crescita batterica identificazione batterica

Crescita battericaIdentificazione batterica

G I O VA N N I D I B O N AV E N T U R A

C I « M I C R O B I O L O G I A E M I C R O B I O L O G I A C L I N I C A »

C D S M E D I C I N A E C H I R U R G I A

U N I V E R S I TÀ “ G . D ’A N N U N Z I O ”, C H I E T I - P E S C A R A

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Terreni di colturaTerreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo

Caratteristiche:

▪ concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica

▪ adeguato grado di umidità

▪ reazione (pH) adatta

▪ sterile e protetto da qualsiasi inquinamento

Terreni di colturaContenuto qualitativo

▪ Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)

▪ NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti

▪ Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari

▪ Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

▪ Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine; necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale

▪ Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)

▪ Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori critici di pH del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo fermentativo del batterio

Terreni di colturaClassificazione

In base allo stato fisico:

▪ Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati.

▪ Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

In base alla composizione chimica:

▪ Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi; gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.

▪ Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.

▪ Terreni COMPLESSI: non è nota l’esatta composizione chimica; comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.).

Terreni di colturaClassificazione

In base alla funzione:

▪ Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.

▪ Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di quella(e) di interesse; utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati (es. feci, espettorato).

▪ Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso; usati per la identificazione di specifici microrganismi.

Terreni di colturaPreparazione

1. Pesata degli ingredienti

2. Dissoluzione in acqua degli ingredienti

3. Correzione del pH al valore desiderato

4. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi)

5. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi) o provette (terreni liquidi)

6. Controllo della sterilità

Terreni di colturaTecniche di semina

Semina per isolamento

▪ Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate, a partire da brodocoltura o crescita su agar.

▪ Mediante utilizzo di un'ansa sterile si esegue una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da separare le singole cellule.

Terreni di colturaTecniche di semina per isolamento


Semina per inclusione

▪ Agevola la conta delle colonie batteriche.

▪ La sospensione batterica viene miscelata, in una capsula Petri sterile, al terreno agarizzato allo stato liquido che, raffreddandosi, successivamente gelificherà.

▪ Solitamente, l’agar si cimenta con differenti diluizioni, in soluzione fisiologica (NaCl 0.9%) sterile, del campione.


Semina per infissione

▪ Mediante un ago da inoculo, il campione viene seminato nello spessore del terreno agarizzato.

▪ Consente di valutare il rapporto del metabolismo batterico con O2 sulla base della altezza in cui si osserva crescita: nella parte alta (AEROBIO), sul fondo (ANAEROBIO), diffusa (ANAEROBIO FACOLTATIVO).

▪ Consente di valutare la motilità del microrganismo: se la crescita è diffusa, il batterio possiede flagelli.

▪ Consente di valutare specifiche attività enzimatiche: proteasi, ureasi, produzione indolo

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

Agar sangue

▪ Non selettivo; la presenza di sangue (montone, cavallo) consente la crescita di gran parte dei batteri. Utile per la evidenziazione della emolisi (S. aureus, streptococchi emolitici).

Cetrimide Agar

▪ Selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di P. aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. La presenza di cetrimide, composto ammonio quaternario verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.


Hektoen Enteric Agar

▪ differenziale e selettivo per Salmonella e Shigella dalle

altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari

inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza

di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio

ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie

nerastre, Salmonella)

MacConkey agar

▪ selettivo per coliformi ed enterobatteri (Escherichia coli,

Klebsiella spp, Salmonella spp, Shigella spp). Cristalvioletto

e sali biliari inibiscono la crescita di Gram+. Il lattosio

evidenzia la capacità fermentante: colonie fermentanti

lac+ (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appaiono

di rosa acceso, incolori quelle non fermentanti lac-

(Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).

Salmonella typhimurium Shigella flexneri


Mannitol Salt Agar

▪ selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di altri batteri; sistema fermentante: mannitolo e rosso fenolo (indicatore pH); S. aureus,fermentante, produce colonie con alone giallo-brillante, mentre stafilococchi coagulasi-negativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora

Salmonella-Shigella Agar (SS Agar)

▪ selettivo e differenziale per Salmonella e Shigella; sodio citrato, sali biliari e verde brillante inibiscono la crescita di Gram+ e alcuni enterobatteri; sistema fermentante: lattosio e rosso neutro; Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero, dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di H2S a partire da sodio tiosolfato presente nel terreno

