PURIFICACIÓNDE

PROTEÍNASSemestre 2013-2

Febrero 12 2013

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos

¿Qué es un aminoácido?

¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS

Catálisis

Defensa

Transporte

Soporte

Movimiento

Regulación

Señalización

LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS

Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas

Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas

Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales

Soporte Colágeno, queratina

Movimiento Actina, miosina

Regulación Factores de transcripción (proteínas de unión al DNA)

Señalización Hormonas (insulina)

¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS?

Para la producción de anticuerpos

ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática

REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X,

espectroscopía NMR.Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con

ácidos nucleícos

Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada:

La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!

ANTES DE EMPEZAR!!!!

1. Seleccionar la muestra biológica (fuente)2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo

Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica

Moderada > 95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos

SecuenciaciónEspectrometría de masas

ANTES DE EMPEZAR!!!!2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

ANTES DE EMPEZAR!!!!

3. Investigar las PROPIEDADES de la proteína que se desea purificar

1. Tamaño2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico)

3. Hidrofobicidad (solubilidad)4. Estabilidad (temperatura, pH, oxidación-

reducción)

5. Afinidad por un ligando

ANTES DE EMPEZAR!!!!

4. Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés.

Monitorear el progreso de la purificación

a. Cuantificación de proteína total

a. Detectar específicamente la proteína de interés

SDS-PAGE: una técnica utilizada ampliamente para monitorear el progreso de una purificación

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS

Fase I. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración.

Fase II. El objetivo principal es eliminar una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación.

Fase III. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad.

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS

Al final de la práctica aprenderemos a hacer e interpretar un

CUADRO DE PURIFICACIÓN

A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!!1. Ya seleccionamos la muestra biológica (fuente)

¿Cuál es el primer paso?

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULARAlgunos ejemplos son:

1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células detejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido

3. Lisis con detergentes

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a

muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.

¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

UTILIZAR:Soluciones amortiguadoras

Inhibidores de proteasasBajas temperaturas (4°C)

EVITARAltas temperaturas

Manipular demasiado la muestra

PROCURARque el proceso sea lo más corto posible.

Algunos agentes estabilizadores son:

El resultado de la lisis celular es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de

proteínas, membranas y células rotas.

Esta preparación se somete a filtración y/o centrifugación

Para obtener el clarificado

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO

Centrifugación

CENTRIFUCACIÓN DIFERENCIAL

VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A DIFERENTES VELOCIDADES

La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad

de la del medio.

Métodos de purificación de proteínas

BAJA RESOLUCIÓN

Precipitación con sales, precipitación con temperatura

y pH

ALTA RESOLUCIÓN

Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio

iónico, afinidad

Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante,

desnaturalizante, isoelectroenfoque

Precipitación con sales

Sal más usada: Sulfato de Amonio

EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE

SATURACIÓN ESPECÍFICO

Piruvato + NADH Lactato + NAD+ LDH

Oxidorreductasa que cataliza la reducción del piruvato a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+.

Lactato deshidrogenasa (LDH)

LDH - Isoenzimas• La LDH es un tetrámero

• Las cinco isoenzimas se han enumerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética. Así la LDH-1 (H4) es la que más avanza hacia el ánodo mientras que la LDH-5 (M4) es la de menor movilidad electroforética.

LDH - Isoenzimas• LDH - 1 (H4): en el corazón, músculos y eritrocitos. • LDH - 2 (H3M): en el sistema retículo endotelial y leucocitos. • LDH - 3 (H2M2): en los pulmones. • LDH - 4 (HM3): en los riñones, placenta y páncreas. • LDH - 5 (M4): en el hígado y músculo esquelético. • Todas las isoenzimas pueden unir 4 moléculas de coenzima

LDH• Vida media de 144 horas.• Peso molecular es de aproximadamente 140

kDa, cada subunidad pesa aproximadamente 35 kDa.

• EC. 1.1.1.27- Clase : 1 (oxidorreductasa)- Subclase : 1 (actúa sobre un sustrato que poseeun grupo CH-OH como donador de electrones)- Subsubclase : 1 (NAD+ o NADP+ es el coenzimaaceptor)- Orden dentro de la subsubclase : 27 (número de enzima en este grupo)