proprietà della vita la cellula classificazione dei...

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�Proprietà della VITA

�La CELLULA

�Classificazione dei viventi

Diversità tra i viventi

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Ciascun vivente nasce, cresce, genera dei figli a lui simili e muore. La nascita, la crescita, la generazione di figli e la morte rappresentano le più evidenti manifestazioni della vita.Perché un vivente può realizzare questi eventi ?

Tutti i viventi possiedono delle caratteristiche comuni

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La vita è organizzata su più livelli di complessità crescente

Organizzazione

part

icel

le

suba

tom

iche

atomo molecola popolazione comunità ecosistema biosfera

organismo

apparatoorganotessutocellulaorganulo

Tutti i viventi sono formati da materia, organizzata in molecole, come i non viventi. La composizione chimica del vivente è, tuttavia, qualitativamente diversa rispetto a quella dell'ambiente che lo circonda. Le molecole dei viventi, inoltre, sono organizzate in "impalcature" che costituiscono sistemi altamente complessi.

Le proprietà della vita (1/4)

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Capacità di trasformare materia ed energia

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Per mantenere la loro particolare organizzazione i viventi devono assumere materia e “spendere”energia. L’energia è indispensabile per trasformare la materia in strutture viventi.

Attraverso la nutrizione il cibo

viene trasformato in materia vivente


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3 Capacità di rispondere agli stimoli

4 Adattamento

Un vivente è in grado di reagire

di fronte al pericolo

e di adattarsi ai cambiamenti ambientali


Un vivente può muoversi per afferrare la preda, per sfuggire al pericolo, o, come nel caso delle piante, per “inseguire”la luce.

Un vivente è inoltre in grado di trasformarsi per sopravvivere anche in condizioni avverse (evoluzione).

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5 Capacità moltiplicarsi

La riproduzione consente di mantenere

la vita nel tempo


Qualsiasi organismo vivente èdestinato presto o tardi a scomparire: con la riproduzione la vita passa da un individuo all’altro, permettendo la perpetuazione della specie.

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CELLULA si riproducescambia materia

ed energia

con l’ambiente

si autoregola

si può evolvere

La cellula : espressione minima della vita

Tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule: è la cellula la piùpiccola porzione organizzata di materia che possiede le caratteristiche della vita.

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parete cellulare

ribosomicitoplasma

regione nuclearemembrana cellulare

La cellula procariota è organizzata per garantire la sopravvivenza di organismi molto semplici, con minime richieste energetiche, e non risulta specializzata nel compiere funzioni particolari.

Tutto il volume cellulare è occupato da un liquido di consistenza gelatinosa (il citoplasma), in cui sono immersi tuti i costituenti chimici della cellula, e dei piccoli organuli (ribosomi), deputati alla sintesi delle proteine.

Il materiale genetico (DNA) si trova fluttuante nel citoplama, in una regione priva di una membrana che la delimiti (non esiste un nucleo vero e proprio).

Esiste invece una struttura rigida di protezione e di contenimento, la parete cellulare, che la separa dall’ambiente esterno.

La cellula procariota

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membrana cellulare

nucleo

citoplasma

membrana nucleare

mitocondri

La cellula eucariota è un tipo di cellula molto più voluminosa e complessa della cellula procariota. Al suo interno lo spazio èorganizzato in settori cui compete una certa funzione in modo da assicurarne la sopravvivenza e la riproduzione.

Le diverse regioni all’interno della cellula sono delimitate da membrane interne. In particolare , una membrana (membrana nucleare) delimita il nucleo, in cui si trova il materiale genetico (DNA) che presiede al controllo di tutte le attività della cellula stessa.

La cellula eucariota possiede inoltre numerosi organuli, in alcuni dei quali hanno luogo i processi metabolici fondamentali : nei ribosomi, ad es.,avviene la sintesi delle proteine; i mitocondri sono la sede della respirazione cellulare

La cellula eucariota

Reticolo endoplasmaticocon ribosomi

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SPECIEGeneri

Famiglie

Ordini

ClassiPhyla

DivisioniREGNI

La chiave della classificazione naturale del mondo vivente è la specie .

Tassonomia : livelli gerarchici

Riconoscere individui della stessa specie può risultare abbastanza complesso. Ecco una definizione di specie universalmente accettata: “la specie rappresenta una categoria sistematica comprendente una o più popolazioni di individui con caratteri simili, in grado di accoppiarsi originando prole feconda”.

Varie specie con caratteristiche comuni vengono raggruppate in generi; a loro volta i generi possono essere riuniti tra loro per alcuni caratteri generali e raggruppati in famiglie; le famiglie in ordini; gli ordini in classi; le classi in tipi di phila per gli animali e divisioni per i vegetali; i phila/divisioni in regni.

Linneo

11MONERE

PROTISTI

PIANTE ANIMALIFUNGHI

Organismi unicellulari procarioti

Organismi eucarioti per lo più

unicellulari

Organismi eucarioti pluricellulari

( differiscono principalmente per il modo di nutrirsi )

I cinque regni

Il modello ad albero di Whittaker in cinque regni evidenzia l’origine comune e la successiva evoluzione di tutte le forme viventi.

