aquest temps, les membranes es netejaven dues vegades amb aigua

destil·lada i a continuació es bullien 10 minuts més en una solució d’EDTA

1mM (Annex). A continuació es deixaven refredar, es nuava un dels extrems de

cada sac i es dipositaven dins d’una safata estèril a 4 ºC fins el moment del seu

ús. En total es preparaven uns 20–25 tubs per experiment. Tota la manipulació

s’efectuava amb guants de làtex i sota condicions de treball estèril.

2.1.2. Inoculació de les membranes: El dia de l’experimental es procedia a emplenar

les membranes preparades anteriorment amb la suspensió homogeneïtzada de

treball. Aquesta suspensió consistia en una dilució 1/50 de l’efluent primari de

la depuradora de Castell-Platja d’Aro, que es va utilitzar com a inòcul. El

mateix dia es realitzava una anàlisi microbiològica completa d’aquest primari

per conèixer la concentració dels diferents indicadors bacterians en l’inòcul

(veure Apartat 3.1).

La dilució es va realitzar en recipients estèrils i utilitzant dos tipus d’aigua com

a diluent:

a) aigua de l’efluent terciari de la pròpia EDAR: en les rèpliques 1 dels

experimentals de Juliol i Setembre de 2007; o


9

b) aigua de la pròpia llacuna GdA2 (rèpliques 2 dels experimentals de Juliol i

Setembre de 2007, i ambdues rèpliques de l’experimental de Gener de 2008,

Fig. 2.2).

Una vegada realitzada la dilució, aquesta s’homogeneïtzava completament i es

procedia a emplenar amb l’ajuda d’una xeringa estèril de 60 ml els sacs de

diàlisi necessaris per l’experimental (entre 15 i 25 sacs de diàlisi per realitzar

els recomptes diaris previstos). Una vegada plens (aprox. 75–100 ml per sac),

es tancava el sac nuant l’extrem obert i es dipositava en una nevera portàtil.

Totes les manipulacions s’efectuaven amb guants de làtex i sota condicions de

treball estèril.

Fig. 2.2. Esquema (fora d’escala) de la bassa GdA2 on es mostren els punts de recollida de l’aigua que va servir com a diluent per els diferents experimentals

realitzats. El codi de les mostres correspon a Nº de mostratge (1: Juliol 2007; 2: Setembre 2007; 3: Gener 2008) i al Nº de rèplica (1 o 2).

Estació de bombeig i mostratge

Mostra 31

Mostra 32

Sistemad’incubació

en secció

Mostres 12 i 22

en planta

Llacuna GdA2


10

2.1.3. Col·locació del sistema d’incubació i dipòsit de les membranes: Com s’ha

comentat, la incubació de les membranes es va portar a terme a la bassa

d’emmagatzematge GdA2 del Golf d’Aro (Fig. 2.1). Les membranes prepara-

des per l’experimental es dipositaven dins d’un sistema d’incubació que con-

sistia en una gàbia que permetia l’entrada d’aigua però alhora protegia les

membranes de possibles agressions externes. Aquest sistema ha estat utilitzat

amb èxit en d’altres experimentals similars realitzats per grup de recerca en

“Microbiologia d’aigües relacionades amb la Salut” del Prof. J. Jofre i F.

Lucena de la UB. El sistema es va adequar afegint-hi un sistema de pesos i

boies (Fig. 2.3) que permetien la seva subjecció al fons de la llacuna evitant la

seva deriva degut al vent o les corrents d’aigua.

Una vegada dins la gàbia, aquesta es va col·locar dins la llacuna a una profun-

ditat d’uns 50 cm sota la superfície (Fig. 2.4). El sistema dissenyat era de fàcil

ubicació, tenia un impacte visual mínim en el paisatge del Golf i, el més im-

portant, permetia retirar cada dia els sacs previstos per l’anàlisi d’una manera

fàcil i ràpida amb l’ajuda d’una embarcació inflable.

Fig. 2.3. Sistema d’incubació dissenyat per els experimentals realitzats.


11

Fig. 2.4. Col·locació del sistema d’incubació durant el primer dels experimentals realitzats (Juliol, 2007). A la dreta de la imatge es mostra un esquema (fora d’escala) del sistema dissenyat una

vegada col·locat en la llacuna.

2.1.4. Mostratge: Una vegada col·locat el sistema amb les mostres en posició, es

retiraven els sacs de diàlisi corresponents al primer dia (temps 0) i

s’abandonava la llacuna. Aquestes mostres es processaven a l’arribada al

laboratori (veure apartat següent).

A intervals de 24 h es retiraven un o dos sacs de diàlisi en funció del volum de

mostra que es necessitava per les anàlisis microbiològiques i que depenia del Nº

inicial de microorganismes i del Nº de supervivents esperat. Normalment cada

dia es retiraven entre 1 i 2 sacs de diàlisi (cadascun amb un volum d’entre 75 a

100 ml de mostra). L’experimental Nº1 (Juliol 2007) es va allargar durant 4

dies, el Nº2 (Setembre 2007) durant una setmana i el Nº3 (Gener 2008) durant

10 dies. Els intervals de mostratge per cadascun d’aquests experiments

d’incubació es mostren a la Taula 2.1.

boiasuperfície llacuna

Fond

ària

apro

x. 5

m.Sacs de diàlisi

Gàbia de protecció

pes

cadena


12

Taula 2.1: Intervals de mostratge (en hores) per cadascun dels experiments d’incubació realitzats.

