quimiorreflexo e receptores at : papel no controle ...‡Ão... · 13 resumo neste trabalho...
TRANSCRIPT
13
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Quimiorreflexo e receptores AT1: papel no
controle cardiovascular de animais
recuperados da restrição proteica
sedentários e treinados
Renato Willian Martins Sá
Ouro Preto
2015
13
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Quimiorreflexo e receptores AT1: papel no
controle cardiovascular de animais
recuperados da restrição proteica
sedentários e treinados
Autor: Renato Willian Martins Sá
Orientador: Prof. Dr. Leonardo Máximo Cardoso
Dissertação apresentada ao programa de Pós
Graduação do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas, Área de concentração:
Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
Ouro Preto
2015
13
13
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fisiologia Endócrina e
Cardiovascular em parceria com o Laboratório de Hipertensão, ambos do
Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, com
auxílio da CAPES, CNPq, FAPEMIG e UFOP.
13
Agradecimentos
Ao meu orientador, professor Dr. Leonardo Máximo Cardoso, pela amizade,
confiança, oportunidade e por ter sido a principal referência ao meu processo de
aprendizagem ao longo de todos os anos de trabalho em conjunto.
A professora Dra. Lisandra Brandino de Oliveira pelo incentivo e pelas contribuições
cientificas e materiais que tanto contribuíram para realização desse trabalho.
A professora Dra. Andréia Carvalho Alzamora pelo apoio científico e principalmente
pela disponibilização de recursos laboratoriais.
Aos professores Dr. Vagner Roberto Antunes e Dra. Lenice Kappes Becker Oliveira
por gentilmente aceitarem compor a banca.
Aos meus amigos e colegas de laboratório Paula, Giovana, Rafael, Nadia, Marcone,
Milede pela convivência agradável e por contribuírem de forma direta e indireta para
realização deste trabalho.
Ao Centro de Ciência Animal CCA/UFOP pelo fornecimento dos animais.
Aos Laboratórios do NUPEB: Laboratório de Hipertensão e Laboratório de Bioquímica
e Biologia Molecular pela disponibilização de recursos materiais para realização dos
experimentos.
13
Resumo
Neste trabalho investigamos o quimiorreflexo arterial e o possível envolvimento
de receptores AT1 na sua modulação em ratos recuperados da restrição proteica pós
desmame submetidos ao treinamento físico crônico. Para tanto, ratos Fischer foram
divididos em grupos controles sedentários (C105 S) e treinados (C105 T), e recuperados
sedentários (R-RP S) e treinados (R-RP T). Os ratos recuperados foram alimentados
com dieta hipoproteica (caseína - 8%) por 35 dias após o desmame e, em seguida,
recuperados com dieta normoproteica (20%) por 70 dias. Os grupos controles
receberam apenas dieta normoproteica por 105 dias. O programa de treinamento
físico de natação foi realizado diariamente (5 dias por semana) durante oito semanas,
cumprindo normativas de intensidade e volume progressivos. 48 horas após a cirurgia
de canulação, a pressão arterial média (PAM) e a frequência cardíaca (FC) foram
registradas em ratos acordados. O quimiorreflexo foi estimulado por injeções
intravenosas (i.v.) de KCN (20-160µg/kg) imediatamente antes (basal) e após 75
minutos do bloqueio de receptores AT1 com losartan (20 mg/kg, i.v.). Em ratos
sedentários, as respostas pressora e bradiarrítmica evocadas pela dose de 60 µg/kg
de KCN foram maiores no grupo R-RP S em relação ao grupo C105 S [25 ± 5 mmHg;
-27 ± 9 bpm (C105 S) e 45 ± 4 mmHg e -76 ± 14 bpm (R-RP S)]. A administração
de losartan não modificou estas respostas. Em ratos treinados, não foram observadas
diferenças na resposta pressora para a mesma dose de KCN entre os grupos R-RP T
e C105 T. Contudo, a resposta bradiarrítmica foi maior no grupo C105 T em relação ao
grupo R-RP T [-166 ± 44 bpm (C105 T) e -44 ± 36 bpm (R-RP T). O losartan também
não alterou a magnitude destas respostas. Em conclusão, a restrição proteica seguida
pela recuperação alimentar eleva a sensibilidade do componente cardiovascular do
quimiorreflexo arterial por mecanismos que parecem não depender de receptores AT1.
O treinamento físico crônico foi capaz de normalizar a sensibilidade do componente
pressor do quimiorreflexo arterial em ratos recuperados de restrição proteica pós-
desmame sugerindo que o treinamento físico possa estar corrigindo ou compensando
alterações do quimiorreflexo arterial geradas pela restrição/recuperação.
13
Abstract
In the current study, we tested the effects of low protein intake after weaning
followed by a recover protocol combined with exercise on cardiovascular responses to
chemoreflex activation before and after systemic AT1 receptors blockade. Male Fischer
rats were randomly divided into sedentary (C105 S) and trained (C105 T) control groups,
and sedentary (R-RP S) and trained (R-RP T) recovered groups. Recovered rats were
fed low protein (8% casein) diet for 35 days after weaning and refed normal protein
(20%) diet for 70 days. Control rats received normal protein diet for 105 days. The
training protocol was performed daily (5 days per week) for 8 weeks. Training volume
and intensity were progressively increased along the weeks. 48 hours after cannulation
surgery, mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) were acquired by digital
recording system in freely moving rats. Chemoreflex was elicited by intravenous (i.v.)
KCN (20-160µg/kg) just before and 75 minutes after AT1 receptors blockade with
losartan (20 mg/kg, i.v.). In sedentary rats, the pressor and the bradycardic responses
elicited by KCN (60 µg/kg) were higher in R-RP S than in C105 S [25 ± 5 mmHg; -27
± 9 bpm (C105 S) e 45 ± 4 mmHg e -76 ± 14 bpm (R-RP S)]. Losartan did not affect
these responses. In trained rats, pressor responses to chemoreflex activation were
similar between C105 T and R-RP T. However, the bradycardic response elicited by
KCN (60 µg/kg) was higher in C105 T than in R-RP T [-166 ± 44 bpm (C105 T) e -44 ±
36 bpm (R-RP T). Losartan did not affect this response. In conclusion, low protein
intake after weaning followed by recover increases the sensitivity of the cardiovascular
component of arterial chemoreflex independently of AT1 receptors. Exercise training
normalizes the pressor component of arterial chemoreflex in recovered rats.
13
Lista de figuras
Figura 1. Representação do comportamento da pressão arterial sistólica (mmHg) e
do intervalo sistólico (em segundos) em função do tempo de um rato movendo-se
livremente...................................................................................................................16
Figura 2. Protocolo alimentar aplicado ao grupo restrição proteica (RP) e ao grupo
recuperado (R-RP). ....................................................................................................25
Figura 3. Representação esquemática dos equipamentos utilizados para a aquisição
de dados cardiovasculares. .......................................................................................27
Figura 4. Representação esquemática dos equipamentos utilizados para a aquisição
de dados ventilatórios.................................................................................................28
Figura 5. Protocolo experimental desenvolvido para a aquisição dos dados
cardiovasculares.........................................................................................................29
Figura 6. Massa corporal e ingestão de ração...........................................................34
Figura 7. Animais RP e R-RP apresentam níveis elevados de frequência cardíaca
derepouso...................................................................................................................36
Figura 8. Animais RP não apresentam alterações no controle neuro-humoral do tônus
vasomotor...................................................................................................................41
Figura 9. Animais R-RP apresentam aumento da participação do sistema nervoso
simpático e de angiotensina II na regulação do tônus vasomotor................42
Figura 10. Respostas cardiovasculares evocadas pela ativação do quimiorreflexo por
KCN............................................................................................................................44
Figura 11. A sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo arterial é
elevada em animais R-RP por mecanismos independentes de receptores
AT1..............................................................................................................................45
Figura 12. As alterações no controle ventilatório em animais R-RP não são mediadas
exclusivamente por mecanismos dependentes de receptores AT1.............................47
13
Figura 13. A sensibilidade do componente ventilatório do quimiorreflexo arterial não
se difere em animais R-RP em relação aos animais C105............................................49
Figura 14. O treinamento físico normaliza a frequência cardíaca de animais
recuperados................................................................................................................68
Figura 15. O treinamento físico normaliza a participação do sistema nervoso simpático
e da angiotensina II na regulação do tônus vasomotor em animais
recuperados................................................................................................................72
Figura 16. A sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo arterial é
aumenta em animais C105 T e reduzida em animais R-RP T........................................74
Figura 17. Receptores AT1 participam na manutenção da pressão arterial em animais
R-RP T........................................................................................................................76
Figura 18. Receptores AT1 participam na manutenção do tônus vasomotor em animais
R-RP T........................................................................................................................79
Figura 19. Losartan não modifica a sensibilidade do componente cardiovascular do
quimiorreflexo arterial em ratos treinados...................................................................81
13
Lista de tabelas
Tabela 1. Composição de nutrientes a cada 100g de ração normoproteica e
hipoproteica................................................................................................................24
Tabela 2. Os níveis elevados de variabilidade da pressão arterial sistóilica em animais
R-RP não são controlados pelo losartan.....................................................................38
Tabela 2. O treinamento físico normaliza a variabilidade da pressão arterial sistólica
de animais recuperados..............................................................................................70
Tabela 3. Losartan não modifica a variabilidade no domínio do tempo da PAS, do IS
e o ganho do barorreflexo espontâneo em ratos treinados..........................................77
13
Lista de abreviaturas
SNC – Sistema Nervoso Central
CC – Corpúsculo Carotídeo
SHR – Ratos Espontaneamente Hipertensos
NTS – Núcleo do Trato Solitário
RVLM – Região Rostroventral do Bulbo
NA – Núcleo Ambíguo
SRA – Sistema Renina Angiotensina
ECA – Enzima Conversora de Angiotensina
SBR – Sensibilidade do Barorreflexo
PAS – Pressão Arterial Sistólica
IS – Intervalo Sistólico
VLF – Muito Baixa Frequência
LF – Baixa Frequência
HF – Alta Frequência
FFT – Transformada Rápida de Fourier
PAP – Pressão Arterial Pulsátil
PAM – Pressão Arterial Média
FC – Frequência Cardíaca
VE – Volume-minuto Respiratório
VT – Volume Corrente
fR – Frequência Respiratória
KCN – Cianeto de Potássio
i.v. – Intravenoso
PBS – salina tamponada com fosfato
13
Sumário
Capítulo I ............................................................................................................... 15
1. Introdução ............................................................................................................. 14
1. 1. Princípios da regulação autônoma cardiovascular ........................................ 15
1. 1. 1. Quimiorreflexo arterial ............................................................................ 17
1. 1. 2. Sistema renina-angiotensina .................................................................. 20
1. 2. Hipótese ......................................................................................................... 21
2. Objetivos ............................................................................................................... 22
2. 1. Objetivo geral ................................................................................................. 22
2. 2. Objetivos específicos ..................................................................................... 22
3. Metodologia ........................................................................................................... 23
3. 1. Modelo Animal ............................................................................................... 23
3. 2. Grupos Experimentais ................................................................................... 23
3. 3. Procedimento de aquisição dos dados cardiovasculares .............................. 26
3. 4. Procedimento de aquisição dos dados ventilatórios ...................................... 27
3. 5. Administração de drogas ............................................................................... 29
3. 6. Análise dos parâmetros cardiovasculares ..................................................... 30
3. 7. Análise espectral ........................................................................................... 30
3. 8. Análise dos parâmetros ventilatórios ............................................................. 31
3. 9. Análise estatística .......................................................................................... 32
4. Resultados ............................................................................................................ 33
4. 1. Massa corporal .............................................................................................. 33
4. 2. Ingestão de ração .......................................................................................... 33
4. 3. Pressão arterial e frequência cardíaca .......................................................... 35
13
4. 4. Sensibilidade do barorreflexo espontâneo e a variabilidade do PAS e do IS no
domínio do tempo .................................................................................................. 37
4. 5. Análise espectral do intervalo sistólico .......................................................... 39
4. 6. Análise espectral da pressão arterial sistólica ............................................... 40
4. 7. Respostas cardiovasculares induzidas pela ativação do quimiorreflexo arterial
............................................................................................................................... 43
4. 8. Ventilação ...................................................................................................... 46
4. 9. Taquipnéia induzida pela ativação do quimiorreflexo .................................... 48
6. Discussão .............................................................................................................. 50
Capítulo II .............................................................................................................. 13
1. Introdução ............................................................................................................. 58
2. Objetivos ............................................................................................................... 61
2. 1. Objetivo Geral ................................................................................................ 61
2. 2. Objetivos específicos ..................................................................................... 61
3. Metodologia ........................................................................................................... 62
3. 1 Grupos Experimentais .................................................................................... 62
3. 2. Protocolo de treinamento físico ..................................................................... 62
3. 3. Procedimento cirúrgico .................................................................................. 63
3. 4. Procedimento de aquisição dos dados cardiovasculares .............................. 64
3. 5. Administração de drogas ............................................................................... 65
3. 6. Análise dos parâmetros cardiovasculares ..................................................... 65
3. 7. Análise espectral ........................................................................................... 66
3. 8. Análise estatística .......................................................................................... 66
4. Resultados ............................................................................................................ 67
4. 1. Efeito do treinamento físico sobre a pressão arterial e frequência cardíaca .. 67
13
4. 2. Efeito do treinamento físico sobre a sensibilidade do barorreflexo espontâneo
e sobre a variabilidade da PAS e do IS no domínio do tempo ............................... 69
4. 3. Efeito do treinamento físico sobre a variabilidade do IS no domínio da
frequência .............................................................................................................. 71
4. 4. Efeito do treinamento físico sobre a variabilidade da PAS no domínio da
frequência .............................................................................................................. 71
4. 5. Efeito do treinamento físico sobre a sensibilidade do quimiorreflexo ............ 73
4. 6. Efeito do losartan sobre a pressão arterial e frequência cardíaca de ratos
treinados ................................................................................................................ 75
4. 7. Efeito do losartan sobre a sensibilidade do barorreflexo espontâneo e sobre a
variabilidade da PAS e do IS no domínio do tempo de ratos treinados ................. 75
4. 8. Efeito do losartan sobre a variabilidade do IS no domínio da frequência ...... 78
4. 9. Efeito do losartan sobre a variabilidade da PAS no domínio da frequência... 78
4. 10. Efeito do losartan sobre a sensibilidade do quimiorreflexo arterial .............. 80
5. Discussão .............................................................................................................. 82
6. Conclusão ............................................................................................................. 86
Referências ............................................................................................................... 87
Anexos
13
Capítulo I
A hipersensibilidade do quimiorreflexo em ratos
recuperados da restrição proteica pós-desmame não
está associada à sinalização via receptores AT1
P á g i n a | 14
1. Introdução
As proteínas são consideradas moléculas de estruturas bastante complexas
que constituem cerca de 50% do peso celular (GIACOMELLI e MARÇAL-NATALI,
1999). Além de serem importantes para a regulação das funções biocatalisadoras, tais
como crescimento, digestão, absorção e transporte celular, estas moléculas também
são fundamentais para o desenvolvimento estrutural dos órgãos e tecidos, para o
controle das funções imunológicas, para a regulação dos processos de coagulação
sanguínea e do equilíbrio osmótico e, principalmente, para o processo de
comunicação intercelular e entre sistemas mantenedores da homeostasia
(GIACOMELLI e MARÇAL-NATALI, 1999).
A restrição da ingestão de proteínas durante fases inicias de desenvolvimento
pode, além de prejudicar a estrutura e a capacidade funcional de órgãos e sistemas
(HOPPE et al., 2007; ALAMY e BENGELLOUN, 2012; PENITENTE et al., 2013),
modificar a atividade de mecanismos homeostáticos relacionados com o controle do
sistema cardiovascular e respiratório, predispondo o organismo ao desenvolvimento
de doenças que acometem estes sistemas na vida adulta (ALVES et al., 2014).
Estudos experimentais presentes na literatura mostraram que ratos submetidos
a desnutrição proteica pós-desmame apresentam alterações na sensibilidade do
quimiorreflexo arterial e também na responsividade do sistema renina angiotensina
(SRA) (PENITENTE et al., 2007; GOMIDE, J. M. et al., 2012). Como será descrito com
mais detalhes nos próximos capítulos, tanto as vias autonômicas moduladas pelo
quimiorreflexo arterial quanto os hormônios derivados da cascata do SRA formam
respectivamente um conjunto de mecanismos que são fundamentais para a regulação
da ventilação e da pressão arterial. No entanto, tem sido demonstrado também que a
presença de anormalidades na atividade destes mecanismos parecem estar
correlacionadas com a fisiopatologia da hipertensão arterial (LI et al., 2008; MOREIRA
et al., 2008; ABDALA et al., 2012; ALVES et al., 2014).
P á g i n a | 15
1. 1. Princípios da regulação autônoma cardiovascular
A porção autônoma do sistema nervoso central desempenha papéis
fundamentais na integração e no processamento da maioria das funções fisiológicas
necessárias para a manutenção da homeostasia cardiovascular (VALENTI et al.,
2007; GOLDSTEIN et al., 2011). Esta porção é composta por grupamentos neuronais
localizados em regiões hipotalâmicas, bulbares, medulares e também na ponte que
modulam de forma tônica e reflexa a atividade elétrica dos nervos simpáticos e
parassimpáticos que se projetam perifericamente ao coração e aos vasos sanguíneos
(REID, 1992; DAMPNEY et al., 2001; ANGELIS et al., 2004; DUN et al., 2004; COSTA
et al., 2014).
A estimulação do sistema nervoso simpático induz a liberação de
noroadrenalina pelas terminações pós-glanglionares simpáticas. A sinalização da
noroadrenalina aos receptores pós-sinápticos presentes no coração (receptores β1) e
nos vasos sanguíneos (receptores α1) ativa cascatas de eventos intracelulares que
estimulam a contração do musculo cardíaco e do liso, favorecendo a elevação da
pressão arterial pelo aumento do débito cardíaco e da resistência vascular periférica
(BARROS et al., 1999; ANGELIS et al., 2004). Antagonicamente, a ativação do
sistema nervoso parassimpático induz a liberação de acetilcolina pelas terminações
nervosas parassimpáticas, que ao se ligar a receptores muscarinicos (tipo M2)
presentes no coração favorecem a diminuição da pressão arterial por meio da redução
do débito cardíaco (OLIVEIRA, 1994; DAMPNEY et al., 2001; STRATTON et al.,
2003).
