recherche de microremaniements chromosomiques par cgh array chez des foetus présentant une hernie...
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ACADEMIE DE VERSAILLES
UNIVERSITE DE VERSAILLES SAINT-QUENTIN EN YVELINES
U F R MEDICALE DE PARIS-ILE-DE-FRANCE-OUEST
ANNEE 2009 N°
MEMOIRE DU DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES
DE BIOLOGIE MEDICALE
Conformément aux dispositions du décret du 23 janvier 2003 tient lieu de
THESE
POUR LE DIPLOME
D’ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE
PAR
Capucine HYON
Née le 20 juin 1980 à Fontenay aux Roses
Présentée et soutenue publiquement le 30 septembre 2009
Recherche de microremaniements chromosomiques par CGH array chez des fœtus
présentant une hernie diaphragmatique Président : M. Le Professeur M. VEKEMANS Directrice : Mme Le Docteur N. MORICHON-DELVALLEZ
2
REMERCIEMENTS
A Monsieur le Professeur Michel Vekemans qui m’avez fait l’honneur d’accepter la
présidence de ce jury. Vous m’avez accueillie dans votre service, et m’avez toujours apporté
votre soutien dans la réalisation de mes projets. Veuillez accepter mes hommages
respectueux.
A Monsieur le Professeur Michel Vidaud. Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de
participer à ce jury, veuillez accepter mes remerciements respectueux.
A Monsieur le Professeur Jean Michel Dupont. Pour avoir accepter de juger ce travail,
veuillez accepter toute ma reconnaissance.
A Madame le Docteur Alexandra Bénachi qui m’a permis de réaliser ce travail dans le
cadre du Centre de Référence Maladies Rares pour les hernies diaphragmatiques congénitales
et qui a eu la gentillesse de participer au jury de cette thèse. Veuillez accepter toute ma
gratitude.
A Madame le Docteur Nicole Morichon-Delvallez. Pour avoir accepter de diriger ce travail
et pour m’avoir donné des conseils avisés, soyez en ici, remerciée.
A toute l’équipe du Laboratoire d’Histologie-Embryologie et Cytogénétique de l’hôpital
Necker-Enfants Malades et notamment :
Au Professeur Serge Romana et au Docteur Valérie Malan, pour m’avoir donné
l’envie de faire de la Cytogénétique. Merci à tous deux de m’avoir initiée aux techniques de
cytogénétique moléculaire et en particulier à la CGH array. Valérie, merci sincèrement pour
ton aide et ta disponibilité.
A Jean-Michel et Marie-Christine pour m’avoir aidée à la réalisation de toutes les
techniques : sans vous, cela aurait été bien plus difficile. Merci beaucoup pour votre aide.
A Céline, Sophie et Stéphanie pour avoir réalisé toutes les techniques de sang du
protocole mais également pour votre disponibilité et votre gentillesse.
3
Aux Docteurs Férechté Razavi, Tania Attié-Bitach, Jélèna Martinovic et Maryse
Bonnière Darcy, pour votre contribution et votre disponibilité.
A Chantal pour son aide précieuse pour la préparation des échantillons de
foetopathologie. Merci encore pour ta grande disponibilité.
Aux Docteurs Catherine Turleau, Odile Raoul et Marie-Christine Deblois, pour votre
soutien et votre écoute, un grand merci.
A tous les autres, médecins, techniciens, secrétaires et agents du laboratoire, sans qui
ce travail n’aurait pas pu se faire. Merci à vous tous pour votre aide et votre disponibilité.
A toute l’équipe du Laboratoire de Cytogénétique de l’hôpital Armand Trousseau :
Au Professeur Jean-Pierre Siffroi, pour m’avoir accueillie dans votre service.
Aux Docteurs Marie-France Portnoï, Jacqueline Van Den Akker, Sandra Chantot et
Nicole Joyé pour vos enseignements, vos conseils et votre soutien.
A toutes les techniciennes et personnels du service. Merci pour votre gentillesse et
votre bonne humeur.
A tous ceux que j’ai rencontrés pendant mon internat et qui m’ont guidée jusque là :
Aux Docteurs Marie-Céline Blanc et Nathalie Neveux pour m’avoir fait découvrir et
apprécier la Biologie Médicale.
Au Docteur Alexandra Doloy, merci pour tes encouragements ta disponibilité et ton
soutien.
A toute l’équipe de Robert Debré, en particulier Elisabeth, Julie, Kelly, Laure et
Lydia, merci pour votre soutien et votre gaîté.
4
A vous qui êtes là depuis le début de l’aventure ou bien plus récemment mais qui serez
toujours là j’en suis sûr
Merci à Chacha, Martin, Mim’s et Arnaud. Merci sincèrement pour votre soutien sans
faille, votre disponibilité et votre bonne humeur.
Merci à Candice pour tes précieux conseils et surtout pour les fous rires que tu m’as
fais partager, ça fait toujours un grand bien.
Merci à Marie Laure et Philippe pour votre gaîté.
A ma famille,
Merci à vous de m’avoir guidée et amenée jusque là.
A Thomas,
Merci pour tout le soutien et le bonheur que tu m’apportes chaque jour.
5
TABLE DES MATIERES
TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .................................................................................................................. 7
ABREVATIONS ................................................................................................................................................... 8
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................................... 9
LISTE DES TABLEAUX................................................................................................................................... 10
LISTE DES ANNEXES...................................................................................................................................... 10
I. Introduction ............................................................................................................................................... 11
II. Le diaphragme........................................................................................................................................... 12
A. Anatomie du diaphragme........................................................................................................................ 12 1. Centre phrénique................................................................................................................................ 12 2. Portion périphérique musculaire ........................................................................................................ 14 3. Orifices principaux............................................................................................................................. 14 4. Vaisseaux et nerfs .............................................................................................................................. 14
B. Embryologie du diaphragme .................................................................................................................. 15 1. Diaphragme primitif........................................................................................................................... 15
a. Septum transversum...................................................................................................................... 15 b. Mésentère dorsal de l'œsophage.................................................................................................... 15 c. Membranes pleuro-péritonéales .................................................................................................... 15 d. Paroi thoracique ............................................................................................................................ 16
2. Muscularisation du diaphragme ......................................................................................................... 17 3. Migration du diaphragme................................................................................................................... 17
C. Anomalies du développement du diaphragme. ....................................................................................... 18 1. Hernies de Bochdalek ........................................................................................................................ 18 2. Hernies non postéro-latérales............................................................................................................. 19
a. Hernies de Morgagni. .................................................................................................................... 19 b. Hernies centrales ........................................................................................................................... 19
3. Eventration......................................................................................................................................... 19
D. Bases génétiques des hernies diaphragmatiques.................................................................................... 21 1. Modèles animaux ............................................................................................................................... 23
a. Modèle de tératogenèse................................................................................................................. 23 - Métabolisme des rétinoïdes ...................................................................................................... 23 - Rôle des rétinoïdes dans les HCD ............................................................................................ 26
b. Modèles génétiques....................................................................................................................... 27 - Modèle Fog2 (Friend of GATA protein 2) ............................................................................... 28 - Modèle Coup-tfII (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor II)................ 28 - Modèle Gata4 (GATA binding protein 4)................................................................................. 30 - Modèle Wt1 (Wilms tumor 1)................................................................................................... 30
2. Chez l’Homme................................................................................................................................... 31 a. Rétinoïdes et hernie....................................................................................................................... 31 b. Anomalies génétiques fréquentes associées à des HCD................................................................ 31
- Syndromes monogéniques........................................................................................................ 31 - Anomalies chromosomiques..................................................................................................... 33 - Formes familiales ..................................................................................................................... 34
III. Notre travail .......................................................................................................................................... 35
A. Intérêt de la CGH array pour l’étude génétique des hernies de coupole diaphragmatique congénitales...................................................................................................................................................... 35
B. Objectif de l’étude................................................................................................................................... 36
6
IV. Matériels et méthodes........................................................................................................................... 37
A. Recrutement des sujets............................................................................................................................ 37 1. Cohorte prospective ........................................................................................................................... 37 2. Cohorte rétrospective ......................................................................................................................... 37
B. Techniques d’étude ................................................................................................................................. 38 1. Caryotypes ......................................................................................................................................... 38 2. Hybridation In Situ Fluorescente (FISH) ........................................................................................... 38
a. Principe général............................................................................................................................. 38 b. Matériel d’études........................................................................................................................... 39 c. Préparation des sondes .................................................................................................................. 39 d. Hybridation et lecture.................................................................................................................... 40 e. Applications .................................................................................................................................. 40
- FISH ciblée « hernie diaphragmatique » .................................................................................. 40 - Vérification des CNV............................................................................................................... 41
3. Comparative Genomic Hybridization Array (CGH array)................................................................. 41 a. Principe général............................................................................................................................. 41 b. Préparation des échantillons.......................................................................................................... 43
- Matériel d’étude ....................................................................................................................... 43 - Marquage des ADN.................................................................................................................. 44
c. Hybridation ................................................................................................................................... 45 - Puces BlueGnome .................................................................................................................... 45 - Puces PerkinElmer.................................................................................................................... 45
d. Lecture des lames.......................................................................................................................... 46 e. Analyses ........................................................................................................................................ 46
- Puces BlueGnome .................................................................................................................... 46 - Puces PerkinElmer.................................................................................................................... 46
V. Résultats ..................................................................................................................................................... 48
A. Résultats de l’étude en CGH array......................................................................................................... 48
B. Patients présentant une anomalie........................................................................................................... 48 1. Sujet 4 ................................................................................................................................................ 48
a. Clinique......................................................................................................................................... 48 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 49
- Caryotypes et FISH ciblée........................................................................................................ 49 - CGH array ................................................................................................................................ 50 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 52 - Etude chez les parents .............................................................................................................. 53
2. Sujet 38 .............................................................................................................................................. 55 a. Clinique......................................................................................................................................... 55 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 55
- CGH array ................................................................................................................................ 55 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 59
3. Sujet 49 .............................................................................................................................................. 61 a. Clinique......................................................................................................................................... 61 b. Résultats cytogénétiques ............................................................................................................... 61
- CGH array ................................................................................................................................ 61 - Confirmation par FISH............................................................................................................. 64
VI. Discussion .............................................................................................................................................. 65
VII. Conclusion ............................................................................................................................................. 74
ANNEXES ........................................................................................................................................................... 75
BIBLIOGRAPHIE.............................................................................................................................................. 81
7
TITLE
Search for chromosomal aberrations using array CGH in fetuses with congenital
diaphragmatic hernia.
SUMMARY Congenital diaphragmatic hernia (CDH) is a common major malformation affecting 1/4000 births. Although the exact etiology of most cases of CDH remains unknown, it is becoming increasingly clear that genetic factors play an important role. The data supporting genetic etiologies include single gene disorders associated with CDH and the association of CDH with recurring chromosome abnormalities. The aim of this work was to study 50 fetuses with syndromic CDH or isolated CDH using array CGH to identify and map new chromosome aberrations in this disease. We identified three different chromosome aberrations: 15q26 deletion which is well known to be implicated in CDH, PTPRD intragenic deletion located on chromosome 9p23 inherited from a healthy parent, responsible for abnormal diaphragmatic development in mouse models and 17pter duplication which implication requires further exploration.
8
ABREVATIONS
ADN : acide désoxyribonucléique
CAV : canal atrio-ventriculaire
CGH : comparative genomic hybridization
CGH array : comparative genomic hybridization array
CIV : communication interventriculaire
CNP : copy number polymorphisms
CNV : copy number variations
Cy3 : cyanine 3
Cy5 : cyanine 5
DGV : Database of Genomic Variants
dNTP : désoxynucléotides triphosphate
DS : déviation standard
EDTA : acide éthylène diamine tetra acétique
FITC : isothiocyanate de fluorescéine
FISH : hybridation in situ fluorescente
HCD : hernie de coupole diaphragmatique congénitale
IRM : image par résonance magnétique
kb : kilobases
Mb : mégabases
PH : phytohémagglutinine
RCIU : retard de croissance intra-utérin
SA : semaine d’aménorrhée
SDS : sodium dodécyl sulfate
SSC : citrate sodique de sel
T.E : tris-EDTA
9
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de Médecine Toulouse-Purpan 2. .................................................................................................. 13
Figure 2. Coupe tranversale embryonnaire montrant la fermeture des canaux péricardo-péritonéaux, d’après Larsen4. .................................................................................................. 16
Figure 3. Illustration des différents types de hernies diaphragmatiques (vue inférieure du diaphragme), d’après Pober9. .................................................................................................. 20
Figure 4. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement pulmonaire, d’après Klaassens et al14. ........................................................... 22
Figure 5. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement du diaphragme, d’après Klaassens et al14. ..................................................... 22
Figure 6. Schéma général de la voie de signalisation des rétinoïdes, d’après Montedonico et al6. ............................................................................................................................................ 25
Figure 7. Aperçu du thorax et de l’abdomen après dissection et aspect du diaphragme chez des souris témoins et des souris mutantes pour Coup-tfII, d’après You et al26. ...................... 29
Figure 8. Schéma récapitulatif des principales anomalies chromosomiques associées aux HCD, d’après Holder et al39. ................................................................................................... 33
Figure 9. Synoptique comparatif des principales étapes entre la CGH sur chromosomes et la CGH array, d’après Sanlaville et al52...................................................................................... 42
Figure 10. Représentation graphique de la technique en « dye swap ». ................................. 43
Figure 11. FISH ciblée métaphasique, chez le Sujet 4, ne montrant pas d’anomalie. ............ 49
Figure 12. Profil du chromosome 1 en CGH array chez le sujet 4.......................................... 50
Figure 13. Profil du chromosome 9 en CGH array chez le sujet 4.......................................... 51
Figure 14. FISH métaphasique chez le sujet 4 montrant une asymétrie de signal franche avec la sonde RP11-176P17 située en 9p23 (en vert). ..................................................................... 52
Figure 15. FISH réalisée chez la mère du sujet 4 montrant deux signaux verts (sonde RP11-176P17) en place et symétriques.............................................................................................. 53
Figure 16. FISH réalisée chez le père du sujet 4 montrant une asymétrie de signal pour la sonde RP11-176P17 située en 9p23 (vert). .............................................................................. 54
Figure 17. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 38. ........... 56
Figure 18. Profil du chromosome 4 en CGH array chez le sujet 38........................................ 57
Figure 19. Profil du chromosome 15 en CGH array chez le sujet 38.....................................58
Figure 20. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-52G4 chez le sujet 38 montrant la présence de 3 signaux verts (RP11-52G4) dans tous les noyaux examinés......................... 59
Figure 21. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-89K11 chez le sujet 38 montrant la présence d’un seul signal vert (RP11-89K11) dans tous les noyaux examinés. .................. 60
Figure 22. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 49, mettant en évidence une anomalie sur le bras court du chromosome 17. ............................................ 62
Figure 23. Profil du chromosome 17 en CGH array du sujet 49............................................. 63
10
Figure 24. FISH interphasique réalisée avec le contig 17pter chez le sujet 49 montrant la présence de 3 signaux verts (contig 17pter) et de 2 signaux rouges (contig 8qter). ............... 64
Figure 25. Détail de la région comprenant NR2F2 (COUP-TFII) et IGF1R.......................... 66
Figure 26. Schéma de la translocation t(4;15)(q34.1;q26.2) et les dérivés der(4) et der(15). 67
Figure 27.Aspect du diaphragme et coupe transversale du diaphragme chez des souris témoins et des souris double-mutantes (RPTP-σ-/-/δ-/-), d’après Uetani et al63. .................... 69
Figure 28. Idéogramme du bras court du chromosome 17 avec la schématisation de la duplication 17p retrouvée chez notre patient (sujet 49) et celles rapportées dans la littérature.................................................................................................................................. 71
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Exemples de modèles murins de HCD, d’après Ackerman et al5. ......................... 27
Tableau 2. Syndromes monogéniques pour lesquels la HCD est l’élément principal, d’après Pober12. .................................................................................................................................... 32
LISTE DES ANNEXES
Annexe I. Caractéristiques de la cohorte prospective.............................................................. 75
Annexe II. Caractéristiques de la cohorte rétrospective.......................................................... 76
Annexe III. Protocole de culture de sang périphérique. .......................................................... 77
Annexe IV. Principe de la RCA. ............................................................................................... 78
Annexe V. Principe de marquage par la technique de « Nick-translation »............................ 79
Annexe VI. Protocole d’extraction d’ADN à partir de sang frais total. .................................. 80
Annexe VII. Protocole d’extraction d’ADN à partir de tissus congelés. .................................80
11
I. Introduction Le diaphragme est un organe essentiel séparant les viscères thoraciques des viscères
abdominaux. Les anomalies de son développement embryonnaire conduisent à différents
types de pathologies congénitales dont les hernies diaphragmatiques.