2.1.5. Anàlisis microbiològiques

Experiment

: Una vegada al laboratori les mostres es processaven

per realitzar-ne les pertinents anàlisis microbiològiques dels indicadors bacteri-

ans seleccionats. Aquests indicadors foren: Coliformes Totals, Escherichia coli,

Enterococs Fecals i Clostridis Sulfit Reductors. Les anàlisis es van realitzar

mitjançant el mètode de filtració en membrana seguint la normativa bàsica es-

tablerta en les normes ISO corresponents (Coliformes i E. coli (UNE-EN

ISO9308-1) i per Enterococs (UNE-EN ISO 7899-2)). Tot i així i per tal de fa-

cilitar els recomptes i optimitzar el temps i els recursos es va optar per utilitzar

el medi cromogènic MLGA (veure Annex). Aquest medi permet la identificació

i recompte combinat de Coliformes Total i E. coli gràcies dos reaccions bio-

químiques cromogèniques. En concret, el substrat 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-

D-glucurònid (BCIG) és hidrolitzat per l’enzim β-glucoronidasa i produeix un

cromòfor blau que tenyeix les colònies del microorganisme que posseeix aquest

enzim (E. coli). Els coliformes són lactosa positius i les colònies esdevenen

grogues gràcies al viratge de l’indicador de pH (roig fenol). Atès que E. coli és

també un coliforme, les colònies d’aquest microorganismes són verdes

(groc+blau). Aquest medi permet la identificació fiable d’E. coli en només 24 h

a 37 ºC sense necessitat de confirmacions posteriors.

En el cas dels Clostridis, tot i que el mètode utilitzat fou també el de filtració en

membrana, no es va seguir la ISO corresponent (UNE-EN ISO 26461-2) en

Interval de mostratge (hores)

Nº1 (23–28 Juliol, 2007) 0 24 48 72 96 – –

Nº2 (3–10 Setembre, 2007) 0 24 48 72 96 168 –

Nº3 (21–31 Gener, 2008) 0 24 48 72 168 196 240


13

quant l’anàlisi d’espores i el medi recomanat. En el seu lloc es va realitzar un

recompte de clostridis totals (cèl·lules vegetatives i espores) i es va utilitzar el

medi cromogènic m-CP (Annex).

En el primers mostratges també es va procedir als recomptes de Salmonella spp.

Les dificultats sorgides durant el treball experimental pel que fa els recomptes

d’aquest enterobacteri i la incertesa en la seva correcta identificació en el medi

de cultiu seleccionat (agar de Salmonella-Shigella) van fer-nos decidir a des-

cartar l’analítica i per tant, aquests resultats no es mostren en aquest informe.

En la majoria de casos es van realitzar sembres de tres dilucions diferents (nor-

malment filtrant 10, 1 i 0,1 ml de cada mostra) per cobrir amb garanties el rang

de concentracions esperada per l’indicador en estudi. Els resultats es llegien al

cap de 24 o 48 h en funció del tipus d’indicador i de les recomanacions del

protocol en cada cas.

2.1.6. Càlculs: Una vegada fets els recomptes del nº de colònies per placa, es calcu-

lava la concentració de microorganismes (en UFC/100 ml) en la mostra original

i es representava gràficament en funció del temps (veure apartat de resultats).

Això ha permès calcular les taxes de mort (k) per cadascun dels indicadors

aplicant la fórmula:

k (t–1) = (log Nt – log N0) / (tt–t0)

Per facilitar la determinació dels temps necessaris per eliminar el 90% i el 99%

de la població d’indicador (t90 i t99, respectivament) s’ha cregut convenient

representar també la disminució logarítmica en funció del temps. Això permet

extrapolar directament els valors de t90 i t99 directament a partir del les inter-

secció de l’eix de les ordenades corresponents a una (t90) o dues (t99)

disminucions logarítmiques en l’eix de les abscisses.


14

3. RESULTATS

A continuació es mostren els resultats obtinguts durant els tres seguiments

experimental realitzats així com un recull d’una sèrie de paràmetres ambientals mesurats en

les llacunes durant el període d’incubació de les mostres en la llacuna GdA2.

3.1. Anàlisi microbiològica de l’inòcul

Com s’ha comentat en l’apartat d Material i Mètodes, l’homogenat inicial amb la que

es realitzaven les incubacions era una dilució de l’efluent primari de la pròpia EDAR de

Castell-Platja d’Aro. La dilució es realitzava o bé amb aigua del terciari de l’EDAR

(Experimentals de Juliol i Setembre, rèpliques 1) o bé amb aigua de la llacuna GdA2 (resta

de mostres). En tots els casos es va realitzar prèviament un recompte dels indicadors en la

mostra del primari (Taula 3.1) per conèixer quina dilució era la més adient (1/50, finalment)

per preparar l’homogenat de partida. Això permetia tenir una estima de la concentració de

cadascun dels indicadors a temps 0 que després era corroborada pels recomptes efectuats en

les mostres recollides el mateix dia d’inici de cada un dels experimentals.

Taula 3.1. Concentracions (en UFC/100 ml) de cadascun dels indicadors bacterians analitzats en l’efluent primari de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro en comparació amb els recomptes de les

mostres inicials per cada un dels experimentals realitzats.

