Prof. Dr. Feray KKAR Emre YAVUZ

Bir zeltideki toplam protein miktarnn belirlenmesi, bilimsel aratrmalarda, gda analizlerinde, endstriyel ve biyoteknolojik birok rnn analizinde kullanlr. Proteinlerin saflatrma basamaklarnda mutlaka protein tayinleri yaplmaldr.Saflatrlan protein bir enzimse; buna ek olarak aktivite tayinlerinin de yaplmas gerekir.

1. 2.

3.4. 5.

6.

*Bilinen 6 yntem mevcuttur. Kjeldahl Metodu UV Absorpsiyonu Bradford Metodu Biuret Metodu Folin Lowry Metodu BCA Yntemi

Yntem 1883 ylnda Johan Kjeldahl tarafndan gelitirilmitir. Bileiklerin azot miktarn belirlemek iin kullanlan olduka eski bir yntemdir. Bu yntemde protein numunesi H2SO4li ortamda paralanr. Bylece proteinin ierdii azot (NH4) 2SO4a dnr.

(NH4) 2SO4a dnen azot destilasyon cihazna alnr ve NaOH ilave edilir. Oluan NH3 destillenerek alnr.HCl zeltisine gnderilerek, NaOH titre edilir.

Proteindeki azot oranndan hareket ederek protein miktar belirlenir.

Amonyak buhar

rnek+ NaOH

Toplama kab

Protein Numunesi

10 M 50 ml slfrik asitli ortamda 1-2 saat kadar stlarak paralanr.

Paralanm proteinin ierdii azot amonyum slfata dnr.(NH4)2SO4

Proteinler %16 azot ihtiva ettii iin 6,25 ile arplr.

Geri titrasyon yntemiyle mevcut amonyak miktar bulunur.

Ar NaOH ile ortam bazikletirilir ve amonyumun amonyaa dnm salanr.

Yntem btn protein molekllerinin saf polipeptit zincirinden ibaret olup yaklak % 16 orannda azot ierdikleri varsaymna dayanr. Bulunan mg azot miktar 6,25 ile arplarak protein miktarna geirilir. Byk miktarda numunelerle allrken bu metot kullanlabilir. Genellikle bitki materyallerinin ve hayvan yemlerinin analizinde ok kullanldr. Kuru kan rneklerindeki azotu belirlemek iinde bu metot kullanlr. Bu yntemin hassasiyeti iyi deildir.

LM

Protein zeltisinin UV absorbsiyonunun llmesi.

Protein zeltisinin bir belirtele reaksiyona sokulup oluan renkli bileiin (kromofor) grnr alanda llmesi.

*Bu yntemde, allan zeltinin UV absorbsiyonu dorudan llr ve protein deriimi hesap yoluyla bulunur.*Dier yntemlerde ise belirtelerle ilem sonucu oluan renkli bileiin absorbsiyonu belirlenir ve deriimleri bilinen satandart protein zeltilerinin ortaya koyduu verilerle karlatrlr.

Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birok proteinin 280 nmde maksimum absorbsiyon gsterme zelliinden yararlanlarak rnekteki protein miktarnn yaklak olarak bulunmas iin kullanlan hzl bir yntemdir.

Bu yntem ok duyarl olmamakla beraber (duyarllk: 0.05-2.0 mg/ml), kolayl ve hzl sonu vermesi nedeniyle ok kullanlan bir tekniktir. Ancak, 260 nmde maksimum absorbsiyon gsteren nkleik asitlerin 280 nmde de absorbsiyon yetekleri olduu unutulmamaldr. Bu nedenle nkleik asit artklar ile alldnda hatal sonular elde edilebilir. Bunun nne gemek iin, Warburg ve Christian (1941) tarafndan gelitirilmi bir seri hata dzeltme faktr ile ortaya kabilecek hata pay daha aza indirgenebilmektedir.

Diyaliz ya da fraksinasyon (Ters Difzyon) yoluyla protein olmayan maddelerin uzaklatrlmasndan sonra 260-280 nmde UV. absorbsiyon analizleri yaplr. Protein konsantrasyonu ( mg/ml ) = 1.5 x A280 - 0.75 x A260

Boya balama esasl yntemlerin en yaygn 1976 ylnda Bradford tarafndan gelitirilen ve Coomassie Brillant Blue G250 boyasnn kullanld yntemdir.

