practicas biologia-biotecnologia_2013

Biologíacurso2012‐13 Página1

Guion de prácticas

Biología

Grado en biotecnología

Curso 2012-2013


SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

La utilización, tanto de productos químicos como de material biológico entraña

ciertos riesgos, que en este curso se han tratado de reducir al mínimo. Para ello, el alumno

deberá seguir las siguientes normas básicas:

1. Es importante vestir una bata adecuada para proteger las ropas y especialmente el

cuerpo. Al inicia y finalizar el trabajo, lavarse las manos con agua y jabón.

2. Está estrictamente prohibido fumar, comer o beber en el laboratorio. Cuando

se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos,

etc…

3. Mantener el área de trabajo limpia, y el laboratorio en general. No dejar basura

sobre las mesas, fregaderas o áreas comunes (puntas de micropipeta utilizadas, resto de

soluciones, papeles,….) todo el material descartable debe ir inmediatamente a la

papelera (general o vidrio) o al fregadero (según su consistencia y la indicación del

profesor). Dejar el laboratorio y el material limpio (con jabón y pasado por agua

destilada) antes de dejar el laboratorio.

4. Una vez utilizadas las preparaciones, tirar los cubreobjetos al contenedor para

vidrio. Si se olvidan encima de las mesas se rompen y es muy fácil cortarse con ellos.

Los portaobjetos, una vez limpios, se colocaran en su sitio.

5. Antes de utilizar por primera vez cualquier producto químico, leer las indicaciones

del bote. Si es necesario, utilizar guantes o mascarilla durante la manipulación. En caso

de duda, preguntar al profesor.

6. Nunca se debe pipetear con la boca: utilizar las peras o las micropipetas disponibles

en el laboratorio. En el caso de disoluciones volátiles o tóxicas, trabajar en campana

extractora. Es esencial utilizar etiquetas y rotuladores. Marcar bien las disoluciones que

se preparen, y no utilizar nunca botellas "sospechosas" ni soluciones o reactivos sin

etiquetar. El saber que es cada cosa y que contiene cada frasco es el mejor sistema para

evitar confusiones y accidentes innecesarios.

7. No deben dejarse botellas de disolventes volátiles (éter, acetona, isopropanol...)

abiertas sobre la mesa. Tampoco deben exponerse al sol o a las proximidades de alguna

llama. Manejar los mecheros de alcohol con extremado cuidado, no moviéndolos

una vez encendidos, y no dando fuego de un mechero a otro.

8. No utilizar ningún microscopio por primera vez sin atender a las indicaciones

previas del profesor. Si un microscopio da señales de comportamiento anormal, avisar

inmediatamente al profesor. Dicho aparato deberá ser desconectado inmediatamente


hasta que sea revisado y reparado. Debe tenerse cuidado con el derrame de soluciones

conductoras de la electricidad, que son la mayoría, especialmente si están en contacto

con enchufes o cables; en caso de que así ocurra, debe desconectarse primero la

corriente, limpiar la solución vertida, lavar la zona afectada con abundante agua

destilada y secarla bien.

9. Las células y los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama o

en campana de flujo laminar. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el

laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir

accidentes.

10. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización

del experimento deben estar apartados del lugar de trabajo.


PRACTICA 1 y 2.

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y MEDIDA DEL TAMAÑO DE UN OBJETO

MICROSCÓPICO

OBJETIVOS:

- Conocer las características y el funcionamiento de un microscopio.

- Aprender a manejarlo con soltura.

- Efectuar mediciones del tamaño de objetos de dimensiones microscópicas.

1. DESCRIPCIÓN DEL MICROSCOPIO

2.1. SOPORTE MECANICO

-UN PIE PESADO o base, que da estabilidad al microscopio.

-UN BRAZO, que articula con:

-EL TUBO OPTICO: lleva las lentes oculares en la parte superior, y objetivos, en la pieza giratoria

o revolver en la parte inferior.


-LA PLATINA: es la plataforma sobre la que se colocan las preparaciones. Lleva un carro móvil

que permite desplazamientos transversales y en sentido vertical.

La distancia entre el tubo óptico y la platina puede variar, lo que permite el enfoque. La variación

de distancia entre estos, puede hacerse con el tornillo macrométrico, cuyo giro da lugar a una gran

variación de distancia (enfoque grosero) y con el tornillo micrométrico cuyo giro corresponde a

pequeñísimas variaciones de distancia (enfoque fino).

