Aislamiento, separacin y purificacin de protenasTrabajo para concurso de oposicin C.CNI.a.001.10

Tania Ethel Cuadra Zelaya 2 de Junio de 2010

ContenidoContenido................................................................................................................ 2 Aislamiento, separacin y purificacin de protenas...............................................3 Introduccin.........................................................................................................3 1. Obtencin del extracto proteico.......................................................................4 1.1 Naturaleza y almacenamiento del material de inicio..................................4 1.2 Extraccin de protenas..............................................................................5 2. Purificacin de la protena..............................................................................12 2.1 Purificacin no cromatogrfica de protenas............................................15 2.2 Purificacin cromatogrfica de protenas.................................................17 3. Consideraciones finales.................................................................................22 Bibliografa......................................................................................................... 23

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Aislamiento, separacin y purificacin de protenasTania Ethel Cuadra Zelaya

IntroduccinEl estudio de las protenas y sus funciones es bsico no solo para el entendimiento de las clulas y organismos, sino tambin para un aprovechamiento adecuado de ellas en los procesos biotecnolgicos. En los organismos, las protenas sirven como catalizadores de los procesos metablicos, elementos estructurales, componentes de rutas de sealizacin, receptoras y convertidoras de informacin, componentes clave de la maquinaria que determina que genes se expresan y si los ARNs son traducidos a protenas, en general estn involucradas en el flujo de la informacin gentica. Dadas estas importantes funciones, es valioso poder purificar y estudiar una protena aislada, ya que de esta forma puede ser estudiada separada de otras protenas y sus funciones pueden ser evaluadas en detalle (Roe S. 2001). En el caso de los procesos biotecnolgicos, la produccin de protenas representa un mercado de productos de alto valor- bajo volumen, usualmente son producidos por un grupo de organismos genticamente modificados bastante conocidos. Entre los organismos de produccin comnmente usados estn la Escherichia coli, clulas animales, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorii, algunos bacilos, clulas de insectos, etc. En un importante nmero de casos, no hay sistemas de transporte celular que secreten el producto desde la clula productora al ambiente de fermentacin. Consecuentemente las clulas deben romperse y el producto blanco quedar disperso entre otras sustancias similares (contaminantes). Esta situacin hace de la recuperacin, separacin y purificacin actividades de extrema importancia (Leser y Ajenjo 1994). Mediante este trabajo se pretende presentar una visin general de todas las tareas necesarias para el adecuado aislamiento, separacin y purificacin de protenas; dividiendo el contenido en dos reas principales: la obtencin del 3

extracto proteico y la purificacin de la protena de inters. En principio, con el objetivo de su estudio a nivel de laboratorio, y tambin tratando de hacer una aproximacin a la compleja seleccin de actividades necesarias para su produccin a gran escala.

1. Obtencin del extracto proteico1.1 Naturaleza y almacenamiento del material de inicio.Se puede tener poca influencia en la eleccin del material de inicio para la purificacin de una protena. Una fermentacin que ha sido previamente optimizada para producir una gran cantidad de una enzima en particular es un ejemplo clsico. Sin embargo, se aconseja, cuando sea apropiado, revisar las opciones para el material de inicio, y en el caso de estar siguiendo las instrucciones de una publicacin cientfica, no asumir que el material utilizado en la referencia sea necesariamente el mejor para usar en la investigacin a realizar. El material para purificar una protena puede venir de una gran variedad de fuentes tejidos animales, materiales de plantas, leche, sangre, y productos de cultivos microbianos como se mencion antes (Roe 2001). En la mayora de los casos, el inters se enfoca en una actividad biolgica en particular, tal como una enzima, y el origen de esta actividad es a menudo de poca importancia. Se debe tener, por lo tanto, un gran cuidado en la seleccin de la fuente adecuada de esta enzima; ya que puede haber considerables variaciones respecto a la concentracin y estabilidad de sta, la disponibilidad y costos de la materia prima, la presencia de actividades y protenas interferentes, y dificultades en el manejo de materias primas en particular (Janson y Rydn 1998). Las protenas son producto de la actividad ribosomal y por lo tanto estn asociadas al metabolismo celular. Consecuentemente, sin importar la fuente, las protenas se localizan ya sea dentro de la clula, formando parte de su estructura, o secretadas fuera de ella. Las protenas localizadas dentro de la clula incluyen cuerpos de inclusin insolubles, enzimas solubles o protenas estructurales que forman parte de una estructura celular tal como la membrana. Las protenas que son secretadas por las clulas o localizadas en el espacio periplsmico tambin pueden proveer un proceso de purificacin ms simple dado que el nivel de contaminantes proteicos es reducido en comparacin al de protenas 4