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Caratteristiche dei regni

Regno Tipo cellula Nutrizione Num. cellule

Monere Procariote Autotrofi e eterotrofi

Unicellulari

Protisti Eucariote Autotrofi e eterotrofi

Principalmente unicellulari

Funghi Eucariote Eterotrofi Principalmente pluricellulari

Vegetali (Piante) Eucariote Autotrofi Pluricellulari

Animali Eucariote Eterotrofi Pluricellulari

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Coltura Cellulare

●Insieme di cellule mantenute “in vitro”, derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue.

●Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita.

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Coltura Cellulare

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Tecniche Sterili o Asettiche

• Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne

• Per impedire la contaminazione di se stessi o di terzi

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Metodi di Sterilizzazione• Sterilizzazione al calore rosso su fiamma

• Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160°C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio

• Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 °C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo l’uso

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Laboratorio di Coltura Cellulare

• Spazio o area di lavoro• Abbigliamento da laboratorio• Reagenti colturali• Vetreria e Plastica di laboratorio• Cappa a flusso laminare

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CAPPA A FLUSSO LAMINARE

• Flusso laminare:flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, para lleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici.

• Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.

• Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente

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Cappa a flusso laminare di classe II

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●Cappe biologiche di classe II:maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica

●Cappe biologiche di classe III:caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa.

I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita

-Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente.

-Manipolazioni ad alto rischio biologico

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●All’interno dell’organismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di pH, protezione, mantenimento della temperatura…) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo. Una volta che le cellule sono nel terreno di cultura, queste funzioni, oltre all’ambiente di coltura, devono essere sostituite dallo strumento.

Condizioni fisico-chimiche

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● pH 7.2-7.4

● Sistema tampone (NaHCO3)

● Temperatura 35-37°C

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● Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37°C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30°C o 34°C.

● Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente.


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Condizioni fisico-chimiche●Molte colture cellulari sono tamponate con bicarbonato per mantenere costante il pH

●Il pH del terreno dipende generalmente dalla %CO2 nell’incubatore

●La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0.5% a 8.5% in funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH desiderato

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Relazione tra [NaHCO3] e il pH

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● In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita.


rosso-arancio a ph 7.3

rosso-viola a ph alcalino

giallo-arancio a ph acido

Rosso Fenolo

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●La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al 4.6- 5.9% di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo dellecellule.

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●Triturazione tessuto

● I frammenti vengono sottoposti all’azione di agenti chelanti(EDTA,) o enzimi proteolitici (tripsina o collagenasi) che degradano la matrice del tessuto

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Sospensione Cellulare Mista

Approcci per separare i diversi tipi cellulari:●proprietà fisiche●capacità di adesione●proprietà di legame con anticorpi specifici●uso di terreni o condizioni di coltura selettivi

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Tipi di Coltura di Cellule “in vitro”

Coltura Primaria Coltura Secondaria

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Coltura Primaria

●Coltura preparata direttamente da un tessuto:le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitrodopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita)Vantaggi : le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo

Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a l ungo termine

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Ciclo vitale di Cellule Primarie

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●Isolamento di ceppi clonali: il programma genetico della senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte

● Derivazione: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali

Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose

Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie

Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare

Linea Cellulare Continua

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Coltura Primaria

Coltura a breve termine Coltura a lungo termine

< 10 duplicazioni 50-60 duplicazioni

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Coltura Secondaria


>150-200 duplicazioni

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• Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata

• Crescita ininterrotta per oltre un anno• Immortale

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Le prime Linee Cellulari Continue

1952, Johns Hopkins University

1963, University of Ibadan

HELA RAJI

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Medium di Coltura

●I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule

●I più comuni terreni base di coltura:

-MEM: Minimum Essential Medium

-DMEM: Dulbecco’s modification of MEM

-RPMI: Roswell Park Memorial Institute

Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e sali e per la concentrazione di glucosio

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Medium di ColturaSali inorganici

▪ Cloruro di calcio anidro▪ Solfato di magnesio anidro▪ Cloruro di potassio▪ Nitrato di potassio▪ Cloruro di sodio▪ Fosfato di sodio bibasico▪ Bicarbonato di sodio

Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo

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Medium di ColturaVitamine

BiotinaPantotenatoAcido folicoInositoloNicotinamidePiridossinaRiboflavinaTiaminaVitamina B12

Agiscono come catalizzatori o come substratiper facilitare o controllare alcune funzionimetaboliche

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Medium di ColturaAmminoacidi-isomeri L

AlaninaArgininaAsparaginaAcido asparticoCisteinaGlutaminaAcido glutamicoGlicinaIstidinaIsoleucina

LeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaProlinaSerinaTreoninaTriptofanoTirosinaValina

Necessari per la sintesi delle proteine

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Medium di ColturaZuccheri

Rappresentano la principale fonte di energia o di carbonioper le biosintesi

Glucosio

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Medium di Coltura• Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di

essere utilizzato, viene complementato con:

