Genetica batterica

Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc.

Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)

Fondazione Università “G. d’Annunzio”

0871 54 15 19 (lab)

333 169 65 59 (cell)

gdibonaventura@unich.it

Genoma batterico

Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di due componenti:

- Cromosoma (geni essenziali)

- Elementi extracromosomici “mobili” (MGEs) (non essenziali, responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale)

- plasmidi - elementi trasponibili

- sequenze di inserzione - trasposoni- elementi invertibili

Cromosoma batterico

Singolo (microrganismi aploidi)DNA bicatenario DNA (prevalentemente) circolare

lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia burgdorferi

Mosaico in natura – soggetto agli effetti del trasferimento genetico orizzontale (contiene geni di diversa provenienza)

Dimensioni variabili (0.6-8.6 Mb; 1100-1400 m)

Replicazione bidirezionale, da una singola origine

Trasferimento genetico orizzontale – il trasferimento (e successiva integrazione) di geni tra diverse cellule

Escherichia coli: cromosoma rilasciato in seguito a lisi batterica

Replicazione DNA batterico

MGEs: Plasmidi Elementi genetici extracromosomici in grado di

replicarsi autonomamente Episoma = plasmide in grado di integrarsi nel

cromosoma batterico DNA bicatenario circolare (lineare in Streptomyces spp) Presenza di numerosi e “caratteristici” (gruppi di

compatibilità) plasmidi in un singolo batterio: dimensioni = 1/k n. copie

Qualità dell’informazione genetica• Scarsa omologia (“estranei”) con il cromosoma e raramente

indispensabili per la sopravvivenza e moltiplicazione batterica in condizioni “ottimali”

• Informazione per replicazione indipendente (se unica informazione = plasmidi “criptici”)

• Codificano per fattori di virulenza batterica:• Produzione di pili, tossine, adesine, siderofori,• Fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza• Plasmidi F: sessuali o coniugativi• Plasmidi F’ (Hfr): integrati nel cromosoma (alternanza tra

forma libera ed integrata = episoma)

Plasmidi

Duplicazione “rolling circle” di DNA-plasmidi

1. Plasmidecircolare

2. Rottura diuna catena nick

5. Termine replicazione, ligazione

Replicazionediscontinua

una catena completa

5’5’ 3’

Roll

3. Spiazzamentodi catena

Punto di nuovasintesi di DNA

Catenaspiazzata

5’

DNA sintetizzato

4. Sintesi DNA

3’3’Roll 5’

Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)

Caratteristica traslocazione tra “elementi” diversi (cromosoma, plasmidi) del genoma batterico.

Generalmente, la traslocazione avviene all’interno della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di trasferimento di materiale genetico)

eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione)

Due meccanismi di trasposizione: conservativa – nessuna duplicazione di elementoreplicativa – duplicazione di elemento

La trasposizione induce un effetto “mutageno”:mutazione letalemutazione non letale

Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2)

Sequenze di Inserzione (IS) – piccole dimensioni (800-2.000 bp), integrazione sito-specifica mediante sequenze invertite e ripetute, “core” codificante solo per trasposizione (solo effetto mutageno).

Trasposoni – rilevanti dimensioni (> 2.000 bp), integrazione sito-specifica mediante IS, “core” contenente uno o più geni (es. geni per farmaco-resistenza).

Elementi invertibili – oltre a geni codificatori per la trasposizione, presenza di “DNA-invertasi” capace di invertire l’elemento di 180° (rispetto ad un asse centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica –“variazione di fase flagellare” H1/H2 in Salmonella

Isole genomiche – integrate nel cromosoma mediante fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity island) e per la vita simbiontica

Altri MGEs: Elementi trasponibili (2 di 2)

Mutazione genicaTrasferimento genico e ricombinazioneConiugazioneTrasformazione Trasduzione

Conversione lisogenica Fusione del protoplasto

Meccanismi di variazione batterica

Mutazioni Mutazione = modificazione della sequenza nucleotidica Mutazioni spontanee (10-7- 10-11 bp / generazione) insorte durante la

duplicazione del DNA (low frequency) o in seguito a fenomeni di inversione/traslocazione (high freq.).

Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac. nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.), biologici (virus)

Tipologie:– Mutazioni MICROlesionali (puntiformi):

• Transizione (sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche)• Transversione (sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur)• Frameshift (inserzione o perdita di una base)

– Mutazioni MACROlesionali:• Delezione (di sequenze)• Duplicazione (di sequenze)• Inversione e Traslocazione (di sequenze)

Effetti sul fenotipo:– Generalmente, sono compatibili con la sopravvivenza del batterio, grazie

alla sua eterogeneità genetica– Mutazioni missense (silente: sequenza aa immutata), nonsense (STOP

codon), frameshift (sequenza aa modificata)– Possono essere “letali”

Mutazioni missense (transversione), nonsense e frameshift

ConiugazioneConiugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un contatto “fisico” tra due cellule batteriche:

Pilo sessuale (Gram-negativi)Ferormoni (Gram-positivi)

Plasmidi coniugativi – plasmidi che possono essere trasferiti tra cellule mediante coniugazione

Plasmide F – plasmide della “fertilità” (F – fertility)geni rep – codificano per la replicazionegeni tra - codificano per il trasferimentogeni mob - codificano per la mobilizzazione4 elementi IS – mediano l’integrazione nell’endogenote

Coniugazione: tipi cellulari

Cellula F+ - cellula contenente un plasmide F - (cellula donatrice o “maschile”)

Cellula F- - cellula non contenente un plasmide F- (cellula ricevente o “femminile”)

Cellula Hfr – cellula contenente un plasmide F integrato nel cromosoma (Hfr – high frequency of recombination)

- (cellula donatrice o “maschile”)

Pilo sessuale – struttura superficiale prodotta da cellule F+ che media lo specifico contatto tra cellule F+ e F-, ed il trasferimento del plasmide

Coniugazione: F+ x F-

1. F+ (donatore) contenente un plasmide F+ codificante per il pilo sessuale.

2. Formazione “coppia coniugativa”. Rottura in oriT di una catena del plasmide F+.

3. Retrazione del pilo sessuale e formazione di un ponte intercellulare. Una catena del plasmide F+ entra in F-.

4. Sintesi della catena complementare di F+ in entrambi i batteri, adesso in grado di produrre il pilo sessuale.

Nella coniugazione F+ x F- non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico

1

2

3

4

Coniugazione: F+ x F-

4

2

Coniugazione: Hfr x F-

1. Formazione Hfr: inserzione di un plasmide F+ nel nucleoide del batterio accettore.

2. Formazione “coppia coniugativa”. Rottura monocatenaria del DNA a livello del plasmide F+ integrato.

3. Retrazione pilo sex e formazione ponte intercellulare. Ingresso del DNA monocatenario nel batterio accettore. Interruzione spontanea della coniugazione: solo una parte del DNA donatore verrà trasferita all’accettore.

4. Il donatore sintetizza una copia complementare del DNA rimanendo Hfr. L’accettore sintetizza una catena complementare del DNA trasferito.

1

3

-Degradazione(nessun effetto)

-Circolarizzazione(plasm. coniugativo)

-Integrazione(nuovi caratteri)

Integrazione del plasmide F nel cromosomaa formare una cellula Hfr

cellula F+plasmide F

IS

IS

plasmide F

cromosoma

integrazione del plasmide F

ricombinazioneomologa tra elementi IS

IS3

IS3

IS2

gdsequenze di inserzione

(IS) nelplasmide

cellula Hfr

plasmide F integrato

Coniugazione: Hfr x F-

Pilo F

Cellula F+

Cellula F-

Coniugazione nei Gram+

• Enterococcus faecalis• Produzione e rilascio di ferormoni da parte

della cellula “accettrice” (femminile)

• Ferormoni inducono produzione della sostanza aggregante alla superficie della cellula “donatrice” (maschile)

• Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo

Significato della coniugazione

Significato clinico:

Principale meccanismo di trasferimentodi geni per l’antibiotico-resistenza

Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori)

Significato evoluzionistico:Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico

Significato ambientale:Trasferimento di resistenza a erbicidi ed

idrocarburi aromaticiResistenza batterica ai metalli pesantiTrasferimento di geni per la fissazione dell’azoto

tra RhizobiaPlasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire

geni alle piante(meccanismo di trasferimento genico tra Domini)

Trasformazione

Assunzione di frammenti di DNA solubile dall’ambiente circostante da parte di cellule batteriche “competenti” (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus)

Meccanismo di trasferimento genetico “evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale

Influenzato da:

Dimensioni DNA

Sensibilità DNA a nucleasi

“Competenza” della cellula “accettrice”

naturale o indotta artificialmente

Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)Streptococcus pneumoniae

Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)

Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarononel DNA la “sostanza trasformante”

Trasformazione batterica

1. Morte e degradazione del

batterio “donatore”.

2. Un frammento di DNA

bicatenario (ds) interagisce

con specifiche proteine (DNA-

binding protein) alla superficie

della cellula “competente”. Il

DNA è reso monocatenario

(ss) da una nucleasi.

3. La proteina Rec A promuove

la ricombinazione omologa tra

il DNA ss donatore e quello ss

recipiente.

4. Lo scambio è completato.

Formazione di heteroduplex:

una sola delle cellule figlie

risulterà essere “trasformata”.

