enzimas de restricción
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
INGENIERIA GENETICA
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción,
la K12 en E coli.
Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se
pensó que reconocía secuencias específicas del DNA.
Se abandonó porque aunque reconocía una zona
determinada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.
En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción en
Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en un
duplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una
bacteria de un DNA extraño y lisis del mismo en pequeños
fragmentos.
El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando
se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece
encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no
encontaremos colonias.
En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero
si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de
crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido
por esta cepa.
MODIFICACION- RESTRICCION
TÍpico ejemplo de
restricción de crecimiento
del bacteriófago lamda
en una cepa determinada
de E. coli
La eficiencia con la que el fagocrece en una cepa depende de la
última cepa donde fue propagado.
Explicación:
El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la
endonucleasa responsable de esta degradación se le llama
endonucleasa de restricción o enzima de restricción.
El huésped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la
acción de las enzimas de restricción y para ello modifica
a su propio DNA.
Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy
limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las
enzimas de restricción.
El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo
se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y
por lo tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva
reinfección.
MODIFICACION- RESTRICCION
METILACION Y RESTRICCION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Se conocen cuatro tipos de sistemas de restricción y
modificación:
Tipo I:
En la misma enzima tienen 2 subunidades para
la restricción, 2 subunidades para la modificación (metii
lación) y una subunidad para el reconocimiento.
Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.
El corte se da a alguna distancia del lugar de
reconocimiento.
Poco valor para manipulación genética.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Tipo II:
La restricción (división) y modificación las provocan diferentes
enzimas de la bacteria, por lo que puede haber división del
DNA en ausencia de modificación.
No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetionina
por lo que su uso es más sencillo.
El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan
al DNA en el lugar de reconocimiento.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Tipo IIs:
Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre en
Lugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, por
Lo que su uso en ingeniería genética también es reducido.
Tipo III:
Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se
parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que
son poco útiles.
Algunas enzimas de restricción no entra dentro de
esta clasificación.
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Nomenclatura:
Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró
2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna
cepa especial)
Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica
por números romanos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Ejemplos:
HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción
HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción
SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción
BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima
Los nombres de las enzimas de restricción se escribe en itálica.
Endonucleasas de tipo II
Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos,
que tienen un eje rotacional de simetría: Secuencias palíndrome
Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de
restricción
Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por
modificación
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Plegado típico Tipo II
CAP “Motif”
(topoisomerasas)
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Para EcoRI:
5´- GAATTC- 3´
3´- CTTAAG-5´
5´- G/AA*TTC- 3´
3´- CTT A*A/G-5
Generalmente solo se escribe la secuencia desde el 5´
G/AATTC
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos
5´que son complementarios entre sí:
5´- G 5´- AATTC - 3´
3´- CTTAA - 5 G - 5´
A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II
se les denomina extremos coheisvos o pegajosos.
No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los
extremos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Extremos cohesivos Extremos romos
ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Para reconocer el tamaño delos fragmentos que se producen tras la acción de unaendonucleasa de restricciónse utiliza la electroforesisen gel de agarosa y latinción con bromurod deetidio.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Se han estudiado 10,000 bacterias paraEncontrar enzimas de restricción.
Se han encontrado 3,000 enzimas deRestricción específicas para aproximadamente 200 secuencias de DNA.
www.rebase.neb.com
Las enzimas diferentes que tienenespecificidad por la misma secuenciade DNA y que cortan en el mismo sitiose les llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugaral DNA se les denomina neoeschizomeros.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
El número y el tamaño de fragmentos de DNA generados por una enzima de restricción depende de la frecuencia de apariciónDe los lugares diana en el DNA.
Teóricamente, si tenemos un DNA que sea:
- 50% de frecuencia de C+G- las cuatro bases distribuidas al azar
El número de cortes en sería cada:
si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) basessi la secuencia diana es de 6 bases corte cada 46 (4096) bases
En la práctica, no ocurre exactamente así.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Revisa las siguientes ligas (material de estudio):
“Restriction Endonucleases Overview”http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/overview.asp
Restriction Enzymes Quality Controlshttp://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/quality_controls.asp