Mostra

Indicador Primari1 Estimada2 t03

(Juliol 2007) t0

3 (Set-2007)

t03

(Gener 2008)

Coliformes Totals 1.0E+07 2.E+05 n.d. n.d. 2.3E+05

Coliformes Fecals 6.0E+06 1.2E+05 n.d. n.d. n.d.

Escherichia coli 2.5E+06 5.0E+04 1.1E+05 4.2E+04 2.7E+04

Enterococs fecals 1.5E+05 3.0E+03 2.9E+03 4.3E+03 7.9E+03

Salmonella spp. 5.0E+04 1.0E+03 n.d. n.d. n.d. 1: A data de 18/07/2007 2: Concentració estimada per una dilució 1/50. 3: De la rèplica 2, utilitzant aigua de la bassa com a diluent. n.d.: no disponible.


15

3.2. Experimental nº1 (23–28 Juliol de 2007)

Els paràmetres fisicoquímics mesurats a la llacuna GdA2 durant la setmana de Juliol

en que es va realitzar l’experimental van mostrar els valors normals per la llacuna durant

aquest període (Taula 3.2). Cal destacar l’alta temperatura de l’aigua (24, 5 ºC) durant la

setmana com a principal paràmetre que pot afectar la persistència i supervivència dels

microorganismes en l’aigua. També a destacar que el potencial Red-Ox fou prou baix (90,4

mV) tenint en compte l’oxigenació de la columna d’aigua.

Taula 3.2.Valors mitjans dels principals paràmetres fisicoquímics de la llacuna GdA2 durant l’experimental Nº1 (Juliol 2007).

Paràmetre Valor Temperatura (ºC) 24,5 Conductivitat (µS cm-1) 1248,4 pH 9,9 Oxigen (mg l-1) 9,9 EH (mV) 90,4

Aquest seguiment experimental es va realitzar per duplicat utilitzant aigua del primari de

l’EDAR de Castell-Platja d’Aro com a inòcul i aigua del terciari de la mateixa planta

(rèplica 1) o bé aigua de la pròpia bassa GdA2 (rèplica 2) com a diluent (veure Material i

Mètodes). S’ha cregut convenient però presentar només els gràfics corresponents a la

rèplica 2 en el present informe ja que, estrictament parlant, la dilució amb aigua de la

pròpia bassa és la que simula millor el que succeeix realment durant el procés

d’emmagatzematge. Tot i així, cal dir que els resultats registrats per la rèplica 1 foren molt

similars als obtinguts en la rèplica 2 (Taula 3.3), descartant qualsevol efecte d’interferència

de l’aigua del terciari en la supervivència dels microorganismes presents en l’homogenat1.

1 Es pot argumentar que la utilització d’aigua del terciari com a diluent podria interferir en les mesures de supervivència atès que aquesta aigua pot presentar concentracions residuals de clor. Per minimitzar aquest efecte, l’aigua es va recollir 24 hores abans de fer la dilució, s’hi va afegir tiosulfat sòdic per fixar el clor residual i es va deixar en agitació “overnight". Els resultats que es van obtenir semblen descartar qualsevol efecte en el cas que ens ocupa.


16

Taula 3.3: Concentració (en UFC/100 ml) dels diferents indicadors bacterians durant l’experimental Nº1 (Juliol 2007).

RÈPLICA 1 (aigua terciari com a diluent) Temps (hores) Indicador 0 24 48 72 96

E. coli 1.02E+05 7.40E+04 6.70E+04 1.60E+04 5.00E+02

Enterococs 2.10E+03 1.40E+03 6.70E+02 8.00E+01 6.00E+01

CSR 7.10E+03 9.40E+03 2.30E+03 3.50E+02 1.50E+03

RÈPLICA 2 (aigua GdA2 com a diluent) Temps (hores) Indicador 0 24 48 72 96

E. coli 1.11E+05 2.10E+04 8.70E+03 1.30E+03 3.60E+02

Enterococs 2.90E+03 1.60E+03 1.29E+03 5.00E+01 2.00E+01

CSR 7.30E+03 1.04E+04 2.00E+03 4.70E+02 6.00E+02

Figura 3.1: Evolució de la concentració de supervivents (en UFC/100ml) dels diferents indicadors bacterians en funció del temps mesurats en la rèplica 2 durant

l’experimental Nº1 (Juliol 2007). E. coli (cercles negres); Enterococs fecals (cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells). Es mostra la recta de regressió

resultant de l’ajust exponencial.

1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

0 24 48 72 96

ufc/

100

ml

Temps (hores)


17

Figura 3.2: Cinètiques d’inactivació dels diferents indicadors bacterians en la rèplica 2 durant l’experimental Nº1 (Juliol 2007). E. coli (cercles negres);

Enterococs fecals (cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells).

Taula 3.4. Taxa de mort (k) i t90 i t99 pels diferents indicadors calculats a partir dels resultats de la rèplica 2 de l’experimental Nº1 (Juliol 2007).

Indicador k (h–1) t90a (h) t99

b (h)

E. coli 0,026 38 77

Enterococs fecals 0,022 52 93

CSR 0,011 80 148 a: temps necessari per reduir la població en un 90% (una reducció logarítmica) b: temps necessari per reduir la població en un 99% (dues reduccions logarítmiques) n.a.: no aplicable.