A participação do sistema nervoso autônomo no controle cardiovascular pode
ser quantificada de forma indireta pela análise espectral da variabilidade da pressão
arterial sistólica (PAS) e do intervalo sistólico (IS) (JÚNIOR e SILVA, 2000). Para a
realização desta técnica, usualmente utiliza-se um algoritmo matemático denominado
transformada rápida de Fourier (FFT) que permite a obtenção de espectro de potência
em função da frequência, a partir dos padrões complexos de oscilações destas
variáveis. Neste espectro, verifica-se a ocorrência consistente de bandas de baixa
frequência (LF) e de alta frequência (HF) em diferentes espécies de animais contidas
em séries temporais como as representadas na figura 1. Apesar das diferenças quanto
P á g i n a | 16
à faixa de frequência em que ocorrem, estas bandas são identificáveis em diferentes
espécies de mamíferos e usualmente atribuídas à modulação da pressão e arterial e
frequência cardíaca por elementos autonômicos. É observado em humanos e outros
mamíferos que a modulação do sistema nervoso simpático sobre o coração e os vasos
sanguíneos está relacionada às bandas LF da variabilidade do IS e da PAS
respectivamente (JÚNIOR e SILVA, 2000; JULIEN, 2005; GOLDSTEIN et al., 2011;
CARRASCO-SOSA e GUILLÉN-MANDUJANO, 2012). O efeito da modulação vagal
sobre o coração e o efeito mecânico da ventilação sobre a parede dos vasos
sanguíneos na caixa torácica são os responsáveis pelo surgimento das bandas HF
nos espectros de ambas as séries temporais (PARATI et al., 1995). Adicionalmente,
tem sido demonstrado que a participação de mecanismos humorais no controle
cardiovascular, tais como angiotensina II e catecolaminas circulantes, induzem o
aparecimento de ondas de muito baixa frequência (VLF) nos espectros de ambas
séries temporais (LANGAGER et al., 2007).
Os reflexos cardiovasculares são os principais mecanismos de controle rápido
da pressão arterial pelo sistema nervoso autonômico. Estes mecanismos são
compostos por estruturas sensoriais localizados em diferentes regiões do sistema
circulatório que sinalizam aos centros autonômicos a necessidade de ajuste da
pressão arterial e/ou da ventilação (MACHADO et al., 1997; COSTA et al., 2014). Os
componentes sensoriais periféricos dos principais reflexos cardiovasculares são
formados por estruturas celulares de terminações nervosas livres capazes de
Figura 1. Representação do comportamento da pressão arterial sistólica (mmHg) e do intervalo
sistólico (em segundos) em função do tempo de um rato movendo-se livremente.
P á g i n a | 17
codificar, em sinal neuronal, o nível de estiramento vascular em leitos de alta pressão,
como os barorreceptores, ou de baixa pressão, como os receptores
cardiopulmonares, e também por células quimiossensíveis especializadas em
codificar eletricamente as modificações da pressão parcial de gases e do pH no
sangue arterial (quimiorreceptores arteriais) (CAMPAGNOLE-SANTOS e HAIBARA,
2001). Os impulsos elétricos originados a partir destes sensores são conduzidos ao
sistema nervoso central por meio dos nervos glossofaríngeo e vago e, em seguida,
são processados de maneira a produzir ajustes apropriados na atividade eferente do
sistema nervoso simpático e parassimpático (IRIGOYEN et al., 2001).
1. 1. 1. Quimiorreflexo arterial
Os quimiorreceptores compõem a estrutura sensorial do quimiorreflexo arterial.
Esta estrutura localiza-se bilateralmente em corpúsculos presentes nas bifurcações
carotídeas e, em uma menor quantidade, no arco da artéria aorta. É sabido que os
corpúsculos carotídeos (CC) são constituídos, principalmente, por células do tipo I,
denominadas também de células de glomus, e do tipo II, conhecidas como células
sustentaculares (PRABHAKAR e OVERHOLT, 2000; WIDDOP et al., 2003). Sabe-se
que as células de glomus são as principais unidades sensibilizadas pelos níveis de
oxigênio presentes no CC, enquanto que as células sustentaculares exercem função
crucial na manutenção e na sustentação da estrutura física do CC (PRABHAKAR e
OVERHOLT, 2000). Além das células do tipo I e II, estão presentes no CC células
neuronais adjacentes que formam vias aferentes de comunicação entre os
quimiorreceptores e o SNC via nervo glossofaríngeo (KATZ et al., 1993; COSTA et al.,
2014).
A estimulação dos quimiorreceptores arteriais pode ocorrer devido a alterações
do gradiente de pressão de gases no sangue arterial, como ocorre em condições de
hipoxemia ou hipercapenia, pela acidemia e também pelo aumento da osmolaridade
sanguínea (MACHADO et al., 1997; ALLEN, 1998; DUN et al., 2004). Corneille
Heymans e colaboradores demostraram, na primeira metade do século passado, que
os quimiorreceptores arteriais também podiam ser ativados por um conjunto de
agentes químicos como o sulfato de sódio, nicotina, lobelina e cianeto de potássio
(KCN), que eram capazes de produzir respostas ventilatórias e cardíacas ao serem
P á g i n a | 18
administrados por via intra-arterial em cães. Seus experimentos também
demonstraram que estas repostas eram dependentes da integridade das inervações
neuronais presentes nos quimiorreceptores, sugerindo que estes sensores poderiam
agir reflexamente em centros respiratórios e cardiovasculares no SNC (HEYMANS et
al., 1930; 1931).
Ao longo dos últimos anos, muitas investigações a respeito do funcionamento
do quimiorreflexo arterial foram conduzidas em animais de experimentação,
ampliando a compreensão das vias centrais responsáveis pelo processamento deste
reflexo (COSTA et al., 2014). É sabido que os quimiorreceptores, ao serem
estimulados, enviam sinais aferentes ao bulbo, em uma região conhecida como núcleo
do trato solitário (NTS), onde interagem com diferentes subpopulações de neurônios
pós-sinápticos conectados a centros autonômicos cardiovasculares e respiratórios
(ACCORSI-MENDONÇA e MACHADO, 2013). Em essência, a ativação dos neurônios
integrados a via do quimiorreflexo no NTS possibilita a deflagração de estímulos
excitatórios que são conduzidos a neurônios pré-simpáticos localizados no núcleo
rostral ventrolateral (RVLM) que estimulam diretamente os neurônios simpáticos da
coluna intermédio lateral (IML), produzindo resposta simpato-excitatória e aumento da
pressão arterial. Estímulos que partem do NTS para o grupamento respiratório ventral
(VRG) eleva a atividade elétrica do nervo frênico produzindo taquipneia e inspiração
e expiração forçadas. Sabe-se também que durante a hipoxemia severa são
deflagrados estímulos excitatórios do NTS para neurônios pré-ganglionares
parassimpáticos localizados no núcleo ambíguo (NA), produzindo resposta
parassimpatoexcitatória e bradiarritmia (MACHADO et al., 1997; COSTA et al., 2014).
É particularmente interessante o fato de que o componente cardiovascular do
quimiorreflexo arterial parece estar envolvido com a gênese da hipertensão arterial.
Estudos têm demonstrado que a desnervação do CC promove atenuação dos níveis
exagerados do tônus simpático basal e também da pressão arterial em ratos
espontanemente hipertensos (SHR) (ABDALA et al., 2012). Estes dados corroboram
com estudos anteriores demonstrando que a inibição de neurônios integrados a via
do quimiorreflexo arterial no NTS promove redução significativa da atividade simpática
e da pressão arterial em SHR (SATO et al., 2001; SATO et al., 2002). Estes estudos
sugerem que mudanças na atividade do quimiorreflexo arterial parecem estar
P á g i n a | 19
envovidas com a produção de transtornos no controle autônomo cardiovascular e com
a gênese da hipertensão arterial.
Foi reportado na literatura que a magnitude das respostas cardiovasculares
induzidas pela ativação do quimiorreflexo arterial por KCN é maior em ratos
submetidos a restrição proteica (ingestão de dieta com 6% de proteína) pós-desmame
ao final de 35 dias comparado a ratos normonutridos da mesma idade (PENITENTE
et al., 2007). Neste estudo, os autores também observaram que as alterações no
quimiorreflexo eram acompanhadas de aumentos nos níveis basais de pressão
arterial média (PENITENTE et al., 2007). Adicionalmente, o mesmo modelo de
restrição proteica pós-desmame foi capaz de produzir alterações no controle
autônomo cardiovascular produzindo aumento do tônus simpático e redução do tônus
parassimpático (MARTINS et al., 2011), o que vem sendo associado, pelos autores, a
um maior risco de hipertensão arterial e desenvolvimento de doenças
cardiovasculares.
No intuito de testar esta hipótese e de verificar se as alterações adaptativas
ocorridas durante a restrição proteica permanecem após a recuperação,
desenvolvemos um modelo de recuperação destes mesmos animais sob restrição
proteica (6% de proteína na dieta) por um período de 70 dias após o término da
restrição. Nossos dados mostraram que os níveis de pressão arterial foram
semelhantes ao do controle ao final do protocolo e que, apesar disso, alterações na
sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo permaneceram após a
recuperação (SÁ et al., 2014). Em conjunto estes estudos sugerem que a desnutrição
proteica pode provocar anormalidades, aparentemente não reversíveis, no
funcionamento do quimiorreflexo arterial.
Os mecanismos fisiológicos que explicam a relação entre a recuperação
alimentar, após a restrição proteica, e a sensibilidade do quimiorreflexo arterial ainda
são pouco entendidos, talvez, por serem pouco estudados. Entretanto, já é sabido que
o aumento da responsividade do sistema renina angiotensina parece ser um elemento
central para a origem de transtornos cardiovasculares observados em diferentes
modelos de restrição proteica (LANGLEY-EVANS e JACKSON, 1995; GOMIDE, J. M.
C. et al., 2012; SOUZA et al., 2014). Logo, presumimos que as alterações no
quimiorreflexo observadas em ratos recuperados da restrição proteica possa guardar
P á g i n a | 20
alguma relação com alterações sistêmicas em mecanismos angiotensinérgicos
ocorridas durante a restrição proteica.
1. 1. 2. Sistema renina-angiotensina
O sistema renina-angiotensina (SRA) é um importante mecanismo do controle
humoral da homeostasia cardiovascular e do balanço hidroeletrolítico (RIBEIRO e
FLORÊNCIO, 2000). A atividade deste sistema está ligada aos efeitos fisiológicos
exercidos por diferentes peptídeos formados a partir da conversão de moléculas de
angiotensinogênio (sintetizadas pelo fígado) em angiotensina I pela enzima renina
(FYHRQUIST e SAIJONMAA, 2008). A principal via de produção e secreção de renina
na corrente sanguínea ocorre pelas células justaglomerulares renais em resposta a
redução expressiva da pressão de perfusão renal, ao aumento da atividade simpática
e também a redução da concentração de sódio na mácula densa. Sabe-se também
que o SRA pode ser ativado localmente por diferentes mecanismos regulatórios em
algumas regiões do sistema nervoso central, nos rins, no coração, nos vasos
sanguíneos e também em glândulas endócrinas (WIDDOP et al., 2003; FYHRQUIST
e SAIJONMAA, 2008; SOARES et al., 2011).
Um dos peptídeos mais potentes formados a partir da cascata enzimática
iniciada pela renina é a angiotensina II. Este octapeptídeo é produzido a partir da
clivagem de dois aminoácidos da extremidade C-terminal da cadeia polipeptídica da
angiotensina I pela enzima conversora de angiotensina (ECA) produzida pelos
capilares pulmonares (OIGMAN e NEVES, 2000). Os efeitos provocados pela
angiotensina II podem se distinguir de acordo com o tipo de receptor ao qual ela se
liga. A ativação de receptores AT1 induz a vasoconstrição, aumento do débito
cardíaco, estimulação da liberação de noradrenalina pelos nervos simpáticos,
aumento da liberação de vasopressina e aldosterona, sede, fibrose e crescimento
celular (REID, 1992; RUPP e JÄGER, 2001; FYHRQUIST e SAIJONMAA, 2008). Por
outro lado, a ativação de receptores AT2 medeia vasodilatação, liberação de oxido
nítrico e inibição do crescimento celular (FYHRQUIST e SAIJONMAA, 2008). Sabe-
se que devido a uma predominância da expressão de receptores AT1 no coração e
nos vasos sanguíneos de animais a partir do nascimento, os efeitos cardiovasculares
P á g i n a | 21
ligados a ativação destes receptores se sobressaem em relação aos dos receptores
AT2 (WIDDOP et al., 2003).
Estudos suportam a ideia de que os receptores AT1 estão presentes em grande
parte das células que compõem o corpúsculo carotídeo (CC), o que permite que a
angiotensina II exerça um efeito potencial na regulação da excitabilidade dos
quimiorreceptores por vias dependentes de fosfolipase C/cálcio (LEUNG et al., 2003).
De fato, a alta expressão de receptores AT1 no CC provoca hipersensibilidade do
quimiorreflexo arterial em animais submetidos a hipóxia crônica intermitente (LEUNG
et al., 2000; LEUNG et al., 2003). Considerando o fato que animais submetidos a
restrição proteica (6%) pós-desmame exibem uma maior sensibilidade a angiotensina
II exógena e uma maior expressão de receptores AT1 nos vasos sanguíneos
(GOMIDE, J. M. C. et al., 2012), é possível que elementos estruturais do
quimiorreflexo arterial possam ser afetados de forma irreversível por estas
anormalidades, o que poderia contribuir para a manutenção da pressão arterial destes
animais durante a restrição proteica e após a recuperação alimentar.
1. 2. Hipótese
Tomando-se como base o exposto, nossa hipótese é de que as alterações nos
mecanismos angiotensinérgicos ocorridas durante a restrição proteica possa levar a
alterações no quimiorreflexo e que essas alterações possam se perpetuar após a
recuperação da restrição proteica. Logo, isso culminaria um mecanismo
quimiorreflexo que produz respostas cardiovasculares e respiratórias distintas
daquelas observadas em animais que não passaram pela restrição proteica durante o
desenvolvimento.
P á g i n a | 22
2. Objetivos
2. 1. Objetivo geral
Avaliar a participação dos receptores AT1 sistêmicos na sensibilidade do
quimiorreflexo arterial e na regulação autonômica cardiovascular de ratos recuperados
da restrição proteica pós-desmame.
2. 2. Objetivos específicos
Avaliar, por meio da análise espectral, a participação do sistema nervoso
autônomo na regulação cardiovascular de ratos sob restrição proteica (RP, 8% de
proteína na dieta) e recuperados da restrição proteica (R-RP).
Avaliar o efeito do bloqueio sistêmico de receptores AT1 com losartan sobre a
regulação cardiovascular de ambos os grupos.
Quantificar as respostas cardiovasculares e ventilatórias do quimiorreflexo em
ratos R-RP.
Avaliar o efeito do bloqueio sistêmico de receptores AT1 com losartan sobre o
componente cardiovascular e ventilatório do quimiorreflexo em ratos R-RP.
P á g i n a | 23
3. Metodologia
3. 1. Modelo Animal
Ratos Fischer com 21 dias de idade (pós desmame) foram obtidos do Centro
de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) em
conformidade com protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Uso Animal (protocolo
nº 2013/24). Os animais foram gerados e mantidos no CCA em gaiolas coletivas, com
ração e água ad libitum, ciclo claro-escuro de 12h e temperatura média de 23°C, até
a realização dos procedimentos experimentais. Animais individuais dentro de uma
mesma gaiola foram distintos uns dos outros por marcação da pelagem com solução
1% de ácido pícrico.
3. 2. Grupos Experimentais
Os animais foram divididos randomicamente nos seguintes grupos: restrição
proteica (RP), que foram alimentados com dieta hipoproteica (8% de proteína na dieta,
sob a forma de caseína) durante 35 dias (n=9); recuperados (R-RP), que receberam
dieta hipoproteica por 35 dias e, em seguida, receberam dieta normoproteica (20% de
proteína na dieta) por 70 dias (n=10). Os respectivos grupos controles receberam
apenas dieta normoproteica durante 35 (C35, n=8) e 105 (C105, n=10) dias (ver figura
2 para distribuição dos grupos). As dietas hipoproteica e normoproteica foram
mantidas isocaloricas (16,52kJ/g) por meio da reposição de caseína por amido (tabela
1). A massa corporal e a ingestão de ração foram monitoradas durante todo o período.
P á g i n a | 24
Dieta normoproteica
Quantidade (g/100g)
Dieta hipoproteica
Quantidade (g/100g)
Valor calórico total (Kcal) 395 395
Caseína 20 8
Amido 53 65
Sacarose 10 10
Óleo de soja 7 7
Mistura de vitaminas 1 1
Mistura de minerais AIN-93G 3,5 3,5
Celulose 5 5
Bitartarato de colina
0,25 0,25
Cistina
0,3 0,3
Tabela 1. Composição de nutrientes a cada 100g de ração normoproteica e hipoproteica. AIN-
93G: American Institute of Nutrition-93 G. As dietas normoproteica e hipoproteica foram mantidas
isocaloricas – 16,52kJ/g (3,95 Kcal/g) por meio da reposição de caseína por amido.
P á g i n a | 25
3. 3. Procedimento cirúrgico
Ao final do período de tratamento destinado a cada grupo (35 ou 105 dias), e
dentro de um período de 3 dias, os animais foram anestesiados com injeção
intraperitoneal de uma mistura de quetamina (80mg/kg) com xilazina (7mg/kg).
Cânulas de polietileno foram implantadas na artéria e na veia femorais esquerdas para
mensuração da pressão arterial pulsátil (PAP) e para administração de drogas,
respectivamente, em conformidade com procedimentos descritos previamente
(CARDOSO et al., 2009). Para a confecção das cânulas, foram utilizados tubos de
polietileno PE-50 (com dimensões ajustadas de acordo com o tamanho do animal)
previamente soldados a tubos de polietileno PE-10 de 1 cm.
Em suma, a cirurgia consistiu de uma incisão ventral da pata traseira esquerda
onde a artéria e a veia foram dissecadas e cateterizadas utilizando-se a porção PE-
10 das cânulas. As extremidades PE-50 foram transpassadas sub-cutaneamente na
região lateral, com o auxílio de um trocater, para a cintura escapular e exteriorizadas
no dorso, próximo ao pescoço. Após a cirurgia, analgésico (cetoprofeno, 4mg.kg−1,
RP Restrição Proteica
21 dias 35 dias
Amamentação
Início do protocolo
de restrição
R-RP Recuperados
21 dias 35 dias
Amamentação
Fim do protocolode recuperação
Dieta normoproteica(20% de proteína)
70 dias
Dieta
hipoproteica(8% de proteína)
Dieta
hipoproteica(8% de proteína)
Fim do protocolo
de restrição
Início do protocolo
de restrição
Fim do protocolo
de restrição
Figura 2. Protocolo alimentar aplicado ao grupo restrição proteica (RP) e ao grupo recuperado (R-RP).
Respectivos grupos controles receberam apenas dieta normoproteica por 35 (C35) ou 105 (C105) dias.
P á g i n a | 26
0.1mL intramuscular) e antibióticos [benzilpenicilina benzatina (600.000 UI),
benzilpenicilina procaína (300.000 UI), benzilpenicilina potássio (300.000 UI) e
estreptomicina sulfato (500 mg) 0,1mL subcutâneo] foram administrados. Cada animal
se recuperou da cirurgia em gaiolas individuais por um período de 48 horas com livre
acesso a água e comida.
3. 3. Procedimento de aquisição dos dados cardiovasculares
Findadas as 48 horas de recuperação da cirurgia, os animais foram levados à
sala de registro e ali permaneceram por pelo menos uma hora para adaptação às
condições ambientais do laboratório. Imediatamente antes do início do registro, 0,1
mL de uma solução de heparina em salina isotônica (1000 UI/mL) foi injetada na
cânula arterial (pela extremidade do PE50 exteriorizada) para evitar a formação de
coágulos durante o registro. A cânula arterial foi conectada a um sistema “spin”,
desenvolvido e construído pelo próprio laboratório, e este a um transdutor de pressão
(MLT0699) ligado a um sistema digital de aquisição de sinais biológicos PowerLab
(ADInstruments Pty Ltd, Austrália) (figura 3).
