proteiner og massespektrometri

• Udover vand, er de stoffer, som der er mest af i vores krop, proteiner. Proteiner er stoffer, der f.eks. bruges som kroppens byggematerialer og dermed er med til at give de celler, som kroppen består af, deres struktur. Desuden virker mange proteiner som små maskiner (enzymer), der eksempelvis medvirker til at danne energi til kroppens celler fra den mad, vi spiser.

• Proteiner er dannet af lange kæder af en type af kemiske stoffer kaldet aminosyrer. Korte kæder af aminosyrer kaldes peptider.

• Da proteiner medvirker i så mange processer i vores krop, er de også involveret i de fleste sygdomme, hvilket gør det vigtigt at vide, hvordan de fungerer både enkeltvis og indbyrdes for at kunne forebygge og behandle disse sygdomme.

• Viden om, hvordan proteinerne fungerer kan bl.a. opnås ved hjælp af massespektrometri (også kaldet MS), der er en teknik, der kan bestemme massen (vægten) af meget små molekyler. Ved at kende vægten af et protein og rækkefølgen af de aminosyrer, som udgør proteinet, kan man ved hjælp af computerbaserede databasesøgninger identificere proteinet.

• Før man skal analysere et protein, bliver det ofte fordøjet (nedbrudt) til peptider ved hjælp af et fordøjelsesenzym, da peptider er lettere at analysere end et helt protein.

Proteiner og massespektrometri

Protein Peptider

Nedbrydning til små dele(peptider) vha. fordøjelsesenzym

• Massespektrometrets ionkilde laver først peptiderne om til ladede stoffer (ioner), som kan flyve i et elektrisk felt. Vægten af et peptid kan f.eks. bestemmes (alt efter typen af massespektrometer) efter, hvor lang tid det tager peptid-ionen at flyve en vis afstand i et lufttomt rør i massespektrometret, inden de rammer en detektor. De første peptider, som når detektoren, er de letteste, mens de tungeste er længere tid om det.

• Udover vægten af et peptid, kan den nøjagtige rækkefølge af aminosyrer i et peptid også bestemmes. Dette sker, ved at lade peptip-ionen kollidere med en gas-art i røret, hvorved peptidet bliver nedbrudt til mindre stykker, hvis vægt man selvfølgelig også kan bestemme. Denne proces kaldes MS/MS, da man først laver massespektrometri på peptidet og derefter på dets fragmenter. Ud fra vægten af disse fragmenters kan aminosyrerækkefølgen bestemmes.

Proteiner og Massespektrometri

Ion-kilde hvor de ladede peptid-ioner dannes

Lufttomt rørmed elektrisk felt

Detektor Computer

++ -

-+Flyveretning

+

+

+ +


Detektor Computer

+ -

-+Flyveretning

Område i rørmed kollisions-gas

Nedbrydning af peptider til aminosyrer ved kollision med gas

Alanin

Glycin

Prolin

Argenin

Serin++

+

+++

• Når man både kender peptidets masse og aminosyrerækkefølge, kan man ved hjælp af en computer søge efter dette bestemte peptid i en database over alle kendte proteiner og dermed finde det protein peptidet stammer fra.

• Ved at udnytte disse massespektrometriske teknikker kan man designe eksperimenter, som kan afsløre, hvilken rolle proteinerne spiller i en bestemt sygdom, og dermed give mulighed for at lave lægemidler, som kan kurere sygdommen.

Identifikation af peptiderComputerbaseret databasesøgning

Aminosyrerækkefølge: glycin-serin-alanin-prolin-argeninVægt: 543.3 Da

Proteinsekvens:

…alanin-lysin-glycin-serin-glycin-alanin-prolin-argenin-alanin-leucin-…

Teoretisk peptid-vægt: 543.27649 Da

Aminosyresekvens:

glycin-serin-glycin-alanin-prolin-argenin

Målt peptid-vægt: 543.3 Da

Match:

Behandling af data

Proteiner og Massespektrometri

Protein Peptider

Nedbrydning til små dele(peptider) vha. fordøjelsesenzym Analyse af peptider vha.

massespektrometri

Identifikation af peptiderComputerbaseret databasesøgning

Identifikation af protein

Aminosyrerækkefølge: glycin-serin-alanin-prolin-argeninVægt: 543.3 Da

MS(bestemmelse af peptiders masse)

MS/MS(bestemmelse af peptiders aminosyrerækkefølge)

Behandling af data


Lufttomt rørmed elektrisk felt

Detektor Computer

++ -

-+Flyveretning

+

+

+ +


Detektor Computer

+ -

-+Flyveretning

Område i rørmed kollisions-gas

Nedbrydning af peptider til aminosyrer ved kollision med gas

Alanin

Glycin

Prolin

Argenin

Serin++

+

+++

Identifikation af et protein vha. massespektrometri

R:\Kasper E-K\Fra Søren\PR_FT00453 23/05/2006 15:09:56 ssj. glyco 2

RT: 0.00 - 65.16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

58.70

58.94

59.1139.16 39.54 50.8423.86

39.01 50.6224.31 51.2123.73 40.1024.76

40.4625.09 29.01

51.6340.7429.5128.60 59.5152.0042.1730.05 33.74 34.16 53.1743.2923.65 47.83 60.5718.0614.0612.1511.116.342.61