De nombreux arguments existent en faveur d’une origine génétique des hernies de
coupole diaphragmatique congénitales (HCD). En effet, celles-ci sont retrouvées dans de
nombreux syndromes monogéniques. Par ailleurs, des anomalies chromosomiques récurrentes
sont également associées à la survenue d’une HCD. Enfin, l’existence de récidives de HCD
dans certaines familles conforte cette hypothèse.
Ceci nous a poussé à explorer, par une étude globale du génome, des fœtus ayant une
HCD, pour rechercher de nouvelles anomalies chromosomiques responsables de hernies
syndromiques ou non. Nous avons choisi comme méthode d’analyse, la CGH array
(Comparative Genomic Hybridization array). Celle-ci permet une étude rapide de l’ensemble
du génome avec une résolution bien supérieure à celle du caryotype standard.
Cette étude a été rendue possible car l’hôpital Necker-Enfants Malades est Centre de
Références des Maladies Rares pour la hernie de coupole diaphragmatique. Ce centre, dont le
coordonnateur est le Docteur Alexandra Bénachi, a initié plusieurs travaux de recherche sur
les bases moléculaires des HCD. C’est dans ce cadre qu’un protocole de recherche sur les
causes chromosomiques de HCD a été instauré.
12
II. Le diaphragme
A. Anatomie du diaphragme Le diaphragme est une cloison musculo-aponévrotique qui joue un double rôle, d’une
part, il permet de séparer la cavité thoracique de la cavité abdominale et, d’autre part, il est
l’élément essentiel de la dynamique respiratoire.
La partie périphérique du diaphragme est un muscle large et mince formé d’une
portion verticale, dite vertébro-lombaire qui correspond aux piliers et d’une portion
horizontale, dite sterno-chondro-costale, composée de 2 coupoles qui, en expiration forcée, se
projettent au niveau du 4ème espace intercostal pour la coupole droite et au niveau du 5ème
espace intercostal pour la coupole gauche1.
Il est composé d’un ensemble de muscles digastriques dont les tendons intermédiaires
sont réunis sur un centre tendineux unique que l’on appelle le centre phrénique. La partie
musculaire périphérique prend ses insertions sur le squelette de la cage thoracique en ventral
et latéral, et sur le rachis lombaire en dorsal. On distingue donc à cet ensemble musculaire,
situé en périphérie, une partie lombaire, une partie costale et une partie sternale.
1. Centre phrénique
Le centre phrénique, partie centrale du diaphragme, est une nappe tendineuse blanc
nacrée, en forme de feuille de trèfle à trois folioles, constituée par la réunion de l'ensemble
des tendons intermédiaires :
- la foliole antérieure, large et courte, est allongée transversalement et se rapproche en
ventral du sternum ;
- les folioles latérales, réunies à la foliole antérieure par une portion rétrécie ou
pédicule, sont obliques en dorsal et en latéral. Au niveau de la foliole latérale droite, les deux
bandelettes semi-circulaires supérieure et inférieure délimitent l'orifice de la veine cave
inférieure (Figure 1).
13
Figure 1. Vue inférieure du diaphragme, d’après le Laboratoire d’Anatomie Faculté de Médecine
Toulouse-Purpan 2.
Le centre phrénique est représenté en gris. La portion périphérique musculaire est représentée en marron.
1. Orifice de la veine cave inférieure ; 2. Orifice de l’œsophage ; 3. Orifice de l’aorte.
14
2. Portion périphérique musculaire
La partie musculaire est elle-même composée de 3 parties : lombaire, costale et
sternale. La partie lombaire est la plus puissante et composée des piliers gauche et droit du
diaphragme. Ils participent à la formation des orifices oesophagien et aortique (Figure 1). Ils
sont reliés entre eux par le ligament médian.
L'orifice aortique se situe en face de T12-L1 et l'orifice oesophagien est situé au
niveau de T10, ventralement par rapport à l'aorte. Ce dernier est complètement encerclé par
des muscles.
La partie costale du muscle diaphragmatique naît à partir de 6 arcs costaux
cartilagineux et irradie vers la partie tendineuse. Il existe un hiatus sans élément musculaire
entre les parties lombaire et costale; plus souvent à gauche qu'à droite (hiatus de Bochdalek).
Dans ces zones "affaiblies", seuls la plèvre et le péritoine séparent les cavités péritonéale et
pleurale.
La partie sternale est constituée de petits segments musculaires émergeants de
l'aponévrose abdominale et du processus xiphoïde. Entre les parties sternale et costale, on
observe un espace étroit clos par du tissu conjonctif : à droite, l'espace de Morgagni et à
gauche la fente de Larey par où transitent des vaisseaux épigastriques et lymphatiques.
3. Orifices principaux
Le hiatus aortique, fibreux et inextensible, se projette au niveau de T12. L’aorte est
accompagnée en arrière par le canal thoracique.
Le hiatus oesophagien, musculaire et extensible, se projette au niveau de T10, il
contient également les nerfs pneumogastriques.
L’orifice de la veine cave inférieure, fibreux et inextensible se projette en T9.
4. Vaisseaux et nerfs
La vascularisation du diaphragme est assurée principalement par les artères phréniques
inférieures droite et gauche naissant de l’aorte abdominale à hauteur de T12. Les artères
phréniques inférieures, plus accessoires naissent de l’artère thoracique interne.
L’innervation est assurée par les nerfs phréniques droit et gauche. Ils naissent
essentiellement du 4ème nerf spinal. Ce sont les nerfs moteurs du diaphragme.
15
B. Embryologie du diaphragme Le diaphragme se forme à partir de la réunion de 4 structures qui vont former le
diaphragme primitif. Celui-ci va ensuite se musculariser puis migrer pour atteindre sa position
définitive3.
1. Diaphragme primitif
Le diaphragme primitif se forme entre la 4ème et la 7ème semaine de vie intra-utérine
par fusion du septum transversum, des membranes pleuro-péritonéales, du mésentère dorsal
de l'œsophage et des muscles de la paroi thoracique.
a. Septum transversum
Cette structure forme le centre phrénique du diaphragme adulte. Le septum
transversum est identifiable à la fin de la 3ème semaine sous forme d'une masse ventrale, non
divisée, de mésoblaste. Au cours de la quatrième semaine, cette masse s'étend en arrière et
forme une cloison incomplète, ou diaphragme partiel qui sépare le cœlome en deux cavités
secondaires, l'une ventro-craniale ou péricardique, l'autre dorso-caudale ou pleuro-péritonéale,
qui communiquent latéralement par les gouttières pleuro-péricardiques. Le septum
transversum fusionne en arrière, sur la ligne médiane avec le méso-œsophage.
b. Mésentère dorsal de l'œsophage
Le mésentère dorsal de l'œsophage constitue la partie médiane du diaphragme. Il
donne en arrière les deux piliers principaux du diaphragme.
c. Membranes pleuro-péritonéales
Elles naissent de la partie dorso-latérale de la paroi du corps et forment
progressivement les canaux péricardo-péritonéaux entre la 5ème et la 6ème semaine. Elles vont
se fixer, en avant, à la partie dorsale du septum transversum et en dedans, aux bords latéraux
du mésentère dorsal de l'œsophage (Figure 2). Elles achèvent ainsi le cloisonnement entre la
cavité thoracique et la cavité abdominale. C'est le diaphragme primitif. La dernière partie à se
former est postéro-latérale et correspond au Foramen de Bochdalek.
16
d. Paroi thoracique
Le quatrième composant du diaphragme vient de la paroi du corps, plus tardivement,
entre la 9ème et la 12ème semaine. Les cavités pleurales s'agrandissent et s'enfoncent dans les
parois corporelles latérales. Les tissus de la paroi du corps laissés en dedans par la pénétration
pleurale vont constituer les parties périphériques externes du diaphragme et vont se
développer aux dépens des membranes pleuro-péritonéales qui ne représentent plus que de
toutes petites parties intermédiaires sur le diaphragme final. L'extension ultérieure des cavités
pleurales dans la paroi du corps forme les culs-de-sac costo-diaphragmatiques et détermine la
forme en dôme du diaphragme primitif.
Figure 2. Coupe transversale embryonnaire montrant la fermeture des canaux péricardo-péritonéaux,
d’après Larsen4.
A. Début de la 5ème semaine de développement embryonnaire, les flèches indiquent la migration des membranes
pleuro-péritonéales. B. Septième semaine de développement embryonnaire, la fermeture du canal pleuro-
péritonéal est complète.
Aorte
Membrane pleuro – péritonéale
Intestin antérieur
Veine cave inférieure
Septum transversum
Paroi du tronc
A B
Latéral gauche
Ventral
17
2. Muscularisation du diaphragme
Les myoblastes dérivés des myotomes cervicaux migrent et forment la musculature
diaphragmatique. Cette colonisation musculaire postérieure est complétée à partir des cellules
mésenchymateuses du septum transversum et à partir des myotomes thoraciques lors du
creusement de la paroi du corps.
3. Migration du diaphragme
Pendant la 4ème semaine, le septum transversum ou diaphragme partiel se situe en face
des somites cervicaux supérieurs. Pendant la 5ème semaine, le nerf venu du 4ème segment
cervical pénètre dans le septum transversum et constitue, de chaque coté, le nerf phrénique.
La croissance rapide de la partie dorsale du corps de l'embryon par rapport à celle de la partie
ventrale, produit une migration apparente ou descente du diaphragme.
Vers la 6ème semaine, le diaphragme en développement est situé au niveau des somites
thoraciques, et c'est au cours de la 8ème semaine que la partie dorsale du diaphragme se
retrouve au niveau de la première vertèbre lombaire.
18
C. Anomalies du développement du diaphragme. Les anomalies de développement du diaphragme surviennent dans environ 1/3000 à
1/4000 naissances vivantes5. Il faut savoir que le terme de « hernie diaphragmatique »
recouvre en définitive un large spectre d’anomalies, ce qui augmente la difficulté de
compréhension des mécanismes de survenue. Sous le terme de hernies diaphragmatiques, il
faut distinguer les hernies diaphragmatiques proprement dites qui se caractérisent par la
présence d’un brèche dans le diaphragme entraînant une communication anormale entre la
cavité abdominale et la cavité thoracique, des éventrations diaphragmatiques qui sont
caractérisées par la persistance d’une fine membrane et qui sont en réalité un défaut de
muscularisation du diaphragme. Toutefois, il est possible de voir coexister les deux types
d’anomalies chez un même patient.
Le plus souvent, les hernies diaphragmatiques sont accompagnées d’une anomalie du
développement pulmonaire engageant le pronostic respiratoire5. Dans près de la moitié des
cas, elles sont accompagnées de malformations touchant d’autres organes, on parle alors de
hernies syndromiques.
Dans près de 85% des cas, la hernie survient du côté gauche, dans 13% des cas du côté
droit et dans 2% des cas des deux côtés à la fois6. On distingue également les hernies en
fonction de leur localisation, antérieure ou postérieure.
1. Hernies de Bochdalek La hernie de Bochdalek se situe dans la région postéro-latérale du diaphragme. C’est
le type de hernie le plus fréquent, environ 90 à 95% des hernies congénitales7. La majorité des
hernies de Bochdalek surviennent du côté gauche tandis que les hernies de Bochdalek, à
droite ou bilatérales, ne comptent que pour 15 à 20 %7,8.