Terreni «dedicati»Isolamento di agenti eziologici poco frequenti

Campione Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento

Feci Colera Vibrio choleraeVibrio parahaemolyticus

Acqua peptonata alcalina

Faringe Infiammazione ostruttiva epiglottide e faringe

Faringite membranosa

Haemophilus influenzae

Corynebacterium diphteriae

Agar sangue cioccolatoAgar Casman

Agar LoefflerAgar TinsdaleTerreno al tellurito di sodio

Tampone rinofaringeo

Pertosse Bordetella pertussis Bordet-Gengou

Escreato Tubercolosi

Micosi polmonare

Mycobacterium tuberculosis

Blastomyces dermatitidis

Lowenstein-JensenMiddlebrook 7H-11

Brain-heart Infusion agarUrina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher

Sangue, midollo osseo o biopsia

Brucellosi Brucella spp. Agar brucella

Terreni «dedicati»Isolamento di anaerobi ed «esigenti»

Terreno Scopo

Agar sangue Terreno in piastra non selettivo di uso generale

Agar cioccolato Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti

Agar MacConkey Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi

Agar sangue feniletil alcool Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-

Terreno al tioglicolato + emina + vitamina K1

Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso

Terreno di Thayer-Martin modificato Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis

Agar sangue kanamicina-vancomicina Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-

Crescita battericaDefinizioni

Crescita vs Tolleranza

▪ la crescita presuppone attiva divisione cellulare (riproduzione) e, quindi, aumento di biomassa; si usa il suffisso “-fili”

▪ in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possonosopravvivere ma non riprodursi, si usa il suffisso “-tollerante”

Esempio:

- un batterio “termofilo” cresce in presenza di elevate temperature

- un batterio “termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori

Obbligato (stretto) vs facoltativo

▪ “obbligato” (o “stretto”): una data condizione è necessaria per la crescita

▪ “facoltativo”: il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali

Esempio:

- un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita

- un “termofilo facoltativo” può crescere sia ad alte che basse temperature

Crescita battericaTemperatura

La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 30°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”

▪ Psicrofili: crescono nel range 0 20 °C (Listeria monocitogenes; Flavobacterium)

▪ Mesofili: crescono nel range 10 - 50 °C (maggior parte dei batteri)

▪ Termofili: crescono nel range 40 - 75 °C (Bacillus stearotermophilus)

▪ Ipertermofili: crescono nel range 65 - 110 °C (Pyrodictium brockii)

La febbre rappresenta un efficace mezzo di difesa contro le infezioni

Crescita battericapH

La maggior parte dei batteri cresce a valori di pH compresi tra 6 ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum di pH”:

▪ Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2-6, generalmente); funghi e lieviti più tolleranti vs batteri (pH 5-6).

▪ Neutrofili: crescono a pH 6-8 (la maggior parte dei batteri).

▪ Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8-9.5, generalmente).

I lattobacilli acidificano la mucosa vaginale, proteggendola dalle infezioni da parte di saprofiti (Escherichia coli, Streptococcus, Candida)

Crescita battericaAttività dell’acqua e pressione osmotica

Attività dell’acqua: indice relativo alla quantità d'acqua che, in un determinato prodotto, è libera da particolari legami con altri componenti; espressa in un valore adimensionale compreso tra 0 e 1

Crescita battericaAlofilia

Alofili:

▪ crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportandoelevate pressioni osmotiche e bassa aw;

▪ microrganismi alotolleranti (1-6% NaCl), alofili (6-15% NaCl), alofili estremi (15-30% NaCl)

▪ queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran parte dei microrganismi

Gli stafilococchi sono, tra i microrganismi clinicamente rilevanti, gli alofili per eccellenza

Crescita battericaO2

▪ Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di O2 (M. tuberculosis, N. gonorrheae)

▪ Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O2 (Bacteroides spp, Clostridium spp)

▪ Anaerobi facoltativi: crescita ottimale in presenza di O2, sebbene crescano anche in assenza (stafilococchi, Enterobacteriaceae).

▪ Anaerobi aerotolleranti: non usano O2, ma crescono anche in sua presenza (C. jejuni).

▪ Microaerofili: crescono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%) (H. pylori).

La dipendenza della crescita batterica dal livello di O2 contribuisce a stabilire il tropismo di una specie batterica, ossia la tendenza a colonizzare siti peculiari dell’ospite.