intracelulares. Adems, las protenas extracelulares (como la lisozima y la amilasa son generalmente ms robustas ya que tienen que operar en ambientes adversos. Las protenas intracelulares son generalmente menos estables y presentan un mayor reto para los cientficos purificadores debido a su mayor labilidad y presencia de otras protenas contaminantes. Cuando las protenas estn asociadas con material celular, es recomendable generar extractos clarificados (Ej.: Sin partculas) del material de inicio tan pronto sea posible a travs de rompimiento celular, solubilizacin de la protena blanco en un amortiguador apropiado y eliminacin de las celular y debris celular a travs de filtracin o centrifugacin. Cuando la protena es extracelular al material celular, se requiere una separacin inicial que permita retirar las clulas y dejar un sobrenadante claro que contenga la protena blanco. A partir de entonces, la preparacin clara puede utilizarse inmediatamente para la purificacin o se pueden congelar alcuotas para uso futuro (Roe 2001). La frescura del material de inicio es muy importante dados los procesos de degradacin natural y la contaminacin por microorganismos que ocurren rpidamente y resultan en reduccin de los niveles de protena blanco y un material de inicio no representativo. Por lo tanto a menos que la purificacin inicie a horas de la obtencin del material de inicio, la degradacin debe ser reducida a travs de reduccin de la temperatura, a 5 C por un perodo de unas pocas horas, o mediante congelamiento a -70 C por das. Sin embargo, es necesario considerar que durante el congelamiento ciertos cambios pueden suceder en el material de inicio, los cuales, si no son verificados, pueden reducir subsecuentemente la eficiencia de la purificacin (Roe 2001). En la siguiente seccin se detallan todos los cuidados a tomar en cuenta durante obtencin del extracto proteico y las precauciones a tomar para su mantenimiento ptimo antes y durante la purificacin de la protena deseada.

1.2 Extraccin de protenasCon el fin de aislar las protenas intracelulares, se debe realizar la ruptura celular. Se encuentran disponibles varias tcnicas de rompimiento celular, tanto mecnicas como qumicas (Tabla 1.1). Se debe desarrollar un protocolo de ruptura celular eficiente para liberar la protena en forma soluble desde su 5

compartimiento intracelular. El protocolo de disrupcin debe ser lo ms suave como sea posible para la protena, dado que la etapa de extraccin es el punto de partida para todos procedimientos posteriores. El xito de la ruptura celular depende de una serie de variables, tales como la eleccin de buffers, la presencia de inhibidores proteasas, y la osmolaridad del buffer de resuspensin. tipo celular, de la protena de la blanco, y su aplicacin prevista (Ahmed 2005). Una buena parte de estrategia y evaluacin se requieren para la seleccin de las condiciones adecuadas para la extraccin. Los investigadores necesitan tener una respuesta antes de la extraccin para algunas preguntas frecuentes: Cmo se utilizar la protena? Se utilizar la protena para la secuenciacin de pptidos con el objeto de llevar a cabo la clonacin y secuenciacin del cDNA? Se requiere la protena para la investigacin de sus propiedades y actividades biolgicas? Para la secuenciacin de pptidos, son adecuados unos pocos microgramos de protenas desnaturalizadas en gel de poliacrilamida o en membrana de difluoruro de polivinildeno (PVDF). Pero si se pretende la investigacin de las propiedades y actividades biolgicas de las protenas, se debe tener el cuidado de mantener la protena de inters en forma estable y activa. Tabla 1.1 Varias tcnicas de lisis celular TcnicaDigestin enzimtica Lisis por choque osmtico Homogenizacin manual Homogenizador de cuchillas Molienda con alumbre o arena Molienda con perlas de vidrio

