PRODUCCION DE ENZIMAS

• De todas las enzimas que se producen : el 65% están relacionadas con la industria alimentaria, el 25% en producción de detergentes y 10% en el área farmacéutica.

• Existen más de 2000 enzimas caracterizadas. Las enzimas de naturaleza proteica actúan como biocatalizadores, y son responsables de las reacciones de transformación del metabolismo de los seres vivos. Lo que interesa saber es la actividad catalítica de cada enzima, ésta es regulada por el pH y la temperatura.

• La acción catalítica de las enzimas se diferencia por ser de efectividad exclusiva sobre un substrato no teniendo semejantes en la catálisis. La acción es en segundos y fracciones de segundos sin necesidad de bases ni ácidos fuertes. En la transmisión de la información hereditaria, las estructuras genéticas se controlan y dirigen mediante reacciones catalizadas por enzimas (enzimas de restricción y ligasas.

Fuentes de Enzimas • Son tejidos y órganos de animales, diferentes

plantas y microorganismos. En la producción industrial se utilizan microorganismos extraídos de fuentes naturales y cepas mutantes obtenidas como resultado de la acción de mutágenos de naturaleza física y química. Como resultado de investigaciones los microorganismos son capaces de sintetizar al mismo tiempo un complejo de diferentes enzimas pero dentro de las cepas mutantes se encuentran aquellas que pueden producir grandes cantidades de una sola enzima industrial importante.

Aplicaciones de enzimas en alimentos

Tecnología de Producción de Preparados enzimáticos

Los procesos de fermentación con cultivos en superficie se utilizan ampliamente además de los cultivos sumergidos para la producción de enzimas extracelulares fúngicos, y en este caso la masa semisólida de la post-fermentación se extrae usualmente con agua antes de ser filtrada. El sobrenadante o filtrado que contiene la enzima se concentra y se vende como una preparación enzimática líquida normalizada que contiene conservantes y estabilizantes, o se precipita, se seca y se muele con objeto de obtener la enzima en forma de polvo o gránulos.

El proceso de fermentación para la producción de enzimas intracelulares debe finalizar antes de que comience la lisis celular, que daría lugar a la salida de la enzima al medio. El aislamiento de enzimas intracelulares implica la ruptura de la célula seguido por el empleo de una combinación apropiada de técnicas bioquímicas de purificación para recuperar la enzima intracelular con unas especificaciones dadas.

Diagrama de flujo para la producción de enzimas industriales mediante fermentación.

• Cultivo microbiano

• Fermentador para siembra

• Cultivo sumergido Cultivo en superficie • • Extracción de agua y filtración

• Enzima líquida

• Enzima liquida concentrada

• Precipitación

• Filtración

• Adición de estabilizantes Secado por aire o por atomización

• Trituración

• Enzima líquido Enzima en polvo

Método en Superficie • Obtención del material de siembra Se utilizan hongos microscópicos,desarrollados en condiciones de cultivos sumergidos

en medios nutritivos líquidos. Medio de cultivo sólido Salvado de trigo húmedo: Debe ser poroso y con este fin al salvado de trigo húmedo

se le agrega 5-10% de aserrín de madera o 15-20% de germen de malta. Se esteriliza a: 0,15 MPa , una hora. Humedad del medio de cultivo enfriado a 35°C , 40-60%. A este medio de cultivo se le esparce una suspensión de conidios (500-600 mil ufc/ml)

y se coloca una capa de 10-15 cms en una cubeta para siembra estéril. Las cubetas se colocan en cámaras de crecimiento; El primer día a 28-32°C , humedad 70-95%.

El segundo día a 26-30 °C ,humedad 60-85%. El tercer día a 24-26°C , humedad 55-64%.

El máximo de formación de conidios ocurre a las 72-85 horas de crecimiento. Luego las cubetas se mantienen 72-96 horas a 8-10 °C. Tiempo de duración de éste cultivo 15-20 días. Material de siembra en forma de esporas El cultivo se lleva a un separador vibratorio, donde se separan las esporas. Pasan por

un filtro poroso. Este material de esporas puede conservarse durante 1,5 añosa 8-24 °C.

Preparación del medio de cultivo ,nutritivo Por ejemplo para el género Aspergillus sirven :salvado de trigo ,

melaza de beterraga,residuos de la industria cervecera, residuos de papa. Para obtener una estructura porosa a los medios se les agrega aserrín de madera (5-10 % o 15-20% ).

Composición del salvado de trigo: Aminoácidos esenciales . Metionina 19%, triptófano 0,3%,y lisina 0,6%,

16-20% de almidón, 10-12 % de proteína, 4% de grasa,además diferentes compuestos de fósforo, sales minerales, microelementos, etc.

Luego de la mezcla de los ingredientes , ésta se humedece hasta 20-40 %. Se esteriliza a 104-140°C a una presión de 0,03 MPa. La capacidad del esterilizador es de 300 hasta 500 kg.

Después se humedece con agua estéril hasta 58-60%. Si la humedad es mayor la aireación empeora en el cultivo en crecimiento y si es menor el crecimiento de los micelios es lento. En condiciones industriales al final del ciclo de crecimiento la humedad disminuye hasta 35-40 %.