Metodun Prensibi: Proteinlerin fosforik asitli ortamda Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) boyas ile kompleks yapma esasna dayanr. Bu boya negatif ykldr ve pozitif ykl proteinlerle kompleks yaparak krmz renkten (Amax=465) mavi renge (Amax=595) dnr.

Coomassie Blue G-250 zeltisi hazrlanr. (Literatrde mevcut)

1 mlsinde 1 mg protein ihtiva eden standart albumin zeltisinden tplere 10,20,30,40,50,60,70,8 0,90,100 l alnr

Saf su ile hacim 100 l ye tamamlanr. 5 ml Coomassie Blue reaktifinden her bir tpe ayr ayr ilave edilir.

Numuneye ayn ilemler uygulanp, absorbans llerek standart grafikten protein miktar belirlenir.

Absorbans deerlerine karlk gelen mg protein deerlerinden faydalanlarak standart bir grafik hazrlanr.

10 dk inkubasyona braklr ve 595 nm de kre kar absorbanslar okunur.

Yntem ok basit ve hzldr. Oluan reaksiyon hzldr ve 2 dakika ierisinde tamamlanr. Oluan renk stabildir. Reaktif hazrland zaman renkli ielerde uzun sre saklanabilir. Standart eri uzun sre kullanlr.

Renk iddeti ph deiimine kar ok duyarldr. Standart erinin elde edilii zordur.nk geni bir konsantrasyon aralnda lineerlik salanamamaktadr. SDS ve Triton X-100 gibi maddeler bu reaksiyon iin bozucu faktrlerdir. Boya kvetlerde kalnt brakt iin kvetler tek kullanmlk olmaldr.

Ama: Konsantrasyonu bilinmeyen maddelerin standart eriden tayin edilmesi. Metodun prensibi: ki ya da daha fazla peptid bana sahip peptidler ya da proteinlerin bazik ortamda Cu +2 iyonu ile mor-mavi kompleks yapmas esasna dayanr. Bu kompleks iki peptid zincirindeki 4 azot atomunun ortaklamam elektronlar ile Cu +2 iyonu arasnda gerekleir. Oluan renkli bileik 546 nmde llebilir. Duyarll dk (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratiklii nedeniyle geni apta kullanlan bir yntemdir.

Oluan renk iddeti sadece proteine aittir. Burada nkleik asitlerin bulunmas lm etkilemez. Pratik bir yntem.

Bu metot sonucu protein baka bir molekle dnt iin onu geri kazanmamz olanakszdr. Amonyak ve amonyum iyonlar bozucu faktr olduundan amonyum slfat ktrmesi sonucu elde edilen protein numunesine direkt uygulanamaz.Duyarll dk.

Biuret zeltisi Hazrlanr

(Literatrde mevcut)

Biuret reaksiyonu iin nceden bir standart erinin hazrlanmas gerekir.

Bu maksatla 7 ayr tpe sr albumin zeltisinden srasyla 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 ml konulur.

Her bir tpe 1,5 ml Biuret reaktifi ve 1ml destile su konur.

5 dk 1200 rpmde santrifjlenir. Proteinler tp tabanna km olacandan stteki sv atlr. Her tp 1-2 dakika bir szge kadnn stne ters evrilerek konur.

Her tp 2 ml destile su ile tamamlanr. 3mllik trikloroasetikasit den 4 er damla (0,4 ml) eklenir.

45 dakika beklendikten sonra 546 nmde kr olarak kullanlan 1. tp sfr absorbansa ayarlanarak btn tpler srasyla okutulur.

Absorbans deerleri mg proteine kar grafie geirilir.

Bilinmeyen proteinin absorbans deeri ayn ilemler tekrarlanarak llr. Grafikten protein miktarna ulalr.