La

condicin y constitucin del tampn de extraccin depender de la naturaleza del

PrincipioDigestin de la pared celular llevando a la disrupcin osmtica de la membrana celular. Disrupcin osmtica de la membrana celular Las clulas son forzadas a travs de un espacio estrecho, lo cual las lleva al rompimiento de la membrana celular Clulas grandes se rompen mediante accin de corte Las paredes celulares se rompen debido a superficies rugosas microscpicas Las paredes celulares se rompen por la vibracin rpida del vidrio

Tiempo de lisis15-30 min

EjemploBacterias Gram positivas Glbulos rojos Tejido de hgado

< 5 min 10-15 min

5-10 min 5-10 min 10-20 min

Tejido muscular, tejido animal, tejido de plantas Bacterias Bacterias

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Prensa francesa

Sonicacin

Las clulas son forzadas a pasar a travs de un orificio pequeo a una presin muy alta. Las fuerzas cortantes desbaratan las clulas La disrupcin celular se realiza debido a las fuerzas cortantes y cavitacin causada por ondas snicas de alta presin

10-30 min

Bacterias y clulas de plantas Bacterias

5-10 min

1.2.1 Amortiguadores para extraccin de protenasLas protenas son macromolculas biolgicas extremadamente heterogneas. Sus propiedades pueden ser afectadas severamente por pequeos cambios en la concentracin de iones hidrgeno, de tal forma que es necesario un pH estable del ambiente proteico. Se consideran varios factores durante la eleccin de un amortiguador (Tabla 1.2). Estos factores son el pKa y los efectos de la temperatura, interacciones con otros componentes (tales como enzimas y iones metlicos), compatibilidad con diferentes tcnicas de purificacin, absorcin UV, permeabilidad a travs de membranas biolgicas, y costos. Cuando se estudia las propiedades de una protena, una debe considerar determinar el pH ptimo de la actividad de la protena con el objeto de elegir el mejor amortiguador. Para determinar el pH ptimo, se aconseja empezar con una serie de amortiguadores relacionados que abarcan un amplio rango de pH. Una vez que el pH ptimo ha sido determinado, diferentes amortiguadores dentro del mismo rango de pH pueden ser examinados para un efecto amortiguador especfico. Una vez que se ha elegido el tampn apropiado, es mejor trabajar a la mnima concentracin razonable (alrededor de 50 mM) para evadir efectos de fuerza inica no especficos. Amortiguadores a concentraciones de 50 mM son normalmente no txicos para las clulas (Ferguson y col. 1980).

Tabla1.2 Limitaciones de amortiguadores comnmente usados para extracciones. Amortiguador Fosfato Ventaja Compatible cromatografa permeacin Desventaja con Dbil capacidad amortiguadora de dentro del rango de pH de 8-11. gel Precipita en presencia de 7

en

(cromatografa de exclusin) e intercambio catinico. Compatible con la mayora de reactivos para entrecruzamiento. Barato. Tris Adecuado para la cromatografa de exclusin y cromatografa de intercambio aninico. Barato