2.2. PARTE ÓPTICA

-OCULARES: Puede haber dos lentes oculares (microscopio binocular) o una sola (microscopio

monocular). En muchos modelos, puede ajustarse la distancia entre ellos (binóculos) para adaptarse a

la distancia interpupilar de cada usuario. El aumento está indicado en ellos (X10, X12... etc). En el

ocular puede incluirse una escala micrométrica para medir objetos.

-OBJETIVOS: se encuentran situados en la base de una pieza giratoria llamada revólver. Cada

microscopio lleva un juego de diversos objetivos, que permite trabajar con diferentes aumentos. Los

aumentos están indicados en la lente (por ejemplo: 40 x = 40 aumentos).

-SISTEMA DE ILUMINACIÓN: pueden tener el sistema de iluminación incorporado en la base, o

captar mediante un espejo, luz procedente de una lamparita o luz solar. Usar la parte cóncava para

luz artificial, y la parte plana para luz solar.

-DIAFRAGMA: regula la cantidad de luz que pasa a través del espécimen y a través de las lentes

del microscopio. La posición del diafragma debe de ser adaptada a cada muestra y a cada aumento

utilizado. Permite el contraste de la muestra con el medio que lo rodea.

-CONDENSADOR: consiste en una lente o serie de lentes que dirigen la luz hacia el espécimen. El

condensador puede colocarse a diferentes distancias en algunos microscopios.

Estas piezas son variables según el modelo de microscopio.

2. USO DEL MICROSCOPIO

Los aumentos totales, con cada juego de objetivos se obtienen multiplicando los aumentos del

objetivo por los aumentos del ocular.

NORMAS GENERALES

- No tocar nunca las lentes con los dedos. Las lentes se limpian con papel especial para lentes.

Cualquier otro material puede dañarlas.

- Empezar a trabajar con objetivos de pequeño aumento (objetivo “buscador”).

- Ajustar la iluminación óptima.


- No efectuar el movimiento de aproximación tubo óptico/platina (preparación) mirando por el

ocular.

2.1 ENFOQUE:

-Colocar la preparación en la platina, sujetarla con las pinzas de presión lateral y centrarla mediante

los tornillos situados a la derecha. Cerciorarse de que la posición de la preparación es: portaobjetos

abajo y cubreobjetos arriba.

-Colocar el objetivo girando el revolver, tras levantar ligeramente el tubo óptico (los objetivos de

mayores aumentos suelen ser más largos).

-Aproximar, mirando por fuera, el tubo óptico y la preparación (Tornillo macrométrico).

-Mirando por el ocular, girar muy despacio, alejando el tubo óptico con el tornillo macrométrico.

Los aumentos de un objetivo son inversamente proporcionales a la distancia focal, por lo que

dependiendo del objetivo, el plano de enfoque va a estar más o menos próximo a la preparación.

-Tras obtener el máximo de nitidez con el tornillo macrométrico, afinar el enfoque con el

micrométrico. Observar que pueden verse nítidos diferentes planos de nuestra muestra. Adaptar la

iluminación usando las diferentes posiciones del condensador, y la apertura del diafragma. Cada

muestra y cada aumento usado requieren la adaptación de la iluminación.

-Tras realizar el enfoque con un objetivo de poco aumento, centrar la muestra en el campo, y girando

el revolver colocar el objetivo de mayor aumento, repitiendo el proceso de enfoque.

Cuestiones:

1. Aumentos totales ¿Cómo se calculan?. Calcular para vuestro caso concreto. Citar marca, modelo y

características de vuestro microscopio.

2. ¿Cómo debes preparar tu microscopio para comenzar el enfoque con una preparación?

3. ¿Qué tipo de aumento es aconsejable utilizar al empezar a examinar una preparación?

¿El cambio de objetivo al observar una muestra implica adaptar la iluminación?


3. MEDIDA DE OBJETOS MICROSCÓPICOS

MATERIAL:

- Micrómetro ocular

- Micrómetro objetivo

Para medir las dimensiones de material microscópico es necesario disponer de una escala o

micrómetro ocular (algunos oculares llevan incorporado el micrómetro). Esta escala deberá de ser

calibrada, para conocer el valor de sus divisiones en cada una de las posibilidades de aumentos del

microscopio, con un micrómetro objetivo.

PROCEDIMIENTO:

1.- Colocar el micrómetro ocular dentro del ocular sin tocar las lentes, desenroscando la parte

superior e introduciendo la escala (excepcionalmente puede haber casos en que se introduce en la

parte inferior). Comprobar que el micrómetro ocular está correctamente incorporado dentro del

ocular, debe observarse la escala con nitidez.