Différents degrés de déficit du rebord musculaire postérieur sont retrouvés : dans
certains cas, la musculature est complètement absente tandis que dans d’autres cas, le bord est
bien préservé (Figure 3).
Le plus souvent le feuillet péritonéal et le feuillet pleural sont continus au niveau de la
brèche, c’est la hernie sans sac. Parfois, la masse intestinale est recouverte d’un feuillet
péritonéal et pleural, c’est la hernie avec sac.
19
2. Hernies non postéro-latérales9
a. Hernies de Morgagni.
Le terme de hernie de Morgagni regroupe les hernies retrosternales ou parasternales.
Elles représentent 5 à 10% des HCD. Les hernies de Morgagni se développent à droite dans
90% des cas et à gauche dans seulement 2% des cas en raison de la présence du cœur. Elles
comportent de façon quasi-constante un sac herniaire à la différence des hernies de
Bochdalek. Les hernies de Morgagni sont latentes dans la plus part des cas, découvertes de
façon fortuite à l’âge adulte.
b. Hernies centrales
Les hernies centrales concernent la partie tendineuse du diaphragme. Elles sont liées à
un défaut de développement du septum transversum. Liu et al. ont démontré en 2003 qu’elles
avaient un mécanisme de survenue bien différent des autres types de hernie10.
3. Eventration L’éventration se caractérise par la présence d’une paroi diaphragmatique très fine qui
se distend et qui permet aux viscères abdominaux de se retrouver dans la cavité thoracique. La
surface intéressée par cette finesse du diaphragme peut varier de quelques centimètres à
pratiquement toute une coupole diaphragmatique.
20
Figure 3. Illustration des différents types de hernies diaphragmatiques (vue inférieure du diaphragme),
d’après Pober9.
21
D. Bases génétiques des hernies diaphragmatiques La pathogénie et l’étiologie des hernies diaphragmatiques sont encore très mal
comprises. Actuellement, deux concepts principaux s’affrontent au sujet du primum movens
de la hernie de coupole diaphragmatique congénitale :
- l’orifice diaphragmatique est primitif et entraîne une hypoplasie pulmonaire ;
- une anomalie primitive du mésenchyme pulmonaire permet aux viscères abdominaux
de pénétrer dans le thorax, ce qui empêche la fermeture du diaphragme et entraîne une
hypoplasie du diaphragme11.
En 2008, dans une revue de la littérature portant sur les aspects génétiques des hernies
diaphragmatiques12, Pober souligne les faits suivants en faveur d’une origine génétique des
hernies diaphragmatiques syndromiques :
- existence d’anomalies chromosomiques récurrentes chez des patients non apparentés,
révélant la présence de hot spots de HCD ;
- existence de syndromes monogéniques dont la malformation principale est une
hernie diaphragmatique ; les gènes pour la plupart de ces anomalies sont connus et permettent
d’avoir un aperçu des voies de signalisation impliquées dans le développement normal du
diaphragme ;
- survenue de plusieurs cas dans une même famille.
Il existe également quelques arguments en faveur d’une origine génétique dans les
HCD isolées. En effet, Ackerman et al., en 2005, ont mis en évidence une mutation dans le
gène FOG2 chez une patiente ayant une HCD isolée13.
En 2009, Klassens et al., dans le but de préciser les gènes et facteurs pouvant être
impliqués dans la survenue de HCD, décrivent dans deux schémas les différentes voies de
signalisation et les différents gènes impliqués dans la formation des poumons et du
diaphragme (Figure 4 et 5)14.
22
Figure 4. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement
pulmonaire, d’après Klaassens et al14.
Figure 5. Interaction cellulaire, gènes et voies de signalisation impliqués dans le développement du
diaphragme, d’après Klaassens et al14.
Ces deux schémas permettent de mettre en évidence plusieurs voies de signalisation
communes au développement de ces deux organes, en particulier la voie des rétinoïdes. Ils
mettent également en avant le rôle de certains gènes tels que COUP-TFII, FOG2 et GATA4
dans le développement normal de ces deux organes.
23
Ceci est en faveur de la survenue d’une anomalie simultanée du parenchyme
pulmonaire et du diaphragme dans la genèse de la hernie diaphragmatique.
1. Modèles animaux Pour essayer de préciser l’origine des hernies diaphragmatiques, différentes études ont
été menées à l’aide de modèles animaux. Ces modèles sont très différents puisque certains
font appel à la tératogenèse, d’autres sont obtenus par mutagenèse ou transgenèse.
Le premier modèle animal étudié est celui dont la hernie a été induite par le nitrofène,
un toxique qui intervient sur la voie des rétinoïdes.
a. Modèle de tératogenèse
Depuis de nombreuses années, le nitrofène (2,4-dichlorophenyl-p-nitropheniyl
ether) est utilisé chez le rat pour créer des modèles de hernies diaphragmatiques. En effet, le
nitrofène est inoffensif chez le rat adulte, mais administré entre le 8ème et le 10ème jour de
gestation chez le rat, celui-ci entraîne un fort taux de hernie diaphragmatique associée à une
hypoplasie pulmonaire et des anomalies de vascularisation des poumons, similaires aux
anomalies retrouvées chez l’Homme15.
- Métabolisme des rétinoïdes6
Les rétinoïdes sont une famille de molécules qui dérivent de la vitamine A essentielle
à la différenciation, à la croissance et au développement. La vitamine A est retrouvée dans
l’alimentation en particulier dans la viande animale ou bien le β-carotène présent dans les
légumes.
Après absorption aux niveau de l’intestin, les rétinyl esters sont transportés jusqu’au
foie pour y être stockés puis métabolisés en rétinol. Le rétinol est ensuite transporté aux tissus
cibles par l’intermédiaire de la retinol-binding-protein (RBP) sécrétée par le foie complexé à
la transthyrétine (Figure 6).
Le rétinol se fixe ensuite sur le récepteur cellulaire puis est internalisé dans la cellule
cible. Dans le cytoplasme, le rétinol peut être soit oxydé en rétinal, soit estérifié en rétinyl
ester par la lecithin retinol acetyltransferase, pour être stocké.
24
Si le rétinol subit une oxydation, celui-ci est pris en charge dans le cytoplasme par la
cellular retinol binding protein I (CRBP-I) puis est transformé en rétinal par la retinol
dehydrogenase (ROLDH) suivi d’une deuxième étape de déshydrogénation par les quatre
retinal dehydrogenase cytosoliques (RALDH), pour être transformé en acide rétinoïque. La
retinal dehydrogenase RALDH2 est celle qui a un rôle prépondérant dans la formation de
l’acide rétinoïque.
L’acide rétinoïque est le métabolite actif des rétinoïdes. Une fois synthétisé dans la
cellule, celui-ci entre dans le noyau et se fixe à deux classes de facteurs de transcription intra-
nulcéaires : retinoic acide receptors (RARs) et retinoid X receptors (RXRs). Il existe trois
membres de chaque classe nommés RARα, RARβ et RARγ et RXRα, RXRβ et RXRγ. Pour
agir sur un gène sensible à l’acide rétinoïque, il se forme un hétérodimère entre une des
molécules RARs et RXRs. C’est l’hétérodimère RAR-RXR qui est l’unité active pour la
transduction du signal de la voie des rétinoïdes, au niveau du gène.
Par ailleurs, l’acide rétinoïque est inactivé par l’enzyme Cyp26, de la famille du
cytochrome P450.
25
Figure 6. Schéma général de la voie de signalisation des rétinoïdes, d’après Montedonico et al6.
26
- Rôle des rétinoïdes dans les HCD
La première preuve du lien existant entre les rétinoïdes et les HCD provient des études
menées dès les années 1940 par Andersen, chez des rats ayant une alimentation déficiente en
vitamine A. Dans 25 à 70% des cas, il existe une hernie diaphragmatique chez les jeunes rats
avec une prédominance de hernie de coupole droite16. Dans les années 1950, Wilson et al.
montrent que la réintroduction de la vitamine A dans l’alimentation permet de diminuer le
taux de hernies diaphragmatiques et que celui-ci devient nul si la vitamine A est réintroduite
aux 10ème et 11ème jours de gestation17.
Différents auteurs ont étudié les modèles de hernies induites pas le nitrofène. Ces
études suggèrent que le nitrofène agit sur l’activité de la RALDH2 en inhibant celle-ci18,19.
D’autres auteurs ont montré que l’administration concomitante de nitrofène et de vitamine A
permettait de diminuer le taux de hernie de 80 à 20 - 40% en fonction du moment où la
vitamine A était réintroduite20-22. Une autre étude a montré que la diminution était encore plus
marquée si l’acide rétinoïque était administré, à la place de la vitamine A (incidence diminuée
de 54% à 8%)23. Ceci suggère que la diminution de l’activité enzymatique de RALDH2
induite par le nitrofène peut être bloquée par une forte dose de substrat (vitamine A). D’autre
part, l’administration d’acide rétinoïque diminue fortement l’incidence des hernies chez le rat
car elle permet de contourner l’altération de RALDH223.
L’ensemble de ces résultats montre que la voie de signalisation des rétinoïdes ainsi
que le précurseur, la vitamine A semblent jouer un rôle important dans la survenue des
hernies diaphragmatiques.
D’autres modèles animaux ont également été étudiés pour approfondir les mécanismes
de survenue des HCD.
27
b. Modèles génétiques
Différents modèles de souris génétiquement modifiées ayant des lacunes
diaphragmatiques variables ont été étudiés. Il a été mis en évidence que certains gènes
impliqués dans l’apparition d’un orifice anormal chez la souris sont également impliqués chez
l’Homme.
En 2007, Ackerman et al. ont rassemblé les principaux modèles murins qui ont été
étudiés pour comprendre l’implication des différents gènes dans la formation normale et
pathologique du diaphragme chez l’Homme5. L’ensemble de ces modèles est rassemblé dans
le tableau suivant :
Tableau 1. Exemples de modèles murins de HCD, d’après Ackerman et al5.
Certains de ces modèles ont été particulièrement étudiés puisqu’ils sont associés à des
anomalies chez l’Homme.
28
- Modèle Fog2 (Friend of GATA protein 2)
En 2007, l’équipe d’Ackerman a étudié des souris traitées par un agent chimique
mutagène, le N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) et qui présentaient une hypoplasie pulmonaire
associée à une anomalie de développement du diaphragme (hernie postérieure) et du coeur5.
Ils ont mis en évidence une mutation dans le gène Fog2, entraînant la synthèse d’une protéine
Fog2 tronquée.
Fog2 code pour une protéine à doigts de zinc qui module l’activité transcriptionnelle
de Gata4, facteur de transcription impliqué dans l’embryogenèse précoce. D’autre part, le
schéma de Klaassens met en évidence l’interaction de FOG2 avec COUP-TFII14.
L’étude chez l’Homme du gène orthologue FOG213, situé en 8q23, dans une cohorte
de 30 enfants décédés et présentant une hernie diaphragmatique, a mis en évidence la
présence d’une mutation, survenue de novo, dans la séquence de FOG2 chez une seule
patiente, entraînant l’apparition d’un codon STOP et une protéine tronquée n’ayant pas le
domaine en doigts de zinc. Les auteurs considèrent que la mutation survenue de novo est
responsable du phénotype de la patiente.
Bleyl et al., en 2007, ont également séquencé FOG2 chez 96 patients présentant une
hernie diaphragmatique24. Ils ont mis en évidence une mutation chez deux patients. Ces
mutations n’entraînent pas l’apparition d’un codon STOP mais sont responsables de la
substitution d’un acide aminé conservé à proximité ou au niveau du domaine en doigts de
zinc. Elles n’ont pas été retrouvées chez des sujets contrôles.
Ce modèle montre l’importance de FOG2 dans le développement du diaphragme et le
rôle qu’il peut jouer dans la survenue d’une hernie diaphragmatique par défaut d’interaction
avec les autres gènes impliqués dans l’embryogenèse du diaphragme et en particulier GATA4
et COUP-TFII
- Modèle Coup-tfII (Chicken ovalbumin upstream
promoter-transcription factor II)
En 2005, Klaassens par une étude en CGH array (Comparative Genomic Hybridization
array) met en évidence une région critique pour les HCD25 d’environ 5Mb située en 15q26.1-
q26.2. Quatre gènes sont situés dans cet intervalle et Klassens met en avant un gène, COUP-
TFII, précédemment nommé NR2F2, qui est un gène codant pour un facteur de transcription
agissant comme un répresseur sur la voie de signalisation des rétinoïdes.
29
You en 2005, suite à ces résultats, étudie ce gène Coup-tfII chez la souris26. Des études
précédentes avaient montré que des souris Coup-tfII -/- présentaient un défaut d’angiogenèse et
de développement cardiaque et mouraient avant le 10ème jour de développement
embryonnaire27. C’est pourquoi ils ont conçu un modèle de souris conditionnel, où Coup-tfII
n’est pas exprimé dans le tissu mésentérique. La plupart de ces mutants présentaient une
hernie postérieure de type Bochdalek, identique à celle que l’on retrouve chez l’Homme
(Figure 7).
Figure 7. Aperçu du thorax et de l’abdomen après dissection et aspect du diaphragme chez des souris
témoins et des souris mutantes pour Coup-tfII, d’après You et al26.
Les auteurs ont montré que la délétion du gène Coup-tfII contribuait à l’apparition
d’une HCD. Cependant, l’absence de hernie de coupole chez les mutants hétérozygotes
soulève le problème du mécanisme de survenue des HCD chez les patients présentant une
délétion de COUP-TFII. Pour expliquer cette différence, les auteurs suggèrent que d’autres
mutations dans les allèles de COUP-TFII ou dans d’autres molécules telles que FOG2
interagissant avec COUP-TFII sont nécessaires pour le développement d’une hernie
diaphragmatique chez l’Homme.
CDH of P0 mutant mouse. (A and B) Frontal view of representative P0 newborn mice. (A) Control newborn. (B) Mutant CDH at P0. In the mutant, the stomach is located in the center of the thorax, just above the diaphragm, the liver is herniated, and the left lung is severely compressed. The heart is also mislocated to the right thorax, exhibiting dextroposition. (C and D) Dissected diaphragm illustrates the presence of a left-sided dorsolateral hernia in the mutant. The dissected diaphragm has been placed with the abdominal side facing the objective, with the dorsal side on top. Note the large left-sided dorsolateral defect of the diaphragm forming a hole (indicated by an arrow), which permitted the abdominal contents (e.g., stomach) to herniate into the thorax. H, heart; Lg, lung; SC, spinal cord; St, stomach; Lv, liver.