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

0 24 48 72 96

Log

(UFC

/100

ml) t

-Lg(

UFC

/100

ml) 0

Temps (hores)


18

3.3. Experimental nº2 (3–10 Setembre de 2007)

Els resultats obtinguts per aquest experimental van mostrar diferències molt

importants en quant la supervivència dels diferents indicadors estudiats. Aquestes

diferències són paleses tant en els concentracions mesurades en els sacs de diàlisi retirats a

diferents intervals de temps com en els càlculs que se’n deriven, resultant en taxes de mort

molt més baixes (Taula 3.7) que les obtingudes pel mostratge de Juliol (Taula 3.4).

Aquestes diferències són sorprenents atenent a la similitud en les condicions atmosfèriques

entre ambdós períodes ja que ni la temperatura de l’aigua (24,5 ºC al Juliol i 21,3 ºC al

Setembre) ni la resta de paràmetres fisicoquímics foren molt diferents. No ens queda clar

quin és el motiu del comportament anòmal registrat pels indicadors bacterians mesurats ni

el perquè els resultats s’allunyen tant dels valors esperats (similars al mostratge de Juliol).

La comparació amb els resultats del grup de recerca de la Universitat de Barcelona pot

aclarir si les anomalies detectades van afectar només als indicadors bacterians o si també ho

van alterar la persistència dels indicadors vírics. En aquest cas caldria buscar una explicació

tècnica que no tingués a veure amb la biologia dels sistema sinó amb el disseny

experimental d’aquest segon mostratge o en una errada metodològica durant els

procediments de laboratori realitzats.

Taula 3.5.Valors mitjans dels principals paràmetres fisicoquímics de la llacuna GdA2 durant l’experimental Nº2 (Setembre 2007).

Paràmetre Valor Temperatura (ºC) 21,3 Conductivitat (µS cm-1) 1.056,6 pH 8,3 Oxigen (mg l-1) n.d. EH (mV) 119,6

n.d.: no disponible


19

En aquest segon experimental d’estiu també es va realitzar un duplicat utilitzant com a

diluent aigua del terciari de la mateixa planta (rèplica 1) i un altre amb aigua de la pròpia

bassa GdA2 (rèplica 2). Al igual que en el cas anterior en aquest informe només es mostren

els gràfics corresponents a la rèplica 2, tot i que en la taula 3.6 es recullen els resultats de la

concentració dels diferents indicadors obtingudes en ambdues rèpliques i on s’observa que,

independentment del tipus d’aigua utilitzada com a diluent, aquestes es van comportar de

manera similar.

Taula 3.6: Concentració (en UFC/100 ml) dels diferents indicadors bacterians durant l’experimental Nº2 (Setembre 2007).

RÈPLICA 1 (aigua terciari com a diluent) Temps (hores) Indicador 0 24 48 72 96 168

E. coli 5.50E+04 6.70E+04 1.17E+05 9.60E+04 1.74E+05 4.50E+04

Enterococs 4.70E+03 6.70E+03 7.20E+03 4.70E+03 5.50E+03 8.70E+02

Clostridis 6.60E+03 7.50E+03 8.70E+03 5.60E+03 5.00E+03 9.90E+02

RÈPLICA 2 (aigua GdA2 com a diluent) Temps (hores) Indicador 0 24 48 72 96 168

E. coli 4.20E+04 4.00E+04 1.21E+04 7.70E+03 9.40E+03 2.30E+03

Enterococs 4.30E+03 3.80E+03 2.10E+02 1.00E+02 5.00E+02 5.20E+02

CSR 5.90E+03 5.90E+03 8.50E+02 6.60E+02 5.30E+02 2.00E+02


20

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

0 24 48 72 96 120 144 168

ufc/

100m

l

Temps (hores)

Figura 3.3: Evolució de la concentració de supervivents (en UFC/100ml) dels diferents indicadors bacterians en funció del temps mesurats en la rèplica 2 durant l’experimental Nº2 (Setembre 2007). E. coli (cercles negres); Enterococs fecals (cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells). Es mostra la recta de regressió resultant de l’ajust exponencial.


21

Figura 3.4: Cinètiques d’inactivació dels diferents indicadors bacterians en la rèplica 2 durant l’experimental Nº2 (Setembre 2007). E. coli (cercles negres);

Enterococs fecals (cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells).

Taula 3.7. Taxa de mort (k) i t90 i t99 pels diferents indicadors calculats a partir dels resultats obtinguts en l’experimental Nº2 (Setembre 2007).


b (h)

E. coli 0,0075 129 260



-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

0 24 48 72 96 120 144 168

Log

(UFC

/100

ml) t

-Lg(

UFC

/100

ml) 0

Temps (hores)


22

3.4. Experimental nº3 (21–31 Gener de 2008)

Aquest assaig correspon al mostratge hivernal, realitzat la darrera setmana del mes de

Gener de 2008. En aquest cas els dos duplicats es van realitzar utilitzant aigua de la llacuna