Borato Citrato Carbonato

Barato Barato Barato

Good Buffers Relativamente libres de (Jed: MES, efectos secundarios. MOPS, HEPES) Baja absorbancia a la luz UV Efectos mnimos de la temperatura y de la fuerza inica

cationes polivalentes. Inhibe una amplia variedad de enzimas, incluyendo las quinasas, fosfatasas y deshidrogenasas. No adecuado para cromatografa de intercambio aninico Amortiguador pobre debajo de pH 7. Pasa a travs de membranas biolgicas Contiene una amina primaria reactiva y por lo tanto forma aductos de bases de Schiff con aldehdos e inhibe la conjugacin por entrecruzamiento basado en aminas. Forma complejos con los motivos de ribosa de los cidos nucleicos, y otros mono y oligosacaridos Se une a alguna protenas y forma complejos metlicos Solubilidad limitada. Dado que el carbonato est en equilibrio con el CO2, los estudios deben ser llevados a cabo en sistemas cerrados La mayora de los amortiguadores Good (HEPES, PIPES, etc.) forman radicales bajo varias condiciones y por lo tanto no son adecuados cuando se estudian procesos redox. Caros.

La seleccin de buffer tambin depende de los mtodos de separacin empleados. Por ejemplo., en la cromatografa de permeacin en gel, casi cualquier amortiguador adecuado para la protena de inters puede ser elegido. Pero para la cromatografa de intercambio aninico, los buffers catinicos tales como el Tris (y para la cromatografa de intercambio catinico, buffers aninicos tales como fosfato) se prefieren. Sin embargo estos amortiguadores inorgnicos tienen algunos efectos secundarios. Los buffers de fosfato muestran inhibicin de muchas enzimas incluyendo la carboxipeptidasa, ureasa, quinasa, y deshidrogenasa (Blanchard 1984). Tris y otros buffers de aminas primarias 8

pueden formas aductos de bases de Schiff con aldehdos y cetonas e inhibir la conjugacin de protenas mediante fijadores basados en aminas. Los buffer de borato pueden formar complejos covalente con los motivos de ribosa de los cidos nucleicos, y otros mono y oligosacridos. Sin embargo, los amortiguadores Good (desarrollados por Good y col 1966) tales como MES, PIPES y MOPS ha mostrado estar relativamente libres de efectos secundarios. Tienen baja absorbancia al UV y son afectados mnimamente por la temperatura o la fuerza inica. A diferencia de los buffers inorgnicos, los amortiguadores Good tambin son tiles respecto a la baja capacidad de uniones metlicas, reteniendo la mayora de los metales esenciales para la actividad enzimtica.

1.2.2 Uso de inhibidores de proteasas y detergentes para la extraccinLa protelisis puede ser un problema mayor despus de la extraccin y en cualquier etapa de la purificacin de la protena deseada. Es un serio problema porque, adicionalmente a la completa inactivacin de la protena deseada, la protelisis podra generar protenas degradadas, reteniendo parcialmente la actividad biolgica. Es aconsejable usar una mezcla de inhibidores cuando se trabaje con un nuevo extracto de protenas. Los investigadores deben tener en mente que los iones metlicos (como el Cu2+), si se utilizan para inhibidores de proteasa acidia, se oponen a la utilizacin simultnea de quelantes (tales como EDTA y EGTA) que son requeridos para inhibir metaloproteasas. El uso de aprotinina es incompatible con los buffers de extraccin que contienen una gran cantidad de agentes reductores. La aprotinina contiene tres enlaces disulfuro y por lo tanto el agente reductor podra inactivar la aprotinina. Una mezcla de benzamida y benzamidina podra sustituir la aprotinina, debido a que la mezcla es tan activa como la aprotinina. Una vez se han logrado las condiciones para mantener la protena deseada en una forma estable, se pueden usar inhibidores selectivos de proteasas (Ahmed 2005). Los detergentes son agregados generalmente al buffer de extraccin y purificacin de protenas de membrana, las cuales usualmente son insolubles en amortiguadores acuosos. Los detergentes son una clase de compuestos caracterizada por su estructura anfifilica (Tanto hidrofbica como hidroflica). La 9