30
- Modèle Gata4 (GATA binding protein 4)
La microdélétion de la région 8p23.1, chez l’Homme, contenant le gène GATA4 a été
rapportée de nombreuses fois dans les hernies diaphragmatiques28-32. GATA4, gène codant
pour un facteur de transcription connu pour être responsable d’anomalies du
développement cardiaque, interagit avec FOG2. En tenant compte de tous ces points, Jay
et al., en 2007, ont évoqué le rôle de GATA4 dans la survenue de HCD d’autant plus souvent
qu’une anomalie cardiaque est associée33.
Pour vérifier cette hypothèse, ils ont conçu et étudié des souris mutantes Gata4 +/- . Ils
ont mis en évidence la présence d’une hernie diaphragmatique associée à des anomalies des
voies aériennes et du développement cardiaque. Les souris mutantes présentent une HCD
dans environ 30% des cas, tandis que les malformations cardiaques sont constantes. Ils ont
également montré que l’interaction entre Gata4 et Fog2 (ou d’autres facteurs de transcription)
régule la fonction cellulaire du mésenchyme pendant le développement du diaphragme et des
poumons.
- Modèle Wt1 (Wilms tumor 1)
Alors que des souris mutantes Wt1 -/- ont été produites pour étudier le rôle de ce gène
dans les malformations du tractus urinaire, des cas de hernie diaphragmatique ont été
identifiés34. Le gène WT1, situé en 11p13, qui code pour une DNA-binding protein ayant 4
domaines en doigts de zinc est connu pour agir comme un facteur de transcription mais
également comme ayant un rôle dans la formation des ARN. Clugston et al. ont décidé
d’étudier ce gène puisqu’il est exprimé dans le mésothéliome pleural et abdominal qui aboutit
à la formation du diaphragme. Dans cette étude, ils ont montré qu’il existait bien des hernies
diaphragmatiques chez des souris Wt1 -/- et que celles-ci étaient liées à une anomalie du
développement de la partie non musculaire de la membrane pleuro-péritonéale.
31
2. Chez l’Homme
a. Rétinoïdes et hernie
En 1998, Major et al. ont réalisé une étude clinique pour évaluer le lien entre vitamine
A et HCD chez l’Homme35. Le rétinol et RBP ont été mesurés chez 11 nouveaux-nés en
bonne santé et 11 nouveaux-nés présentant une hernie de coupole. Les résultats ont montré
que la concentration en rétinol et RBP, mesurés au niveau du cordon, était diminuée de 50%
chez les enfants avec hernie par rapport aux enfants sains. A l’inverse le taux de rétinol et de
RBP était augmenté dans le sang des mères ayant un enfant avec une hernie. Devant ces
résultats, les auteurs ont suggéré une possible détérioration du transport du rétinol à travers le
placenta.
b. Anomalies génétiques fréquentes associées à
des HCD
De nombreuses anomalies génétiques associées à la survenue d’une hernie
diaphragmatique ont été rapportées dans la littérature. Ces différentes anomalies sont soit des
syndromes monogéniques soit des anomalies chromosomiques récurrentes.
- Syndromes monogéniques
En 2008, dans une revue de la littérature sur les hernies diaphragmatiques, Pober
regroupe les principaux syndromes monogéniques dans lesquels, la hernie diaphragmatique
est fréquemment retrouvée12. Le tableau 2 rassemble ces syndromes et les gènes impliqués
lorsqu’ils sont connus.
32
Tableau 2. Syndromes monogéniques pour lesquels la HCD est l’élément principal, d’après Pober12.
On retrouve dans ce tableau l’implication du gène STRA6 dans la survenue du
syndrome de Matthew-Wood. D’après les schémas de Klaassens (Figure 4 et 5) STRA6 est
impliqué dans la formation du diaphragme et des poumons.
D’autre part, on voit également la présence du gène WT1 dont on a vu précédemment
son implication dans la survenue de HCD.
33
- Anomalies chromosomiques
Dès 1996, des anomalies chromosomiques ont été identifiées comme étant
responsables de hernies diaphragmatiques36. En 2003, Lurie a analysé près de 150 cas de
hernies diaphragmatiques rapportées dans la littérature. Les délétions des régions 15q26,
8p23, sont le plus fréquemment rapportées en association avec une HCD37,38. Les régions
22q11, 4q28.3q32, sont également rapportées comme des régions associées aux HCD mais
lorsqu’elles sont dupliquées.
La tétrasomie 12p associée au syndrome de Pallister-Killian est une anomalie
chromosomique souvent impliquée dans les HCD puisque Lurie dénombre plus de 50 cas de
hernie diaphragmatique associés à ce syndrome.
En 2007, Holder reprend toutes les anomalies chromosomiques répertoriées dans la
littérature39 et délimite les régions les plus fréquemment impliquées dans les HCD.
Son travail est schématisé dans le Figure 8.
Figure 8. Schéma récapitulatif des principales anomalies chromosomiques associées aux HCD, d’après
Holder et al39.
34
Nous retrouvons parmi ces anomalies, les délétions 15qter comprenant le gène COUP-
TFII qui sont rapportées 26 fois dans la littérature, et les délétions 8p23 comprenant le gène
GATA4.
- Formes familiales
Dans la littérature, plus de 50 familles, dont au moins deux apparentés sont atteints et
pour lesquels il n’a pas été mis en évidence d’anomalie chromosomique, ont été rapportées9.
D’après l’Association of Congenital Diaphragmatic Hernia Research, Advocacy and Support
(CHERUBS), dans 2% des cas, le sujet atteint a un apparenté du premier degré également
atteint. Cependant, les cas familiaux de HCD représentent un groupe très hétérogène. En effet,
différents modes de transmission ont été évoqués :
- dans le cas des familles consanguines, l’hypothèse d’une transmission autosomique
récessive est évoquée40,41 ;
- dans le cas des familles non consanguines, l’hypothèse d’une transmission
autosomique récessive ou bien liée à l’X est proposée car dans certaines familles étudiées, les
sujets atteints sont parfois de sexe opposé mais le plus souvent de même sexe masculin9,42,43 ;
- dans quelques cas, transmission apparemment autosomique dominante, avec deux
cas rapportés dans la littérature, de parents atteints d’une éventration diaphragmatique, ayant
eu un enfant avec une HCD44,45.
Cependant, un mode de transmission plus complexe faisant intervenir plusieurs gènes
ayant des effets complémentaires ne peut pas être exclu.
Par ailleurs, les formes familiales sont également hétérogènes du point de vue clinique
puisqu’elles peuvent être isolées ou bien syndromiques. Des analyses de liaison n’ont pas
encore été réalisées du fait de la mortalité liée à la hernie et de l’hétérogénéité des formes
familiales.
35
III. Notre travail
A. Intérêt de la CGH array pour l’étude génétique
des hernies de coupole diaphragmatique
congénitales
Les techniques de cytogénétique ont beaucoup évolué depuis la découverte du nombre
exact de chromosomes chez l’Homme en 1956. La réalisation du caryotype, avec
l’introduction des techniques de bandes, a permis d’améliorer la résolution et la sensibilité de
l’analyse cytogénétique. Cependant, l’analyse du caryotype en haute résolution ne permet pas
de mettre en évidence des anomalies dont la taille est inférieure à 5 Mb. L’introduction des
techniques de cytogénétique moléculaire et en particulier l’Hybridation In Situ Fluorescente
(FISH) dans les années 1990 a permis d’augmenter le degré de résolution et la sensibilité de
l’analyse cytogénétique. Toutefois cette technique a également une limite. Elle ne permet de
mettre en évidence que des anomalies ciblées. C’est pourquoi, à la fin des années 1990 les
puces à ADN ou micro-array ont été mises au point pour permettre un criblage global du
génome avec une meilleure résolution.
Jusqu’en 2005, la quasi-totalité des applications et des publications liées à la CGH
array concernaient la cytogénétique oncohématologique et la cytogénétique des tumeurs.
Cette technique a ensuite été utilisée en cytogénétique constitutionnelle, dans un premier
temps pour borner des anomalies diagnostiquées par la cytogénétique classique ou la biologie
moléculaire pantélomérique et maintenant, comme un outil de screening lorsque le caryotype
et les ananlyses ciblées sont normales46.
En effet, la CGH array convient particulièrement au diagnostic en cytogénétique
constitutionnelle puisque les anomalies retrouvées sont souvent uniques. De plus, de
nombreuses études ont montré l’intérêt de l’utilisation de la CGH array dans les cas de
syndromes où une anomalie chromosomique est évoquée tels que le retard mental de l’enfant
associé à des malformations et/ou à une dysmorphie. Différentes études montrent que dans les
cas de retard mental, la CGH array peut mettre en évidence une anomalie dans 4 à 17% des
cas47.
36
En revanche, l’utilisation de la CGH array au cours du diagnostic prénatal reste
prudente en raison des difficultés d’interprétation des CNV (Copy Number Variations). Le
terme CNV désigne un segment d’ADN ayant une longueur supérieure à 1 kb, avec un
nombre de copies qui est variable lorsqu’il est comparé à un génome de référence48,49. Ce
terme ne préjuge pas du caractère pathogène ou non de cette variation. L’interprétation des
CNV n’est pas toujours aisée. Il est parfois difficile de démontrer le lien de causalité entre un
CNV mis en évidence et le phénotype du patient. Cette incertitude rend difficile en période
prénatale, l’appréciation du pronostic et le conseil génétique.
B. Objectif de l’étude Par arrêté du Ministre de la santé et des solidarités en date du 3 mai 2007, l’hôpital
Necker-Enfants Malades a été désigné en qualité de Centre de référence Maladies Rares pour
la hernie diaphragmatique congénitale.
Les objectifs du Centre de référence sont d’harmoniser l’accès au diagnostic et à la
prise en charge par la mise en place d’une filière de soins, la définition de protocoles
thérapeutiques, une veille épidémiologique, et une surveillance à long terme. Enfin, ce centre
a initié un travail de recherche sur les bases moléculaires de la malformation. C’est dans ce
cadre qu’un protocole de recherche sur les causes chromosomiques des HCD a été instauré.
Notre objectif était donc de rechercher la présence de microremaniements
chromosomiques déséquilibrés, par CGH array, dans le but d’identifier des nouveaux gènes
présents éventuellement dans ces régions et pouvant être impliqués dans la genèse des HCD.
37
IV. Matériels et méthodes
A. Recrutement des sujets Cinquante sujets au total ont été inclus dans cette étude. Ils proviennent d’une cohorte
prospective et d’une cohorte rétrospective.
1. Cohorte prospective Les sujets inclus dans cette cohorte ont été adressés par la maternité de l’hôpital
Necker-Enfants Malades entre le mois de janvier 2008 et le mois d’avril 2009. Les familles
ont reçu et signé un consentement pour participer à une étude génétique sur les hernies
diaphragmatiques. Cette cohorte comporte 25 fœtus et nouveaux-nés décédés ainsi que 9
enfants vivants. Ce groupe est constitué majoritairement de sujets présentant une hernie
isolée. Seuls quatre sujets présentaient des malformations associées [Annexe 1].
2. Cohorte rétrospective Cette cohorte est constituée de 14 fœtus pour lesquels il y a eu un examen embryo-
fœtopathologique à l’hôpital Necker-Enfants Malades, entre 2001 et 2007. Ces fœtus ont été
inclus dans cette étude car ils présentaient pour la majorité une autre malformation associée à
la hernie de coupole. Les familles avaient signées un consentement pour la réalisation
d’examens permettant de mettre en évidence les causes du décès. Tous les fœtus inclus dans
cette cohorte ont eu un caryotype en période anténatale dont le résultat était consigné dans le
dossier. Cette cohorte comporte également 2 enfants vivants. Le sujet 49 a été inclus car il a
deux frères ayant également une hernie de coupole isolée. Le sujet 50 a été inclus dans cette
cohorte car il présente une dysmorphie [Annexe 2].
38
B. Techniques d’étude
1. Caryotypes Tous les sujets de la «cohorte prospective» inclus dans l’étude ont bénéficié d’un
caryotype en bandes R (RHG-banding : R-bands by heating using Giemsa) et en bandes G
(GTG-banding : G-bands by trypsin using Giemsa) selon les recommandations de l’ACLF
(Association des Cytogénéticiens de Langue Française)50. Cette étude du caryotype a été
effectuée sur un prélèvement de liquide amniotique. La formule chromosomique était rendue
en suivant la nomenclature de l’ISCN (An International System for Human Cytogenetic
Nomenclature).
Les sujets pour lesquels il existait une anomalie visible au caryotype n’étaient pas
inclus dans l’étude.
Pour les sujets de la « cohorte rétrospective », le résultat du caryotype était indiqué
dans le dossier.
2. Hybridation In Situ Fluorescente (FISH)
a. Principe général
Les techniques d'Hybridation In Situ sont fondées sur la propriété de réassociation
spécifique des acides nucléiques. Une sonde dénaturée (ADN simple brin marqué) en solution
peut s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible (préparation chromosomique
dénaturée) grâce à la complémentarité des bases nucléotidiques. La sonde s'apparie par des
liaisons hydrogènes établies selon les critères de Watson et Crick. Les hybridations
aspécifiques et les molécules de sonde non hybridées sont éliminées par lavage, puis les
hybrides spécifiques sont révélés. Enfin, l'observation s'effectue grâce à un microscope à
fluorescence.
39
b. Matériel d’études
Pour confirmer les résultats obtenus par la CGH array, une étude en FISH a été
réalisée.
Dans le cas de la «cohorte prospective», les étalements cellulaires ont été obtenus à
partir de sang frais prélevé sur héparinate de lithium puis mis en culture dans un milieu
contenant de la phytohémagglutinine (PH) permettant la stimulation des lymphocytes T. La
culture cellulaire a été synchronisée au bout de 48 heures pour obtenir une meilleure qualité
d’étalement cellulaire [Annexe 3]. Pour cette cohorte, nous avons pu réaliser une FISH
métaphasique et interphasique.