2.- Calibrar: comparando con una longitud conocida (micrómetro objetivo), se calibra el valor de las

divisiones del ocular, en cada posibilidad de aumento de nuestro microscopio. Enfocar la escala del

portaobjetos de la forma habitual.

La escala objetiva tiene un milímetro dividido en centésimas de milímetro. Al ser observada y

comparada, permitirá calibrar el valor de las divisiones del ocular.

Calibrar primero con el objetivo de menor aumento. Un procedimiento simple puede ser hacer

coincidir los orígenes de ambas escalas, y buscar divisiones que coincidan exactamente colocando

ambas escalas paralelas, lo más próximas posible, pero sin que se superpongan. Por ejemplo, si 50

divisiones del ocular, coinciden con 70 divisiones del objetivo, es decir con 70 centésimas de

milímetro.

ocular (?) objetivo (conocida)

50 divisiones 70 centésimas de mm.

1 x

luego x= 70 =1.4 centésimas de milímetro.

50

La unidad de medida en microscopía óptica suele ser la milésima de milímetro, el micrómetro (µm),

luego, una división equivalente a 14 µm.


El calibrado suele hacerse 3 veces, enfocando y desenfocando, y se halla la media. Cuanto más larga

es la superficie comparada de las escalas menor será el error cometido.

Se procede de idéntica manera con los diferentes objetivos disponibles.

3.- Medida: Una vez conocida la equivalencia en micras de la escala ocular con cada posibilidad de

aumento, puede procederse a medir las muestras problema. Se retira el micrómetro objetivo, y se

sustituye por la preparación a medir, girando si es necesario el ocular, para superponer la escala a la

longitud a medir; se cuenta el número de divisiones, y se multiplica por su valor en micras. Por

ejemplo si mide 30 divisiones, como cada una de ellas vale 14 µm el tamaño real del objeto será 30 x

14 µm = 420 µm.


4. PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA DE TIERRA DE DIATOMEAS

PROCEDIMIENTO

1. Tomar una alícuota de tierra de diatomeas y ponerla en el centro de un portaobjetos.

2. Añadir una gota de agua.

3. Colocar el cubreobjetos con cuidado. Una de las aristas del cubreobjetos se pone en contacto

con el borde de la gota, y muy despacio se baja, para evitar que se forman burbujas de aire.

4. Medir el diámetro o longitud de una serie de ejemplares de la misma especie, y calculad los

valores medios dando las dimensiones reales.

Además se observaran al microscopio y medirán granos de polen distintas preparaciones

que ya han sido previamente montadas.

Cuestiones:

1.-¿ Qué es un micrómetro ocular?. ¿Dónde está situado?

2.-¿Qué objetivo se ha de calibrar en primer lugar?

3.-¿Cuál es la unidad de medida habitual en microscopia óptica?

4- Resultados de la calibración


Anexo: Relación entre la distancia focal, el diámetro del campo e iluminación del

campo:


PRACTICA 3.

OBSERVACIÓN DE TIPOS CELULARES PROCARIOTAS.

OBJETIVOS:

- Montar preparaciones sencillas.

- Uso del objetivo de inmersión.

- Observación de tipos celulares procariotas.

- Aprendizaje de técnicas de tinción sencillas.

MATERIAL Y REACTIVOS:

- Placas de agar nutritivo

- Bastoncillos

- Portaobjetos y cubreobjetos.

- Mechero de alcohol.

- Objetivo de inmersión y aceite.

- Alcohol 70% y absoluto.

- Cristal violeta, safranina, lugol

4.1 OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS.

Las cianobacterias comprenden un grupo grande y heterogéneo de organismos procariotas

fototróficos. Tienen una distribución muy extensa en la naturaleza, tanto en ecosistemas

terrestres como acuáticos. Las dimensiones de las células de cianobacterias fluctúan desde

0.5 a 1 µm de diámetro (tamaño característico de las bacterias), hasta 60 µm de diámetro.

Algunas cianobacterias filamentosas forman a partir de células vegetativas heterocistos

(células especializadas en la fijación de nitrógeno).

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar con una pipeta pasteur una gota de un cultivo de Anabaena variabilis y ponerla

en el centro de un portaobjetos.