cola de la molcula de detergente es hidrofbica, y usualmente consiste de un hidrocarburo ramificado o lineal, mientras que la cabeza hidroflica puede tener diversas estructuras qumicas. La consideracin ms importante en la eleccin de un detergente apropiado es la propiedad no desnaturalizante. Los detergentes no inicos, tales como el Tritn X-100 y octylglucosido y detergentes zwitterionicos, tales como el CHAPS, son a menudo utilizados para solubilizar protenas de membrana. Se deben considerar tambin las propiedades espectrales de los detergentes, especialmente cuando la purificacin de la protena de membrana se realiza a travs de cromatografa de columna y se desea el monitoreo UV de la fraccin deseada. Los detergentes con grupos aromticos como el Tritn X-100 y el Tritn X-114 tienen una absorbancia ultravioleta sustancial a 280 nm. Las sales biliares y sus derivados incluyendo CHAPS y CHAPSO no tienen tal interferencia. Los detergentes inicos interfieren con los procedimientos relacionados con carga tales como la cromatografa de intercambio inico y el isoelectroenfoque. Por lo tanto, los detergentes inicos deben ser evitados si las tcnicas de separacin basadas en diferencia de cargas van a ser empleadas. Si las protenas van a separarse de acuerdo al tamao por medio de cromatografa de filtracin en gel, se deben elegir los detergentes con menor nmero de tamao de agregacin micelar ( SO42- > CH3COO- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- > I- > SCN- y para cationes son NH 4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ (Arakawa y Timasheff 1984).

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La hidrofobicidad es la repulsin entre un compuesto no polar y un medio polar, Ej.: agua (Kennedy 1990). Las glicoprotenas de membrana se unen a la bicapa lipdica de las membranas biolgicas mediante interacciones hidrofbicas. Las interacciones hidrofbicas pueden ser utilizadas para separar biomolculas que poseen motivos hidrofbicos. En las protenas los aminocidos hidrofbicos son el triptfano, tirosina, leucina, valina, metionina y alanina, en orden decreciente de hidrofobicidad. En la cromatografa de hidrofobicidad las protenas son usualmente adsorbidas en soportes fenil- o octil-inmovilizados en presencia de altas concentraciones de sal. La HIC puede ser convenientemente desarrollada despus de

fraccionamiento con sulfato de amonio, pero antes de la cromatografa de intercambio inico. Dado que la protena blanco se eluye en un buffer bajo en sales, el eluido puede entonces quedar listo para someterse una cromatografa de intercambio inico sin la necesidad de un paso de dilisis (Ahmed 2005).

2.2.5 Cromatografa de fase reversaEn la cromatografa de fase reversa (RPC), la matriz es slica que ha sido sustituida con cadenas n-alquilicas, usualmente C4, C8 y C18. La fase mvil es usualmente una mezcla de agua y un solvente orgnico menos polar. El nombre fase reversa se introdujo para distinguirla de la cromatografa de fase normal, en la cual la matriz es slica y la fase mvil es un solvente no polar como el hexano. En el sistema de fase reversa, el agua presente en la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria, la slica derivatizada con C8 o C18. RPC raramente se usa para las purificacin de molculas proteicas biolgicamente activas. Sin embargo, esta cromatografa es ampliamente utilizada para separar pptidos obtenidos a partir de protenas purificadas y que han sido digeridas mediante mtodos qumicos o enzimticos, y para otras aplicaciones donde la perdida de la actividad biolgica de la protena no es un preocupacin (Ahmed 2005).

2.2.6 Cromatografa de afinidadEl procedimiento ms poderoso para la purificacin de protenas es la cromatografa de afinidad. Bajo condiciones ideales la protena blanco puede ser purificada en un solo paso. Adems, la protena purificada se obtiene en una forma biolgica activa, como la purificacin se basa en sus interacciones 21

bioespecficas con un ligando inmovilizado. El procedimiento involucra la adsorcin de un extracto de protena cruda en un soporte slido con un ligando conjugado (comnmente llamado matriz). Las protenas en el extracto que tengan un sitio de unin complementario al ligando permanecen unidas a la matriz, mientras que los componentes que no se unan son separados mediante lavado de la matriz con un amortiguador. La protena unida es eluida con un buffer de elucin. Principio. En la cromatografa de afinidad, las protenas se unen