Os dados de pressão arterial foram aquisitados pelo transdutor de pressão e
pré-amplificados por um pré-amplificador (BridgeAmp). Os dados analógicos foram
convertidos a variáveis discretas por um conversor analógico para digital
(ADInstruments Pty Ltd, Austrália). Os dados foram registrados pelo software LabChar
7 for Windows e estocados em arquivos individuais para cada animal. A amplitude
(resolução espacial) da janela de digitalização foram configurados para 20 mV e os
dados foram digitalizadas com resolução temporal de 1 ms (1000 Hz).
P á g i n a | 27
3. 4. Procedimento de aquisição dos dados ventilatórios
Em um grupo separado de animais recuperados (R-RP, n=8) e controles (C105,
n=8), dados de frequência respiratória (fR), volume corrente (VT) e ventilação (VE)
foram obtidos pelo método de pletismografia de corpo inteiro para pequenos animais
(BARTLETT e TENNEY, 1970). Para tanto, os animais foram colocados no interior de
uma câmara pletismográfica adaptada para ratos (volume ocupado pelo animal 5%)
ligado a um transdutor de pressão (ML141Spirometer, PowerLab, ADInstruments,
Bella Vista, NSW, Australia), conectado a um pré-amplificador (BridgeAmp) e a um
conversor de sinal analógico para digital (ADInstruments Pty Ltd, Austrália).
Antes do início dos experimentos, os animais foram mantidos por um período
mínimo de 15 minutos no interior da câmara pletismográfica para familiarização com
ambiente experimental. Durante o experimento, a câmara foi completamente selada
Pré-amplificador analógico (BridgeAmp)
Conversor de sinal (analógico/digital)
Computador equipado com o software LabChart® Pro (v. 7)
Oscilações de pressão arterial pulsátil, média e frequência cardíaca. Resolução espeacial: 20
mV. Resolução temporal: 1ms (1000 Hz)
Cânulas de polietileno (PE50)
Transdutor de Pressão
(MLT0699)
2
3
4
1
Cânulas de polietileno (PE50/PE10) implantadas na artéria e veia femoral.
Figura 3. Representação esquemática dos equipamentos utilizados para a aquisição de dados
cardiovasculares. A cânula arterial foi conectada a um sistema “spin”, desenvolvido e construído pelo
próprio laboratório, e este a um transdutor de pressão (1), ligado a um pré-amplificador analógico (2),
a um conversor de sinal analógico (ADInstruments Pty Ltd, Austrália) (3) e a um computador equipado
com o software LabChart® Pro 7.0 (4).
P á g i n a | 28
por períodos curtos (2 minutos aproximadamente) para que fosse possível registrar
as oscilações de pressão no interior da câmara, causadas pela diferença de
temperatura entre o gás inspirado (25ºC, aproximadamente) e expirado (~37ºC,
aproximadamente). As oscilações de pressão no interior da câmara geraram ciclos
curtos de pressão que foram usados para as análises dos parâmetros ventilatórios.
Os sinais foram digitalizados com resolução temporal de 1 ms em um computador
equipado com o software LabChart 6.0 for Windows (figura 4).
Conversor de sinal (analógico/digital)
Computador equipado com o software LabChart® Pro (v. 6)
Oscilações de pressão usadas para a determinação do volume corrente e da
frequência respiratória. Resolução espeacial: 20 mV. Resolução temporal: 1ms (1000 Hz)
Transdutor de Pressão
(ML141Spirometer)
2
3
4
1
Ar expirado
(~37ºC)
Pressão no interior da câmara
Ar inspirado
Pressão no interior da câmara
(~23ºC)
Câmara pletismográficaadaptada para ratos
Pré-amplificador analógico (BridgeAmp)
Figura 4. Representação esquemática dos equipamentos utilizados para a aquisição de dados
ventilatórios. A câmara pletismográfica foi conectada a um transdutor diferenciado de pressão
(ML141Spirometer, 1), ligado a um pré-amplificador analógico (2), a um conversor de sinal analógico
(ADInstruments Pty Ltd, Austrália, 3) e a um computador equipado com o software LabChart® Pro 6.0
(4).
P á g i n a | 29
3. 5. Administração de drogas
Doses de cianeto de potássio (KCN - 20, 40, 60, 80 e 160 μg/kg), foram
randomicamente injetadas intravenosamente (i.v.) para a estimulação das respostas
cardiovasculares à ativação dos quimiorreceptores arteriais. As doses de KCN foram
baseadas em nosso estudo prévio (SÁ et al., 2014). A estimulação do quimiorreflexo
foi iniciada 60 minutos antes (basal) e após 90 minutos do bloqueio de receptores AT1
por meio da administração periférica de losartan (20 mg/Kg, i.v.) (figura 5.A). Para os
ensaios ventilatórios, as doses de 60 e 80 μg/kg de KCN foram utilizadas (figura 5.B).
Injeções de KCN
Losartan
15
registro pré-KCN
20 30
Basal Pós-losartan
17 3222
60 µg/kg 80 µg/kg
20 mg/kg
Injeções de KCN
registro pré-KCN
60 µg/kg 80 µg/kg
minutos: (33-40) 55 57 60 62 70 72
= registro de ventilação. Tempo máx: 2min
Injeções de KCN
20, 40, 60, 80 e 160 µg/Kg
Losartan20 mg/Kg i.v.
Injeções de KCN
20, 40, 60, 80 e 160 µg/Kg
15min
registro da PAP
1h30min 2h30min 2h45min 4h 5h
Basal Pós-losartan
registro da PAP
Figura 5. Protocolos experimentais desenvolvidos para a aquisição dos dados cardiovasculares (A) e
ventilatórios (B).
(A)
(B)
P á g i n a | 30
Um intervalo mínimo de 10 minutos foi respeitado entre cada injeção. As drogas foram
preparadas usando salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,20 como veículo. O
volume injetado para cada droga variou entre 0,08 a 0,12 mL (para KCN) e 0,2 a 0,4
mL (para losartan), de acordo com o peso corporal de cada rato.
3. 6. Análise dos parâmetros cardiovasculares
A pressão arterial média (PAM) e a frequência cardíaca (FC) foram registrados
durante o basal de forma continua por um período de 75 minutos após 15 minutos de
adaptação. Após o bloqueio dos receptores AT1, estas variáveis também foram
registradas por um período de 75 minutos após 15 minutos da injeção de losartan. A
sensibilidade do barorreflexo (SBR) espontâneo foi analisada por meio do método
descrito por Parati e colaboradores (PARATI et al., 1988), e reportado por nós
previamente (SÁ et al., 2014). O barorreflexo espontâneo foi analisado utilizando-se
seguimentos estáveis de registro da PAP que apresentavam janela temporal mínima
de 40 minutos. As respostas cardiovasculares geradas pela estimulação do
quimiorreflexo foram quantificadas detectando-se o pico máximo de variação da PAM
e da FC como resultado das injeções de KCN. A análise do quimiorreflexo foi iniciada
60 minutos antes (basal) e após 90 minutos do bloqueio dos receptores AT1.
3. 7. Análise espectral
A variabilidade no domínio da frequência da pressão arterial sistólica (PAS) e
do intervalo sistólico (IS) foi avaliada pela análise espectral. Para tanto, sequências
de valores consecutivos de PAS e IS foram extraídos de segmentos de no mínimo 40
minutos do registro da PAP e analisados pelo software CardioSeries v2.4. As séries
temporais da pressão arterial sistólica (PAS) e do intervalo sistólico (IS) foram
redimensionadas para 10 Hz, dividas em segmentos contínuos de 512 valores e
sobrepostos a 50%. Os espectros da PAS e do IS foram calculados usando o algoritmo
transformada rápida de Fourier (FFT). Três componentes oscilatórios majoritários
foram observados a partir do espectro: bandas de muito baixa frequência (VLF; 0 a
0,20 Hz), de baixa frequência (LF; 0,20 a 0,75 Hz) e de alta frequência (HF; 0,75 a
P á g i n a | 31
3,00 Hz). As potências máximas dessas bandas foram comparadas entre os grupos.
A análise espectral foi realizada durante o basal e 15 minutos após a injeção de
losartan.
3. 8. Análise dos parâmetros ventilatórios
Os ciclos de pressão detectados no interior da câmara pletismográfica foram
analisados manualmente em conformidade com os procedimentos realizados por
estudos recentes (SILVA et al., 2015). Para a determinação do VT, a amplitude média
de ciclos consecutivos de pressão, presentes em um segmento de 30 segundos do
registro, foi analisada e inserida em uma fórmula reportada previamente por estudos
de Granjeiro (2009), desenvolvida a partir de estudos de Drorbaug e Fenn
(DRORBAUG e FENN, 1955):
𝑽𝑻 = 𝑽𝑲 ×𝑷𝑻
𝑷𝑲×
𝑻𝑪 × (𝑷𝑩 − 𝑷𝑨)
𝑻𝑪 × (𝑷𝑩 − 𝑷𝑨) − 𝑻𝑨 × (𝑷𝑩 − 𝑷𝑪)
Onde: VT = volume corrente;
VK = volume de ar injetado na câmara para calibração;
PT = deflexão de pressão associada a cada volume de ar corrente;
PK = deflexão de pressão associada a cada volume de ar injetado para
calibração;
TC = temperatura corporal;
TA = temperatura do ar dentro da câmara do animal;
PB = pressão barométrica;
PA = pressão de vapor de água à temperatura da câmara;
PC = pressão de vapor de água à temperatura corporal.
𝑽𝑬(𝒎𝑳. 𝒌𝒈−𝟏. 𝒎𝒊𝒏−𝟏) = 𝑽𝑻(𝒎𝑳. 𝒌𝒈−𝟏) × 𝒇𝑹(𝒄𝒑𝒎)
Onde: VE = volume-minuto respiratório;
VT = volume corrente;
P á g i n a | 32
fR = frequência respiratória.
Para a análise da fR, a quantidade de ciclos presente no mesmo segmento de
30 segundos foi multiplicada por 2 para a estimativa da quantidade de ciclos em um
minuto (ciclos por minuto, cpm). VE foi quantificado por meio da multiplicação do VT
pela fR. As análises dos parâmetros ventilatórias foram conduzidas 1 minuto antes e
15 minutos após a administração de losartan (20 mg/kg). A taquipnéia induzida pela
ativação do quimiorreflexo arterial foi analisada contando-se a quantidade ciclos
existentes em cada segmento de 2 segundos no período correspondente entre 6
segundos antes e 18 segundos após a injeção de KCN. A quantidade de ciclos em
cada segmento foi expressa em cpm (SILVA et al., 2015). As respostas máximas
evocadas pelo KCN (segundo 2) foram comparadas entre os grupos C105 e R-RP.
3. 9. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 6.01 for
Windows. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média
(SEM), e as comparações foram feitas utilizando a análise de variância (ANOVA) de
duas vias seguida do teste de Holm-Sidak. Diferenças entres pares de médias foram
considerados estatisticamente significativas quando valores de p foram menores do
que 5% (p<0.05).
P á g i n a | 33
4. Resultados
4. 1. Massa corporal
Na figura 6 (A) estão apresentados os dados de massa corporal dos animais
R-RP e C105 a partir do desmame (dia 0) até o centésimo dia de tratamento. O grupo
R-RP obteve um aumento de massa corporal menor do que o grupo C105 durante a
maior parte do período analisado. Próximo ao término da fase de restrição proteica,
dia 30, os ratos R-RP pesavam 49% menos do que o grupo C105 [180 ± 5 g (C105) e
92 ± 9 g (R-RP) P < 0,0001]. A realimentação possibilitou os animais R-RP atingirem
apenas 87% da massa corporal total observada no grupo C105 no centésimo dia de
tratamento [328 ± 11 g (C105) e 287 ± 5 g (R-RP P < 0,0001]. Os animais R-RP tiveram
o ganho de massa corporal reduzido em relação aos animais do grupo C105 durante
todo período analisado da restrição proteica (figura 6.B). No 30º dia, os resultados
obtidos foram: [48 ± 2 g (C105) e 8 ± 4 g (R-RP) P < 0,0001]. No entanto, foi observado
no início da fase de recuperação, nos dias 50 e 60, que os animais R-RP exibiram
valores de ganho de massa corporal elevados em relação aos animais do grupo C105.
No 60º dia, os resultados obtidos foram: [30 ± 2 g (C105) e 43 ± 2 g (R-RP) P = 0,0301].
4. 2. Ingestão de ração
Os valores absolutos de ingestão de ração mostraram que os animais R-RP
consumiram menos ração do que o grupo C105 durante a maior parte da primeira
metade do tratamento (figura 6.C). No entanto, a relação entre ingestão de ração e
massa corporal (figura 6.D) revelou haver redução significativa apenas no 30º dia
[0,101 ± 0,002 (C105) e 0,062 ± 0,009 (R-RP) P = 0,0305].
P á g i n a | 34
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
C 1 0 5 (n = 1 6 ) R -R P (n = 1 7 )
A p ó s o d e s m a m e
D ie ta n o r m o p r o te ic a
D ia s
Ma
ss
a c
orp
ora
l (g
)
* **** ** **
A p ó s o d e s m a m e
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0
2 0
4 0
6 0
D ia s
Ga
nh
o d
e m
as
sa
co
rp
ora
l (g
)
D ie ta n o r m o p r o te ic a
**
*
*
*
D ie ta n o r m o p r o te ic a
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
A p ó s o d e s m a m e
D ia s
Ige
stã
o d
e r
aç
ão
(g
/dia
)
* *
**
D ie ta n o r m o p r o te ic a
A p ó s o d e s m a m e
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
0 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5
D ia s
Ing
es
tão
de
ra
çã
o/
ma
ss
a c
orp
ora
l
*
(A ) (B )
(C ) (D )
Figura 6. Massa corporal (A), ganho de massa corporal (B), ingestão de ração (C) e ingestão de ração/massa
corporal (D) dos animais R-RP ( ) e C105 (●). A faixa colorida representa o período em que os animais R-RP
foram alimentados com dieta hipoproteica (8% de proteína). Dados foram representados como média ± erro
padrão da média (SEM). *P < 0,05 comparado com C105 por ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc
de Holm-Sidak.
P á g i n a | 35
4. 3. Pressão arterial e frequência cardíaca
A pressão arterial média (PAM) não foi diferente entre os grupos RP e C35, tanto
no basal quanto após o losartan (figura 7.A). No entanto, foi observado que frequência
cardíaca (FC) foi maior nos animais RP do que nos animais C35 durante o basal [392
± 9 bpm (C35) e 431 ± 10 bpm (RP) P = 0,0236], mas não após losartan. O losartan
induziu taquicardia no grupo C35 [392 ± 9 bpm (basal) e 432 ± 8 bpm (pós-losartan) P
= 0,0024] e no grupo RP [431 ± 10 bpm (basal) e 457 ± 10 bpm (pós-losartan) P =
0,0234].
A PAM foi similar entre os grupos R-RP e C105 durante o basal e após o losartan
(figura 7.B). Contudo, foi observado que o losartan reduziu a PAM no grupo C105 [115
± 2 mmHg (basal) e 104 ± 2 mmHg (pós-losartan) P = 0,0036], mas não no grupo R-
RP [115 ± 2 mmHg (basal) e 108 ± 2 mmHg (pós-losartan)]. Os animais R-RP
apresentaram níveis elevados de FC em relação ao grupo C105 durante o basal [332
± 7 bpm (C105) e 371 ± 10 bpm (R-RP) P = 0,0445] e após o losartan [363 ± 13 bpm
(C105) e 420 ± 13 bpm (R-RP) P = 0,0031]. O losartan também produziu taquicardia
nos animais C105 [332 ± 7 bpm (basal) e 363 ± 13 bpm (pós-losartan) P = 0,0053] e
nos R-RP [371 ± 10 bpm (basal) e 420 ± 13 bpm (pós-losartan) P < 0,0001].
P á g i n a | 36
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
C 3 5 (n = 8 )
R P (n = 9 )
2 0 m g /k g ( i.v .)
PA
M(m
mH
g)
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
3 0 0
3 5 0
4 0 0
4 5 0
5 0 0
FC
(bp
m)
2 0 m g /k g ( i.v .)
***
**
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
C 1 0 5 (n = 1 0 )
R -R P (n = 1 0 )
PA
M(m
mH
g)
2 0 m g /k g ( i.v .)
**
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
3 0 0
3 5 0
4 0 0
4 5 0
5 0 0
FC
(bp
m)
2 0 m g /k g ( i.v .)
***
*
**
(A )
(B )
R-R
PR
P
Figura 7. Animais RP e R-RP apresentam níveis elevados de frequência cardíaca de repouso. Pressão
arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) referente aos grupos RP e C35 (A), e R-RP e C105
(B). As médias foram coletadas no basal e após o losartan (20mg/kg, i.v.). Os dados foram
representados como média ± SEM. *P < 0,05 comparado com controle; **P < 0,05 comparado com
basal. ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak.
P á g i n a | 37
4. 4. Sensibilidade do barorreflexo espontâneo e a variabilidade do PAS e do IS
no domínio do tempo
A sensibilidade do barorreflexo (SBR) espontâneo, assim como a variabilidade
da PAS e do IS no domínio do tempo, não foram diferentes entre os grupos RP e C35,
tanto no basal quanto após o losartan (tabela 2). Comparando o efeito do losartan em
cada grupo individualmente, foi observado uma redução da SBR espontâneo no grupo
RP [0,49 ± 0,03 ms/mmHg (basal) e 0,33 ± 0,03 ms/mmHg (pós-losartan) P = 0,0362],
mas não no grupo C35 [0,50 ± 0,13 ms/mmHg (basal) e 0,55 ± 0,17 ms/mmHg (pós-
losartan)].
Nos ratos R-RP, a variabilidade da PAS foi maior do que a do grupo C105 no
basal [27,7 ± 2.8 mmHg2 (C105) e 47,2 ± 8 mmHg2 (R-RP) P = 0,0206] e após o losartan
[22,7 ± 1,8 mmHg2 (C105) e 41,6 ± 5,6 mmHg2 (R-RP) P = 0,0252]. Contudo, não foram
detectadas diferenças na variabilidade do IS e na SBR espontâneo. Comparando o
efeito do losartan em cada grupo individualmente, foi observado uma redução na SBR
espontâneo e na variabilidade do IS no grupo R-RP em resposta a injeção, mas não
no grupo C105 (tabela 2).