Cappa (camera) per anaerobiosi

Crescita battericaAtmosfera «controllata»: anaerobiosi

Giara per anaerobiosi

Sistemi per generazione di carbossifilia(5% O2, 10% CO2, 85% N2)

Crescita battericaAtmosfera «controllata»: carbossifilia

Identificazione dei microrganismi1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

▪ Colorazione di Gram

▪ Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) ▪ tipo (aspetto) coloniale

▪ emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.

▪ crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche

4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)

5. Identificazione genotipica (molecolare)

6. Tipizzazione fagica

ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie

Rilievo

Forma

Superficie

Margine

ID dei microrganismiAspetti macroscopici: emolisi

Staphylococcus aureusStreptococcus pyogenes

Emolisi completa (β-emolisi)

Emolisi: importante criterio distintivo per gli streptococchi.

Tre tipologie di emolisi:α, emolisi incompletaβ, emolisi completa, assenza di emolisi

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/2/2f/Agarplate_redbloodcells.jpg

ID dei microrganismiAspetti macroscopici: fermentazione

Agar sale-mannite

A) Il mannitolo non viene fermentato da S. epidermidis; il terreno non vira.

B) Fermentazione del mannitolo ad opera di S. aureus; il terreno vira al giallo.

A B

ID dei microrganismiAspetti macroscopici: sciamaggio

Proteus mirabilis. Il batterio si muove grazie ai numerosi flagelli disposti alla superficie cellulare (peritrico), formando «fronti» concentrici (sciamaggio).

ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche

Enterobacteriaceae, in particolare:

▪ capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio

• acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore pH

▪ presenza di particolari enzimi

• ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi

▪ produzione di specifici prodotti metabolici terminali

• H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)

▪ capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)

• 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan (produzione di gas)

API (bioMérieux) Identification System

ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche

Lettura ed interpretazione del test in ciascun pozzetto:▪ Giallo: reazione non avvenuta; no viraggio▪ Viola: reazione avvenuta, come indicata dal viraggio

ID dei microrganismiCaratteristiche antigeniche

La ricerca antigenica mira alla tipizzazione specifica (definizione di specie) e/o intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi appartenenti alla stessa specie).

La ricerca di Ag specifici avviene generalmente mediante utilizzo di Ab specifici.

Esempio: utilizzo di antisieri (Ab specifici) per reazione di agglutinazione:

▪ colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico

▪ reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi

Utilizzo di sferule di latex quali «carrier» di Ag o Ab (reazione macroscopica di agglutinazione).

Utilizzo di Abs specifici per la ricerca microscopica(immunofluorescenza)









5. Identificazione genotipica


ID dei microrganismiIdentificazione molecolare

Polymerase Chain Reaction (PCR)

▪ amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico

▪ elevata sensibilità (necessarie poche copie del target di partenza) e specificità

▪ sequenziamento genico (genotipizzazione)

RNA ribosomale

▪ grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti.

▪ presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. Il grado di differenza in rRNA di due batteri è funzione diretta della «vicinanza» filogenetica: piccole differenze sono suggestive per una “vicinanza” tra le specie, mentre grandi differenze indicano una distanza maggiore.

▪ l’individuazione di un pattern in rRNA che non trovi riscontro in nessuna altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

ID dei microrganismiIdentificazione molecolare: PCR

Agarose gel electrophoresis of the PCR products for detection of bacteria. Line M: 100 bp DNA ladder. Lines 1-5: Nitrosomonas sp., Pseudomonas sp., Proteusinconstans , Pseudomonas fluorescence, Pseudomonas aeruginosa; Line 6: negative control without DNA.

ID dei microrganismiTipizzazione fagica

Nell’ambito di una stessa specie possiamo rinvenire differenti ceppi batterici (sottospecie o tipi), ciascuno caratterizzato da un peculiare grado di virulenza.

E’ possibile utilizzare la tecnica della tipizzazione fagica sia a fini identificativi (tipo fagico) che epidemiologici (studio della circolazione dei ceppi sul territorio, studio delle modalità di diffusione dell’infezione).

Questo è il caso, ad esempio, di S. aureus:

▪ estremamente sensibile a numerosi (almeno 20) fagi litici

▪ la sensibilità non è uniforme (ceppo-specifica) e, pertanto, consente la individuazione di differenti “tipi fagici” sulla base dello spettro di sensibilità

ID dei microrganismiTipizzazione fagica: S. aureus

Tipizzazione di S. aureus

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