especficamente a un ligando inmovilizado. Cuando el extracto crudo pasa a travs de la columna. Al lavar la columna, las protenas no ligadas se eliminan de la columna. Finalmente, la protena ligada es desplazada mediante la incorporacin del ligando libre que compite por sitios de unin de la protena. Alternativamente, el desplazamiento de la protena unida puede ser logrado mediante cambio del pH o incrementando la fuerza inica del amortiguador o, en el caso de las protenas de unin a metales, mediante adicin de un quelante de metales, tales como el EDTA o EGTA (Ahmed 2005).

3. Consideraciones finalesUn paso de primordial cuidado para la purificacin exitosa de una protena consiste en la obtencin y preservacin de la fuente de protena, esta fuente debe permitir obtener la protena deseada en suficiente cantidad y calidad para estudios posteriores. Sin embargo, para poder evaluar las fuentes de protenas ser imprescindible contar un con una metodologa adecuada para la determinacin cuantitativa de la presencia de esta. La metodologa de deteccin de la protena de inters debera cumplir con dos criterios principales: ser experimentalmente conveniente, es decir lo ms sencilla de realizar; pero sobretodo, ser especfica para la actividad de inters (http 1). Dado que no todas las purificaciones son iguales, y el cientfico de separaciones se enfrenta con una gran variedad de tcnicas disponibles para lograr su meta, la mayora de purificaciones pretenden lograr los mismos resultados: Liberacin de la protena blanco desde el material de inicio 22

Eliminacin de slidos para dejar la protena en un sobrenadante Eliminacin de agua para concentrar la protena Eliminacin de contaminantes para lograr la pureza deseada Estabilizacin de la protena blanco

Un proceso de purificacin bien diseado no debe solamente tener pasos optimizados para lograr los objetivos mencionados, sino que tambin estos pasos deben estar enlazados en una secuencia que permita que el producto de un paso alimente al siguiente con ajuste mnimos. Esto es particularmente importante cuando un proceso va a ser escalado (Roe 2001). Leser y Ajenjo (1994) sealan que el complejo problema de seleccionar una secuencia ptima para el proceso de purificacin de protenas a partir de mezclas complejas puede ser simplificado. La utilizacin de una aproximacin racional basada en la explotacin de las propiedades fisicoqumicas fundamentales de las molculas proteicas llevar a decisiones coherentes y optimizadas. Para ayudar a cumplir esta tarea el uso de tcnicas computacionales contemporneas apoyadas por la computacin simblica ha probado ser una herramienta extremadamente til. Estas tcnicas son desarrolladas para la consecucin de soluciones optimizadas para aplicaciones de produccin a gran escala, pero tambin para encontrar esquemas de separacin simples y ptimos en el laboratorio de investigacin.

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http1. Cornell University. Studying proteins and protein purification, revisada 20/05/2010 http://wwwusers.med.cornell.edu/~jawagne/proteins_&_purification.html#The value of protein purification. Janson J-C y Rydn L. 1998. Protein purification: Principles, high resolution methods, and applications. 2nd ed. John Wiley & sons. Estados Unidos de America. Kennedy RM. 1990. Hydrophobic chromatography, Methods Enzymol., 182:339. Leser E y Ajenjo A. 1994. Protein recovery, separation and purification. Selection of optimal techniques using an expert system. Mem inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 89(1):99-109. Pharmacia Fine Chemicals. 1980. in Chromatofocusing with Polybuffer and PBE, Uppsala, Sweden. Roe S. 2001. Protein purification techniques: A practical approach. 2nd edition. Oxford University Press. Great Britain. Soderberg L, Laas T & Low D. 1982. Chromatofocusing: A new high resolution method for protein fractionation, Protides Biol. Fluids, 29:955. Scopes RK.1993. in Protein Purification: Principles and practice, SpringerVerlag, New York.

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