Crescita batterica

Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.

CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica»

CdS Medicina e Chirurgia

Università “G. d’Annunzio”, Chieti-Pescara

AA 2015-2016

Crescita batterica – fissione binaria

Durante la divisione, l’aumento dei costituenti cellulari può tradursi in:

aumento delle dimensioni cellulari

microrganismi cenocitici: divisioni nucleari non accompagnate da divisioni cellulari (es. alghe, muffe)

aumento del numero cellulare (es. batteri, lieviti, protozoi)

La Microbiologia generalmente studia la crescita di una popolazione, piuttosto che la crescita delle singole cellule

Crescita batterica – divisione cellulare

Rhodophyta spp. (alga rossa)

Rhizopus spp (Zigomicete, muffa)

Cinetica della divisione cellulareLa curva di crescita

Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo)

Misura la variazione della “quantità” (massa totale o concentrazione) di batteri nel tempo:

rappresentazione grafica di tipo “semilogaritmica”

Log10 (concentrazione cellulare espressa come CFU/ml, dove CFU= unità formanti colonie) vs tempo

Si articola in 4 fasi (periodi), distinte e sequenziali

Fase di latenza (lag phase)

Fase di adattamento metabolico:

sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare

sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari

Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico

Durata variabile (specie-specifica):

in alcuni casi può essere di breve durata od assente

Fase esponenziale (log phase)

Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva (max velocità)

gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata)

Velocità di crescita costante nel tempo:

aumento del numero cellulare

aumento della massa cellulare totale

Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche

Chiamata anche fase logaritmica

Fase stazionaria

Numero totale di cellulare vitali rimane costante:

Arresto della riproduzione Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di mortalità (no aumento n cellulare)

Metabolismo quasi quiescente (cryptic growth)

Espressione di specifici geni “di sopravvivenza”

Possibili cause:

Raggiungimento di una densità critica di popolazione

Accumulo dei cataboliti (azione tossica)

Limitazione dei nutrienti

Limitata disponibilità di O2

Fase di morte (declino)

Morte cellulare a velocità esponenziale

Morte:

perdita irreversibile della capacità di riprodursi

lisi cellulare

In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta a causa di un accumulo di cellule “resistenti” (viable but not culturable, VBNC)

logNt = logNo + t

Nt = n. cellule al tempo tNo = n. cellule al tempo 0n= n. generazioni al tempo t = n. generazioni nell’unità di tempo (h)t = tempo trascorso

Nt = N0 x 2n

logNt = logN0 + n x log2

logNt - logN0= n x log2

n =logNt - logN0

log2

n = 3.3 x (logNt - logN0)

Nt = No x 2t

Crescita battericaModellizzazione matematica

Tempo di generazione e velocità di crescita

k = n/t = velocità di crescitaLa pendenza (slope) della retta è diretta funzione della velocità di crescita

g = t/n = tempo di generazione (necessario perchè il numero cellulare raddoppi)

La gran parte dei batteri ha un tempo di generazione che oscilla tra 20 e 60 minuti, in condizioni ottimali (in vitro, in laboratorio).

La maggior parte dei patogeni il tempo di generazione osservato nell’ospite (in vivo, al sito di infezione) è maggiore, oscillando tra le 5 e le 10 h.

Se si avviasse una coltura batterica contenente 10 cellule di Escherichia coli (N0=10), dopo 12 h di incubazione (t=12) avrebbero avuto luogo 36 generazioni (n=36; considerando un tempo di generazione medio di 20 min), ossia la popolazione batterica sarebbe composta da un numero Nt di cellule pari a:

10 x 236 = Nt = 687.194.767.360 E. coli

Nt = N0 x 2n

12 h

… dopo 48 h di incubazione, il peso della popolazione risultante sarebbe4.000 volte maggiore quello della Terra !!!

(una singola cellula pesa ~ 9.5 x 10-13 g)

Fortunatamente…non accade! La crescita viene infatti limitata dalla mancanza di nutrienti essenziali e/o dalla produzione di cataboliti tossici.La popolazione entra nella fase stazionaria.

Crescita battericaDiamo i numeri …

Log phase (fase esponenziale)Crescita “bilanciata”

Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata:

i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera congiunta

Di contro, si osserva crescita non bilanciata, quando:

modificazione del livello dei nutrienti

- shift-up (terreno "povero” terreno “ricco”)

- shift-down (terreno “ricco” terreno “povero”)

modificazioni delle condizioni ambientali

Concentrazione di nutrienti vs crescita

Colture continueChemostato

Coltura “vecchia” (in fase stazionaria)

Coltura “giovane” (in fase logaritmica)

Necessità di un modello che riproduca fedelmente la situazione in vivo

Chemostato, consente il controllo indipendente di velocità di crescita e densità cellulare:

velocità del terreno in ingresso = velocità del terreno in uscita

nutriente essenziale in quantità limitanti

incremento costante del numero cellulare e della massa batterica

Coltura sincronizzata:ogni cellula si riproduce allo STESSO tempo.La curva ha andamento a scala(altezza di un gradino è 2x quella del gradino precedente)

Coltura non sincronizzata:ogni cellula si riproduce a tempi LEGGERMENTE DIFFERENTI.La curva ha andamento lineare.

Escherichia coli(tgen = 20 min)

Coltura sincronizzata vs non sincronizzata

Tecniche per la determinazione della dimensione di una popolazione cellulare

Conta diretta cellulare

Conteggio in camera contaglobuli

Contatori elettronici

Filtrazione su membrana

Conta vitale cellulare

Metodo della semina su terreno agarizzato

Metodo di filtrazione su membrana

Semplice, economico e veloce

Adatto per la conta di eucarioti e procarioti

Limitazioni:

NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare

scarsa precisione

disponibilità di un microscopio ottico

scarsa sensiblità (≥ 106 cells/ml)

Conteggio mediante contaglobuli

Passaggio “forzato” della sospensione microbica attraverso un orifizio di piccoledimensioni

Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all’orifizio

Conteggio degli eventi “interruzione” della corrente elettrica

Veloce e di semplice esecuzione

Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche

Limitazioni:

NON distingue le cellule vive dalle morte

Contatori elettronici

Conta vitale cellulare

Determina il numero di cellule vitali

La dimensione di popolazione viene espressa come unità formanti colonie (UFC; oppure CFU: colony-forming units)

Conta vitale cellulare

Diluizioni seriali (10-fold) del campione

Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione

Incubazione (37°C, 24h)

Conteggio del numero di colonie (UFC)

Calcolo n cellule nella popolazione

UFC/ml = n UFC x fattore diluizione

Particolarmente adatto per l’analisi dei campioni ambientali

Metodo delle membrane filtranti

Misura della massa cellulare

Peso secco

tempi lunghi

scarsamente sensibile

Quantità di un particolare costituente cellulare

proteina, DNA o ATP

adeguato se la quantità del target è costante in ogni cellula

Misurazione turbidimetrica (light scattering)

comune impiego

veloce, semplice e sensibile

La densità ottica è la quantità di luce in grado di passare attraverso la sospensione batterica.

Principio: tanto maggiore sarà il numero cellulare, tanto più densa (opaca) sarà la coltura.

Questo significa che, in presenza di crescita batterica, una quantità minore di luce sarà in grado di passare attraverso il campione, a causa della torbidità della sospensione cellulare.

Misurazione turbidimetrica

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