Desarrollo del cultivo en condiciones industriales.

En el medio de cultivo esterilizado y enfriado a 40°C con agitación constante se agrega el material de siembra y agua estéril hasta que el medio llegue a 58-60% de humedad. Los conidios del cultivo puro de hongos o el medio de cultivo nutritivo sembrado con estos hongos se distribuyen en capas de 2-3 cms en cubetas. Se les mantiene frecuentemente de 28-32 °C durante 22-40 horas en cámaras de reproducción especiales . El cultivo preparado se envía a la trituradora. Los microorganismos se cultivan a temperatura ,humedad y aireación determinadas.

Parámetros de cultivo en superficie según etapas de crecimiento:

Tiempo de cultivo ,horas

Etapa de crecimiento

Temperatura del aire°C

Temperatura del medio °C

Humedad del aire %

8-10 Desarrollo de conidios

30-32 30-32 98-99

12-24 Formación de micelios

27-28 30-32 99-100

24-30;36-48

Formación completa del cultivo

28-30 28-30 92-94

Ejemplos de tiempos de cultivo :

• Aspergillus oryzae- 30-36 horas.

• Aspergillus awamori-36-42 horas.

(productor de amilasa)

• Aspergillus awamori- 46-48 horas

(productor de pectinasa)

• Aspergillus terrícola – 44-48 horas.

• Aspergillus foetidus- 48-52 horas.

• Aireación • El aire para la aireación se toma de la atmósfera se acondiciona a 22-24 °C ,se filtra

e ingresa a caloríficos donde se calienta hasta la temperatura de 30°C y humedad cerca a100% .El aire recircula en el sistema de la siguiente manera: el calor tomado por el aire al pasar por la cámara de cultivo se retira en el enfriador de aire, luego el aire del acondicionador principal se mezcla con 10% de aire fresco, se le da los parámetros necesarios y nuevamente ingresa a la cámara de cultivo.El aire utilizado es expedido a la atmósfera.

• En el proceso de crecimiento de los hongos, estos utilizan el 25-35% de m.s. del medio y como resultado de la desamilación expelen gran cantidad de calor y dióxido de carbono al medio exterior. Si es que el calor en exceso no se extrae de las cámaras de cultivo, el cultivo se seca, disminuye su actividad fermentativa. La cantidad de calor máxima de un cultivo en crecimiento durante 1 a 2 horas es de 355-377 kJ/kg de medio diluido. Para retirar esta gran cantidad de calor se realiza una ventilación intensiva de las cámaras de crecimiento con aire acondicionado que tiene los siguientes objetivos:

• Limpieza del polvo y de la microflora extraña . • Mantenimiento de determinada temperatura. • Saturación con humedad cerca a 100%.

• Deshidratación del Cultivo

• Al extraer el cultivo de hongos con humedad 35-58% es un producto inestable, las enzimas se pueden inactivar en 3 horas.

• Para conservar la actividad enzimática se deshidrata el cultivo hasta 10-13 %.

• Luego se procede a su trituración hasta un tamaño de partículas de 2-3 mm.

Producción de celulasas por el método Koji

Método en cultivo sumergido Es mejor que el método anterior porque : -Es posible variar la composición del medio nutritivo . - Se obtiene mayor rendimiento de enzimas. - Puede ser automatizado. - Se controla mejor el proceso. Obtención del Material de Siembra Primero la siembra se realiza en tubos de ensayo para su

aislamiento a 28-32 °C y luego en matraces en medio de cultivo líquido en constante agitación 180-200 rev/min a 28-32 °C, durante 30-40 horas.

Luego se pasa a un biorreactor donde se cultiva el 10% del medio del total del biorreactor de producción.

Si el microorganismo productor forma esporas la cantidad de material de siembra disminuye hasta 1% .

Proceso de Fermentación

La preparación del medio nutritivo para el desarrollo del material de siembra y el cultivo de producción se realiza en tanques mezcladores (1). Luego se esterilizan en (2,3,5). El material de siembra (7) se inocula en los biorreactores (9). Para la aireación del biorreactor del material de siembra y de los 2 biorreactores de producción , el aire pasa por un filtro de limpieza previa 10, por la bomba de aire 12, para llegar al filtro principal 11 y los filtros individuales 8 instalados en los 3 biorreactores.

Una vez concluído el proceso de fermentación el líquido de cultivo fermentado se bombea al tanque receptor 13 del cual se extrae las enzimas.

Esquema Tecnológico

1. Mezclador del medio de cultivo 2. Esterilizador. 3. Esterilizador (mantenimiento de la temperatura). 4. Válvula. 5. Intercambiador de calor. 6. Bomba. 7. Biorreactor para Material de siembra. 8. Filtro. 9. 02 Biorreactores de producción. 10. Filtro de aire. 11. Filtro de aire. 12. Bomba para aire. 13. Tanque para el cultivo preparado fermentado.

Obtención de enzimas extracelulares

Obtención de enzimas intracelulares