NL:1.84E8

TIC MS PR_FT00453

PR_FT00453 #611-678 RT: 15.98-16.76 AV: 7 NL: 6.25E3T: FTMS + p NSI Full ms [300.00-1600.00]

631.6 631.8 632.0 632.2 632.4 632.6 632.8 633.0 633.2 633.4

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

631.79

632.29

632.79

633.29631.75 632.22 632.87

Zoom

Et massespektrumHver signal/top i massespektret repræsenterer en peptid-ion. Ud af x-aksen er vægten af ionen og op ad y-aksen signalets styrke

Her er der zoomet ind på en enkelt peptid-ion. Den udgøres af en række såkaldte isotop-toppe. Dette skyldes, at atomerne af de grundstoffer, som peptidet indeholder, findes i forskellige udgave (isotoper). F.eks. findes kulstof (carbon) mest som kulstof-12,men ca. 1% af alt kulstof på Jorden er det tungere kulstof-13. Derfor findes der mange udgaver af peptid-ionen i massespektret,som indeholder forskellige kombinationer af lette og tunge isotoper. Den letteste top (længst til venstre) er en peptid-ion kunindeholdende de letteste isotoper af grundstofferne i peptidet (f.eks. kulstof-12, nitrogen-14 eller hydrogen-1), mens den næsteindeholder et enkelt atom af de tungere isotoper (f.eks. kulstof-13, nitrogen-15 eller hydrogen-2), den næste indeholder to tunge isotoper osv.

Peptid kun indholdende lette isotoper

Peptid indeholdende et enkelt atom af en tung isotop

Peptid indeholdende to atomer af tunge isotoper


RT: 0.00 - 65.16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

58.70

58.94

59.1139.16 39.54 50.8423.86

39.01 50.6224.31 51.2123.73 40.1024.76

40.4625.09 29.01

51.6340.7429.5128.60 59.5152.0042.1730.05 33.74 34.16 53.1743.2923.65 47.83 60.5718.0614.0612.1511.116.342.61

NL:1.84E8

TIC MS PR_FT00453

PR_FT00453 #611-678 RT: 15.98-16.76 AV: 7 NL: 5.59E4T: FTMS + p NSI Full ms [300.00-1600.00]

300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

388.26

875.93

445.12512.24402.24

633.65 802.44531.26371.23 1023.48606.30416.23

650.78 813.84697.64467.25 1075.44764.79

850.37

877.93

1174.48363.17 981.92938.40 1127.41

902.68


RT: 0.00 - 65.16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

58.70

58.94

59.1139.16 39.54 50.8423.86

39.01 50.6224.31 51.2123.73 40.1024.76

40.4625.09 29.01

51.6340.7429.5128.60 59.5152.0042.1730.05 33.74 34.16 53.1743.2923.65 47.83 60.5718.0614.0612.1511.116.342.61

NL:1.84E8

TIC MS PR_FT00453

PR_FT00453 #652 RT: 16.51 AV: 1 NL: 9.37E4T: FTMS + p NSI Full ms [300.00-1600.00]

300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce875.93

388.26462.29

402.24 512.24 802.44584.29

416.23 1023.48824.80604.96 649.94467.25 558.28

519.14

712.38371.23

877.93

799.03 974.41 1075.45 1174.48940.74862.01 1105.38

902.68

327.11

MS spektrum(fuldt spektrum)

MS/MS spektrum (zoom i massespektrum over nogle af fragmenterne fra 730,32 ionen )

Peptid-ion udvalgttil fragmentering (631,78)


RT: 0.00 - 65.16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

58.70

58.94

59.1139.16 39.54 50.8423.86

39.01 50.6224.31 51.2123.73 40.1024.76

40.4625.09 29.01

51.6340.7429.5128.60 59.5152.0042.1730.05 33.74 34.16 53.1743.2923.65 47.83 60.5718.0614.0612.1511.116.342.61

NL:1.84E8

TIC MS PR_FT00453

PR_FT00453 #657 RT: 16.59 AV: 1 NL: 3.16E2T: ITMS + p NSI d w Full ms2 [email protected] [160.00-1275.00]

200 250 300 350 400 450 500 550 600

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

387.18

272.18

500.27248.00

571.27

588.27361.09 476.18

597.36213.00

513.91 553.36196.00 458.27331.91 401.09 488.36443.18370.18220.00 274.00185.09 314.18

MS/MS

alaninisoleucinaspartat

Efter fragmentering af peptidet med massen 631,78 kan noget af aminosyrerækkefølgen ”læses” ved hjælp af afstanden mellemde forskellige toppe i massespektret, der svarer til vægten af de enkelte aminosyrer i peptidet. Dette peptid indeholder altså aminosyrerne aspartat,isoleucin og alanin. Denne information, sammen med den nøjagtige vægt af peptidet kan bruges til at identificere det protein, peptidet stammer fra.

Massespektrometri på et peptid

proteiner og massespektrometri

Documents