Peptit Zinciri

Mor Biuret Kompleksi

absorbans

rnek

0

1

2

4

6

8

10 12

Deriim mg/ml

Protein Miktarlarna Gre renk gstergeleri

Folin Lowry yntemi, protein miktarnn Biuret ynteminden daha duyarl olarak belirlenmesini salayan bir metottur. Bu yntem iin Biret ynteminin bir modifikasyonudur diyebiliriz. Hassasiyet aral 5 - 100 g/mldir. Yntem alkali koullarda meydana gelen iki farkl reaksiyona dayaldr.

1. Reaksiyon Amid balar ile bakr arasnda meydana gelen ve indirgenmi bakr oluumu ile sonulanan Biret reaksiyonu

2. Reaksiyon Folin-Ciocalteu ayracnn (fosfomolibden ve fosfotungsten) tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenmesi ndirgenmi ayra mavi renktedir.

Oluan rengin iddeti 660 nmde spektrofotometrik olarak llebilir. Bu iki reaksiyonu bir arada gereklemesi Biret reaksiyonunun hassasiyetini 100 kat artrr. Lowry yntemi pH hassasiyeti gsterir, ortam pHs 10-10.5 olmaldr. Yntem triptofan ve tirozin ierii fazla olan proteinlerin miktar tayini iin avantajldr zira ayra bu amino asitlere daha yksek hassasiyet gsterir.

ndirgenmi bakr ve proteinlerin yan zincirinde bulunan Tyr, Trp ve Cys a.a.lar Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek mavi-yeil rengin olumasna neden olur.

nce 1 ml %5 bakrslfat penta hidrat ve %1 sodyum potasyum tartarat, %2 sodyum karbonat ieren 0,1 M sodyum hidroksit zeltisi ierisinde hazrlanr.

0,5 ml protein zeltisi hazrlanan reaktifin 5 mlsi ierisine katlr. Ve sonra 10 dk kadar beklenir.

Folin-Ciocalteu fenol reaktifinden 0,50 ml hzl bir ekilde eklenerek kartrlr. 30 dk bekletilir.

Serum albumin gibi proteinlerden 20-400g/ml konsantrasyon serisi kullanlarak standart eri hazrlanr.

Absorbans 660 nmde llr.

Lowry yntemi, hassasiyetinin iyi olmas ve kolayl asndan protein biyokimyas ilemlerinde ok fazla kullanlr. En fazla gda proteinlerinin tayininde kullanlr. nk gda karmndan proteinleri izole etmeye gerek yoktur. Biret yntemine gre 50-100 kez daha hassastr. 280 nm de absorbans yntemine gre ise 10-20 kez hassastr. Dier yntemlere gre daha spesifiktir.

Renk oluumu proteinlere gre farkllk gsterebilir. Renk tamamen protein konsantrasyonuyla orantl olmayabilir. Lipitler, sakaroz, fosfat tamponlar, monosakkaritler ve hegzoaminlar giriim yaparlar.

Bu yntem Lowry metodunun deiik bir uygulamasdr. Folin-Lowrynin 2. reaksiyonundaki fosfomolibdotungstat tuzu yerine BCA (bicinchoninic acid) kullanlr. BCA, proteinlerden elektron alarak Cu+2 formundan Cu+1 formuna indirgenen bakr katyonlarna balanr.

Reaksiyon sonucu oluan renk 560 nmde spektrofotometrik olarak llr.

BCA yntemi proteinin amino asit kompozisyonundan az etkilenir ve giriim etkisi gsteren ok fazla bileik yoktur. Amino asitler, lipitler, ekerler ve nkleik asitler Lowry metoduna gre daha iyi tolere edilir. Lowry metoduyla hemen hemen ayn hassasiyeti gsterir. UV ve Biuret metotlarndan ise daha duyarldr. Deterjanlardan etkilenmez.

BCA reaktifi pahaldr ve tekrarlanabilirlik dktr. ndirgen ekerler ve bakr elatlayc maddeler bu yntemde giriim etkisi gsterir. Cu+2 iyonlar ile elat oluturan EDTA gibi maddeler de giriime yol aar. ndirgen ajanlar, triptofan, tirozin, sistein, hidrojen peroksit gibi bir ok bileik bu yntem iin problemdir.

BCAFolin - Lowry

BradfordBiuret

UV AbsorbsiyonKjeldahl