P á g i n a | 38
C35 (n=8) RP (n=9) C105 (n=10) R-RP (n=10)
Basal
Pós-
losartan Basal
Pós-
losartan Basal
Pós-
losartan Basal
Pós-
losartan
Variância, PAS (mmHg2) 32 ± 6 41 ± 10 26 ± 3 24 ± 2 27 ± 2 22 ± 1 47 ± 8* 41 ± 5*
Variância, IS (ms2) 70 ± 38 47 ± 26 17 ± 11 30 ± 22 11 ± 3 19 ± 9 22 ± 6 7 ± 1**
SBR espontâneo (ms/mmHg)
0,54 ± 0,13
0,59 ± 0,16 0,49 ±
0,03
0,33 ±
0,03**
0,42 ± 0,03
0,37 ± 0,04
0,46 ± 0,07
0,33 ±
0,03**
Tabela 2. Os níveis elevados de variabilidade da pressão arterial sistóilica em animais R-RP não são
controlados pelo losartan. PAS: Pressão arterial sistólica; IS: intervalo sistólico; SBR: sensibilidade do
barorreflexo. Valores foram representados como média ± SEM. *P < 0,05 comparado com controle;
**P < 0,05 comparado com o basal. ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak
P á g i n a | 39
4. 5. Análise espectral do intervalo sistólico
A potência das bandas VLF, LF e HF do espectro do IS não foram diferentes
entre os grupos RP e C35 [VLF: 0,50 ± 0,13 ms2/Hz (C35) e 0,51 ± 0,14 ms2/mmHg
(RP)]; [LF: 0,43 ± 0,07 ms2 (C35) e 0,41 ± 0,13 ms2 (RP)] e [HF: 1,29 ± 0,31 ms2 (C35)
e 1,06 ± 0,24 ms2 (RP)]. O tratamento agudo com o losartan não produziu diferenças
significativas nestes resultados.
Os animais R-RP, quando comparados aos C105, também não apresentaram
diferenças significativas na potência das bandas de VLF, LF e HF do espectro do IS
durante o basal [VLF: 0,38 ± 0,08 ms2/Hz (C105) e 0,67 ± 0,14 ms2/Hz (R-RP)]; [LF:
0,35 ± 0,12 ms2/Hz (C105) e 0,75 ± 0,21 ms2/Hz (R-RP)] e [HF: 0,87 ± 0,34 ms2/Hz
(C105) e 1,27 ± 0,2 ms2/Hz (R-RP)], permanecendo inalterados após o losartan.
Analisando o efeito do losartan isoladamente no grupo R-RP, foi observado que este
fármaco reduziu significativamente o pico da potência das bandas de VLF e de LF do
espectro do IS [VLF: 0,67 ± 0,14 ms2/Hz (R-RP, basal) e 0,24 ± 0,05 ms2/Hz (R-RP,
pós-losartan) p = 0,0252] e [LF: 0,75 ± 0,21 ms2/Hz (R-RP, basal) e 0,34 ± 0,09 ms2/Hz
(R-RP, pós-losartan) p = 0,0206]. Em todas as comparações realizadas, a intensidade
da banda HF não se apresentou alterada.
P á g i n a | 40
4. 6. Análise espectral da pressão arterial sistólica
Os animais do grupo RP, comparados ao C35, não apresentaram diferenças na
potência das bandas de VLF, LF e HF da PAS, tanto no basal quanto após o losartan
(figura 8).
Espectro de potência em função da frequência, a partir dos padrões complexos
de oscilações da PAS obtidos no basal (figura 9.A) e após o losartan (9.B) Os animais
R-RP exibiram picos da potência das bandas VLF e LF elevados em relação aos
animais C105 durante o basal [VLF: 5,33 ± 0,62 mmHg2 (C105) e 10,75 ± 1,92 mmHg2
(R-RP) p = 0,0020] e [LF: 4,89 ± 0,71 mmHg2 (C105) e 11 ± 1,64 mmHg2 (R-RP) p =
0,0191] (figura 9.C), mas não após o losartan [VLF: 5,55 ± 0,39 mmHg2 (C105) e 7,19
± 0,63 mmHg2 (R-RP)] e [LF: 7,69 ± 0,97 mmHg2 (C105) e 11,82 ± 2,36 mmHg2 (R-RP)]
(figura 9.C). Losartan reduziu significativamente o pico da potência das bandas de
VLF nos ratos R-RP. A potência das bandas de HF do espectro da PAS foi similar nos
grupos RP, R-RP e em seus respectivos grupos controles, tanto durante o basal
quanto após o losartan.
P á g i n a | 41
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
5
1 0
1 5
C 3 5 ( n = 8 )
R P (n = 9 )
2 0 m g /k g ( i.v .)
VL
F d
a P
AS
(mm
Hg
2)
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
5
1 0
1 5
LF
da
PA
S
(mm
Hg
2)
2 0 m g /k g ( i.v .)
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
2
4
6
HF
da
PA
S
(mm
Hg
2)
2 0 m g /k g ( i.v .)
(A )
(B )
(C )
Figura 8. Animais RP não apresentam alterações no controle neuro-humoral do tônus
vasomotor. Valores absolutos do pico da potência das bandas de VLF (A), LF (B) e HF
(C) do espectro da pressão arterial sistólica (PAS) dos grupos RP (vermelho) e C35 (preto),
durante o basal e após o losartan (20 mg/kg, i.v.).
P á g i n a | 42
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6
0
1 3
2 6
3 9
5 2
6 5
R -R P (n = 1 0 )C 1 0 5 (n = 1 0 )
L F
H F
V L F
H z
Po
tên
cia
Es
pe
ctr
al
(mm
Hg
2/
Hz
)
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
5
1 0
1 5
2 0 m g /k g ( i.v .)
VL
F d
a P
AS
(mm
Hg
2)
* **
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6
0
1 3
2 6
3 9
5 2
6 5
L F
H F
V L F
H z
Po
tên
cia
Es
pe
ctr
al
(mm
Hg
2/
Hz
) B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
5
1 0
1 5
2 0 m g /k g ( i.v .)
LF
da
PA
S
(mm
Hg
2)
*
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
1
2
3
4
5
2 0 m g /k g ( i.v .)
HF
da
PA
S
(mm
Hg
2)
(C )(A )
(B )
B a s a l
P ó s -lo s a r ta n
Figura 9. Animais R-RP apresentam aumento da participação do sistema nervoso simpático e de angiotensina
II na regulação do tônus vasomotor. Espectro da pressão arterial sistólica (PAS) dos grupos R-RP (vermelho)
e C105 (preto) durante o basal (A) e após o losartan (B). Nos gráficos à direita (C), estão apresentados os
valores absolutos do pico da potência das bandas de VLF, LF e HF do espectro da PAS dos animais R-RP e
C105, durante o basal e após o losartan. Os resultados foram representados como média ± SEM. *P < 0,05
comparado com controle; **P < 0,05 comparado com o basal. ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc
de Holm-Sidak.
P á g i n a | 43
4. 7. Respostas cardiovasculares induzidas pela ativação do quimiorreflexo
arterial
As alterações na PAM e na FC induzidas pela estimulação do quimiorreflexo
arterial, pelo KCN, não foram diferentes entre os grupos RP e C35, durante o basal e
após o losartan (figura 11, A e B).
O perfil das respostas cardiovasculares evocadas pela injeção de KCN (60
μg/kg) está apresentado na figura 10. As doses de 60 e 80 µg/kg de KCN geraram
respostas pressóricas mais elevadas no grupo R-RP em relação grupo C105 [60 µg/kg:
25 ± 5 mmHg (C105) e 45 ± 4 mmHg (R-RP) p = 0,0002; 80 µg/kg: 47 ± 3 mmHg
(C105) e 60 ± 6 mmHg (R-RP) p = 0,0265] (figura 11.C). O losartan não afetou a
magnitude dessas respostas. Além disso, as doses de 60, 80 e 160 µg/kg de KCN
também geraram respostas bradiarrítmicas mais elevadas no grupo R-RP em relação
ao grupo C105 [60 µg/kg: -27 ± 9 bpm (C105) e -76 ± 14 bpm (R-RP) p = 0,0144; 80
µg/kg: -66 ± 7 bpm (C105) e -120 ± 19 bpm (R-RP) p = 0,0071; 160 µg/kg: -120 ± 16
bpm (C105) e -173 ± 13 bpm (R-RP) p = 0,0082] (figura 11.D). O losartan também
não afetou a magnitude dessas respostas.
P á g i n a | 44
50
100
150
200
PA
P(m
mH
g)
KCN (60µg/kg)
C105
(A)
50
100
150
200
PA
P(m
mH
g)
KCN (60µg/kg)
PAM
(m
mH
g)
FC (
bp
m)
Basal Pós-losartan
PAP
(m
mH
g)
50
100
150
200
PA
P(m
mH
g)
(B)
50
100
150
200
PA
P(m
mH
g)
5 segundos
R-RP
KCN (60µg/kg) KCN (60µg/kg)
50
100
150
200
PA
P(m
mH
g)
Basal Pós-losartan
PAP
(m
mH
g)
FC (
bp
m)
PAM
(m
mH
g)
Figura 10. Traçados representativos da pressão arterial pulsátil (PAP), pressão arterial média (PAM) e frequência
cardíaca (FC) mostrando o perfil das respostas cardiovasculares evocadas pela injeção de KCN (60 μg/kg de massa
corporal) em um animal do grupo C105 (A) e em um do grupo R-RP (B). As setas indicam o exato momento da injeção.
P á g i n a | 45
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
C 3 5 (p ó s - lo s a r ta n )
C 3 5 (b a s a l)
R P (p ó s -lo s a r ta n )
R P (b a s a l)
20 40 60 80 160
K C N ( g /k g d e m a s s a c o r p o r a l)
P
AM
(mm
Hg
)
0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
C 1 0 5 (p ó s - lo s a r ta n )
C 1 0 5 (b a s a l)
R -R P (p ó s -lo s a r ta n )
R -R P (b a s a l)
20 40 60 80 160
K C N ( g /k g d e m a s s a c o r p o r a l)
PA
M(m
mH
g)
0
*
*
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
20 40 60 80 160
F
C(b
pm
)
0
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
20 40 60 80 160
F
C(b
pm
)0
*
**
R P R -R P
(A ) (C )
(B ) (D )
Figura 11. A sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo arterial é elevada em animais
R-RP por mecanismos independentes de receptores AT1. Respostas pressóricas (A e C) e bradiarrítmicas
(B e D) evocadas pela estimulação do quimiorreflexo por KNC (20, 40, 60, 80 e 160 µg/kg de massa
corporal, i.v.) dos animais RP (n = 9) e C35 (n = 8) – gráficos à esquerda, e dos animais R-RP (n = 10) e
C105 (n = 10) – gráficos à direita. As médias foram coletadas na condição basal (símbolos preenchidos) e
após losartan (símbolos vazios). Resultados foram representados como média ± SEM. *P < 0,05
comparado com controle (em sua respectiva condição). ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de
Holm-Sidak.
P á g i n a | 46
4. 8. Ventilação
O presente estudo fornece resultados a respeito da ventilação apenas dos
animais R-RP e C105. Na condição basal, VT e VE foram 30% e 49%, respectivamente,
mais elevados nos animais R-RP em relação aos animais C105 (figura 12) [VT: 12,2 ±
0,6 mL.kg-1, VE: 856 ± 39 mL-1.kg-1.min (C105) e VT: 17,1 ± 1,6 mL.kg-1, VE: 1274 ±
126 mL.kg-1.min (R-RP)]. No entanto, não foram detectadas diferenças na fR durante
o basal.
Os valores de VE permaneceram elevados no grupo R-RP após o losartan [903
± 61 mL-1.kg-1.min (C105) e 1450 ± 165 mL-1.kg-1.min (R-RP) p = 0,0046], porém VT
foi normalizado [14,1 ± 1,5 mL.kg-1 (C105) e 18,6 ± 1,5 mL.kg-1 (R-RP)]. Além disso,
os resultados mostraram que os ratos R-RP apresentaram níveis elevados de fR após
o losartan [65 ± 3 cpm (C105) e 77,6 ± 1,6 cpm (R-RP) p = 0,0278].
P á g i n a | 47
B a s a l P ó s - lo s a r ta n
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
f R(c
pm
)
2 0 m g /k g ( i.v .)
*
C 105 (n = 8 )
R -R P (n = 8 )
B a s a l P ó s - lo s a r ta n
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
VT
(mL
.kg
-1)
2 0 m g /k g ( i.v .)
*
B a s a l P ó s - lo s a r ta n
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
VE
(mL
.kg
-1.m
in-1
)
2 0 m g /k g ( i.v .)
**
(A )
(B )
(C )
Figura 12. As alterações no controle ventilatório em animais R-RP não são mediadas exclusivamente
por mecanismos dependentes de receptores AT1. Frequência respiratória (fR), volume corrente (VT) e
ventilação por minuto (VE) dos animais R-RP (vermelho) e C105 (preto). As médias foram coletadas na
condição basal e após o losartan (20 mg/kg, i.v.). Os resultados foram representados como média ± SEM.
*P < 0,05 comparado com controle. ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak
P á g i n a | 48
4. 9. Taquipnéia induzida pela ativação do quimiorreflexo
Os dados apresentados na figura 13 mostraram que o pico das respostas de fR
(segundo 2) evocadas pela estimulação do quimiorreflexo arterial, por KCN (60 e 80
µg/kg i.v.), foram similares entre os animais R-RP e C105, na condição basal [60 µg/kg
de KCN: 255 ± 22 cpm (C105) e 311 ± 29 cpm (R-RP), e 80 µg/kg de KCN: 313 ± 21
cpm (C105) 330 ± 29 cpm (R-RP)] e após o losartan [60 µg/kg e KCN: 341 ± 17 cpm
(C105) e 318 ± 37 cpm (R-RP), e 80 µg/kg de KCN: 365 ± 33 cpm (C105) 346 ± 17 cpm
(R-RP)].
P á g i n a | 49
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
C 1 0 5 (n = 8 ) R -R P (n = 8 )
T e m p o (s )
fR
(cp
m)
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
T e m p o (s )
fR
(cp
m)
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
T e m p o (s )
fR
(cp
m)
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
T e m p o (s )
fR
(cp
m)
(A )
(B )
B a s a l P ó s -lo s a rta n
K C N (6 0 g /k g )
K C N (8 0 g /k g ) K C N (8 0 g /k g )
K C N (6 0 g /k g )
K C N (6 0 g /k g )
K C N (8 0 g /k g )
B a s a l P ó s -lo s a rta n
Figura 13. A sensibilidade do componente ventilatório do quimiorreflexo arterial não se difere em
animais R-RP em relação aos animais C105. Curso temporal da frequência respiratória durante a
estimulação do quimiorreflexo arterial, por KCN (60 e 80 µg/kg de massa corporal) nos grupos R-RP
( ) e C105 ( ), no basal (A) e após o losartan (B).
P á g i n a | 50
6. Discussão
Os principais resultados obtidos no presente estudo revelaram que ratos
submetidos a restrição proteica (8%) pós-desmame, seguida por um protocolo de
recuperação com dieta normoproteica (20%), apresentaram níveis elevados de FC de
repouso, de variabilidade da pressão arterial e de magnitude das respostas
cardiovasculares evocadas pela ativação do quimiorreflexo arterial. Além disso, o
nosso estudo mostra pela primeira vez que o volume-minuto respiratório é
significativamente elevado nos animais R-RP, sugerindo que o controle da ventilação
também é afetado pela restrição proteica/recuperação. O bloqueio dos receptores AT1
por meio da injeção intravenosa de losartan não foi capaz de normalizar nenhum dos
parâmetros mencionados acima, sugerindo que a sinalização por angiotensina II via
receptores AT1 pode não estar diretamente relacionada com os transtornos
cardiorrespiratórios observados nos animais R-RP. Por outro lado, a atividade
espontânea do barorreflexo nos animais RP e R-RP foi reduzida para níveis abaixo
do normal pelo losartan, o que pode indicar que receptores AT1 desempenham um
certo papel na manutenção da função do barorreflexo nestes animais.
A massa corporal tem sido amplamente utilizada na literatura científica como
um indicador, ainda que geral, do estado nutricional de ratos (PLAGEMANN et al.,
2000; LOSS et al., 2007; MIÑANA-SOLIS e ESCOBAR, 2008; RODRIGUES et al.,
2012). Observamos que o presente protocolo de restrição proteica/recuperação
resultou em uma redução consistente da massa corporal dos ratos R-RP durante o
período avaliado. A redução da massa corporal devido à restrição de nutrientes
durante as fases iniciais de desenvolvimento já fora reportada na literatura por outros
autores (HUIZINGA et al., 2000; MIÑANA-SOLIS e ESCOBAR, 2008). Por outro lado,
o mesmo não foi observado em nosso estudo prévio realizado em animais
recuperados de um protocolo mais severo de restrição proteica (ingestão de dieta
contendo apenas 6% de proteína) (SÁ et al., 2014). Tal discrepância pode sugerir que
o processo de recuperação do peso corporal de animais alimentados com dieta com
8% de proteínas pode ser mais longo do que o de ratos alimentados com dieta
contendo apenas 6% ou que o presente protocolo de restrição proteica (8%) induz a
diferentes rearranjos compensatórios no metabolismo dos animais. Observamos que
o presente protocolo alimentar também induziu uma redução transitória e voluntária
P á g i n a | 51
da quantidade de calorias ingeridas durante a fase de restrição. Isto porque os valores
de ingestão de ração, quando expressados em proporção a massa corporal, se
apresentaram reduzidos no 30º dia no grupo R-RP. No entanto, os mecanismos que
explicam este comportamento permanecem desconhecidos.
Um estudo recente realizado por Sant’ Helena e colaboradores (2014)
demonstrou que ratos alimentados com dieta hipoproteica (8%), a partir do desmame
até o nono mês de idade exibiam taquicardia de repouso a qual era observada no 3º
(início do período de análise), 4º e 5º meses de idade (SANT’HELENA et al., 2014).
Nossos dados sugerem que a taquicardia induzida por este tipo de dieta pode ocorrer
até mesmo antes do 3º mês idade. Isto porque os procedimentos experimentais nos
animais RP foram conduzidos logo após o 35º dia pós-desmame e, desta forma, é
aceitável presumir que a taquicardia de repouso pode estar ligada principalmente a
anormalidades autonômicas, como um desequilíbrio simpato-vagal, ou cardíacas
geradas pela restrição proteica no período antecedente ao 35º dia pós-desmame,
como documentado por outros estudos realizados em ratos submetidos a restrição
proteica mais severa (MARTINS et al., 2011; RODRIGUES-BARBOSA et al., 2012;
PENITENTE et al., 2013; SILVA et al., 2015). Nossos resultados também mostraram
que os animais recuperados (R-RP) exibiram taquicardia de repouso em relação ao
grupo C105, sugerindo que essa anormalidade funcional gerada pela dieta hipoproteica
(8%) permanece após a recuperação da restrição proteica.
O bloqueio seletivo dos receptores AT1 por meio da injeção intravenosa de
losartan (20 mg/kg) aumentou a frequência cardíaca de repouso em todos os grupos
experimentais do presente estudo. Este efeito foi acompanhado por uma redução de
aproximadamente 10 mmHg na PAM nos animais C105. Estudos realizados por
Davisson e colaboradores demonstraram que o losartan, na dose de 20 mg/kg (i.v.),
foi capaz de reduzir aproximadamente 15 mmHg na PAM em camundongos
normotensos (DAVISSON et al., 1999). Portanto, nossos resultados estão
consistentes com o que é reportado pela literatura para animais controles. Por outro
lado, um certo cuidado deve ser exercido para a interpretação desses resultados,
porque nenhuma diferença na PAM foi observada nos animais C35, RP ou R-RP,
indicando que a hipotensão induzida pelo losartan pode depender da idade ou do
estado nutricional dos animais. Sugerimos também que o incremento na frequência
P á g i n a | 52
cardíaca após a administração de losartan possa ser resultado de um ajuste
compensatório no débito mediado pelo barorreflexo em função da vasodilatação dos
leitos de resistência, na tentativa de manter os níveis de pressão arterial.