1

2

3

4

Trasformazione batterica

Trasformazione batterica: competenza

La cellula accettrice, per poter essere trasformata,deve trovarsi in una particolare condizione che prendeil nome di competenza

Competenza – capacità cellulare di “catturare” il DNA.“Fattore di competenza” (Gram+) induce: modificazioni di parete cellulare (autolisina)formazione/attivazione di proteine DNA-binding

e nucleasi competenza naturale (Bacillus, Neisseria spp.) competenza indotta artificialmente (P. aeruginosa,

E. coli, S. typhimurium) – trattamento “a freddo”con CaCl2 (bassa efficienza, utilizzato di routinenel clonaggio di DNA in E. coli) - elettroporazione

Trasformazione batterica nei Gram-

Mancanza del “fattore di competenza”, sostituito da particolari condizioni del mezzo colturale: Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp. in condizioni permissive per la sintesi proteica ma non per la crescita completa.

Significato della trasformazione

Significato biotecnologico:Clonaggio di geni “utili”

Significato evoluzionistico:Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico

Trasduzione

La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA tra due cellule batteriche mediante un batteriofago (virus batterico).

Esistono 2 tipi di trasduzione: 1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente)

qualsiasi gene può essere trasferito

2. Trasduzione specializzata: solo specifici geni possono essere trasferiti

Batteriofago T4

…infetta Escherichia coli

Trasduzione generalizzata (1 di 2)

1

2

3

1. Un fago litico adsorbe ad un batterio sensibile.

2. Penetrazione del genoma fagico nel batterio. Utilizzo dei sistemi metabolici cellulari per la sintesi e l’assemblaggio delle componenti virali.

3. In alcuni casi, un frammento di DNA batterico o un plasmide possono essere erroneamente inseriti in alcuni capsidi virali (particelle trasducenti).

6

Trasduzione generalizzata (2 di 2)

4

5

4. Rilascio dei fagi batterici in seguito a lisi batterica.

5. Il fago trasduttore adsorbe ad un batterio sensibile.

6. Penetrazione del DNA fagico.

7. DNA fagico ricombina con il DNA della cellula accettrice.

7

Trasduzione generalizzata

Trasduzione specializzata (1 di 2)

1

2

3

1-2. Un fago temperato adsorbe al batterio sensibile e vi inietta il suo genoma.

3. Il genoma fagico ricombina con il nucleoide batterico divenendo un profago.

4. In presenza di stimoli adeguati, un frammento del DNA batterico viene escisso come parte del genoma fagico. 4

Trasduzione specializzata (2 di 2)

5. Durante la replicazione fagica il DNA batterico viene inserito nel genoma fagico. Tutti i fagi veicolano il frammento di DNA batterico.

6. Il fago adsorbe ad una batterio sensibile iniettandovi il suo genoma.

7. Il genoma fagico contenente il DNA trasdotto ricombina con il nucleoide della cellula accettrice.

5

6

7

Trasduzione specializzata

Adattamento ed evoluzione batterica

Mutazione e selezione “classiche” (Selezione naturale ed evoluzione)

Acquisizione di geni da altri batteri -Trasferimento genico ORIZZONTALE:

- Coniugazione- Trasformazione - Trasduzione

Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica)Trasferimento genico VERTICALE

La ricombinazione genica è coinvolta in ogni fenomeno generante variabilità genica

Quantità (valori percentuali) di DNA “atipico” (trasferito) nei genomi batterici

Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante trasferimento genico orizzontale.

Ricombinazione genica

Scambio “fisico” di materiale genetico tra due molecole di DNA

Importante processo evolutivo in quanto promuove la diversità genetica (permettendo un rapido adattamento)

Coinvolta nella coniugazione, trasformazione, trasduzione e trasposizione

Ricombinazione tra DNA lineare (a) e plasmidico (b).

A) Ricombinazione OMOLOGA – scambio genetico tra sequenze di DNA omologhe

Molto complessa - in E.coli richiede oltre 25 geni,Alcuni prodotti genici coinvolti:

RecA – catalizza la ricombinazione, ubiquitaria nei procarioti

RecBCD – attività nucleasica ed elicasicaproteine leganti DNA singola elica -

stabilizzano il DNA a singola elica

Ricombinazione genica

B) Ricombinazione SITO-SPECIFICA:trasposizione (nella trasposizione)meccanismo integrasi-mediato (nei fagi)trasposoni integrativi e coniugativi

Ricombinazione omologa nei batteriMeccanismo e Tipologie

Conversione lisogenica

• Integrazione del genoma fagico mediante ricombinazione sito-specifica

• DNA profagico “silente”• Occasionale (essiccamento, U.V.,

radiazioni ionizzanti, agenti mutageni) derepressione di parte del DNA profagico

• Espressione di numerose proprietà patogene dei batteri:

• Produzione di tossine (tox difterica, indotta da carenza di Fe3+)

• Adesine ed antigeni di superficie (Salmonella O antigen)

Fusione del protoplasto

• Protoplasto = citoplasma + nucleo

• Fusione di due protoplasti trattati con lisozima e penicillina