GdA2 com a diluent. Tot i així, en la rèplica 1 l’aigua fou extreta del dipòsit que es troba a

l’estació de bombeig annexa a la bassa mentre que en la rèplica 2 l’aigua fou recollida

directament de la superfície de la bassa (Fig. 2.2 del Material i Mètodes). S’ha de destacar

que tot i tractar-se d’un experiment realitzat durant el període hivernal i que les

temperatures de l’aigua eren molt inferiors a les registrades durant els mesos d’estiu (Taula

3.8), les taxes de mort calculades per aquest període, amb excepció de les dels clostridis,

mostren valors més alts (Taula 3.10) que les obtingudes pel mostratge del Setembre. Durant

el mes de Gener, la supervivència dels diferents indicadors analitzats en la llacuna mostra

un comportament intermedi entre els valors registrats al Juliol i els de Setembre quan, a

priori, hom esperaria trobar una persistència més elevada al Gener, afavorida per les baixes

temperatures, que no pas als mesos d’estiu, on la temperatura de l’aigua i les elevades dosis

de radiació solar tenen un efecte negatiu en la supervivència dels microorganismes en

suspensió (sobretot en el primer metre de la columna d’aigua) (Davies-Colley et al., 1994;

Caslake et al., 2004). Aquestes observacions recolzen la hipòtesi que els resultats del

mostratge de Setembre foren anòmals tot i que no s’han pogut determinar-ne les causes.

Taula 3.8.Valors mitjans dels principals paràmetres fisicoquímics de la llacuna GdA2 durant l’experimental Nº3 (Gener 2008).

Paràmetre Valor Temperatura (ºC) 9,4 Conductivitat (µS cm-1) 1.200 pH 9,0 Oxigen (mg l-1) 14,9 EH (mV) 139,5

n.d.: no disponible


23

Taula 3.9: Concentració (en UFC/100 ml) dels diferents indicadors bacterians en la rèplica 1 durant l’experimental Nº3 (Gener 2008). Els valors en vermell provenen de plaques on el resultat

no és estadísticament fiable (nº de colònies inferior a 15 en la dilució més baixa).

RÈPLICA 1: Aigua de l’estació de bombeig de GdA2 com a diluent. Temps (hores)

Indicador 0 24 48 72 168 196 240

Coliformes Totals 2.30E+05 1.30E+05 1.20E+05 – 1.10E+04 – –

E. coli 2.70E+04 2.70E+04 2.30E+04 7.30E+03 4.50E+02 4.80E+01 6.40E+01

Enterococs 7.90E+03 6.90E+03 4.80E+03 1.20E+03 1.00E+02 2.10E+01 1.00E+00

Clostridis 1.10E+04 1.60E+04 1.10E+04 5.50E+03 2.30E+03 3.20E+03 2.30E+03

RÈPLICA 2: Aigua de la superfície de GdA2 com a diluent. Temps (hores) Indicador 0 24 48 72 168 196 240

Coliformes Totals 2.90E+05 1.70E+05 4.60E+04 – – – –

E. coli 1.70E+04 3.30E+04 1.10E+04 6.50E+03 8.30E+02 4.90E+01 1.00E+02

Enterococs 7.70E+03 7.20E+03 3.70E+03 1.00E+03 1.00E+00 1.00E+00 1.00E+00

Clostridis 1.80E+04 1.10E+04 7.70E+03 5.20E+03 1.90E+03 1.60E+03 1.00E+03


24

1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

ufc/

100m

l

Temps (hores)

Figura 3.5: Evolució de la concentració mitjana de supervivents (en UFC/100ml ± desviació típica) dels diferents indicadors bacterians en funció del temps mesurats durant

l’experimental Nº3 (Gener 2008). E. coli (cercles negres); Enterococs fecals (cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells). Es mostra la recta de regressió resultant de

l’ajust exponencial.


25

Figura 3.6: Cinètiques d’inactivació dels diferents indicadors bacterians durant

l’experimental Nº3 (Gener 2008). Els valors representats corresponen a la mitjana de les dues rèpliques ± desviació típica. E. coli (cercles negres); Enterococs fecals

(cercles blaus); Clostridis Sulfit Reductors (rombes vermells).

Taula 3.13. Taxa de mort (k) i t90 i t99 pels diferents indicadors calculats a partir dels resultats mitjans obtinguts en l’experimental Nº3 (Gener 2008).


b (h)

Coliformes Totals 0,008 123 254

E. coli 0,010 104 186



-4.0

-3.5

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Log

(UFC

/100

ml) t

-Lg(

UFC

/100

ml) 0

Temps (hores)


26

Comparant els diferents paràmetres del creixement calculats a partir de les cinètiques

obtingudes en els diferents mostratges (Fig. 3.7) es poden extreure algunes conclusions in-

teressants. Les condicions ambientals (sobretot la temperatura i la radiació solar, més altes

durant l’estiu) semblen tenir un clar efecte sobre la supervivència dels diferents indicadors

analitzats, tot i que no es pot discriminar quin dels dos té un efecte més important. De fet,

l’ús de la radiació solar com agent desinfectant ha estat utilitzat i defensat com alternativa a

la cloració o a l’ús de làmpades d’ultraviolada sobretot en països en desenvolupament

(Davies-Colley et al., 1994; Caslake et al., 2004).

D’entre els microorganismes indicadors analitzats, E. coli i els Enterococs Fecals van mos-

trar un comportament prou similar mentre que els Clostridis Sulfit Reductors van presentar

una supervivència més elevada en la llacuna, tant a l’estiu com al mostratge hivernal.