O aumento da variabilidade da pressão arterial tem sido amplamente reportado
como um prognostico de doenças cardiovasculares. (VERDECCHIA et al., 1996;
MIAO et al., 2006; TATASCIORE et al., 2007; PIERDOMENICO et al., 2009). Nós
observamos que os animais R-RP apresentaram níveis elevados da variabilidade da
PAS (como notado pelas análises no domínio do tempo) quando comparados aos
C105. Observações similares foram feitas por estudos prévios conduzidos em ratos
submetidos a restrição proteica (6%) durante 35 dias após o desmame (OLIVEIRA et
al., 2004). No entanto, nós não detectamos diferenças na variabilidade da PAS dos
animais RP, sugerindo que a modificação do comportamento da pressão arterial nos
animais R-RP poderia ser resultado do processo de recuperação e à readaptação da
ingestão de níveis normais de proteínas na dieta.
O presente estudo não identificou mudanças na sensibilidade do barorreflexo
espontâneo em nenhum grupo experimental durante a condição basal. Desta forma,
nossos resultados sugerem que o presente protocolo de restrição
proteica/recuperação, no ponto temporal em que avaliamos, afetaria de maneira
seletiva a atividade do quimiorreflexo arterial, sem alterar o ganho barorreflexo
espontâneo. Mostramos recentemente que ratos recuperados de um protocolo de
restrição proteica pós-desmame mais severo (6%) tiveram um aumento no ganho do
barorreflexo espontâneo (SÁ et al., 2014). Corroborando estes dados, estudos
anteriores demonstraram que a ativação do barorreflexo por injeção em bolus de
fenilefrina (0,25 a 4,0 μg/kg, i.v.) gerava repostas bradiarrítmicas que eram mais
intensas em animais submetidos a restrição proteica (6%) pós-desmame em relação
aos animais normonutridos (LOSS et al., 2007). Em adição, foi demonstrado que ratos
submetidos ao mesmo protocolo de restrição proteica (6%) exibiam diferentes padrões
de ativação neuronal em núcleos bulbares (medido por expressão de proteína cFos)
em resposta a estimulação intermitente do barorreflexo, indicando a participação do
sistema nervoso central na mediação das anormalidades barorreflexas em ratos sob
restrição proteica severa (6% de proteína na dieta) (RODRIGUES-BARBOSA et al.,
2012). Em conjunto, os resultados indicam as alterações no barorreflexo em ratos
P á g i n a | 53
expostos à restrição proteica nas fases iniciais da vida, mesmo depois de
recuperados, pode depender da severidade da restrição em si, sugerindo mecanismos
adaptativos distintos com consequência ou sequelas distintas.
Os resultados também mostraram que o losartan reduziu a variabilidade do IS
e a SBR espontâneo no grupo R-RP, sugerindo que a sinalização por angiotensina II
endógena via receptores AT1 pode estar envolvida com a atividade do barorreflexo
nos animais R-RP. O losartan também diminuiu a SBR espontâneo no grupo RP. De
forma conjunta, estes achados suportam a ideia de que o envolvimento da
angiotensina II na manutenção do ganho do barorreflexo em ratos desnutridos pode
não ser revertido pela recuperação da restrição proteica. É possível que tal
observação seja resultado de uma complexa interação entre angiotensina II,
receptores AT1 e o processamento central do barorreflexo, uma vez que a habilidade
deste fármaco em atravessar a barreira hematoencefálica em doses menores a
utilizada no presente estudo já fora demonstrada anteriormente (ZHUO et al., 1994).
Por outro lado, o conhecimento a respeito do papel dos receptores AT1 centrais na
atividade do barorreflexo é limitado e os estudos têm fornecido resultados conflituosos
(PATON e KASPAROV, 1999; WANG et al., 2007). Todavia, não podemos descartar
a possibilidade de a angiotensina II, produzida centralmente, desempenhar um papel
maior no processamento central do barorreflexo nos animais RP e R-RP comparados
a seus grupos controles.
Os resultados da análise espectral revelaram que os componentes VLF e LF
da variabilidade da PAS se apresentaram elevados nos animais R-RP, o que poderia
sugerir um aumento da resistência vascular periférica (LANGAGER et al., 2007;
STAUSS, 2007). Ambos os componentes VLF e LF da variabilidade da PAS
correspondem a flutuações no tônus vasomotor que são induzidas por fatores
miogênicos (formando as ondas de VLF) ou pela atividade do sistema nervoso
simpático (ondas LF) (LANGAGER et al., 2007; STAUSS, 2007; ABDALA et al., 2012).
Sabe-se que as catecolaminas circulantes e a angiotensina II são os principais fatores
miogênicos ligados às bandas VLF (LANGAGER et al., 2007). O losartan normalizou
o componente VLF da variabilidade da PAS nos animais R-RP, sugerindo que um
aumento da ação da angiotensina II ou mesmo nos seus níveis plasmáticos poderiam
provocar aumentos relevantes na resistência vascular periférica neste grupo, apesar
P á g i n a | 54
dos valores de pressão arterial se apresentarem normais. Sugerimos que mecanismos
vasculares angiotensinérgicos são alvos mais susceptíveis para adaptações
fisiológicas durante a restrição proteica e o retorno à ingestão de uma dieta com
conteúdo normal de proteínas poderia não restaurar completamente sua função
normal. De fato, mudanças em mecanismos angiotensinérgicos induzidos por
diferentes modelos de desnutrição têm sido já demonstradas por outros autores
(LANGLEY-EVANS e JACKSON, 1995; WOODS et al., 2001; SAHAJPAL e ASHTON,
2005). Especificamente em modelos de desnutrição gestacional, estas alterações
estão correlacionadas com a manutenção da hipertensão arterial em ratos adultos,
sendo esta hipertensão dependente de angiotensina II visto que o tratamento crônico
com captopril é capaz de revertê-la (LANGLEY-EVANS e JACKSON, 1995).
A relação entre desnutrição proteica (6%) pós-desmame e a elevação da
magnitude das respostas cardiovasculares geradas pela ativação do quimiorreflexo
arterial foi demonstrada previamente por estudos conduzidos por Penitente e
colaboradores (PENITENTE et al., 2007). Os autores atribuíram este achado a três
mecanismos potenciais: i) falha na síntese de oxido nítrico, ii) redução
neurotransmissores em sinapses das vias do quimiorreflexo ou iii) devido ao aumento
dos níveis teciduais e plasmáticos de angiotensina II. Neste modelo de restrição
proteica (6% de proteína na dieta), a recuperação não foi capaz de normalizar as
respostas do quimiorreflexo (SÁ et al., 2014). Os dados do presente estudo, mesmo
utilizando um modelo de restrição mais brando, reproduz, apesar das peculiaridades,
estas observações, especialmente porque nós demonstramos que a magnitude das
respostas pressóricas e bradiarrítmicas do quimiorreflexo são maiores nos animais R-
RP do que nos C105. Estes dados sugerem que vias simpáto-excitatórias e
parassimpáto-excitatórias ativadas pelo quimiorreflexo arterial poderiam estar mais
sensíveis ou excitáveis em animais R-RP.
Evidências experimentais mostram que o aumento da expressão de receptores
AT1 no corpúsculo carotídeo está associada com o aumento da atividade aferente dos
quimiorreceptores em ratos submetidos a hipóxia crônica (LEUNG et al., 2000;
LEUNG et al., 2003). No presente estudo, o losartan (20 mg/kg, i.v.) não produziu
nenhum efeito na curva dose-resposta para o KCN em nenhum grupo experimental,
sugerindo que os efeitos imediatos induzidos pela sinalização da angiotensina II via
P á g i n a | 55
receptores AT1 podem não estar associados com a exacerbação das respostas
pressóricas e bradiarrítmicas do quimiorreflexo nos animais R-RP como sugerido
pelos dados de animais sob hipóxia crônica intermitente.
A restrição proteica durante o desenvolvimento perinatal eleva o VE e as
respostas ventilatórias geradas pela ativação do quimiorreflexo arterial por hipóxia
(ALVES et al., 2014). No presente estudo, VE foi maior no grupo R-RP em relação ao
grupo C105, mas nenhuma diferença foi detectada na taquipnéia induzida pela ativação
do quimiorreflexo pelo KCN (60 e 80 µg/kg). Nossos resultados podem indicar apenas
que as mudanças respiratórias induzidas pelo presente protocolo de
restrição/recuperação podem não depender das alterações da sensibilidade do
quimiorreflexo. Se o aumento da ventilação durante o repouso é consequência de
rearranjos de vias neuronais que controlam o sistema respiratório é algo que ainda
precisa ser confirmado. Embora a fR de repouso do grupo R-RP tenha se tornado maior
do que a do grupo C105 após o losartan, nenhuma diferença foi notada quando
analisamos o efeito da droga de forma individual no grupo R-RP ou no grupo C105,
sugerindo que as anormalidades no controle respiratório observadas nos animais R-
RP podem não estar associadas diretamente com os efeitos da sinalização dos
receptores AT1.
Alguns estudos defendem a ideia de que o controle central respiratório pode
ser afetado pela desnutrição durante as fases iniciais do desenvolvimento, o que pode
levar a transtornos fisiológicos no controle da respiração (GAULTIER e GALLEGO,
2005; ALVES et al., 2014). O núcleo do trato solitário (NTS) é a primeira estação
sináptica onde os impulsos aferentes provenientes do corpúsculo carotídeo são
processados (MACHADO et al., 1997; ALVES et al., 2014). Sugere-se que o L-
glutamato seja o principal neurotransmissor excitatório liberado no NTS pelos
impulsos aferentes dos quimiorreceptores, e este neurotransmissor pode produzir
diferentes respostas fisiológicas, dependendo do tipo de receptor ou neurônio pós-
sináptico ao qual ele se liga (VARDHAN et al., 1993; MACHADO et al., 1997). Uma
vez que o aumento da ventilação basal nos animais R-RP não foi acoplado a
mudanças na resposta taquipnéica pelo KCN, nós hipotetizamos que os ratos R-RP
podem exibir: i) diferentes configurações neuronais em regiões do sistema nervoso
central responsáveis pelo controle da ventilação; ii) uma atividade glutamatérgica
P á g i n a | 56
maior em áreas responsáveis pelo processamento ventilatório. A segunda hipótese
apresenta precedentes na literatura uma vez que estudos prévios demonstraram que
a redução da neurotrasmissão glutamatérgica no NTS, pela microinjeção de ácido
quinurênico, produz uma redução significativa na frequência e na duração da atividade
do nervo frênico no repouso, sem alterar a resposta taquipnéica pela ativação do
quimiorreflexo (COSTA-SILVA et al., 2010). Por esta razão, nós sugerimos que o
aumento da ventilação de repouso nos animais R-RP poderia estar correlacionado
com um possível aumento da sinalização glutamatérgica no bulbo, especialmente nas
vias relacionadas com o “drive” ventilatório. No entanto, estudos futuros serão
necessários para melhor entender a fisiologia envolvida nas anormalidades
respiratórias observadas nos animais R-RP e para provar se estas alterações
poderiam estar, de fato, relacionadas com o aumento da sinalização glutamatérgica
no bulbo.
Em suma, este modelo de restrição proteica (8%) pós-desmame seguida pela
recuperação eleva a FC de repouso, a variabilidade da pressão arterial, o volume-
minuto respiratório e a magnitude das respostas cardiovasculares ativadas pelo
quimiorreflexo arterial em ratos. Este estudo destaca o fato de que o bloqueio agudo
dos receptores AT1 não é capaz de normalizar estes parâmetros, sugerindo que as
mudanças na sinalização de mecanismos angiotensinérgicos podem não estar
envolvidos diretamente as anormalidades observadas no controle cardiorrespiratório.
Capítulo II
O treinamento físico crônico reduz a sensibilidade
do quimiorreflexo arterial e a frequência cardíaca de
repouso de ratos recuperados da restrição proteica
P á g i n a | 58
1. Introdução
A prática regular de exercícios físicos tem sido amplamente reportada como
uma importante medida não farmacológica para mitigar e prevenir doenças
cardiovasculares (VÉRAS-SILVA et al., 1997; RONDON e BRUM, 2003; MONTEIRO
et al., 2007; LATERZA et al., 2008; CALVERT e LEFER, 2013). Estudos realizados
em humanos e em animais mostraram que o treinamento físico crônico de intensidade
moderada promove relevantes adaptações hemodinâmicas e histológicas que incluem
o remodelamento tecidual do coração e também a melhoria do controle autônomo
cardiovascular, proporcionando aumento da capacidade contrátil do coração, redução
da frequência cardíaca de repouso e também redução da pressão arterial em casos
de hipertensão (BRUM et al., 2004; MARTINS-PINGE, 2011; CRUZ et al., 2013;
D’SOUZA et al., 2014; TOTOU et al., 2015).
Dados de nossos estudos revelaram que ratos submetidos a um protocolo de
restrição proteica pós-desmame, seguido de um protocolo de recuperação, exibem
níveis elevados de FC de repouso, variabilidade da pressão arterial e magnitude das
respostas cardiovasculares evocadas pelo quimiorreflexo arterial (dados ainda não
publicados, referentes ao capítulo I). Embora não haja evidencias mostrando que o
treinamento físico poderia contribuir para a normalização do funcionamento do
quimiorreflexo neste modelo experimental, estudos conduzidos em animais com
insuficiência cardíaca crônica (CHF) mostraram que a hipersensibilidade do
quimiorreflexo, também notada na CHF, é completamente normalizada pelo
treinamento físico (ZUCKER et al., 2004; LI et al., 2008)
Ainda que a relação entre exercício físico e o quimiorreflexo arterial tenha sido
pouco explorada, algumas evidências sugerem que as vias autonômicas ativadas pelo
quimiorreflexo durante o treinamento físico são fundamentais para a mediação da
plasticidade de neurônios oxitocinérgicos pré-autonômicos no núcleo paraventricular
do hipotálamo (PVN), os quais parecem estar ligados com o aumento da atividade do
sistema nervoso parassimpático e, consequentemente, com a gênese da bradicardia
de repouso em animais normotensos e hipertensos (CRUZ et al., 2013). Em adição,
estudos têm fornecido resultados que ressaltam a habilidade do treinamento físico
crônico em modular a sensibilidade do quimiorreflexo arterial, muito embora,
P á g i n a | 59
resultados distintos ligados ao modelo experimental e ao método de ativação dos
quimiorreceptores tenham sido documentados. Harthmann e colaboradores
mostraram que a ativação dos quimiorreceptores de ratos saudáveis por doses
crescentes de KCN (60, 80 e 100 µg/Kg) gerava respostas pressóricas e
bradiarrítmicas que eram mais intensas em animais treinados em relação aos
sedentários, sugerindo que a sensibilidade dos componentes para- e
simpatoexcitatório do quimiorreflexo arterial se torna elevada pelo treinamento físico
(HARTHMANN et al., 2007). No entanto, experimentos realizados em coelhos
treinados, também saudáveis, não observaram diferenças em relação aos sedentários
na frequência de disparos das fibras aferentes do corpúsculo carotídeo, na atividade
do nervo simpático renal e na ventilação durante a ativação dos quimiorreceptores
carotídeos por hipóxia (ZUCKER et al., 2004; LI et al., 2008).
Como mencionado anteriormente, diferente do que foi reportado em animais
controles saudáveis (HARTHMANN et al., 2007), o treinamento físico crônico reduz a
sensibilidade do quimiorreflexo arterial de animais com CHF (LI et al., 2008). Foi
demonstrado que habilidade do treinamento físico em reduzir a magnitude da resposta
simpatoexitatória à estimulação dos quimiorreceptores neste modelo experimental
está ligada com o aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal
(nNOS) no corpúsculo carotídeo (CC), a qual exerceria um papel fundamental na
redução da atividade elétrica aferente do CC (LI et al., 2008). De fato, estudos
mostraram que a administração de inibidores de isoformas da óxido nítrico sintase
(NOS) aumentava a atividade elétrica dos quimiorreceptores carotídeos por meio da
ativação de correntes de Ca2+ (elevando a [Ca2+]i), enquanto que essa reação era
claramente deprimida por meio de doadores da NOS (PRABHAKAR et al., 1993;
CHUGH et al., 1994; WANG et al., 1994).
Nossos resultados também apontaram que a restrição proteica/recuperação
eleva o envolvimento dos receptores AT1 na manutenção da sensibilidade do
barorreflexo espontâneo e na regulação do tônus vasomotor, sugerindo que a
angiotensina II poderia exercer algum papel diferenciado no controle autonômico
cardiovascular destes animais. A habilidade do treinamento físico crônico em
modificar o envolvimento da angiotensina II na regulação central e periférica do
sistema cardiovascular tem sido mostrada em estudos prévios conduzidos em
P á g i n a | 60
diferentes modelos experimentais (BECKER et al., 2005; LI et al., 2008). Ratos
normotensos treinados apresentam um aumento da resposta pressórica produzida em
resposta à microinjeção de angiotensina II no núcleo rosto-ventrolateral do bulbo
(RVLM), o que tem sido entendido como uma resposta à redução da angiotensina II
endógena e ao aumento da expressão de receptores AT1 no RVLM (BECKER et al.,
2005). Em contrapartida, foi demonstrado que o treinamento físico crônico também é
capaz de normalizar a alta expressão de receptores AT1 na aorta de animais com CHF
(LI et al., 2008). De forma conjunta, estes achados indicam que as adaptações
humorais induzidas pelo treinamento físico crônico podem ser acompanhadas por
uma complexa dissensão entre a responsividade central e periférica da angiotensina
II. Contudo, se tais adaptações poderiam alterar o envolvimento dos receptores AT1
na regulação do barorreflexo e na responsividade do quimiorreflexo arterial de animais
recuperados de restrição proteica ainda não é estabelecido na literatura e embasado
por evidências experimentais.
Diante das evidências mencionadas neste capítulo, aventamos a hipótese de
que o treinamento físico crônico poderia normalizar a sensibilidade do quimiorreflexo
arterial, assim como abolir envolvimento dos receptores AT1 na manutenção do ganho
do barorreflexo e na regulação autonômica cardiovascular de animais recuperados da
restrição proteica pós-desmame.
P á g i n a | 61
2. Objetivos
2. 1. Objetivo Geral
Avaliar o papel do treinamento físico sobre os mecanismos de controle
cardiovascular que envolvem angiotensina II e o quimiorreflexo arterial em animais
recuperados da restrição proteica pós desmame.
2. 2. Objetivos específicos
Avaliar, por meio da análise espectral, a participação do sistema nervoso
autônomo na regulação cardiovascular de ratos recuperados treinados.
Avaliar o efeito do bloqueio sistêmico de receptores AT1 sobre a regulação
autonômica cardiovascular em ratos recuperados treinados.
Quantificar as respostas pressóricas e bradiarrítmicas do quimiorreflexo em ratos
recuperados treinados.
Avaliar o efeito do bloqueio sistêmico de receptores AT1 sobre o componente
cardiovascular do quimiorreflexo em ratos recuperados treinados.