Dans le cas de la « cohorte rétrospective », les étalements ont été obtenus par
apposition de tissus fœtaux congelés. Cette technique consiste à abraser le bloc congelé pour
obtenir une surface plane. Ensuite, une empreinte est réalisée par apposition, sans pression ni
translation de la lame à la surface du bloc. Selon les tissus, la température du bloc est ajustée
entre -15°C et -20°C et les lames préalablement chauffées ou non pendant 5 minutes sur une
platine chauffante à 45°C. Une température plus élevée et un chauffage de la lame favorisent
le transfert des cellules vers la lame et la densité cellulaire de l’empreinte. Après séchage, les
empreintes sont conservées à température ambiante. Dans ce cas, seule une FISH
interphasique a pu être réalisée.
c. Préparation des sondes
Les sondes utilisées pour l’étude en FISH ont été préparées à partir de la banque de
sondes BAC (bacterial artificial chromosome) du service de Cytogénétique de l’hôpital
Necker-Enfants Malades. Tout d’abord, l’amplification a été réalisée par la technique de
« Rolling Circle Amplification », technique permettant l’amplification exponentielle de
l’ADN circulaire ou linéaire jusqu’à 10 kb et l’obtention de 5 à 10 µg d’ADN à partir de
quelques ng au départ [Annexe 4].
Les sondes ont ensuite été marquées par la technique de « Nick Translation » [Annexe
5]. Une Dnase coupe l’ADN puis, une polymérase reconstitue le brin complémentaire en
présence de dNTP, et de dUTP couplé à un fluorochrome, l'Isothiocyanate de Fluorescéine
(FITC) ou la rhodamine.
40
Les sondes marquées ont ensuite été co-précipitées avec une autre sonde marquée avec
un fluorochrome différent puis remis en suspension dans un tampon d’hybridation contenant
de la formamide
Avant d’utiliser les sondes préparées pour la vérification des résultats de CGH array,
la localisation des sondes a été vérifiée en hybridant, sur des préparations chromosomiques
d’un témoin, un mélange de la sonde à tester avec une sonde témoin située sur le même
chromosome.
d. Hybridation et lecture
La préparation chromosomique et la sonde ont été co-dénaturées sur une platine
chauffante à 72°C pendant 3 minutes. Pour les appositions de tissus, la co-dénaturation était
de 4 minutes à 80°C.
L’hybridation a ensuite été réalisée à 37 °C pendant au moins 16 à 24 heures dans une
chambre noire et humide.
Après une étape de lavage pour éliminer les hybridations aspécifiques, les lames
hybridées ont ensuite été lues au microscope à fluorescence à l’aide de filtres permettant la
lecture de chaque fluorochrome.
e. Applications
- FISH ciblée « hernie diaphragmatique »
L’étude préliminaire de la « cohorte prospective » a été complétée par la réalisation
d’une FISH ciblée en faisant appel à trois sondes :
- Une sonde constituée du clone RP11-46C2 marqué avec un fluorochrome à
fluorescence rouge dérivé de la rhodamine (Tétramethyl Rhodamine Isothiocyanate). Ce clone
est localisé en 15q26.2 et comprend le gène COUP-TFII.
- Une sonde composée des clones RP11-388A16 et RP11-359B12 marqués avec un
fluorochrome à fluorescence verte, le FITC (Isothiocyanate de Fluorescéine). Ceux-ci sont
situés en 12p13. Un compte sur 100 noyaux est effectué car la tétrasomie 12p est retrouvée en
mosaïque dans le liquide amniotique.
- Une sonde constituée du clone RP11-297K5 marqué avec un fluorochrome à
fluorescence bleue, la coumarine. Ce clone est localisé en 8p23.1 et couvre le gène GATA4.
41
Nous utilisons en pratique courante dans le service cette FISH ciblées depuis 2005
puisque ces régions sont connues comme les plus fréquemment associées aux HCD36.
Dans le cas de la « cohorte rétrospective », cette étude n’a pu être réalisée.
- Vérification des CNV
Une étape de vérification est nécessaire pour confirmer les résultats obtenus par CGH
array. Dans notre étude, les vérifications ont été effectuées à l’aide de la FISH, aussi bien dans
les cas de délétion que dans les cas de duplication.
3. Comparative Genomic Hybridization Array
(CGH array)
a. Principe général
La CGH est une technique d'analyse globale du génome qui repose sur l'hybridation
génomique comparative (CGH). Son principe a été décrit par Kallioniemi et al. en 1992, il
consiste à cohybrider une même quantité d'ADN d'un patient et d'un témoin, marquée chacune
par un fluorochrome différent, sur les métaphases d'un autre sujet témoin51. La CGH array
repose sur le principe de la CGH, mais cette technique est réalisée sur une lame de verre sur
laquelle sont déposées des séquences d'ADN connues52. Après avoir cohybridé dans une
chambre noire et humide à 37°C l'ADN du patient et l'ADN du témoin pendant au moins 16
heures, la lecture des signaux est réalisée grâce à un scanner laser automatisé. Une analyse
informatique des données est ensuite réalisée à l'aide d'un logiciel qui enregistre l'intensité de
fluorescence de l'ADN marqué avec chacun des fluorochromes. On obtient alors un profil de
CGH où chaque point représente le ratio des signaux émis par le fluorochrome 1 et le
fluorochrome 2.
42
Figure 9. Synoptique comparatif des principales étapes entre la CGH sur
chromosomes et la CGH array, d’après Sanlaville et al52.
Afin d'assurer un contrôle interne, l’ADN de chaque patient est à nouveau hybridé
avec l’ADN d’un témoin en inversant les fluorochromes. Cette technique permet une étude en
« dye-swap ». En effet, dans la première technique, le patient est marqué avec le
fluorochrome 1 et dans la deuxième technique, avec le fluorochrome 2. Dans les deux cas,
c’est le ratio fluo1/fluo2 qui est étudié. Pour une même séquence d’ADN, si dans la première
technique ce ratio est supérieur à la limite déterminée (par exemple +4 DS) alors dans la
deuxième technique, il devra être inférieur à -4 DS, pour évoquer une anomalie. La
représentation graphique donnera donc une image en miroir.
43
Figure 10. Représentation graphique de la technique en « dye
swap ».
Les points rouges représentent la technique où l’ADN du patient
est marqué avec le fluorochrome 1 et les points bleus, la technique
où il est marqué avec le fluorochrome 2.
b. Préparation des échantillons
- Matériel d’étude
Dans le cas de la «cohorte prospective», l’ADN nécessaire à la réalisation de la CGH
array a été extrait à partir de sang fœtal frais total prélevé sur EDTA. Les globules rouges ont
d’abord été lysés par un tampon de lyse qui provoque un choc hypotonique. Après agitation et
centrifugation, un culot de globules blancs a été récupéré. A partir de celui-ci et après
digestion par la protéinase K, la technique d’extraction phénol-chloroforme a été utilisée.
Après précipitation en présence d’acétate de sodium et d’isopropanol, le prélèvement a été
centrifugé puis séché. Le culot d’ADN a ensuite été élué dans du tampon Tris-EDTA (T.E),
pour obtenir une concentration finale d’environ 200 à 300 µg/mL [Annexe 6].
Dans le cas de la « cohorte rétrospective », l’ADN a été extrait à partir de fragments de
tissus congelés (poumon, thymus et muscle dans la majorité des cas ou bien à partir de culots
globulaires conservés en banque). La technique d’extraction phénol-chloroforme a également
été utilisée après un temps de digestion par la protéinase K. La concentration finale en ADN
obtenue était également d’environ 200 à 300 µg/mL [Annexe 7].
44
- Marquage des ADN
L’ADN a été marqué par une technique de « Random priming ». Cette technique
consiste à chauffer l’ADN du patient à 99°C pendant 10 minutes pour dénaturer les 2 brins
d’ADN puis à le refroidir brutalement. Ensuite, un mélange d’oligonucléotides
(hexanucléotide) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons possibles (46 = 4096)
est ajouté. Quelques uns de ces oligonucléotides vont s’hybrider au hasard avec l’ADN
monobrin. Les oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au fragment de Klenow de l’ADN
polymérase I qui, par son activité polymérase, va reconstituer l’intégrité des 2 fragments en
présence de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) couplés à un marqueur fluorescent la
cyanine. L’ADN du patient est marqué d’une part par la cyanine-3, sous forme de Cy3-dXTP
et d’autre part par la cyanine-5, sous forme de Cy5-dXTP, pour réaliser la technique de « dye
swap ».
Pour les patients étudiés à l’aide des puces BlueGnome, une quantité de 450 ng
d’ADN a été marquée avec chacun des fluorochromes. L’ADN marqué a ensuite été purifié
sur des colonnes de Séphadex G50 Superfine. Cette étape permet d’éliminer les bases
fluorescentes restées libres dans les produits de marquage avant hybridation sur la lame.
Pour les patients étudiés à l’aide des puces PerkinElmer, une quantité de 1000 ng
d’ADN a été marquée avec chacun des fluorochromes. La technique de marquage de
PerkinElmer ne nécessite pas d’étape de purification.
Pour réaliser l’hybridation, nous avons préparé deux mélanges pour chaque patient.
Dans le premier mélange, nous avons associé l’ADN du patient marqué par la cyanine-3 à
l’ADN de référence marqué par la cyanine-5 en proportion égale et dans le second, nous
avons mélangé l’ADN du patient marqué par la cyanine-5 et l’ADN de référence marqué par
la cyanine-3. Les mélanges ont été précipités dans du NaCl et de l’alcool. Le surnageant a été
évacué et le culot séché. Il a ensuite été remis en suspension dans du tampon d’hybridation
contenant de la formamide.
Nous avons réalisé une technique en trio où chaque patient était le témoin d’un autre
patient. Prenons l’exemple de 3 patients A, B et C. Dans la première technique, le patient A
est marqué par la cyanine-3 et hybridé avec le patient B marqué par la cyanine-5 comme
45
témoin. Dans une deuxième technique, le patient A est marqué par la cyanine-5 et hybridé
avec le patient C marqué par la cyanine-3 comme témoin. Pour ne pas biaiser les résultats,
nous avons constitué des trios de patients n’ayant pas la même présentation clinique. Ceci
permet d’éviter de manquer une anomalie qui serait présente chez deux patients de l’étude. En
effet, si deux patients ont la même présentation clinique, on peut supposer qu’ils ont la même
anomalie cytogénétique. Dans ce cas, ils ont le même nombre de copies de la région
anormale. En les hybridant simultanément, nous ne pouvons pas mettre en évidence dans cette
région une variation du nombre de copies.
c. Hybridation
- Puces BlueGnome
Vingt-trois patients de la «cohorte prospective» ont été testés sur une puce BlueGnome
CytoChipTM v2, contenant 4000 clones BAC, couvrant l’ensemble du génome avec une
résolution moyenne d’environ 1 Mb. La couverture du génome est plus dense dans les régions
subtélomériques avec une résolution médiane de 250 kb. De plus, cette puce couvre 90
régions correspondant à des syndromes microdélétionnels connus avec une résolution
médiane de 100 kb. Chaque lame contient deux plages d'hybridation.
Avant l’hybridation, les mélanges ont été chauffés à 99°C pour être dénaturé pendant
10 minutes puis placés à 37°C pendant 1 heure. L’hybridation a été réalisée à l’aide d’une
station d’hybridation TECAN HSTM 400 pro permettant l’automatisation de l’hybridation et
des lavages. Au bout d’une heure, les mélanges ont été injectés dans chaque chambre
d'hybridation puis l’hybridation a eu lieu pendant 22 heures.
Le lavage en fin d’hybridation permet d’éliminer les hybridations non spécifiques et
donc de diminuer le bruit de fond lors de la lecture de la lame.
- Puces PerkinElmer
Les 27 autres patients ont été testés sur une puce PerkinElmer Constitutional Chip®
3.0, contenant 5200 clones BAC, couvrant également l’ensemble du génome mais avec une
résolution moyenne d’environ 650 kb. De la même manière, la couverture est plus dense dans
les régions subtélomériques avec plus de 900 clones dans ces régions. La puce couvre
également les régions impliquées dans des syndromes microdélétionnels connus.
46
Les mélanges ont été chauffés à 99°C pendant 10 minutes puis placés à 37°C pour une
étape de préhybridation pendant une heure. L’hybridation a ensuite été effectuée dans les
chambres d’hybridation recommandées par le fabricant et plongées dans un bain-marie à
37°C. L’hybridation a eu lieu pendant 20 à 24 heures à l’abri de la lumière.
Les étapes de lavage ont été faites manuellement dans des bains successifs de plus en
plus stringents contenant du SDS (Sodium Dodecyl Sulate) et du SSC (Citrate Sodique de
Sel). La stringence augmente au cours du lavage pour éliminer les hybridations non
spécifiques.
d. Lecture des lames
La lecture des lames a été faite à l’aide d’un scanner GenePix® 4000B. L’acquisition
est faite à 10 µm, après un « préscan » de repérage de la zone à scanner à 40 µm. Le scanner
est équipé de deux lasers qui excitent spécifiquement les fluorochromes cyanine-3 à 352 nm
et cyanine-5 à 635 nm, ainsi que d’un tube photomultiplicateur couplé à un scanner pour
analyser les photons émis par les cyanines. Les images acquises ont ensuite été enregistrées
pour l’analyse.
e. Analyses
- Puces BlueGnome
L’analyse a été faite à l’aide du logiciel « BlueFuse for microarrays » de la société
BlueGnome®, analysant les deux techniques pour chaque patient en même temps. Ceci permet
de faire l’analyse en « dye-swap ». Pour l’interprétation, la déviation standard des autosomes
a été déterminée pour chaque patient et si le log2 du ratio Cy3/Cy5 était supérieur à +4 DS ou
inférieur à –4 DS le résultat était considéré comme significatif. Un clone était vérifié en FISH
si d’une part, il existait une image en miroir, c’est-à-dire, au-delà du seuil de significativité
dans les deux techniques, et d’autre part s’il ne faisait pas partie des variants connus, aussi
bien dans la base BlueGnome que dans la base « Database of Genomic Variants » de
Toronto54 ou la base « Ensembl »55.