Aquest fet sembla respondre a la capacitat d’aquests darrers de diferenciar, sota condicions

d’estrès, endòspores capaces de resistir condicions ambientals extremes (Marquis & Shin,

1994; Nicholson et al., 2000). En general però, les taxes de creixement calculades així com

els temps de reducció logarítmica extrapolats de les gràfiques permeten assegurar que els

microorganismes estudiats no troben en la llacuna un ambient òptim pel seu creixement

sinó, en tot cas, unes condicions que els hi són adverses. No s’ha d’oblidar que la majoria

d’aquests microorganismes són habitants del tracte gastrointestinal dels mamífers i d’altres

animals de sang calenta (Payment et al., 2003) i que, per tant, no estan adaptats a viure en

ecosistemes aquàtics, excepte en circumstàncies molt concretes (Fujioka et al., 1999; Vital

et al., 2008) que no es probable que es donin en la llacuna GdA2. Tot i que faria falta un

estudi “in situ” similar al que s’ha portat a terme al Golf d’Aro, creiem que aquestes con-

clusions poden extrapolar-se a d’altres llacunes d’emmagatzematge del Golf d’Aro (GdA1

per exemple) i segurament a d’altres que també reben aigua regenerada d’altres EDARS

(Golf Serres de Pals, Golf Empordà).


27

-0.01

0

0.01

0.02

Taxa

d'in

activ

ació

(h-1

)

Mostratge

E. coli

0.03

Juliol Setembre Gener

38

129104

-0.01

0

0.01

0.02

Taxa

d'in

activ

ació

(h-1

)

Entero

0.03

Mostratge

cocs


52

103

73

-0.01

Ta

Mostratge

Clostridis

0

0.01

0.02

0.03

xa d

'inac

tivac

ió (h

-1)


8098

231

Figura 3.7: Comparació de les taxes d’inactivació (h–1) i els t90 (valor dins les bombolles, en hores) calculades pels tres indicadors en els tres mostratges realitzats.

Finalment, no s’ha d’oblidar que en l’estudi previ realitzat en la llacuna durant l’estiu de 2006 es

van registrar augments significatius en les concentracions de, sobretot, E. coli i Salmonella spp.

que afectaven la qualitat microbiològica de l’aigua i comprometien els resultats analítics d’acord

amb els VMA del RD 1620/2007 (Mestre, 2007). Amb el resultats del present estudi, on s’ha

exclòs qualsevol interferència de microorganismes planctònics en les analítiques efectuades,

sembla clar que els increments registrats l’any 2006 foren deguts a l’entrada continuada de

microbiota fecal a la llacuna degut a la nombrosa presència d’aus aquàtiques (sobretot gavines i

ànecs) portadors d’elevades concentracions d’aquests bacteris (Roll & Fujioka, 1997; Muniesa et

al., 1999; Kuntz et al., 2004; Wither et al., 2005).


28

4. Conclusions

1. El sistema d’incubació utilitzat ha permès determinar amb garanties i sense interferèn-cies externes (microorganismes planctònics presents a la llacuna, efecte de predació del zooplàncton, etc.), l’evolució dels diferents indicadors bacterians en la llacuna durant els períodes estudiats i calcular-ne els principals paràmetres del creixement.

2. Les concentracions dels indicadors bacterians analitzats (Coliformes Totals, Esche-richia coli, Enterococs Fecals i Clostridis Sulfit Reductors) no van registrar, en cap dels períodes estudiats (Juliol, Setembre i Gener), augments significatius que poguessin in-dicar un creixement d’aquests microorganismes en la llacuna.

3. D’entre els indicadors analitzats, tant E. coli com els Enterococs mostren cinètiques temporals semblants i unes taxes de mort comparables mentre que els Clostridis Sulfit Reductors són els microorganismes que mostren una persistència més elevada en la lla-cuna i unes taxes de mort més baixes. La capacitat d’aquests darrers microorganismes de diferenciar formes de resistència (endòspores) seria una explicació a aquest fet.

4. En tots els experiments realitzats, els indicadors bacterians analitzats disminueixen pro-gressivament la seva concentració indicant no només la seva incapacitat per créixer sinó també la seva desaparició progressiva del ecosistema. Ara bé, els resultats obtin-guts permeten apuntar un efecte de les condicions ambientals (sobretot temperatura i radiació solar) en la supervivència dels diferents indicadors. En concret, el temps de re-ducció decimal (t90) per indicadors com E. coli i els Enterococs Fecals augmenta apro-ximadament 1,5 vegades entre Juliol i Gener mentre que pels Clostridis Sulfit Reduc-tors aquest valor d’augment fou d’aproximadament 3 (2,8) entre les mateixes dates. D’acord amb aquests observacions, queda palès que les condicions estivals, dominades per una elevada radiació solar i una temperatura de l’aigua superior als 20 ºC, són per-judicials per a la supervivència dels indicadors analitzats.

5. L’experimental realitzat durant el mes de Setembre va donar resultat anòmals que no s’ajusten al que s’esperava. Malauradament però no s’ha pogut determinar quina o qui-nes foren les causes d’aquestes anomalies. En aquest sentit, els resultats obtinguts pel Grup de Recerca de la Universitat de Barcelona en quant la persistència i cinètiques d’inactivació d’indicadors vírics en la llacuna durant el mes de Setembre pot ajudar a aclarir-ne les causes, ja siguin de tipus metodològic (inòcul, dilucions, sembra dels in-dicadors bacterians) o bé associades a factors externs que va afavorir la major supervi-vència dels indicadors bacterians (i vírics) en la llacuna GdA2.