P á g i n a | 62
3. Metodologia
Ratos Fischer com 21 dias de idade (pós desmame) foram obtidos do Centro
de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) em
conformidade com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Uso Animal
(protocolo nº 2013/24). Os animais foram gerados e mantidos no CCA com ração e
água ad libitum, ciclo claro-escuro de 12h e temperatura média de 23°C, até a
realização dos procedimentos experimentais. Animais individuais dentro de uma
mesma gaiola foram distintos uns dos outros por marcação da pelagem com solução
1% de ácido pícrico.
3. 1 Grupos Experimentais
Os animais foram divididos randomicamente nos seguintes grupos:
recuperados sedentários (R-RP S), que foram alimentados com dieta hipoproteica (8%
de proteína) durante 35 dias e, em seguida, com dieta normoproteica (20%) por 70
dias (n=10); recuperados treinados (R-RP T), que passaram pelo mesmo protocolo
alimentar do grupo anterior, mas com a adição de um protocolo de treinamento físico
durante as 8 semanas finais do período de recuperação (n=8). Os respectivos grupos
controles receberam apenas dieta normoproteica por 105 dias e foram mantidos como
sedentários (C105 S, n=10) ou treinados (C105 T, n=7). As dietas hipoproteica e
normoproteica foram mantidas isocaloricas (16,52kJ/g) por meio da reposição de
caseína por amido (tabela 1).
3. 2. Protocolo de treinamento físico
O programa de treinamento físico de natação com intensidade progressiva foi
realizado durante oito semanas, cinco sessões por semana, cumprindo as normativas
apresentadas abaixo. O treinamento foi realizado em baldes plásticos com dimensões
de 50 cm de diâmetro e 90 cm de profundidade, contendo água pré-aquecida a 30ºC.
P á g i n a | 63
Em cada balde foram mantidos um número máximo de três animais durante as
sessões de treinamento.
1ª semana: o tempo de exercício variou de forma crescente ao longo da semana,
sendo que no primeiro dia os animais se exercitaram durante 10 minutos e, nos dias
seguintes, este tempo foi progressivamente aumentado (10 minutos por dia) até atingir
50 minutos. Não foi adicionado carga extra corporal.
2ª semana: o tempo de exercício foi mantido em 60 minutos por sessão durante toda
a semana, sendo que este tempo foi prescrito em 2 séries de 30 minutos (cumprindo
um intervalo de 15 minutos entre cada série). Não foi adicionado carga extra corporal.
3ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 1% do peso corporal foi anexada
à cauda.
4ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 1,5% do peso corporal.
5ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 2% do peso corporal.
6ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 2,5% do peso corporal.
7ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 3% do peso corporal.
8ª semana: 2 séries de 30 minutos. Carga extra de 3,5% do peso corporal.
3. 3. Procedimento cirúrgico
Ao final do período de tratamento destinado a cada grupo (35 ou 105 dias) e,
dentro de um período de 3 dias, os animais foram anestesiados com injeção
intraperitoneal de uma mistura de quetamina (80mg/kg) com xilazina (7mg/kg).
Cânulas de polietileno foram implantadas na artéria e na veia femorais esquerdas para
mensuração da pressão arterial pulsátil (PAP) e para administração de drogas,
respectivamente, em conformidade com procedimentos descritos previamente
(CARDOSO et al., 2009). Para a confecção das cânulas, foram utilizados tubos de
P á g i n a | 64
polietileno PE-50 (com dimensões ajustadas de acordo com o tamanho do animal)
previamente soldados a tubos de polietileno PE-10 de 1 cm.
Em suma, a cirurgia consistiu de uma incisão ventral da pata traseira esquerda
onde a artéria e a veia foram dissecadas e cateterizadas utilizando-se a porção PE-
10 das cânulas. As extremidades PE-50 foram transpassadas sub-cutaneamente na
região lateral, com o auxílio de um trocater, para a cintura escapular e exteriorizadas
no dorso, próximo ao pescoço. Após a cirurgia, analgésico (cetoprofeno, 4mg.kg−1,
0.1mL intramuscular) e antibióticos [benzilpenicilina benzatina (600.000 UI),
benzilpenicilina procaína (300.000 UI), benzilpenicilina potássio (300.000 UI) e
estreptomicina sulfato (500 mg) 0,1mL subcutâneo] foram administrados. Cada animal
se recuperou da cirurgia em gaiolas individuais por um período de 48 horas com livre
acesso a água e comida.
3. 4. Procedimento de aquisição dos dados cardiovasculares
Findadas as 48 horas de recuperação da cirurgia, os animais foram levados à
sala de registro e ali permaneceram por pelo menos uma hora para adaptação às
condições ambientais do laboratório. Imediatamente antes do início do registro, 0,1
mL de uma solução de heparina em salina isotônica (1000 UI/mL) foi injetada na
cânula arterial (pela extremidade do PE50 exteriorizada) para evitar a formação de
coágulos durante o registro. A cânula arterial foi conectada a um sistema “spin”,
desenvolvido e construído pelo próprio laboratório, e este a um transdutor de pressão
(MLT0699) ligado a um sistema digital de aquisição de sinais biológicos PowerLab
(ADInstruments Pty Ltd, Austrália) (figura 3).
Os dados de pressão arterial foram aquisitados pelo transdutor de pressão e
pré-amplificados por um pré-amplificador (BridgeAmp). Os dados analógicos foram
convertidos a variáveis discretas por um conversor analógico para digital
(ADInstruments Pty Ltd, Austrália). Os dados foram registrados pelo software LabChar
7 for Windows e estocados em arquivos individuais para cada animal. A amplitude
(resolução espacial) da janela de digitalização foram configurados para 20 mV e os
dados foram digitalizadas com resolução temporal de 1 ms (1000 Hz).
P á g i n a | 65
3. 5. Administração de drogas
Doses de cianeto de potássio (KCN - 20, 40, 60, 80 e 160 μg/kg), foram
randomicamente injetadas intravenosamente (i.v.) para a estimulação das respostas
cardiovasculares à ativação dos quimiorreceptores arteriais. As doses de KCN foram
baseadas em nosso estudo prévio (SÁ et al., 2014). Um intervalo mínimo de 10
minutos foi respeitado entre cada injeção. A estimulação do quimiorreflexo foi iniciada
60 minutos antes (basal) e após 90 minutos do bloqueio dos receptores AT1 por meio
da administração periférica de losartan (20 mg/Kg, i.v.). Os protocolos estão
sumariados na figura 5. A. As drogas foram preparadas usando salina tamponada com
fosfato (PBS), pH 7,20 como veículo. O volume injetado para cada droga variou entre
0,08 a 0,12 mL (para KCN) e 0,2 a 0,4 mL (para losartan), de acordo com o peso
corporal de cada rato.
3. 6. Análise dos parâmetros cardiovasculares
A pressão arterial média (PAM) e a frequência cardíaca (FC) foram registrados
durante o basal de forma continua por um período de 75 minutos após 15 minutos de
adaptação. Após o bloqueio dos receptores AT1, estas variáveis também foram
registradas por um período de 75 minutos após 15 minutos da injeção de losartan. A
sensibilidade do barorreflexo (SBR) espontâneo foi analisada por meio do método
descrito por Parati e colaboradores (PARATI et al., 1988), e reportado por nós
previamente (SÁ et al., 2014). O barorreflexo espontâneo foi analisado utilizando-se
seguimentos estáveis de registro da PAP que apresentavam janela temporal mínima
de 40 minutos. As respostas cardiovasculares geradas pela estimulação do
quimiorreflexo foram quantificadas detectando-se o pico máximo de variação da PAM
e da FC como resultado das injeções de KCN. A análise do quimiorreflexo foi iniciada
60 minutos antes (basal) e após 90 minutos do bloqueio dos receptores AT1.
P á g i n a | 66
3. 7. Análise espectral
A variabilidade no domínio da frequência da pressão arterial sistólica (PAS) e
do intervalo sistólico (IS) foi avaliada pela análise espectral. Para tanto, sequências
de valores consecutivos de PAS e IS foram extraídos de segmentos de no mínimo 40
minutos do registro da PAP e analisados pelo software CardioSeries v2.4. As séries
temporais da pressão arterial sistólica (PAS) e do intervalo sistólico (IS) foram
redimensionadas para 10 Hz, dividas em segmentos contínuos de 512 valores e
sobrepostos a 50%. Os espectros da PAS e do IS foram calculados usando o algoritmo
transformada rápida de Fourier (FFT). Três componentes oscilatórios majoritários
foram observados a partir do espectro: bandas de muito baixa frequência (VLF; 0 a
0,20 Hz), de baixa frequência (LF; 0,20 a 0,75 Hz) e de alta frequência (HF; 0,75 a
3,00 Hz). As potências máximas dessas bandas foram comparadas entre os grupos.
A análise espectral foi realizada durante o basal e 15 minutos após a injeção de
losartan.
3. 8. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 6.01 for
Windows. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média
(SEM), e as comparações entre basal e após losartan foram feitas utilizando a análise
de variância (ANOVA) de duas vias, seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak. As
comparações entre animais sedentários e treinados foram feitas utilizando ANOVA de
uma via, seguida do teste de Tukey. Dados foram considerados estatisticamente
consideráveis quando o valor de p foi menor do que 5% (p<0.05).
P á g i n a | 67
4. Resultados
4. 1. Efeito do treinamento físico sobre a pressão arterial e frequência cardíaca
Os valores de PAM não foram diferentes entre os grupos R-RP S, R-RP T e
seus respectivos grupos controles, C105 S e C105 T (figura 14. A). Os animais R-RP S
apresentaram níveis elevados de FC de repouso em relação ao grupo C105 S [332 ± 7
bpm (C105 S) e 371 ± 10 bpm (R-RP S) P = 0,0349] (figura 14. B). No entanto, o mesmo
não foi observado entre os grupos R-RP T e C105 T [326 ± 12 bpm (C105 T) e 332 ± 11
bpm (R-RP T)]. Animais R-RP T apresentaram níveis reduzidos de FC de repouso em
relação aos animais R-RP S [371 ± 10 bpm (R-RP S) e 332 ± 11 bpm (R-RP T) P =
0,0481].
P á g i n a | 68
Figura 14. O treinamento físico normaliza a frequência cardíaca de animais recuperados. Pressão
arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) de animais R-RP S, R-RP T e seus respectivos
grupos controles (C105 S e C105 T). Os resultados foram representados como média ± SEM. *P <
0,05 comparado controle normonutrido; #P < 0,05 comparado com sedentário. ANOVA de uma via
seguida pelo teste de Tukey.
FC
(bp
m)
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0#
S e d e n tá rio s T re in a d o s
*
PA
M(m
mH
g)
0
5 0
1 0 0
1 5 0
C 1 0 5 S (n = 1 0 )
R -R P S (n = 1 0 )
C 1 0 5 T (n = 7 )
R -R P T (n = 8 )
(A )
(B )
P á g i n a | 69
4. 2. Efeito do treinamento físico sobre a sensibilidade do barorreflexo
espontâneo e sobre a variabilidade da PAS e do IS no domínio do tempo
A sensibilidade do barorreflexo (SBR) espontâneo não foi diferente entre os
grupos R-RP S, R-RP T e seus respectivos grupos controles (tabela 3). A variabilidade
da PAS foi maior nos ratos R-RP S em relação aos ratos C105 S [27,7 ± 2,8 mmHg2
(C105 S) e 47,2 ± 8 mmHg2 (R-RP S) P = 0,0408]. No entanto, nenhuma diferença foi
encontrada entre os grupos R-RP T e C105 T. Além disso, a variabilidade da PAS foi
menor no grupo R-RP T em relação ao grupo R-RP S [47,2 ± 8 mmHg2 (R-RP S) 20,2
± 3 mmHg2 (R-RP T) P = 0,0050]. A variabilidade do IS também foi menor no grupo
R-RP T em relação ao grupo R-RP S [22,5 ± 6 mmHg2 (R-RP S) 3,8 ± 1 mmHg2 (R-
RP T) P = 0,0269].
P á g i n a | 70
C105 S (n=10) R-RP S (n=10) C105 T (n=7) R-RP T (n=8)
Variância, PAS (mmHg2) 27 ± 2 47 ± 8* 19 ± 2 20 ± 3
#
Variância, IS (ms2) 11 ± 3 22 ± 6 4 ± 1 3 ± 1
#
SBR (ms/mmHg) 0.42 ± 0.03 0.46 ± 0.07 0.528 ± 0.1 0.525 ± 0.1
Tabela 3. O treinamento físico normaliza a variabilidade da pressão arterial sistólica de animais
recuperados. PAS: Pressão arterial sistólica; IS: intervalo sistólico. Valores foram representados
como média ± SEM. *P < 0,05 comparado controle normonutrido; #P < 0,05 comparado com
sedentário. ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey.
P á g i n a | 71
4. 3. Efeito do treinamento físico sobre a variabilidade do IS no domínio da
frequência
A potência das bandas VLF, LF e HF do espectro do IS não foram diferentes
entres os grupos R-RP S e C105 S [VLF: 0,38 ± 0,08 ms2/Hz (C105 S) e 0,67 ± 0,14 ms2
(R-RP S)]; [LF: 0,35 ± 0,12 ms2 (C105 S) e 0,75 ± 0,21 ms2 (R-RP S)] e [HF: 0,87 ±
0,34 ms2 (C105 S) e 1,27 ± 0,2 ms2 (R-RP S)] e também entre os grupos R-RP T e C105
T [VLF: 0,54 ± 0,18 ms2 (C105 T) e 0,51 ± 0,13 ms2 (R-RP T)]; [LF: 0,52 ± 0,15 ms2
(C105 T) e 0,33 ± 0,08 ms2 (R-RP T)] e [HF: 1 ± 0,3 ms2 (C105 T) e 0,57 ± 0,1 ms2 (R-
RP T)].
4. 4. Efeito do treinamento físico sobre a variabilidade da PAS no domínio da
frequência
Os animais R-RP S exibiram picos da potência das bandas VLF e LF elevados
em relação ao grupo C105 S [VLF: 5,33 ± 0,62 mmHg2 (C105 S) e 10,75 ± 1,92 mmHg2
(R-RP S) p = 0,0131] e [LF: 4,89 ± 0,71 mmHg2 (C105 S) e 11 ± 1,64 mmHg2 (R-RP S)
p = 0,0074]. Contudo, nenhuma diferença foi notada entre os grupos R-RP T e C105 T
[VLF: 6 ± 0,8 mmHg2 (C105 T) e 6,4 ± 0,8 mmHg2 (R-RP T)] e [LF: 7,6 ± 1,8 mmHg2
(C105 T) e 5,5 ± 0,8 mmHg2 (R-RP T)] (figura 15). O pico da potência das bandas HF
foi similar entre os grupos.
P á g i n a | 72
Figura 15. O treinamento físico normaliza a participação do sistema nervoso simpático e da
angiotensina II na regulação do tônus vasomotor de animais recuperados. Valores absolutos do
pico da potência das bandas de VLF, LF e HF do espectro da PAS dos animais R-RP S, R-RP T
e seus respectivos grupos controles (C105 S e C105 S). Os resultados foram representados como
média ± SEM. *P < 0,05 comparado controle normonutrido; #P < 0,05 comparado com sedentário.
ANOVA de uma via seguida pelo teste Tukey.
P á g i n a | 73
4. 5. Efeito do treinamento físico sobre a sensibilidade do quimiorreflexo
Os resultados apresentados na figura 16.A mostraram que a resposta pressora
(Δ PAM) evocada pela estimulação do quimiorreflexo arterial por KCN (60 µg/kg, i.v.)
foi maior em animais C105 T em relação aos animais C105 S [25 ± 5 mmHg (C105 S) e
45 ± 7 mmHg (C105 T) p = 0,0153]. Além disso, as respostas bradiarrítmicas (Δ FC)
ativadas pelas doses de 60, 80 e 160 µg/kg de KCN foram maiores no grupo C105 T
em relação ao grupo C105 S [60 µg/kg: -27 ± 9 FC (C105 S) e -166 ± 44 FC (C105 T)
p < 0,0001; 80 µg/kg: -66 ± 7 FC (C105 S) e -170 ± 27 FC (C105 T) p = 0,0005; 160
µg/kg: -120 ± 16 FC (C105 S) e -241 ± 8 FC (C105 T) p < 0,0001].
Os resultados apresentados na figura 16.B mostraram que as respostas
pressóricas evocadas pelas doses de 60 e 80 µg/kg de KCN se apresentaram
reduzidas no grupo R-RP T em relação ao grupo R-RP S [60 µg/kg: 45 ± 4 mmHg
(R-RP S) e 23 ± 6 mmHg (R-RP T) p = 0,0042; 80 µg/kg: 60 ± 6 mmHg (R-RP S) e
37 ± 6 mmHg (R-RP T) p = 0,0029]. A magnitude das repostas bradiarrítmicas não
foram diferentes entre os grupos R-RP S e R-RP T. As curvas dose-respostas para o
KCN foram similares entre os grupos R-RP T e C105 S (figura 16.B).
A resposta pressora evocada pela dose de 60 µg/kg de KCN foi maior em
animais R-RP S em relação aos animais C105 S [25 ± 5 mmHg (C105 S) e 45 ± 4
mmHg (R-RP S) p = 0,0442] (figura 16.C). Contudo, não foi observado diferença
significativa para a comparação realizada entre os grupos R-RP T e C105 T. Por outro
lado, a resposta bradiarrítmica evocada pela mesma dose KCN (60 µg/kg) foi
consideravelmente menor em animais R-RP T em relação aos animais C105 T S [-166
± 44 bpm (C105 T) e -44 ± 36 bpm (R-RP T) p = 0,0442]. As respostas bradiarrítmicas
ativadas pelas doses de 60, 80 e 160 µg/kg de KCN foram mais elevadas no grupo
C105 T em relação ao grupo C105 S [60 µg/kg: -27 ± 9 FC (C105 S) e -166 ± 44 FC
(C105 T) p < 0,0001; 80 µg/kg: -66 ± 7 FC (C105 S) e -170 ± 27 FC (C105 T) p = 0,0016;
160 µg/kg: -120 ± 16 FC (C105 S) e -241 ± 8 FC (C105 T) p = 0,0002].
P á g i n a | 74
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
F
C(b
pm
)
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
K C N (g /k g d e m a s s a c o rp o ra l)
P
AM
(mm
Hg
)
R -P R S (n = 1 0 ) C 1 0 5 S (n = 1 0 )
R -P R T (n = 8 )
#
#
(A )
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
K C N (g /k g d e m a s s a c o rp o ra l)
P
AM
(mm
Hg
)
C 1 0 5 T (n = 7 )
C 1 0 5 S (n = 1 0 )
#
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
K C N (g /k g d e m a s s a c o rp o ra l)
P
AM
(mm
Hg
)
C 1 0 5 T (n = 7 )
C 1 0 5 S (n = 1 0 )
#
R -R P S (n = 1 0 )
R -R P T (n = 8 )
*
#
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
F
C(b
pm
)
##
#
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
F
C(b
pm
)
##
#
*
(B ) (C )
Figura 16. A sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo arterial é aumenta em animais C105 T e reduzida em animais R-RP T.
Respostas pressóricas (Δ PAM) e bradiarrítmicas (Δ FC) evocadas pela estimulação do quimiorreflexo por KNC (20, 40, 60, 80 e 160 µg/kg de massa
corporal, i.v.) nos animais C105 S e C105 T (A), R-RP S e R-RP T (B) e combinados (C). Os resultados foram representados como média ± SEM. #P <
0,05 comparado com sedentário; *P < 0,05 comparado com controle normonutrido. ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak.