- Puces PerkinElmer
Pour les puces PerkinElmer, l’analyse a été faite à l’aide du logiciel SpectralWare
Web v2.3. Ce logiciel permet également de faire une analyse des patients en « dye-swap ».
47
L’interprétation des résultats a été faite en fonction du ratio log Cy5/log Cy3. Sur les
représentations graphiques, la courbe rouge représente la technique où l’ADN du patient est
marqué par la cyanine-3 et la courbe bleue, celle où l’ADN du patient est marqué par la
cyanine-5. Les bornes de significativité ont été déterminées individuellement pour chaque
patient par le logiciel, à l’aide de la méthode « Iterative 2.5 sigmas », recommandée par le
fabricant. Les clones pour lesquels le ratio log Cy5/log Cy3 dépassait ce seuil et donnait une
image en miroir étaient considérés comme significatifs et donc vérifiés en FISH s’ils n’étaient
pas répertoriés dans les bases de données.
48
V. Résultats
A. Résultats de l’étude en CGH array Sur l’ensemble des individus étudiés, nous avons mis en évidence 171 CNV ce qui
correspond à une moyenne de 3 à 4 CNV par patient avec des valeurs allant de 0 à 12 CNV
par patient. Ce nombre correspond aux données répertoriées dans la littérature puisque le
nombre moyen de CNV par patient dans les différentes études est de 2 à 3 CNV par patient56.
Sur l’ensemble de ces CNV, 140 sont répertoriés dans la base de donnée des variants
« Database of Genomic Variants » de Toronto, ce sont des CNP (Copy Number
Polymorphisms), ils n’ont donc pas donné lieu à une vérification ultérieure. Ceci représente
2,8 CNP par patient, ce qui est le chiffre retrouvé dans la littérature57.
Par ailleurs nous avons mis en évidence 31 CNV qui n’étaient pas répertoriés dans les
bases de données. La taille de ces CNV est très variable, allant de la taille d’un clone soit
quelques kilobases à près de 18,4 Mb. Ces CNV ont été vérifiés en FISH.
Sur les 31 vérifications effectuées, seul 4 CNV ont été confirmés en FISH. Ceci
s’explique par les limites de la technique.
B. Patients présentant une anomalie
1. Sujet 4
a. Clinique
Il s’agit d’un nouveau-né de sexe masculin dont les parents ne sont pas apparentés. Au
cours de la grossesse, le diagnostic de hernie de coupole a été posé et une amniocentèse a été
réalisée au terme de 23 SA (semaines d’aménorrhée), pour réalisation d’un caryotype et d’un
examen en FISH ciblée. A l’échographie il n’existait pas de malformation associée. La suite
de la grossesse a été sans particularité et l’enfant est né au terme de 38 SA + 3 jours. L’enfant
est décédé à 12 jours de vie des conséquences de la hernie diaphragmatique. La famille n’a
pas souhaité l’autopsie. Il n’a donc pas été possible de préciser la position de l’orifice chez cet
enfant.
49
b. Résultats cytogénétiques
- Caryotypes et FISH ciblée
Le caryotype en bandes G et en bandes R avec un niveau de résolution de 500 bandes
n’a pas montré d’anomalie.
La FISH ciblée n’a pas permis de détecter d’anomalie (Figure 11).
Figure 11. FISH ciblée métaphasique, chez le Sujet 4, ne montrant pas d’anomalie.
RP11-46C2 (15q26.2)
RP11-388A16+RP11-359B12 (12ptel)
RP11-297K5 (8p23.1)
50
- CGH array
La CGH array a été réalisée sur une puce SpectralChip de la société BlueGnome. La
qualité de la technique était bonne puisque le pourcentage de clones analysés était de 98,5%
avec une déviation standard des autosomes de 0,087. Le résultat a montré une image en miroir
pour 2 clones, le clone RP11-159A19 situé en 1p36.1 (Figure 12) et le clone RP11-176P17
situé en 9p23 (Figure 13).
Figure 12. Profil du chromosome 1 en CGH array chez le sujet 4.
Présence d’une image en miroir en 1p36.11 pour le clone RP11-159A19.
51
Figure 13. Profil du chromosome 9 en CGH array chez le sujet 4.
Présence d’une image en miroir en 9p22.3 pour le clone RP11-176P17.
Ces deux clones n’étant pas répertoriés comme variants dans les bases de données,
nous avons procédé à une vérification en FISH.
52
- Confirmation par FISH
Pour le clone situé en 1p36.1, la sonde RP11-159A19, marquée avec un fluorochrome
dérivé de la rhodamine a généré deux signaux rouges en place et symétriques sur les
métaphases observées et deux signaux sur tous les noyaux observés.
En revanche, la sonde RP11-176P17, située en 9p23, marquée avec un fluorochrome
vert, le FITC, a généré deux signaux verts en place mais présentant une asymétrie de signal
importante (Figure 14).
Figure 14. FISH métaphasique chez le sujet 4 montrant une asymétrie de signal franche avec la sonde
RP11-176P17 située en 9p23 (en vert).
[La flèche blanche indique le clone RP11-176P17 partiellement délété sur un des chromosomes 9].
L’étude en FISH confirme donc une délétion partielle du clone RP11-176P17 situé en
9p23. Une étude par FISH a été également réalisée chez les parents.
RP11-176P17 (9p23)
RP11-937L7 (9q34.3)
53
- Etude chez les parents
L’étude du caryotype des parents n’a pas montré d’anomalie. L’étude en FISH avec la
sonde RP11-176P17 chez la mère n’a pas montré de remaniement (Figure 15). Les deux
signaux sont en place et symétriques.
Figure 15. FISH réalisée chez la mère du sujet 4 montrant deux signaux verts (sonde RP11-176P17) en
place et symétriques.
RP11-176P17 (9p23)
RP11-937L7 (9q34.3)
54
Chez le père, on a noté la présence de deux signaux présentant une asymétrie de signal
importante, identique à celle retrouvée chez l’enfant (Figure 16).
Figure 16. FISH réalisée chez le père du sujet 4 montrant une asymétrie de signal pour la sonde RP11-
176P17 située en 9p23 (vert).
[La flèche blanche indique le clone RP11-176P17 partiellement délété sur un des chromosomes 9].
En conclusion, l’étude réalisée chez le sujet 4 montre une délétion partielle du clone
RP11-176P17 localisée en 9p23, héritée du père qui ne présente pas de malformation
diaphragmatique.
RP11-176P17 (9p23)
RP11-937L7 (9q34.3)
55
2. Sujet 38
a. Clinique
Il s’agit d’un fœtus de sexe masculin dont les parents sont jeunes et non apparentés. Le
diagnostic de hernie de coupole a été fait pendant la grossesse. Une amniocentèse a été
réalisée à 22 SA pour étude chromosomique. Le caryotype n’a pas montré d’anomalie.
L’échographie réalisée à 29 SA a montré la présence d’un RCIU sévère puisque toutes les
mensurations étaient inférieures au 3ème percentile. Il existait également un syndrome
polymalformatif associant une hernie diaphragmatique gauche, un cœur totalement dévié à
droite avec une hypoplasie cardiaque gauche, des anomalies rénales avec une absence de
différenciation cortico-médullaire habituelle et enfin la présence de pieds en « piolet » et une
dysmorphie faciale avec un rétrognatisme.
Une échocardiographie a également été réalisée confirmant la présence d’une
hypoplasie cardiaque gauche avec une hypoplasie mitrale et aortique, de mauvais pronostic.
Devant la présence de cette hernie de coupole associée aux autres malformations de
mauvais pronostic les parents ont choisi d’interrompre la grossesse au terme de 30 SA.
L’examen embryo-fœtopathologique a confirmé le RCIU puisque toutes les
mensurations étaient inférieures au 5ème percentile. Il a précisé également la présence d’une
agénésie de la coupole diaphragmatique gauche avec hernie du lobe gauche du foie, de
l’estomac et d’une partie de l’intestin grêle et du colon dans le médiastin gauche, associée à
une éventration de la coupole diaphragmatique droite. Il existait une hypoplasie pulmonaire
bilatérale et une hypoplasie du cœur gauche. Il y avait également un polysplénisme, des
anomalies rénales avec des plages corticales dysplasiques, une artère ombilicale unique avec
une dysmaturité placentaire associée. Il n’existait pas d’anomalie cérébrale.
b. Résultats cytogénétiques
- CGH array
Pour ce fœtus, la CGH array a été réalisée avec de l’ADN extrait à partir d’un
fragment de thymus congelé. La CGH array a été réalisée sur une lame fournie par la société
PerkinElmer. La qualité de l’hybridation était assez bonne puisque 99% des clones ont été
analysés et la déviation standard des autosomes était de 0,104.
Sur l’aperçu global des résultats de la CGH array, on observe la présence de deux anomalies
(Figure 17).
56
Figure 17. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 38.
La couleur bleue indique une région amplifiée et la couleur rouge une région délétée.
57
D’une part, il existait une image en miroir dans la région 4qter (Figure 18). Même si
tous les rapports de fluorescence n’étaient pas situés au dessus du seuil de significativité, nous
avons considéré que toute la région était dupliquée, du fait de la qualité moyenne de
l’hybridation (DS des autosomes 0,104). Cette duplication représente environ 18,4 Mb. Elle
est située entre le clone RP11-M15 situé en 4q34.1 et le clone RP5-963K6 situé en 4q35.2
Figure 18. Profil du chromosome 4 en CGH array chez le sujet 38.
On note la présence d’une image en miroir de la région 4qter à partir du clone RP11-12M15 situé en 4q34.1 et
jusqu’au clone RP5-963K6 situé en 4q35.2.
58
D’autre part, il existait une autre région en miroir. Cette anomalie correspond à une
délétion de la région terminale du bras long du chromosome 15 (Figure 19). Cette délétion
mesure environ 5,9 Mb. La délétion correspond à la région comprise entre le clone RP11-
79C10 situé en 15q26.2 et le clone RP1-124O5 situé en 15q26.3.
Figure 19. Profil du chromosome 15 en CGH array chez le sujet 38.
Présence d’une image en miroir dans la région 15qter à partir du clone RP11-79C10 situé en 15q26.2 et jusqu’au
clone RP1-124O5 situé en 15q26.3.
Pour effectuer les vérifications en FISH, nous avons choisi d’utiliser les clones de ces
deux régions qui n’étaient pas répertoriés comme variant dans les bases de données.
59
- Confirmation par FISH
La confirmation de ces deux anomalies a été effectuée sur des appositions de tissus
provenant du thymus. Pour confirmer l’anomalie sur le chromosome 4, nous avons choisi le
clone RP11-52G4, situé en 4q34.1, puisqu’il n’était pas répertorié comme variant dans les
bases de données. Le clone RP11-52G4 a été marqué avec un fluorochrome vert, le FITC et la
sonde contrôle RP11-373J21 située en 4q13 a été marquée avec un fluorochrome rouge dérivé
de la rhodamine. L’hybridation montre la présence de 3 signaux verts et de 2 signaux rouges
dans tous les noyaux analysés (Figure 20). Cette hybridation confirme la présence d’une
duplication 4qter.
Figure 20. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-52G4 chez le sujet 38 montrant la présence de
3 signaux verts (RP11-52G4) dans tous les noyaux examinés.
[Les flèches blanches indiquent la présence de 3 signaux verts].
RP11-52G4 (4q34.1)
RP11-373J21 (4q13)
60
Pour confirmer la délétion 15qter, nous avons choisi d’utiliser le clone RP11-89K11,
qui n’était pas répertorié comme variant dans les bases de données. Le clone RP11-89K11 a
été marqué avec du FITC, en vert et une sonde contrôle située sur le chromosome 15, en
15q11 a été marquée avec la rhodamine, en rouge. L’hybridation montre la présence d’un seul
signal vert correspondant au clone RP11-89K11, dans toutes les cellules examinées (Figure
21).
Figure 21. FISH interphasique réalisée avec la sonde RP11-89K11 chez le sujet 38 montrant la présence
d’un seul signal vert (RP11-89K11) dans tous les noyaux examinés.
[La flèche blanche indique la présence du seul signal vert].
Ces deux hybridations confirment la présence d’une duplication de la région 4qter et
d’une délétion de la région 15qter couvrant la région du gène COUP-TFII incriminé dans la
genèse de hernies diaphragmatiques.
L’étude des parents à la recherche d’un remaniement de structure équilibré chez l’un
d’eux n’a pu être réalisée.
RP11-89K11 (15q26.3)
RP11-131I21 (15q11)
61
3. Sujet 49
a. Clinique
Il s’agit d’un fœtus dont les parents ne sont pas apparentés. Le diagnostic de hernie de
coupole a été fait pendant la grossesse lors de l’échographie réalisée au terme de 13 SA + 5 j.
L’examen a mis en évidence un cœur dévié à droite avec un estomac qui paraissait intra-
thoracique. La clarté nucale a été évaluée entre 5 et 7 mm avec la présence de cloisons. Il a
également été retrouvé un soulèvement cutané au niveau du thorax et de l’abdomen. La
présence de ces différentes anomalies a motivé la réalisation d’une amniocentèse. Le
caryotype est masculin, sans anomalie décelée avec les techniques utilisées. Après conseil
génétique, une IMG (Interruption Médicale de la Grossesse) a été effectuée au terme de 15
SA.