29

6. Per tot plegat, semblar clar que les condicions ambientals en la llacuna GdA2, i presumiblement en la resta de llacunes artificials on s’emmagatzema l’aigua regene-rada provinent de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro, no són les idònies ni per mantenir les concentracions de partida dels diferents indicadors analitzats ni per possibilitar-ne el creixement. Això indicaria que la major part de microorganismes indicadors que sobre-viuen al tractament terciari —que en el cas de l’EDAR de Castell-Platja d’Aro una combinació de radiació ultraviolada i addició d’hipoclorit sòdic—, anirien disminuint progressivament la seva abundància relativa en l’ecosistema planctònic de la llacuna sempre i quan no es donessin entrades, puntuals o continues, de matèria fecal que fes-sin augmentar la seva concentració.

7. D’acord amb els resultats obtinguts en el present treball i comparant-los amb els obtin-guts en la mateixa llacuna amb anterioritat (Mestre, 2007), es pot concloure que la causa més probable de l’augment en les concentracions d’E. coli i Salmonella spp. en la llacuna GdA2 durant l’estiu de 2006 no fou el creixement “in situ” dels supervivents al tractament terciari de l’EDAR sinó l’entrada a l’ecosistema de microbiota fecal que té el seu origen en les nombroses aus aquàtiques que permanentment o esporàdica vi-siten la llacuna.

8. Creiem que seria una bona opció estendre aquest estudi a d’altres sistemes similars (al-tres llacunes, diferents tipus d’aigua regenerada) i ampliar així mateix el rang de condi-cions ambientals (primavera, estiu, hivern i tardor) per tal de disposar d’un fons de da-des més gran que permeti modelar millor el comportament d’aquests indicadors bacte-rians de contaminació fecal una vegada alliberats a les llacunes d’emmagatzemament. Aquest coneixement permetria optimitzar la gestió d’un recurs, de cada vegada més valor, com és l’aigua regenerada i oferir les màximes garanties pel seu ús tant a curt com a llarg termini.


30

Referències

AENOR (1995) Norma Española UNE-EN ISO 26461–2. Calidad del agua: Detección y Recuento de las esporas de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia). Parte 2: Método de Filtración en membrana (ISO 6461–2:1986).

AENOR (2001a) Norma Española UNE-EN ISO 9308–1. Calidad del agua: Detección y Recuento de Escherichia coli y de bacterias coliformes. Parte 1: Método de Filtración en membrana (ISO 9308–1:2000).

AENOR (2001b) Norma Española UNE-EN ISO 7899–2. Calidad del agua: Detección y Recuento de Enterococos Intestinales. Parte 2: Método de Filtración en membrana (ISO 7899–2:2000).

Ashbolt N, W Grabow and M Snozzi (2001). Indicators of microbial water quality. World Health Organization (WHO). Water Quality: Guidelines, Standards and Health. IWA Publishing: London, UK.

Caslake LF, DJ Connolly, V Menon, CM Duncanson, R Rojas and J Tavakoli (2004) Disinfection of Contaminated Water by Using Solar Irradiation. Appl. Environ. Microbiol. 70(2): 1145–1150.

Davies-Colley RJ, RG Bell and AM Donnison (1994) Sunlight Inactivation of Enterococci and Fecal Coliforms in Sewage Effluent Diluted in Seawater. Appl. Environ. Microbiol. 60(6): 2049–2058.

Fujioka, R. S., C. Sian-Denton, M. Borja, J. Castro, and K. Morphew. 1999. Soil: the environmental source of Escherichia coli and enterococci in Guam’s streams. J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 85:83S-89S.

Gibbs R, C Hu, G Ho and I Unkovich (1997). Regrowth of faecal and Salmonellae in stored biosolids and soil amended with biosolids. Water Sci. Tech. 35(11–12): 269–275.

Kuntz RL, PG Hartel, K Rodgers and WI Segars (2004) Presence of Enterococcus faecalis in broiler litter and wild bird feces for bacterial source tracking. Water Res. 38: 3551–3557.

Marquis RE and SY Shin (1994) Mineralization and responses of bacterial spores to heat and oxidative agents. FEMS Microbiol. Rev., 14: 375–380.

Mestre R (2007) Evolució de la qualitat microbiològica de l’aigua regenerada en sistemes d’emmagatzematge fora de l’EDAR. Efecte del recreixement i persistència en l'ambient d'indicadors bacterians. Projecte de Fi de Màster. Màster en Ciència i Tecnologia de l’Aigua, Programa Oficial de Postgrau en Ciències Experimentals i Sostenibilitat, Universitat de Girona.


31

Muniesa M, J Jofre and F Lucena (1999) Occurrence and numbers of bacteriophages and bacterial indicators in faeces of yellow-legged seagull (Larus cachinnans). Lett. Appl. Microbiol. 29: 421–423.

Murphy J, M Devane, B Robson and B Gilpin (2005). Genotypic characterization of bacteria cultured from duck faeces. J. Appl. Microbiol. 99, 301–309.