P á g i n a | 75
4. 6. Efeito do losartan sobre a pressão arterial e frequência cardíaca de ratos
treinados
A PAM não foi diferente entre os grupos R-RP T e C105 T no basal nem após o
a administração de losartan (figura 17. A). Contudo, o losartan (20 mg/kg, i.v.) reduziu
a PAM em animais R-RP T [117 ± 2 mmHg (R-RP T, basal) e 112 ± 1 mmHg (R-RP
T, pós-losartan) P = 0,0236], mas não em animais C105 T [112 ± 1 mmHg (C105 T,
basal) e 107 ± 2 mmHg (C105 T, pós-losartan)]. A FC também não foi diferente entre
os grupos R-RP T e C105 T durante o basal nem após a administração de losartan,
mas foi notado que o losartan produziu taquicardia em ambos os grupos: [326 ± 12
bpm (C105 T, basal) e 369 ± 15 bpm (C105 T, pós-losartan) P < 0,0001] e [332 ± 11 bpm
(R-RP T, basal) e 368 ± 11 bpm (R-RP T, pós-losartan) P = 0,0003] (figura 17. B).
4. 7. Efeito do losartan sobre a sensibilidade do barorreflexo espontâneo e sobre
a variabilidade da PAS e do IS no domínio do tempo de ratos treinados
Os resultados sumarizados na tabela 4 mostraram que a administração de
losartan não modificou a sensibilidade do barorreflexo espontâneo e a variabilidade
da PAS e do IS no domínio do tempo em animais C105 T e R-RP T.
P á g i n a | 76
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
2 0 m g /k g ( i.v .)
FC
(bp
m) **
**
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
C 1 0 5 T (n = 7 )
R -P R T (n = 8 )
2 0 m g /k g ( i.v .)
PA
M(m
mH
g)
**
(A )
(B )
Figura 17. Receptores AT1 participam na manutenção da pressão arterial em animais R-RP T.
Pressão arterial média (A) e frequência cardíaca (B) dos animais R-RP T (vermelho) e C105 T (preto).
As médias foram coletadas no basal e após administração de losartan (20mg/kg, i.v.). Dados foram
representados como média ± SEM. **P < 0,05 comparado com basal. ANOVA de duas vias seguida
do teste post-hoc de Holm-Sidak.
P á g i n a | 77
C105 T (n=7) R-RP T (n=8)
Basal Pós-losartan Basal Pós-losartan
Variância, PAS (mmHg2)
19 ± 2 23 ± 3 20 ± 3 18 ± 3
Variância, IS (ms2) 4 ± 1 3 ± 1 3 ± 1 1 ± 0,3
SBR espontâneo (ms/mmHg)
0,528 ± 0,09 0,528 ± 0,1 0,525 ± 0,1 0,362 ± 0,06
Tabela 4. Losartan não modifica a variabilidade no domínio do tempo da PAS, do IS e o ganho do
barorreflexo espontâneo em ratos treinados. PAS: Pressão arterial sistólica; IS: intervalo sistólico;
SBR: sensibilidade do barorreflexo. Valores foram representados como média ± SEM.
P á g i n a | 78
4. 8. Efeito do losartan sobre a variabilidade do IS no domínio da frequência
A potência das bandas VLF, LF e HF do espectro do IS não foram diferentes
entres os grupos R-RP T e C105 T no basal [VLF: 0,54 ± 0,18 ms2/Hz (C105 T) e 0,51 ±
0,13 ms2/Hz (R-RP T)]; [LF: 0,52 ± 0,15 ms2/Hz (C105 T) e 0,33 ± 0,08 ms2/Hz (R-RP
T)] e [HF: 1 ± 0,3 ms2/Hz (C105 T) e 0,57 ± 0,1 ms2/Hz (R-RP T)] nem após a
administração de losartan [VLF: 0,21 ± 0,07 ms2/Hz (C105 T) e 0,21 ± 0,06 ms2/Hz (R-
RP T)]; [LF: 0,27 ± 0,08 ms2/Hz (C105 T) e 0,27 ± 0,06 ms2/Hz (R-RP T)] e [HF: 0,65 ±
0,1 ms2/Hz (C105 T) e 0,63 ± 0,14 ms2/Hz (R-RP T)].
4. 9. Efeito do losartan sobre a variabilidade da PAS no domínio da frequência
Os resultados apresentados na figura 18 mostraram que a potência das bandas
VLF, LF e HF do espectro da PAS foram similares entre os grupos R-RP T e C105 T
no basal e após a administração de losartan. Contudo, foi observado que os animais
R-RP T apresentaram uma redução do pico da potência das bandas VLF em reposta
ao losartan [VLF: 6,4 ± 0,8 mmHg2 (R-RP T, basal) e 3,1 ± 0,8 mmHg2 (R-RP T, pós-
losartan) p = 0,0155] figura 18. A, e um aumento do pico da potência das bandas LF
[5,5 ± 0,7 mmHg2 (R-RP T, basal) e 8,5 ± 1,2 mmHg2 (R-RP T, pós-losartan) p =
0,0268, figura 18.B]. O losartan não modificou a potência das bandas HF em nenhum
grupo experimental.
P á g i n a | 79
Figura 18. Receptores AT1 participam na manutenção do tônus vasomotor em animais R-RP T. Valores
absolutos do pico da potência das bandas de VLF (A), LF (B) e HF (C) do espectro da PAS dos animais
R-RP T e C105 T. As médias foram coletadas no basal e após o losartan (20mg/kg, i.v.). Os resultados
foram representados como média ± SEM. **P < 0,05 comparado com basal. ANOVA de duas vias
seguida do teste post-hoc de Holm-Sidak.
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
2
4
6
8
C 1 0 5 T (n = 7 )
R -P R T (n = 8 )
2 0 m g /k g ( i.v .)
VL
F d
a P
AS
(mm
Hg
2)
**
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
5
1 0
1 5
2 0 m g /k g ( i.v .)
LF
da
PA
S
(mm
Hg
2) **
B a s a l P ó s -L o s a r ta n
0
1
2
3
4
2 0 m g /k g ( i.v .)
HF
da
PA
S
(mm
Hg
2)
(A )
(B )
(C )
P á g i n a | 80
4. 10. Efeito do losartan sobre a sensibilidade do quimiorreflexo arterial
Os resultados apresentados na figura 19 mostraram que a administração de
losartan não alterou de maneira significativa a magnitude das respostas pressóricas e
bradiarrítmicas evocadas pela estimulação do quimiorreflexo em animais C105 T e R-
RP T.
P á g i n a | 81
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
K C N (g /k g d e m a s s a c o rp o ra l)
P
AM
(mm
Hg
)
C 1 0 5 T (b a sa l)
R -R P T (b a s a l)
C 1 0 5 T (p ó s -lo s a rta n )
R -R P T (p ó s - lo s a rta n )
-3 0 0
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
0
4 0 6 0 8 0 1 6 0
F
C(b
pm
)
(A )
(B )
Figura 19. Losartan não modifica a sensibilidade do componente cardiovascular do quimiorreflexo
arterial em ratos treinados. Respostas pressóricas (A) e bradiarrítmicas (B) evocadas pela estimulação
do quimiorreflexo por KNC (20, 40, 60, 80 e 160 µg/kg de massa corporal, i.v.) nos animais R-RP T
(vermelho, n = 8) e C105 T (preto, n = 7). As médias foram coletadas na condição basal (linhas contínuas)
e após o losartan (linhas tracejadas). Os resultados foram representados como média ± SEM.
P á g i n a | 82
5. Discussão
O ponto de partida para nossa análise dos efeitos do treinamento físico foi a FC
basal de ratos dos grupos R-RP T e C105 T. Os resultados não revelaram diferença
significativa entre os valores médios obtidos a partir dos dois grupos, sugerindo que o
treinamento físico crônico foi eficaz em normalizar a FC de repouso dos ratos
recuperados. A redução da FC basal em resposta ao exercício físico crônico tem sido
apontada como resultado de alterações no balanço autonômico sobre o sistema
cardiovascular, onde o tônus simpático sobre o coração e os vasos sanguíneos é
reduzido e o tônus parassimpático ao coração é aumentado (MEDEIROS et al., 2004;
MASTELARI et al., 2012). Contudo, evidências mais recentes demonstraram, por
meio de experimentos conduzidos in vitro, que a redução de correntes despolarizantes
na membrana das células do nodo sinoatrial, dada pela dessensibilização de canais
HCN4, seria o principal mecanismo mediador da redução da frequência de disparos
das células do nodo sinoatrial dos animais treinados (SOUZA et al., 2014) e, portanto,
contribuiria enormemente para a bradicardia de repouso observada neste grupo.
O presente protocolo de treinamento físico não induziu bradicardia de repouso
nos animais C105 T, sugerindo que a intensidade de treinamento adotada neste estudo
poderia ter sido superior as normativas de intensidade ideais para redução efetiva da
FC em animais normonutridos. De fato, estudos mostram que ratos espontaneamente
hipertensos (SH) submetidos a um protocolo de treinamento físico com a intensidade
configurada a 85% do consumo máximo de oxigênio (VO2máx) não apresentavam
bradicardia de repouso, enquanto que esta adaptação era claramente observada em
ratos SH exercitados a 55% do VO2máx (VÉRAS-SILVA et al., 1997). Embora a
intensidade de esforço não tenha sido investigada no presente estudo, evidências
recentes corroboram nossos achados, mostrando que ratos Fischer normonutridos
submetidos a um protocolo de natação com carga de até 3% do peso corporal não
desenvolviam bradicardia de repouso (SOARES et al., 2011). Com base nestes
achados, postulamos que a normalização da FC basal nos ratos R-RP T possa ter
decorrido de processos adaptativos em mecanismos distintos aos apresentados na
literatura ligados ao treinamento físico de intensidade moderada (HARTHMANN et al.,
2007; MASTELARI et al., 2012; CRUZ et al., 2013; CHAAR et al., 2015) uma vez que
P á g i n a | 83
ratos normonutridos não apresentam bradicardia de repouso, mas ratos que passaram
pela restrição e foram recuperados apresentam redução da FC basal.
Dados da literatura têm mostrado que o treinamento físico crônico realizado em
esteira promove melhorias significativas na sensibilidade do componente taquicárdico
e bradicárdico do barorreflexo de animais normotensos e hipertensos (CAVALLERI et
al., 2011). Contudo, estudos de Soares e colaboradores (SOARES et al., 2011)
demostraram que a resposta bradicárdica do barorreflexo não é alterada em ratos
normotensos submetidos a um protocolo de treinamento físico de natação com carga
de até 3% do peso corporal. Os nossos resultados se assemelham a este achado,
especialmente porque demonstramos que o ganho do barorreflexo espontâneo não
foi afetado pelo treinamento de natação em nenhum grupo experimental. Contudo, a
capacidade de o losartan reduzir a atividade deste reflexo, como observado
previamente nos animais R-RP S, não foi notado nos ratos R-RP T, sugerindo que a
participação da angiotensina II na regulação do barorreflexo espontâneo possa ter
sido minorada pelo treinamento físico de natação em ratos recuperados.
O treinamento físico crônico é eficaz em reduzir a concentração dos níveis
circulantes de angiotensina II e da atividade sérica da enzima conversora de
angiotensina (ECA) em ratos com insuficiência cardíaca crônica (CHF) (GOMES-
SANTOS et al., 2014). É possível que o treinamento físico também reduza os efeitos
da angiotensina II em ratos recuperados da restrição proteica, uma vez que o aumento
na intensidade da banda VLF do espectro da PAS, como observado no grupo R-RP
S, não foi notado no grupo R-RP T. Contudo, as anormalidades em mecanismos
angiotensinérgicos provocados pela restrição/recuperação não são completamente
controladas pelo treinamento físico. Os resultados mostraram que o bloqueio dos
receptores AT1 provoca uma redução significativa na potência das bandas VLF ao
mesmo tempo que aumenta a intensidade da banda LF no espectro da PAS de
animais R-RP T. Estes dados podem indicar que a angiotensina II exerce algum papel
na manutenção da pressão arterial por meio da regulação do tônus vasomotor, e uma
vez bloqueada, justificaria o aumento compensatório da participação do sistema
nervoso simpático na regulação da pressão arterial e, consequentemente, na
intensidade da banda LF no espectro da PAS.
P á g i n a | 84
Os resultados obtidos a partir da análise do quimiorreflexo arterial mostraram
que as respostas pressóricas e bradiarrítmicas evocadas pelo KCN (60µg/kg, i.v.)
foram mais intensas no grupo C105 T do que no grupo C105 S, indicando que o
treinamento físico é capaz de aumentar a sensibilidade do componente cardiovascular
do quimiorreflexo em animais normonutridos. A elevação da magnitude das respostas
para- e simpatoexitatórias evocadas pela administração de KCN em animais treinados
fisicamente foi demonstrado previamente por estudos de Harthmann e colaboradores
(HARTHMANN et al., 2007), o que tem sido sugerido ser resultado de alterações no
controle autônomo cardiovascular, de adaptações na via aferente do quimiorreflexo
ou de alterações crônicas no funcionamento dos quimiorreceptores devido as
constantes mudanças de concentração de gases e metabolitos geradas pelas sessões
de treinamento (HARTHMANN et al., 2007). Curiosamente, os ratos R-RP T
apresentaram uma redução da sensibilidade do quimiorreflexo arterial em
comparação ao grupo R-RP S, sugerindo que a restrição proteica/recuperação
poderia afetar diretamente a maneira como o quimiorreflexo responde ao treinamento
físico crônico. No entanto, consideramos também que este efeito poderia ocorrer
indiretamente devido a diferenças relativas de intensidade de esforço exercida pelos
grupos C105 T e R-RP T.
A elevação da expressão de receptores AT1 no corpúsculo carotídeo está
associada com a hipersensibilidade do quimiorreflexo arterial em animais com CHF
(LI et al., 2006). Entretanto, é observado que o treinamento físico crônico é capaz de
normalizar a expressão destes receptores e, consequentemente, a sensibilidade do
quimiorreflexo arterial no mesmo modelo experimental (LI et al., 2008). Contudo,
baseando-se em nossos resultados, os quais mostraram que o losartan (20mgkg, i.v.)
não alterou a magnitude das respostas cardiovasculares evocadas pelo KCN em
nenhum grupo experimental, sugerimos que os receptores AT1 não estão associados
com as anormalidades na sensibilidade do quimiorreflexo arterial em animais R-RP S
e R-RP T.
Em suma, mostramos pela primeira vez que um protocolo de treinamento físico
crônico de natação com carga é eficiente em normalizar a FC de repouso e a
variabilidade da pressão arterial sistólica no domínio do tempo e da frequência em
animais recuperados da restrição proteica pós-desmame. Os nossos resultados
P á g i n a | 85
permitiram concluir também que o treinamento físico crônico reduz a sensibilidade do
quimiorreflexo arterial neste modelo experimental, assim como inibe a participação da
angiotensina II na modulação do barorreflexo espontâneo.
P á g i n a | 86
6. Conclusão
Tendo em vista os resultados apresentados no presente estudo, determinou-se
que a restrição proteica (8%) pós-desmame, seguida por um protocolo de recuperação
alimentar, eleva a FC de repouso, a variabilidade da pressão arterial, o volume-minuto
respiratório e a magnitude das respostas cardiovasculares ativadas pelo
quimiorreflexo arterial em ratos. Logo, sugere-se que o retorno a uma dieta com
conteúdo normal de proteína após a restrição proteica pelo período avaliado define
um comportamento diferenciado do componente cardiovascular do quimiorreflexo
arterial. Curiosamente o componente ventilatório não foi alterado, apesar da alteração
basal do volume-minuto, sugerindo que o protocolo de recuperação/restrição altera o
controle basal da ventilação pulmonar. Também sugere-se que o comportamento
diferenciado do quimiorreflexo parece não envolver ativação de receptores AT1 pela
angiotensina II.
Os resultados também mostraram a habilidade do treinamento físico crônico de
natação, aplicado durante a recuperação, em normalizar a FC de repouso e a
variabilidade da pressão arterial em ratos recuperados da restrição proteica pós-
desmame. Além disso, o presente estudo ressalta o fato de que as adaptações
induzidas pelo treinamento físico crônico são acompanhadas por uma redução da
responsividade do quimiorreflexo arterial neste modelo experimental, possibilitando
assim uma normalização das respostas cardiovasculares evocadas pela ativação dos
quimiorreceptores por KCN entre animais recuperados treinados e controles treinados
ou sedentários.
P á g i n a | 87
Referências
1. ABDALA, A. P. et al. Hypertension is critically dependent on the carotid body input
in the spontaneously hypertensive rat. The Journal of Physiology, v. 590, n. Pt
17, p. 4269–4277, 2012.
2. ACCORSI-MENDONÇA, D.; MACHADO, B. H. Synaptic transmission of baro- and
chemoreceptors afferents in the NTS second order neurons. Autonomic
Neuroscience: Basic and Clinical, v. 175, p. 3-8, 2013.
3. ALAMY, M.; BENGELLOUN, W. A. Malnutrition and brain development: An
analysis of the effects of inadequate diet during different stages of life in rat.
Neuroscience and Biobehavioral Reviews, v. 36, p. 1463-1480, 2012.
4. ALLEN, A. M. Angiotensin AT1 receptor-mediated excitation of rat carotid body
chemoreceptor afferent activity. Journal of Physiology, v. 510, n. 3, p. 773-781,
1998.
5. ALVES, J. L. D. B. et al. Short- and long-term effects of a maternal low-protein diet
on ventilation, O2/CO2 chemoreception and arterial blood pressure in male rat
offspring. British Journal of Nutrition, v. 111, p. 606–615, 2014.
6. ANGELIS, K. D.; SANTOS, M. D. S. B.; IRIGOYEN, M. C. Sistema nervoso
autônomo e doença cardiovascular. Revista da Sociedade Brasileira de
Cardiologia do Rio Grande do Sul, v. 3, p. 1-7, 2004.
7. BARROS, R. D. A.; OKOSHI, M. P.; CICOGNA, A. C. Via beta-adrenérgica em
corações normais e hipertrofiados. Arquivos Brasileiros de Cardiologia v. 72, n.
5, p. 641-648, 1999.
8. BARTLETT, D.; TENNEY, S. M. Control of breathing in experimental anemia.
Respiration Physiology, v. 10, p. 384-395, 1970.
P á g i n a | 88
9. BECKER, L. K.; SANTOS, R. A. S.; CAMPAGNOLE-SANTOS, M. J.
Cardiovascular effects of angiotensin II and angiotensin-(1–7) at the RVLM of
trained normotensive rats. Brain Research, v. 1040, p. 121–128, 2005.
10. BRUM, P. C. et al. Adaptações agudas e crônicas do exercício físico no sistema
cardiovascular. Revista Paulista de Educação Física, v. 18, p. 21-31, 2004.
11. CALVERT, J. W.; LEFER, D. J. Role of Beta Adrenergic Receptors and Nitric Oxide
Signaling in Exercise-Mediated Cardioprotection. Physiology, v. 28, p. 216-224,
2013.