L’examen embryo-fœtopathologique effectué avec le consentement des parents a
montré la présence d’un excès de peau au niveau du cou. Il n’existait pas de dysmorphie
faciale. Lors de l’examen interne, il a été mis en évidence la présence d’une hernie
diaphragmatique avec une coupole diaphragmatique gauche incomplète postéro-latérale, et
ascension dans l’hémithorax gauche du lobe hépatique gauche, de la rate, de l’estomac, de
l’intestin grêle. Le volume pulmonaire était à la limite de l’hypoplasie. Les autres anomalies
rapportées étaient la présence d’un rein en fer à cheval de faible poids et des surrénales peu
volumineuses. L’examen histopathologique du cerveau n’a pas montré d’anomalie.
b. Résultats cytogénétiques
- CGH array
La technique de CGH array a été réalisée en faisant appel à une puce de la société
PerkinElmer. L’hybridation était d’assez bonne qualité puisque 99% des clones ont été
analysés et la déviation standard des autosomes était de 0,102. L’analyse globale du génome a
montré la présence de multiples anomalies et en particulier une amplification sur le bras court
du chromosome 17 (Figure 22).
62
Figure 22. Aperçu général des anomalies détectées par CGH array chez le sujet 49, mettant en évidence
une anomalie sur le bras court du chromosome 17.
63
Lorsqu’on observe le chromosome 17, on voit la présence d’une image en miroir sur la
partie terminale du bras court du chromosome 17 entre le clone CTD-2326F1 situé en
17p13.3 et le clone RP11-648P8 situé en 17p13.1 (Figure 23). Cette anomalie est une
duplication. Elle mesure environ 10,5 Mb.
Figure 23. Profil du chromosome 17 en CGH array du sujet 49.
Présence d’une image en miroir dans la région 17pter à partir du clone CTD-2326F1 situé en 17p13.3 et
jusqu’au clone RP11-648P8 situé en 17p13.1.
64
- Confirmation par FISH
Nous avons effectué la vérification sur une apposition faite à partir de tissu cardiaque.
Pour avoir une meilleure vision de la duplication, nous avons utilisé une association de
plusieurs clones contigus de la région terminale du bras court du chromosome 17 (contig
17pter). Celui a été marqué avec le fluorochrome FITC donnant une fluorescence verte et une
sonde contrôle située sur le chromosome 8 a été marquée avec le fluorochrome dérivé de la
rhodamine donnant une fluorescence rouge. La sonde contrôle permet de vérifier que les
cellules sont diploïdes. Le résultat de l’hybridation montre la présence de 3 signaux verts,
correspondant au contig 17pter, dans toutes les cellules analysées et la présence de 2 signaux
rouges (Figure 24).
Figure 24. FISH interphasique réalisée avec le contig 17pter chez le sujet 49 montrant la présence de 3
signaux verts (contig 17pter) et de 2 signaux rouges (contig 8qter).
L’analyse en FISH confirme la présence d’une duplication du bras court d’un
chromosome 17.
Le caractère de novo ou hérité n’a pu être vérifié.
Contig 17pter
Contig 8qter
65
VI. Discussion Dans cette étude, nous avons mis en évidence par CGH array trois anomalies
chromosomiques chez des fœtus présentant une hernie de coupole diaphragmatique.
Cependant, une des anomalies est héritée d’un parent sain. Le caractère pathogène ou non ne
peut être retenu de façon formelle. Si l’on ne retient que les deux autres anomalies, ceci
correspond à un taux d’anomalies chromosomiques de 4%, inférieur à ce qui est rapporté dans
la littérature (environ 10%)9.
Cette différence peut être expliquée par différents éléments. Tout d’abord, dans notre
étude nous n’avons étudié que les cas de hernies diaphragmatiques à caryotype normal ce qui
exclut tous les cas pour lesquels une anomalie a été mise en évidence par une étude du
caryotype (tétrasomie 12p par exemple), contrairement à l’étude de Pober où le chiffre de
10% d’anomalies englobe toutes les anomalies y compris celles décelées par l’examen
chromosomique standard.
D’autre part, nous avons vu que le centre de Necker-Enfants Malades est Centre de Référence
pour la prise en charge pré et post-natale des HCD. Ceci implique que les HCD adressées sont
celles de bon pronostic. Elles sont donc le plus souvent isolées, comme nous l’avons vu
précédemment [Annexe 1].
Il existe donc un biais évident responsable du faible taux d’anomalies mises en
évidence dans notre étude.
La première anomalie mise en évidence a déjà été rapportée dans les HCD : la délétion
de la région 15qter. Dans notre cas, elle est associée à une duplication de la région 4qter.
La délétion retrouvée chez le sujet 38, située entre le clone RP11-79C10 et le clone RP1-
124O5 mesure 5,9 Mb. Cette délétion contient la région 15q26 et le gène COUP-TFII dont on
a vu son implication dans la survenue de HCD syndromique.
Le phénotype observé chez notre patient est identique à celui décrit dans la littérature.
En 2007, Klaassens et al. ont regroupé tous les cas de délétion 15q26 (délétions pures,
délétions résultant d’une translocation déséquilibrée, ou anneaux du chromosome 15) et mis
en évidence un phénotype commun25, caractérisé par la présence d’une hernie
diaphragmatique située du côté gauche (92% des cas) et d’un retard de croissance intra-utérin
sévère. Ce retard est expliqué par la délétion du gène IGF1R (IGF1 receptor) situé à 2,3 Mb
66
du gène COUP-TFII (Figure 25). En effet l’haploinsuffisance du gène IGF1R est responsable
d’un retard de croissance pré- et post-natal sévère58.
Figure 25. Détail de la région comprenant NR2F2 (COUP-TFII) et IGF1R.
Il existe également une dysmorphie associant des traits grossiers, un hypertélorisme et
des anomalies des oreilles qui sont basculées en arrière, des anomalies des membres avec des
pieds en piolet. Les auteurs rapportent également des anomalies cardiaques et la présence
d’une artère ombilicale unique qui semble plus fréquente dans les cas de délétion 15q26 pure
(63% des patients avec monosomie 15q26 pure). D’autres anomalies sont présentes chez notre
patient : les anomalies rénales et la micrognathie que l’on peut imputer à la duplication
4qter59.
Nous n’avons pas pu vérifier le caryotype des parents. Nous ne pouvons donc
déterminer le caractère de novo ou hérité de cette anomalie. Devant l’association d’une
délétion d’une part et d’une duplication d’autre part, la présence d’une translocation
réciproque t(4;15)(q34.1;q26.2) présente chez l’un des parents peut être évoquée. L’anomalie
retrouvée chez l’enfant pourrait alors être liée à une malségrégation de cette translocation
t(4;15) avec la présence d’un chromosome 4 normal et du dérivé de translocation der(15)
(Figure 26).
67
Figure 26. Schéma de la translocation t(4;15)(q34.1;q26.2) et les dérivés der(4) et der(15).
Translocation t(4;15)(q34.1;q26.2)
68
La deuxième anomalie mise en évidence est une microdélétion interstitielle de la
région 9p23, ayant une taille maximale de 780 kb, héritée d’un parent n’ayant pas de
phénotype anormal. Il est difficile de retenir cette anomalie comme responsable de la HCD.
En effet, plusieurs critères doivent être présents pour qu’un CNV soit considéré comme
pathogène :
- l’identification de la même anomalie chez un autre individu ayant le même
phénotype ;
- la survenue de novo ;
- la taille de l’anomalie, les remaniements de plus grande taille étant plus souvent
pathogènes60.
Dans notre cas, la présence d’une anomalie d’une taille inférieure à 1 Mb et le caractère hérité
d’un parent sain nous ont conduit à considérer ce CNV comme non responsable de la hernie
de coupole chez ce sujet.
Cependant, cette interprétation peut être discutée. En effet, la région délétée
correspond à une délétion intragénique du gène PTPRD (Homo sapiens protein tyrosine
phosphatase, receptor type, Delta). Ce gène est un très grand gène d’environ 2,3 Mb. Il
appartient à la famille des protéines tyrosine phosphatase (PTP). Ces protéines sont connues
pour réguler différents processus cellulaires en particulier le cycle cellulaire, la croissance et
la différenciation cellulaire. Elles sont également impliquées dans la transformation
oncogénique. Il existe différents isoformes exprimés de manière spécifique dans les divers
tissus de l’organisme61. Le profil d’expression de PTPRD montre que cette protéine est très
exprimée dans le cerveau fœtal et adulte, mais également dans d’autres tissus comme le
poumon fœtal. Les études menées chez les poussins montrent que PTPRD est impliquée dans
la croissance et dans la régulation de l’orientation de la pousse neuronale62.
En 2006, Uetani et al.63 ont étudié des souris knock-out à la fois pour PTPRD et
PTPRS (Homo sapiens protein tyrosine phosphatase, receptor type, Sigma) (RPTP-σ -/-/δ-/-)
dans le but d’étudier le rôle que jouent ces deux récepteurs dans le développement du système
nerveux périphérique et de la structure tissulaire des souris. Les résultats de cette étude
montrent tout d’abord que les souris RPTP-σ-/-/δ-/- meurent immédiatement après la naissance
du fait d’une défaillance respiratoire liée à une forte compression des alvéoles pulmonaires.
Les analyses histologiques et histochimiques de différents tissus, avec des anticorps anti-
chaîne lourde de myosine montrent que la masse axiale dorsale des muscles squelettiques et
des membres est réduite. De la même manière, l’étude du diaphragme des souris double-
69
mutantes met en évidence que celui-ci est plus mince que chez les souris non mutées (Figure
27).
Figure 27.Aspect du diaphragme et coupe transversale du diaphragme chez des souris témoins et des
souris double-mutantes (RPTP-σ-/-/δ-/-), d’après Uetani et al63.
M– N : Aspect du diaphragme chez une souris témoin (M) et chez une souris double-mutante (RPTP-σ-/-/δ-/-) (N).
On note la diminution de muscularisation du diaphragme chez les souris mutantes. O – P : Coupe transversale du
diaphragme d’un témoin (O) et d’un mutant (P). On voit la finesse de la couche musculaire chez les souris
double-mutantes.
L’analyse histologique du cœur, des reins, du colon, du thymus et de la rate ne montre pas en
revanche de différence significative.
Une autre partie de l’étude porte sur l’analyse de l’innervation du diaphragme, les
auteurs mettent en évidence un développement aberrant du nerf phrénique à la surface du
diaphragme et l’absence complète de développement des branches sternocostales. Ils en
concluent que les souris double-mutantes ont un défaut d’expansion pulmonaire en raison
d’une innervation inadéquate du diaphragme. De plus, PTPRD et PTPRS jouent un rôle
70
complémentaire dans le développement neuronal de la souris et ont un rôle important dans la
mise en place des motoneurones.
Le gène PTPRD joue un rôle dans le développement musculaire du diaphragme, en
association avec un autre gène de la famille des PTP.
L’étude des modèles animaux permet d’extrapoler le fonctionnement chez l’Homme.
Une anomalie de PTPRD seule peut-elle expliquer le phénotype chez notre sujet 4 qui
présente une délétion en 9p23 ?
Nous avons mis en évidence chez ce sujet une délétion hétérozygote de PTPRD
héritée d’un parent sain. Plusieurs mécanismes peuvent expliquer le phénotype anormal alors
que le parent sain a la même anomalie chromosomique déséquilibrée :
- le phénomène d’empreinte parentale, c'est-à-dire que les gènes de la région
s’expriment différemment selon que le chromosome qui les porte provient de la mère ou du
père. Dans notre cas, la région 9p23 n’est pas connue pour être une région soumise à
empreinte ;
- le démasquage d’une mutation récessive sur l’autre allèle ;
- la modification de l’anomalie lors de la transmission, elle est plus grande chez le
proposant que chez le parent64 ;
- la variabilité phénotypique avec un spectre phénotypique large ;
- un mosaïcisme parental atténuant le phénotype chez le parent ;
- le rôle de gènes modificateurs, comme dans le cas du syndrome TAR. En 2007,
Klopocki et al. ont montré que tous les patients ayant un syndrome TAR avaient une
microdélétion 1q21.1 mais que dans 75% des cas celle-ci était héritée d’un parent n’ayant pas
de phénotype anormal65. Les auteurs supposent donc que la délétion est nécessaire à la
survenue des symptômes mais pas suffisante et que d’autres gènes doivent être impliqués
dans la survenue de cette anomalie.
En considérant que seul PTPRD est nécessaire à la survenue d’une anomalie
diaphragmatique, certains de ces mécanismes pourraient expliquer la survenue d’une
anomalie du diaphragme chez notre patient 4.
Pour pouvoir mettre en évidence le rôle de PTPRD dans la survenue d’anomalies
diaphragmatiques ou de hernies diaphragmatiques, il est nécessaire de trouver d’autres cas de
délétion intragénique de PTPRD chez des patients présentant une hernie de coupole.
71
La troisième anomalie mise en évidence est la présence d’une duplication 17pter
d’environ 10,5 Mb incluant les régions 17p13.1 à 17p13.3, sans autre anomalie associée chez
le sujet 49. Dans l’article de Holder, en 2007, qui répertorie toutes les anomalies
chromosomiques associées aux HCD, seules deux anomalies du chromosome 17 sont
retrouvées : un anneau du chromosome 17 en mosaïque66 et une duplication 17q terminale
associée à une délétion 15qter67 par malségrégation d’une translocation t(15;17)(q24.3;q23.3)
Dans ce dernier cas, on peut penser que la HCD est liée à la délétion 15qter plus qu’à la
duplication 17qter
Les duplications du bras court du chromosome 17 ont déjà été décrites dans la
littérature. Nous rapportons sur la figure 28 la taille des différentes anomalies rapportées ainsi
que la taille de la duplication de notre patient.
Figure 28. Idéogramme du bras court du chromosome 17 avec la schématisation de la duplication 17p
retrouvée chez notre patient (sujet 49) et celles rapportées dans la littérature.
Paskulin et al, 2007
Bi et al, 2009
Morelli et al, 1999
Notre patient
72
En 2007, Paskulin et al. ont rassemblé 16 cas de duplication complète du bras court du
chromosome 1768. Aucun ne présente de hernie diaphragmatique. Les principaux signes sont
un retard mental et un retard de croissance pré et post-natal. On retrouve aussi une
dysmorphie et des malformations associées. Les auteurs notent une neuropathie périphérique
en rapport avec la duplication du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein-22) responsable de
la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 1A lorsqu’il est dupliqué. Cette région proximale
n’est pas dupliquée chez notre patient.
