electroforesis de dna - biblioceop · enzimas de restricción clasificadas en 3 tipos, donde la...
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DNA Topoisomerasas
Izquierda Derecha
Enzimas de restricciónClasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg2+
Secuencias palindrómicas
Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones.Sma I / Xma I
Secuencias metiladas:A*: N6-metiladeninaC*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp IReconocen la secuencia CC*GGHpa II: no digiere DNA metiladoMsp I: Digiere met o no-metilado*90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G
Desfosforilación de vectores(para evitar asociación intramolecular)
DNA Ligasa
68 kDa
Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)
Ligación de extremos cohesivos
Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa)
Screening: Rastreo, Escrutinio
Fago Lambda como vector de clonamiento
Clonamiento de DNA en plasmidos
Clonamiento de DNA en plasmidos
Clonamiento de DNA en plasmidos
Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
Southern y Northern blot
Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517
Eliminación de fragmentos de Okazaki
Eliminación de fragmentos de Okazaki
(Reacción de Nicktranslation)
Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR
DNA pol I (E. coli) Holoenzima(monómerica) de 109 kDa.5’ 3’ Polimerasa5’ 3’ exonucleasa3’ 5’ exonucleasa
+ Mg2+
SINTESIS de DNA in vitro
Reacción de polimerización en cadena =polymerase chain reaccion (PCR)
- Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado)- Múltiples copias (de una molécula templado 1 millon de copias)- DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol)- Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción)- dNTPs- Tampón (Mg2+, tampón) 30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg
apareamiento, 40-60ºC, 30segextensión, 72ºC, 30seg
ESPECIFICIDADVELOCIDAD SENSIBILIDAD
CONTROLES!
SINTESIS DE DNA in vitro PCR
- Iniciacion, elongacion, terminacion
- par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica
- in vitro
- multiples veces un fragmento de DNA
- DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus)
-ciclos de denaturacion, apareamiento, extension
INICIACION cuando y donde
ELONGACION
TERMINACION
-Extension final y guardar a 4ºC
PCR
Taq DNA pol (Thermusaquaticus) MW 65 kDa
GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA
PCR de MICROSATELITES
GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC
3’
MICROSATELITE
5’
3’ 5’
CGACACTACCAGATGCACCTGATATCTGGTA TGTGTGTGTGTGTGTG
CACCTGATATCTGGTA 3’5’
Partidor 2
llllllllllllllll
5´3’ GCTGTGATGGTCTAC
Partidor 1
lll111111111111
Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc
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190200210
pb1 2 3 4 5 6 7
120 – 140 HTG4
170 – 188 HMS7
Análisis de microsatélites de caballos
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200210220230
pb1 2 3 4 5 6 7
149 – 172 HMS3
218 – 238 HMS2240250
Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex® en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio.
Microscopía Electrónica, Tinción Negativa
Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssDNA o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cDNA
R-Loops
Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET)
Tinción negativa
Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas
Denaturación del DNA e Hipercromicidad
Secuenciación de DNA(Sanger,1977)
35-100 nt/seg>7600 ntTaq DNA pol
300 nt/seg2000-3000 ntSequenasa
45 nt/seg10-50 ntFrag. Klenow
(DNA pol I)
Velocidad de Polimerización
ProcesividadEnzima/
Propiedades
Klenow: MW 76 kDa, carece de actividad 5’ 3’exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970).
Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3’ 5’ exonucleasa)
Secuenciación de DNA (Sanger,1977)
Secuenciación Automatizada de DNA
DNA Fingerprinting
•AFLPAmplified Fragment polymorphism
•RFLPRestriction Fragment Length polymorphism
•RAPDRandom Amplified polymorphic DNA
•DAFDNA Amplification Fingerprinting
•SSCPSingle Strand Confirmational polymorphism
•Microsatellite
AFLP
Análisis de Microarreglos de DNA
Síntesis in situ y análisis in silico
Microarreglos de DNA
Expresión Génica Temporal por
microarreglos de DNA