• Glutammina (aa essenziale molto labile)

• Antibiotici (penicillina/streptomicina)

• Siero (supplemento più comune delle colture cellulari)

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SIERO

• Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule

• Fattori di crescita:PDGF, EGF, IGF

• Fattori di adesione:fibronectina, vitronectina

• Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali

Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS)

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SIERO

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Sistemi di CrescitaADESIONE: cellule di origine nervosa, epiteliale o mesenchimale (che in vivo fanno parte di tessuti solidi)

SOSPENSIONE: cellule di origine ematopoietica (che normalmente vivono in un mezzo fluido)

Fenomeno che richiede l’interazione di recettori di membrana con proteine adesive, adsorbite sulla superficie della piastra di coltura

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Distacco delle cellule in adesione

• Soluzione di EDTA e tripsina-EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per

l’adesione-Tripsina: enzima proteolitico, derivato da

pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato

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Protocollo di tripsinizzazione

●Lavare le cellule (2X) con PBS (phosphate bufferedsaline)

●Aggiungere un volume adeguato di tripsina (pre-riscaldata)

●Incubare a 37°C per almeno 3 min

●Neutralizzare la tripsina con medium completo di FBS( che contiene inibitori della tripsina)

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Protocollo di tripsinizzazione

●Trasferire la sospensione inaprovetta e centrifugare 5 minper 900-1000 giri al min

●Aspirare il sovranatante

●Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule

●Distribuire nelle nuove piastre

Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapiditàin modo da tenere le cellule fuori dall’incubatore il minor

tempo possibile

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Plastica per coltura• Sono generalmente in polistirene:-materiale rigido con superficie lucida

-buona resistenza chimica a soluzioni acquose

-limitata resistenza a solventi

-totale assenza di tossicità per le cellule in coltura

-trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio

-la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

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Efficienza di semina-Generalmente le cellule, al di sotto di una certa

densità non crescono in modo efficiente

-Regola generale: densità > 104 cellule/cm2

Tempo di duplicazione-La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione-Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule umane

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Piastre

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Tipi di Piastre

20-30148150

10-1255100

4-52160

1-2835

Volume

(ml)

Superficie (cm2)

Diametro (mm)

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Multi-well

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Tipi di Multi-well

1,0-2,43,8312

2.0-3,09,406

0,5-1,21,8824

0,3-0,61,048

0,1-0,20,3296

Volume

(ml)

Superficie (cm2)

Multi-well

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Fiasche

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Tipi di Fiasche

35-60175T-175

45-70225T-225

30-50150T-150

15-2575T-75

5-1025T-25

Volume

(ml)

Superficie (cm2)

Fiasche

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microscopio a contrasto di fase: un diaframma anulare origina un cono di luce cavo.

quando un raggio di luce colpisce un campione viene ritardata rispetto ad un raggio che non colpisce il campione

i due raggi vengono rimessi in fase passando une lamina di fase e formeranno un'immagine definita

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FIBROBLASTIFIBROBLASTI

microscopio a contrasto di fase (400X)

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Coltura primaria in confluenza alla fine della seconda settimana

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Conta Cellulare

• Diversi metodi: un metodo semplice ed economico èl’uso dell’emocitometro o camera di Burker

-La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata una camera capillare; la parte superiore della

camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente.

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Procedura per Conta CellularePrima del conteggio si devono staccare le cellule dalla piastra e eliminare gli aggregati cellulari mediante trattamento enzimatico o chimico (es. tripsina, EDTA). La conta del numero di cellule in genere si effettua con la camera di Burker.Questa è costituita da un vetro spesso, in cui è ricavata una camera capillare, la parete superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato da due graffe laterali.Al microscopio diventano evidenti una serie di linee ortogonali tra loro, che definiscono una serie di aree e, quindi, di volumi.

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Protocollo di Conta Cellulare

Per effettuare il conteggio:dopo aver pulito la camera, montata correttamente, depositato undato volume di cellule, al microscopio si contano le cellule presenti nei quadrati delimitati da una doppia barra e quelle presenti su due lati dello stesso quadrato (non si contano, invece, quelle su gli altri due lati).Si ripete la conta per almeno tre quadrati, si fa una media del numero di cellule contate e si ricava il numero totale di cellule moltiplicando il numero ottenuto per 25x104; si corregge poi per il volume totale della sospensione (il numero che si ottiene è riferito, altrimenti, ad 1ml).

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Numero di cellule

-La sospensione cellulare viene risospesa in egual volume di Trypan blue-La sospensione viene fatta scorrere per capillaritàall’interno della cameretta-Si contano le cellule non colorate e quelle colorate

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Percentuale di Vitalità

-Il trypan blue è in grado di colorare le cellule necrotiche-Percentuale di vitalità:N° cellule vitali/N°cell. non vitali + cellule vitali X 100

Concentrazione Cellulare

N° cellule vitali (media dei 3 quadrati) X 10000 X 2

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