En 2009, Bi et al, ont étudié 7 patients non apparentés présentant une duplication de la
région 17p13.369. Cette région est impliquée dans le syndrome de Miller-Dieker lorsqu’elle
est délétée. Les gènes responsables dans ce syndrome sont le gène PAFAH1B1 codant pour la
protéine LIS1 situé en 17p13.3 responsable de la lissencéphalie, et le gène YWHAE codant
pour la protéine 14-3-3ε responsable des manifestations neurologiques plus sévères du
syndrome de Miller-Dieker70. Dans l’étude de Bi, la taille de la région dupliquée chez les
patients était de 240 kb à 4 Mb. Les auteurs ont mis en évidence un phénotype différent selon
que PAFAH1B1 et /ou YWHAE était dupliqué. Les patients ayant une duplication de YWHAE
et non de PAFAH1B1 ont un retard mental léger associé à une dysmorphie et parfois une
avance staturale. Dans le cas de la duplication de PAFAH1B1, les patients ont un retard de
développement plus sévère sans dysmorphie caractéristique et des anomalies cérébrales.
Lorsque les deux gènes sont dupliqués, le patient présente un retard global de développement
et des anomalies du développement cérébral associant une microcéphalie prédominant dans le
cortex occipital, un amincissement du corps calleux et une discrète diminution du volume
cérébelleux. Les auteurs ont étudié les anomalies cérébrales chez des souris surexprimant
PAFAH1B1. Ces souris ont un cerveau plus petit avec des anomalies de la polarité cellulaire
et de la migration neuronale. L’étude chez les patients et chez la souris n’a pas mis en
évidence d’anomalie du développement du diaphragme.
Les manifestations liées à une duplication terminale du bras court du chromosome 17
sont essentiellement neurologiques. Cependant, les duplications étudiées par Bi ont une taille
inférieure à celle que présente notre patient (sujet 49).
Un cas de duplication partielle du bras court du chromosome 17 a été rapporté par
Morelli et al. en 199971, elle concerne la région 17p13.3p12. Les points de cassure n’ont pas
été précisés par FISH, mais la taille de cette duplication semble être proche de la taille de
celle du sujet 49. Dans ce cas, l’échographie réalisée à 15 SA, a mis en évidence la présence
d’un hygroma kystique et une probable anomalie cardiaque. Aucune autre anomalie n’a été
précisée. A la naissance, l’enfant présentait des mensurations moyennes, quelques
73
particularités morphologiques avec une dysmorphie faciale, des anomalies des extrémités :
brachyclinodactylie du 5ème doigt bilatérale, pied gauche équin, et des malformations,
coarctation de l’aorte et uretères dilatés.
Ce phénotype est très différent de celui de notre patient. Le seul point commun entre les deux
était la présence d’un hygroma kystique, mais il s’agit d’un anomalie peu spécifique
puisqu’on retrouve des anomalies chromosomiques variées chez environ 2/3 des fœtus ayant
une hyperclarté nucale supérieure à 6,5 mm72. Par ailleurs, l’appréciation de la morphologie
faciale est impossible compte tenu de l’âge du fœtus.
Nous avons mis en évidence une duplication partielle de la région terminale du bras
court d’un chromosome 17. Le phénotype de notre patient est assez différent de ceux décrits
dans la littérature. Cependant, la précocité de l’interruption de la grossesse ne permet pas de
comparer le phénotype. En effet, le système nerveux est en développement continu pendant
toute la gestation et à 15 SA, la mise en place des structures cérébrales s’achève juste. Les
anomalies cérébrales fœtales sont visibles à partir de 28 - 30 SA lors de la réalisation d’une
IRM cérébrale fœtale. De la même manière, la dysmorphie est difficile à préciser au terme de
15 SA.
La région délétée dans notre étude mesure environ 10,5 Mb. Elle contient plus de 200
gènes. Ceci rend difficile la possibilité de mettre en évidence un gène responsable de HCD.
Dans les cas de grands déséquilibres génomiques, il est difficile de savoir quelle est la base
génétique des HCD9. C’est le cas par exemple de la tétrasomie 12p ou de la trisomie 18 où le
lien entre la hernie diaphragmatique et l’aneuploïdie n’a pas été fait. Dans notre cas, il serait
nécessaire d’avoir d’autres cas de HCD ayant une anomalie du bras court du chromosome 17
pour pouvoir mettre en évidence une région candidate.
Un autre élément est à prendre en compte, c’est la possibilité d’une anomalie située
ailleurs sur le génome qui n’aurait pas été mise en évidence avec la puce à ADN que nous
avons utilisée. La résolution de la puce que nous avons utilisée est de 650 kb en moyenne
mais certaines régions sont couvertes avec une résolution supérieure à 1 Mb. On ne peut pas
exclure la possibilité d’une autre anomalie submicroscopique située dans une de ces régions
moins couverte ou bien ayant une taille inférieure à 650 kb. L’utilisation d’une puce plus
résolutive pourrait nous permettre de mettre en évidence un tel remaniement.
74
VII. Conclusion Notre travail a permis de mettre en évidence 3 anomalies chromosomiques sur les 50
cas de HCD que nous avons étudiés par CGH array. Parmi ces 3 anomalies, la délétion 15qter
est bien connue ainsi que le rôle du gène COUP-TFII dans la genèse d’une hernie de coupole
diaphragmatique. Cette anomalie est peut être le résultat d’une malségrégation d’une
translocation parentale. Nous regrettons de ne pas avoir pu rentrer en contact avec les parents
car cette information aurait eu une grande implication pour le conseil génétique de cette
famille. La délétion intragénique de PTPRD, en 9p23 pose le problème crucial de
l’interprétation des CNV lors des études en CGH array, principal obstacle à la généralisation
de cet examen en diagnostic prénatal. Des études complémentaires devront être menées pour
confirmer l’implication de cette anomalie dans la survenue de hernie diaphragmatique. La
troisième anomalie, la duplication partielle du bras court du chromosome 17 n’a jamais été
décrite précédemment à notre connaissance. L’absence d’étude familiale et la grande taille de
la duplication ne nous permettent pas pour le moment d’envisager des études ultérieures.
Ce travail confirme l’intérêt de la CGH array comme outil diagnostic dans les cas de
HCD. Cette technique est très largement utilisée en diagnostic post-natal. Les améliorations
techniques ainsi que la progression dans l’interprétation vont permettre dans un avenir proche
d’étendre son utilisation au diagnostic prénatal. En attendant, l’utilisation de la FISH ciblée
« hernie diaphragmatique », couvrant les trois locus les plus souvent impliqués dans les
HCD : 15q26, 8p23, 12pter, doit être poursuivie en diagnostic prénatal des hernies de
coupoles. En effet, nous avons mis en évidence dans notre étude, une anomalie habituellement
dépistée par cette technique que nous utilisons dans le service de Cytogénétique de l’hôpital
Necker-Enfants Malades, depuis 2005.
Les anomalies chromosomiques permettent d’expliquer une partie des mécanismes de
survenue des HCD mais d’autres voies de recherche doivent encore être explorées. Des études
portant sur les modifications épigénétiques de l’ADN, en particulier, les anomalies de
méthylation sont une voie intéressante à suivre. En effet, il existe des cas de discordances
chez les jumeaux monozygotes où un seul des deux enfants est atteint. Les mutations et les
anomalies chromosomiques ne peuvent pas complètement expliquer cette situation.
75
ANNEXES
Annexe I. Caractéristiques de la cohorte prospective.
76
Annexe II. Caractéristiques de la cohorte rétrospective.
77
Annexe III. Protocole de culture de sang périphérique.
78
Annexe IV. Principe de la RCA.
79
Annexe V. Principe de marquage par la technique de « Nick-translation ».
ADN double brin
Création d’une extrémité 3’OH libre par action de la DNase I
Retrait de 1 ou plusieurs nucléotides par l’action 5’→3’ exonucléase de l’ADN polymérase I de E.Coli
Les nucléotides excisés sont remplacés par des nucléotides marqués avec un fluorochrome grâce à l’ADN polymérase I de E. Coli
La répétition des étapes (3) et (4) permet d’obtenir un brin d’ADN entièrement marqué avec un fluorochrome.
80
Annexe VI. Protocole d’extraction d’ADN à partir de sang frais total.
Annexe VII. Protocole d’extraction d’ADN à partir d e tissus congelés.
Extraction de l’ADN génomique à partird’un prélèvement de sang frais total I. Lyse des globules rouges 1.Transvaser 3 ml de sang total, prélevé sur EDTA, dans un tube conique de 12 ml. 2.Ajouter 9 ml de tampon de lyse des Globules Rouges 3.Laisser en contact 20 min à température ambiante 4.Centrifuger 10 min à 3500 tours/min puis éliminer le surnagent par retournement ou aspiration 5.Renouveler les étapes 2., 3. et 4. en laissant en contact 10 min On obtient alors un culot de Globules Blancs(GB) qui peut être conservé au congélateur (-20°C) II. Extraction de l’ADN 6.Ajouter 3 ml de tampon de lyse des GB sur le culot de globules blancs 7.Ajouter 60 µl de Protéinase K à 10 mg/ml 8.Homogénéiser par retournement et incuber le tube une nuit à 37°C ou 4h à 54-56°C au bain-marie 9.Agiter pendant 30 min à 1 h sur une roue 10.Ajouter 3 ml de phénol et agiter pendant 5 min sur une roue 11.Centrifuger pendant 10 min à 3500 tours/min 12.Récupérer la totalité du surnageant (phase aqueuse contenant l’ADN) dans un nouveau tube conique de 12 ml 13.(Facultatif) Renouveler étape 10. et 11. s’ il persiste une galette 14.Ajouter 3 ml de chloroforme et agiter pendant 5 min sur une roue 15.Centrifuger pendant 5 min à 3500 tours/min 16.Récupérer à nouveau la totalité du surnageant dans un tube conique neuf de 12 ml 17.Ajouter 300 µl d’acétate de Na 3M 18.Ajouter 3 ml d’isopropanol 19.Agiter délicatement le tube en chaloupant (la méduse d’ADN se forme) et laisser 10 min à -40°C 20.Centrifuger 5 à 10 min à 3500 tours/min 21.Eliminer délicatement le surnageant par retournement 22.Rincer avec 1 ml d’éthanol à 70% 23.Eliminer délicatement l’alcool par retournement en veillant à ne pas entrainer le culot d’ADN (centrifuger si nécessaire) 24.Rincer avec 1 ml d’éthanol 100% puis éliminer l’alcool par retournement délicatement 25.Laisser sécher 10 min à l’étuve à 56°C enveloppé d’un papier d’aluminium 26.Dissoudre le culot dans environ 300 µl de T.E pH8.0 afin d’obtenir une concentration finale en ADN comprise entre 200 et 300 µg/ml NB : Les volumes de phénol et de chloroforme doivent être le même que la quantité de sang initiale. Ex : si sang initial = 4 ml il faut ensuite mettre 4 ml de phénol puis 4 ml de chloroforme.
Extraction de l’ADN génomique à partir d’un fragment de tissu congelé Extraction de l’ADN 1.Récupérer un fragment de biopsie de 0.5 cm3 2.Ajouter 3 ml de tampon de lyse des GB sur le culot de globules blancs 3.Ajouter 90 µl de Protéinase K à 10 mg/ml 4.Homogénéiser par retournement et incuber le tube une nuit à 37°C 9.Agiter pendant 30 min à 1 h sur une roue 10.Ajouter 3 ml de phénol et agiter pendant 5 min sur une roue 11.Centrifuger pendant 10 min à 3500 tours/min 12.Récupérer la totalité du surnageant (phase aqueuse contenant l’ADN) dans un nouveau tube conique de 12 ml 13.(Facultatif) Renouveler étape 10. et 11. s’ il persiste une galette 14.Ajouter 3 ml de chloroforme et agiter pendant 5 min sur une roue 15.Centrifuger pendant 5 min à 3500 tours/min 16.Récupérer à nouveau la totalité du surnageant dans un tube conique neuf de 12 ml 17.Ajouter 300 µl d’acétate de Na 3M 18.Ajouter 3 ml d’isopropanol 19.Agiter délicatement le tube en chaloupant (la méduse d’ADN se forme) et laisser 10 min à -40°C 20.Centrifuger 5 à 10 min à 3500 tours/min 21.Eliminer délicatement le surnageant par retournement 22.Rincer avec 1 ml d’éthanol à 70% 23.Eliminer délicatement l’alcool par retournement en veillant à ne pas entrainer le culot d’ADN (centrifuger si nécessaire) 24.Rincer avec 1 ml d’éthanol 100% puis éliminer l’alcool par retournement délicatement 25.Laisser sécher 10 min à l’étuve à 56°C enveloppé d’un papier d’aluminium 26.Dissoudre le culot dans environ 300 µl de T.E pH8.0 afin d’obtenir une concentration finale en ADN comprise entre 200 et 300 µg/ml
81
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Ce travail a été rendu possible grâce au financement alloué par le Centre de Référence Maladies Rares pour les hernies diaphragmatiques congénitales de l’hôpital Necker-Enfants
Malades.
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RESUME Les hernies diaphragmatiques congénitales (HCD) surviennent dans environ 1/4000 naissances. L’origine génétique semble jouer un rôle important dans le développement de ces HCD. En effet, certains gènes sont connus pour être responsable de HCD chez l’Homme et des anomalies chromosomiques récurrentes ont été mises en évidence dans les cas de HCD. Nous avons donc étudié par CGH array 50 fœtus présentant une hernie diaphragmatique syndromique ou non dans le but de mettre en évidence de nouveaux remaniements chromosomiques et de nouveaux gènes candidats. Notre étude a révélé la présence de trois remaniements chromosomiques : une délétion 15qter déjà connue comme facteur étiologique, une délétion intragénique du gène PTPRD en 9p23, héritée d’un parent sain, qui chez la souris est responsable d’anomalies de développement du diaphragme et une duplication 17pter dont l’implication dans la survenue de la HCD reste à explorer. Ce travail confirme l’intérêt de la CGH array comme outil diagnostic.
MOTS CLES 1. Hernie diaphragmatique congénitale, 2. HCD, 3. CGH array, 4. Délétion 15q26, 5. PTPRD.