12. CAMPAGNOLE-SANTOS, M. J.; HAIBARA, A. S. Reflexos cardiovasculares e
hipertensão arterial. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 8, n. 1, p. 30-40, 2001.
13. CARDOSO, L. M. et al. Cardiovascular responses to hydrogen peroxide into the
nucleus tractus solitarius. American Journal of Physiology - Regulatory,
Integrative and Comparative Physiology, v. 297, n. 2, p. 462-469, 2009.
14. CARRASCO-SOSA, S.; GUILLÉN-MANDUJANO, A. Correlation between Spectral
Measures of Systolic Blood Pressure Variability and Heart Rate Variability during
Paced Breathing, Standing and Exercise. Computing in Cardiology, v. 39, p. 169-
172, 2012.
15. CAVALLERI, M. T. et al. Afferent signaling drives oxytocinergic preautonomic
neurons and mediates training-induced plasticity. American Journal of
Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, v. 301, p.
958-966, 2011.
16. CHAAR, L. J. et al. Early training-induced reduction of angiotensinogen in
autonomic areas—the main effect of exercise on brain reninangiotensin system in
hypertensive rats. PLOS ONE, v. 10, n. 9, p. 1-16, 2015.
P á g i n a | 89
17. CHUGH, D. K. et al. Nitric oxide-related inhibition of carotid chemosensory nerve
activity in the cat. Respiration Physiology, v. 97, n. 2, p. 147-156, 1994.
18. COSTA-SILVA, J. H.; ZOCCAL, D. B.; MACHADO, B. H. Glutamatergic
Antagonism in the NTS Decreases Post-Inspiratory Drive and Changes Phrenic
and Sympathetic Coupling During Chemoreflex Activation. Journal of
Neurophysiology, v. 103, p. 2095–2106, 2010.
19. COSTA, K. M. et al. Evolution and physiology of neural oxygen sensing. Frontiers
in Physiology, v. 5, n. 302, 2014.
20. CRUZ, J. C. et al. Peripheral chemoreceptors mediate training-induced plasticity
in paraventricular nucleus pre-autonomic oxytocinergic neurons. Experimental
Physiology, v. 98, n. 2, p. 386–396, 2013.
21. D’SOUZA, A. et al. Exercise training reduces resting heart rate via downregulation
of the funny channel HCN4. Nature Communications, v. 5, p. 1-12, 2014.
22. DAMPNEY, R. A. L. et al. CENTRAL MECHANISMS UNDERLYING SHORT-
TERM AND LONG-TERM REGULATION OF THE CARDIOVASCULAR SYSTEM.
Proceedings of the Australian Physiological and Pharmacological Society, v.
32, n. 1, 2001.
23. DAVISSON, R. L. et al. Novel mechanism of hypertension revealed by cell-specific
targeting of human angiotensinogen in transgenic mice. Physiological Genomics,
v. 1, n. 1, p. 3-9, 1999.
24. DRORBAUG, J. E.; FENN, W. O. A barometric method for measuring ventilation in
newborn infants. Pediatrics, v. 16, n. 1, p. 81-87, 1955.
25. DUN, N. J.; MACHADO, B. H.; PILOWSKY, P. M. Neural Mechanisms of
Cardiovascular Regulation. 2004.
P á g i n a | 90
26. FYHRQUIST, F.; SAIJONMAA, O. Renin-angiotensin system revisited. Journal of
Internal Medicine, v. 264, p. 224–236, 2008.
27. GAULTIER, C.; GALLEGO, J. Development of respiratory control: Evolving
concepts and perspectives. Respiratory Physiology & Neurobiology, v. 149, p.
3-15, 2005.
28. GIACOMELLI, F. R. B.; MARÇAL-NATALI, M. R. A. A utilização de ratos em
modelos experimentais de carências nutricionais. Arquivos de Ciências da
Saúde da UNIPAR, v. 3, n. 3, p. 239-249, 1999.
29. GOLDSTEIN, D. S. et al. Low-frequency power of heart rate variability is not a
measure of cardiac sympathetic tone but may be a measure of modulation of
cardiac autonomic outflows by baroreflexe. Experimental Physiology, v. 96, n.
12, p. 1255-1261, 2011.
30. GOMES-SANTOS, I. L. et al. Effects of exercise training on circulating and skeletal
muscle renin-angiotensin system in chronic heart failure rats. PLoS ONE v. 9, n. 5,
p. 1-11, 2014.
31. GOMIDE, J. M. C. et al. Increased activity of the renin–angiotensin andsympathetic
nervous systems is required for regulation of the blood pressure in rats fed a low-
protein diet. Experimental Physiology, v. 98, n. 1, p. 1-9, 2012.
32. GRANJEIRO, É. M. Mecanismos nitrérgicos envolvidos na neurotrasmissão
dos componentes autonômicos e respiratório do quimiorreflexo no NTS
caudal de ratos não-anestesiados. 2009. 201 (Doutorado). Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto
33. HARTHMANN, A. D. et al. Exercise training improves arterial baro- and
chemoreflex in control and diabetic rats. Autonomic Neuroscience: Basic and
Clinical, v. 133, p. 115–120, 2007.
P á g i n a | 91
34. HEYMANS, C.; BOUCKAERT, J. J.; DAUTREBANDE, L. Sinus carotidien et
réflexes respiratoires. II. Influences respiratoires réflexes de l'acidôse, de l'alkalôse,
de l'anhydride carbonique, de l'ion hydrogène et de l'anoxémie. Sinus carotidien et
échanges respiratoires dans le poumons et au delà des poumons. Arch Intl
Pharmacodyn Thér v. 39, p. 400-408 1930.
35. HEYMANS, C.; BOUCKAERT, J. J.; DAUTREBANDE, L. Sinus carotidien et
reflexes respiratoires: sensibilite des sinus carotidiens aux substances chimiques.
Action stimulante respiratoire reflexe du sulfure de sodium, du cyanure de
potassium, de la nicotine et de la lobeline. Arch. Int. Pharmacodyn, v. 40, p. 54-
91, 1931.
36. HOPPE, C. C. et al. Combined prenatal and postnatal protein restriction influences
adult kidney structure, function, and arterial pressure. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol, v. 292, p. 462-469, 2007.
37. HUIZINGA, C. T. et al. Effects of Intrauterine and Early Postnatal Growth
Restriction on Hypothalamic Somatostatin Gene Expression in the Rat. Pediatric
Research, v. 48, n. 6, p. 815-820, 2000.
38. IRIGOYEN, M. C.; CONSOLIM-COLOMBO, F. M.; KRIEGER, E. M. Controle
cardiovascular: regulação reflexa e papel do sistema nervoso simpático. Revista
Brasileira de Hipertensão, v. 8, p. 55-62, 2001.
39. JULIEN, C. The enigma of Mayer waves: Facts and models. Cardiovascular
Research, v. 70, p. 12-21, 2005.
40. JÚNIOR, R. F.; SILVA, V. J. D. D. Principais fatores que interferem nas variações
da pressão arterial e do intervalo cardíaco. Revista Brasileira de Hipertensão, v.
7, n. 2, p. 180, 2000.
41. KATZ, D. M.; FINLEY, J. C. W.; POLAK, J. Dopaminergic and Peptidergic Sensory
Innervation of the Rat Carotid Body: Organization and Development. Advances in
Experimental Medicine and Biology v. 337, p. 43-49 1993.
P á g i n a | 92
42. LANGAGER, A. M. et al. Very low-frequency blood pressure variability depends
on voltage-gated L-type Ca2 channels in conscious rats. Am J Physiol Heart Circ
Physiol, v. 292, p. 1321-1327, 2007.
43. LANGLEY-EVANS, S. C.; JACKSON, A. A. Captopril normalises systolic blood
pressure in rats with hypertension induced by fetal exposure to maternal low protein
diets. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 110, n. 3, p. 223-228,
1995.
44. LATERZA, M. C. et al. Exercício físico regular e controle autonômico na
hipertensão arterial. Rev Socerj, v. 21, n. 5, p. 320-328, 2008.
45. LEUNG, P. S.; FUNG, M. L.; TAM, M. S. C. Renin–angiotensin system in the carotid
body. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 35, p. 847-
854, 2003.
46. LEUNG, P. S.; LAM, S. Y.; FUNG, M. L. Chronic hypoxia upregulates the
expression and function of AT1 receptor in rat carotid body. Journal of
Endocrinology, v. 167, p. 517–524, 2000.
47. LI, Y.-L. et al. Exercise training improves peripheral chemoreflex function in heart
failure rabbits. Journal of Applied Physiology, v. 105, p. 782-790, 2008.
48. LI, Y.-L. et al. Angiotensin II enhances carotid body chemoreflex control of
sympathetic outflow in chronic heart failure rabbits. Cardiovascular Research v.
71, p. 129 – 138, 2006.
49. LOSS, I. D. O. et al. Baroreflex dysfunction in rats submitted to protein restriction.
Life Sciences, v. 81, p. 944-950, 2007.
50. MACHADO, B. H. et al. Autonomic processing of the cardiovascular reflexes in the
nucleus tractus solitarii. Braz J Med Biol Res, v. 30, n. 4, p. 533-543, 1997. ISSN
0100-879X.
P á g i n a | 93
51. MARTINS-PINGE, M. C. Cardiovascular and autonomic modulation by the central
nervous system after aerobic exercise training. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, v. 44, p. 848-854, 2011.
52. MARTINS, C. D. D.; JR, D. A. C.; FERNANDES, L. G. Cardiac autonomic balance
in rats submitted to protein restriction after weaning. Clinical and Experimental
Pharmacology and Physiology, v. 38, p. 89-93, 2011.
53. MASTELARI, R. B. et al. Glutamatergic neurotransmission in the hypothalamus
PVN on heart rate variability in exercise trained rats. Autonomic Neuroscience:
Basic and Clinical, v. 170, p. 42-47, 2012.
54. MEDEIROS, A. et al. Swimming training increases cardiac vagal activity and
induces cardiac hypertrophy in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, v. 37, n. 12, p. 1909-1917, 2004.
55. MIAO, C.-Y. et al. Blood pressure variability is more important than blood pressure
level in determination of end-organ damage in rats. Journal of Hypertension, v.
24, n. 6, p. 1125–1135, 2006.
56. MIÑANA-SOLIS, M. D. C.; ESCOBAR, C. Post-Weaning Protein Malnutrition in the
Rat Produces Short and Long Term Metabolic Impairment, in Contrast to Earlier
and Later Periods. International Journal of Biological Sciences, v. 4, n. 6, p.
422-432, 2008.
57. MONTEIRO, H. L. et al. Efetividade de um programa de exercícios no
condicionamento físico, perfil metabólico e pressão arterial de pacientes
hipertensos. Rev Bras Med Esporte, v. 13, n. 2, p. 107-112, 2007.
58. MOREIRA, T. S. et al. Antihypertensive effects of central ablations in
spontaneously hypertensive rats. American Journal of Physiology - Regulatory,
Integrative and Comparative Physiology, v. 296, p. 1797–1806, 2008.
P á g i n a | 94
59. OIGMAN, W.; NEVES, M. F. T. Sistema renina-angiotensina e hipertrofia
ventricular esquerda. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 7, n. 3, p. 261-267,
2000.
60. OLIVEIRA, E. L. et al. A low protein diet causes an increase in the basal levels and
variability of mean arterial pressure and heart rate in Fisher rats. Nutrition
Neuroscience, v. 7, n. 4, p. 201-205, 2004.
61. OLIVEIRA, L. F. D. Transmissão Sináptica. Revista Brasileira de Anestesiologia,
v. 44, n. 1, p. 25-33, 1994.
62. PARATI, G. et al. Evaluation of the baroreceptor-heart rate reflex by 24-hour intra-
arterial blood pressure monitoring in humans. Hypertension, v. 12, p. 214-222,
1988.
63. PARATI, G. et al. Spectral Analysis of Blood Pressure and Heart Rate Variability
in Evaluating Cardiovascular Regulation. Hypertension, v. 25, p. 1276-1286,
1995.
64. PATON, J. F. R.; KASPAROV, S. Differential effects of angiotensin II on
cardiorespiratory reflexes mediated by nucleus tractus solitarii — a microinjection
study in the rat. Journal of Physiology, v. 521, n. 1, p. 213-225, 1999.
65. PENITENTE, A. R. et al. Malnutrition enhances cardiovascular responses to
chemoreflex activation in awake rats. Life Sciences, v. 81, p. 609–614, 2007.
66. PENITENTE, A. R. et al. Protein Restriction after Weaning Modifies the Calcium
Kinetics and Induces Cardiomyocyte Contractile Dysfunction in Rats. Cells
Tissues Organs, v. 198, p. 311-317, 2013.
67. PIERDOMENICO, S. D. et al. Prognostic Value of Different Indices of Blood
Pressure Variability in Hypertensive Patients. American Journal of Hypertension,
v. 22, n. 8, p. 842-847, 2009.
P á g i n a | 95
68. PLAGEMANN, A. et al. Hypothalamic nuclei are malformed in weanling offspring
of low protein malnourished rat dams. Nutritional Neurosciences, v. 130, p.
2582–2590, 2000.
69. PRABHAKAR, N. R. et al. Nitric oxide in the sensory function of the carotid body.
Brain Research, v. 625, n. 1, p. 16-22, 1993.
70. PRABHAKAR, N. R.; OVERHOLT, J. L. Cellular mechanisms of oxygen sensing at
the carotid body: heme proteins and ion channels. Respiration Physiology, v.
122, p. 209-221, 2000.
71. REID, I. A. Interactions between ANG II, sympathetic nervous system, and
baroreceptor reflexes in regulation of blood pressure. American Journal of
Physiology - Endocrinology and Metabolism, v. 262, n. 6, p. 763-778, 1992.
72. RIBEIRO, J. M.; FLORÊNCIO, L. P. Bloqueio farmacológico do sistema renina-
angiotensina-aldosterona: inibição da enzima de conversão e antagonismo do
receptor AT1. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 3, p. 293-302, 2000.
73. RODRIGUES-BARBOSA, M. C. et al. Protein malnutrition modifies medullary
neuronal recruitment in response to intermittent stimulation of the baroreflex. Brain
Research, v. 1483, p. 20-30, 2012.
74. RODRIGUES, F. A.; CHIANCA-JR, D. A.; FERNANDES, L. G. Malnutrition affects
the pressor response to microinjection of L-glutamate into the RVLM of awake rats.
Biological Research, v. 45, p. 337-343, 2012.
75. RONDON, M. U. P. B.; BRUM, P. C. Exercício Físico com Tratamento não
farmacológico da hipertensão arterial. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 10,
p. 134-139, 2003.
76. RUPP, H.; JÄGER, B. The Renin-Angiotensin System and the Sympathetic
Nervous System in Hypertension and Congestive Heart Failure: Implications for
Therapeutic Interventions. J Clin Basic Cardiol, v. 4, p. 47-51, 2001.
P á g i n a | 96
77. SÁ, R. W. M. et al. Chemoreflex control of the cardiovascular system remains
altered after recovery from low protein diet early in life. Autonomic Neuroscience:
Basic and Clinical, v. 185, p. 134-137, 2014.
78. SAHAJPAL, V.; ASHTON, N. Increased glomerular angiotensin II binding in rats
exposed to a maternal low protein diet in utero. The Journal of Physiology, v.
563, n. 1, p. 193-201, 2005.
79. SANT’HELENA, B. D. R. M. et al. Blood pressure, heart rate and its autonomic
modulation in malnourished rats at different ages. Acta Scientiarum. Biological
Sciences, v. 36, n. 4, p. 467-475, 2014.
80. SATO, M. A.; COLOMBARI, E.; MORRISON, S. F. Inhibition of neurons in
commissural nucleus of solitary tract reduces sympathetic nerve activity in SHR.
American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology, v. 282, p.
679-684, 2002.
81. SATO, M. A. et al. Lesions of the Commissural Nucleus of the Solitary Tract
Reduce Arterial Pressure in Spontaneously Hypertensive Rats. Hypertension, v.
38, n. 2, p. 560-564, 2001.
82. SILVA, N. T. et al. Excitatory amino acid receptors in the dorsomedial hypothalamic
area contribute to the chemoreflex tachypneic response. Respiratory Physiology
& Neurobiology, v. 212–214, p. 1-8, 2015.
83. SOARES, E. R. et al. Cardiac and renal effects induced by different exercise
workloads in renovascular hypertensive rats. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, v. 44, n. 6, p. 573-582, 2011.
84. SOUZA, A. D. et al. Exercise training reduces resting heart rate via downregulation
of the funny channel HCN4. Nature Communications 2014.
P á g i n a | 97
85. STAUSS, H. M. Identification of blood pressure control mechanisms by power
spectral analysis. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v.
34, p. 362–368, 2007.
86. STRATTON, J. R. et al. Effects of Aging on Cardiovascular Responses to
Parasympathetic Withdrawal. Journal of the American College of Cardiology, v.
41, n. 11, p. 2077-2083, 2003.
87. TATASCIORE, A. et al. Awake Systolic Blood Pressure Variability Correlates With
Target-Organ Damage in Hypertensive Subjects. Hypertension, v. 50, n. 325-332
2007.
88. TOTOU, N. L. et al. Cardiopulmonary reflex and blood bressure response after
swimming and treadmill exercise in hypertensive rats. Journal of Exercise
Physiology online, v. 18, n. 5, 2015.
89. VALENTI, V. E. et al. Regulação neural do sistema cardiovascular: centro
bulbares. Rev Neurociec v. 15, n. 4, p. 317-320, 2007.
90. VARDHAN, A.; KACHROO, A.; SAPRU, H. N. Excitatory amino acid receptors in
commissural nucleus of the NTS mediate carotid chemoreceptor responses.
American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative
Physiology, v. 264, n. 1, p. 41-50, 1993.
91. VÉRAS-SILVA, A. et al. Low-intensity exercise training decreases cardiac output
and hypertension in spontaneously hypertensive rats. The American journal of
physiology, v. 273, n. 6 Pt 2, p. 31, 1997.
92. VERDECCHIA, P. et al. Prognostic significance of blood pressure variability in
essential hypertension. Blood Pressure Monitoring v. 1, n. 1, p. 3-11, 1996.
93. WANG, W.-Z. et al. AT1 receptors in the nucleus tractus solitarii mediate the
interaction between the baroreflex and the cardiac sympathetic afferent reflex in
P á g i n a | 98
anesthetized rats. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative
and Comparative Physiology, v. 292, n. 3, p. 1137-1145, 2007.
94. WANG, Z. Z. et al. Localization and actions of nitric oxide in the cat carotid body.
Neuroscience, v. 60, n. 1, p. 275-286, 1994.
95. WIDDOP, R. E. et al. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype?
British Journal of Pharmacology, v. 140, p. 809–824, 2003.
96. WOODS, L. et al. Maternal protein restriction suppresses the newborn renin-
angiotensin system and programs adult hypertension in rats. Pediatric research,
2001.
97. ZHUO, J. et al. Blockade by intravenous losartan of and adrenals demonstrated
by in vitro autoradiography AT1 angiotensin II receptors in rat brain, kidney.
Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 21, n. 557-567,
1994.
98. ZUCKER, I. H. et al. Exercise Training and Sympathetic Regulation in
Experimental Heart Failure. Exercise and Sport Sciences Reviews, v. 32, n. 3,
p. 107-111, 2004.