Nicholson WL, N Munakata, G Horneck, HR Melosh and P Setlow (2000) Resístanse of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 548–542.

Roll BM and RS Fujioka (1997) Sources of faecal indicator bacteria in a brackish, tropical stream and their impact on recreational water quality. Water Sci. Tech. 35(11–12): 179–186.

Payment P, M Wait and A Dufour (2003) Introducing parameters for the assessing of drinking water quality. A: Assessing microbial safety of drinking water, OECD, WHO, IWA Publishing, Alliance House, London, Regne Unit.

The Environment Agency - Methods for Examination of Waters and Associated Material - The Microbiology of Drinking Water 2002.

Vital M, F Hammes and T Egli (2008) Escherichia coli O157 can grow in natural freshwater at low carbon concentrations. Environ. Microbiol. 10(9): 2387–2396.

Wither A, M Rehfisch and G Austin (2005) The impact of bird populations on the microbiological quality of bathing waters. Water Sci. Tech. 51(3–4): 199–207.

ANNEX

32

ANNEX: Reactius i Medis de cultiu utilitzats

ANNEX

33

• Solució de rentat

Producte g/litre Na2O3 20,0 EDTA 0.2M 5,0 ml Aigua destil·lada grau MilliQ 995,0 ml

• Esterilitzar a l’autoclau.

• Solució d‘EDTA 1 mM

Producte Volum EDTA 0.2M 5,0 ml Aigua destil·lada grau MilliQ 995,0 ml

• Esterilitzar a l’autoclau.

• Medi MLGA (MEMBRANE LACTOSE GLUCURONIDE AGAR (MLGA)

Producte g/litre Peptona 40.0 Extracte de llevat 6.0 Lactosa 30.0 Roig Fenol 0.2 Lauryl sulfat de Sodi 1.0 Piruvat sòdic 0.5 Agar 10.0 X-Glucurònid (BCIG) 0.2 pH 7.4± 0.2

• Es dissolen els reactius en 1 litre d’aigua destil·lada i es barreja bé. Ajustar el pH a 7,4 i autoclavar 15 minuts a 121 ºC. Refredar fins a 50 ºC i després repartir en plaques de Petri. També es pot comprar ja formulat i plaquejat. Per més informació consultar: http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1031&org=71&c=UK&lang=EN

ANNEX

34

• Medi m-CP (Membrane Clostridium perfringens Medium)

• Medi sòlid per l’aïllament ràpid i la identificació presumptiva de Clostridium perfringens en mostres d’aigua.

Producte g/litre Triptona 30,0 Extracte de llevat 20,0 Sacarosa 5,0 Hidroclorur de L-cisteïna 1,0 Sulfat de Magnesi 7H2O 0,1 Agar 15,0 Porpre de Bromocresol 0,04 pH final 7,6±0.2 Solucions suplementàries (en vial, cada vial per 500 ml de medi)

Producte per vial per litre Sulfat de polimixina B 12,5 mg 25,0 mg Cicloserina D 200,0 mg 400,0 mg

Per reconstituir les solucions de suplement, afegir 2 ml de aigua destil·lada estèril a 1 vial de suplement. Barrejar bé fins que es dissolgui completament. Utilitzar immediatament.

• Es suspenen 35,55 g de l’agar base en 500 ml d’aigua destil·lada i es barreja bé. Esterilitzar amb autoclau 15 min a 121 ºC. Refredar fis a 50 ºC i afegir el contingut d’un vial de les solucions suplementàries asèpticament. Fet això, afegir asèpticament les següents solucions, prèviament dissoltes en aigua destil·lada:

Component volum de solució Sal tetrasòdica de difosfat de Fenolftaleïna 0,5% 10,0 ml Clorur fèrric hexahidratat 4,5% 1,0 ml Indoxil β-D-Glucòsid 0,75% (30 mg en 4 ml) 4,0 ml

Preparar cada vegada. Barrejar bé i afegir a la placa de Petri abans de plaquejar el medi formulat.

• Aquest medi es pot comprar ja formulat i plaquejat. Per més informació consultar: http://www.panreac.com/new/esp/productos/docs/mcpA4.pdf

ANNEX

35

• Medi M-Enterococcus (m-Ent)

• També conegut com Agar Azida. Medi sòlid per l’aïllament ràpid i recompte de enterococs fecals en aigües i altres materials utilitzant filtració en membrana o pour-plate.

Producte g/litre Triptosa 20,0 Extracte de llevat 5,0 Dextrosa 2,0 K2HPO4 4,0 Àzida Sòdica 0,4 Agar 10,0 Clorur de 2,3,5-Trifenil Tetrazoli 0,1 pH 7,2±0.2

• Es suspenen 42 g del producte ja formulat en 1 litre d’aigua destil·lada i es barreja bé. Escalfar fins ebullició remenant contínuament per evitar el bombolleig excessiu. Bullir durant 1 minut fins dissoldre completament el producte. NO AUTOCLAVAR. Refredar fins a 50 ºC i plaquejar en Plaques de Petri estèrils.

• Aquest medi es pot comprar ja formulat i plaquejat. Per més informació consultar: http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/m_Enterococcus_Agar.pdf

recreixement en basses d‘emmagatzematge€¦ · provinent de l’edar de castell- platja d’aro...

Documents