2. Colocar la arista del cubreobjetos en contacto con el borde de la gota.


3. Bajar el cubreobjetos muy despacio evitando que se formen burbujas de aire

Figura 1. En los filamentos pueden observarse dos tipos de células: las vegetativas (más

abundantes, verdes) y heterocistos (aproximadamente 2-3 %; son amarillentas y ligeramente más

grandes). Estas últimas están especializadas en la fijación del nitrógeno atmosférico y constituyen

un caso interesante de diferenciación celular en procariotas.

4. Observar al microscopio la morfología de las cianobacterias y hacer mediciones de las

mismas.

NOTA. Los portas deberán lavarse y se colocarán limpios y secos en sus recipientes. Los

cubres se tiran a la basura; se ruega cuidado en no dejarlos abandonados en las mesas,

pues pueden dañar a los demás.

3.2. OBSERVACIÓN DE LA FLORA BACTERIANA BUCAL MEDIANTE

TINCION DE GRAM.

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial muy utilizado en microbiología para

la visualización de bacterias. Según reaccionan a la tinción Gram, las bacterias se pueden

dividir en dos grandes grupos: gram positivas (color azul-violáceo) gram negativas (color

rojo). Estas diferentes maneras de reaccionar frente a la tinción Gram se deben a diferencias

en la estructura de la envoltura celular de estas bacterias (ver figura 2). Las bacterias se

tiñen con una solución de cristal violeta y yodo, decolorándose posteriormente con alcohol

y/o acetona. Las bacterias gram positivas, al poseer una envoltura celular más resistente


retienen el primer colorante, manteniendo su coloración azul-violácea. Por el contrario las

bacterias gram negativas no resisten a la decoloración y tras añadir la safranina (colorante de

contraste) quedaran coloreadas de rojo.

Figura 2. Envoltura celular bacteriana. A causa de las diferencias en la estructura de la envoltura celular, algunas bacterias (bacterias gram-positivas) retienen ,a tinción Gram (introducida por Hans Christian Gram en 1882) y otras no (bacterias gram-negativas).

PROCEDIMIENTO:

Pueden observarse bacterias de la flora normal de la boca, procediendo de la forma

siguiente:

1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado (limpiar con alcohol del 70 %) añadir una

gota de agua y extender el material procedente de pasar suavemente un bastoncillo por la

superficie interna de la mejilla.

2. Secar al aire o suavemente a la llama de un mechero de alcohol.

PRECAUCION:

- No mover el mechero después de encendido ni inmediatamente antes de hacerlo.

- No utilizar un mechero para encender otro.

- No soplar para apagar el mechero. Hacerlo con la campana de cristal

correspondiente.

3. Fijar la extensión, una vez seca, pasándola dos o tres veces por la llama (el porta debe

poderse coger con las manos, sin que queme; la temperatura óptima es de 45-50 ºC). Esta

operación es muy importante, ya que evita la pérdida de la preparación en las etapas

posteriores.


4. Con el portaobjetos frio, cubrir el frotis con unas gotas de cristal violeta, y dejar actuar al

colorante durante 3-5 minutos.

5. Eliminar el colorante con agua, y arrastrar los restos que pudieran quedar con unas gotas

de lugol. Añadir unas gotas de lugol y dejar actual 30 segundos. La preparación adquiere un

color pardo-negro. Lavar suavemente con agua abundante.

6. Decolorar con alcohol. Inclinando el porta, se deja deslizar la solución, dejando que el

sobrenadante vaya derramándose por el extremo opuesto. Se verterá alcohol-acetona hasta

observar la preparación incolora o escasamente teñida. Prolongar la decoloración puede

llevar a resultados erróneos.

7. Lavar suavemente con abundante agua.

8. Para poner de manifiesto las bacterias Gram negativas, utilizaremos un segundo

colorante, pues al no retener el colorante de Gram, permanecerían incoloras. Para ello,

añadir dos gotas de safranina y mantener durante un minuto.

9. Lavar cuidadosamente con agua abundante y dejar secar al aire.

10. Una vez completamente seca, observar la preparación con el objetivo de inmersión.

Colocar el condensador en posición alta y el diafragma abierto. Poner una gota de aceite de

inmersión en la zona central del frotis. Aproximar el objetivo de inmersión hasta que haga

contacto con la superficie de la gota, y enfocar la preparación moviendo suavemente el

tornillo micrométrico.

El objetivo de inmersión proporciona unos 100 aumentos (ver cada caso); su distancia focal

es tan pequeña que no utilizamos cubreobjetos pues el grosor de éste impediría el enfoque

de la preparación. Por otra parte, la utilización del aceite de inmersión (mayor índice de

refracción que el aire) proporciona las mejores condiciones para la observación de la

preparación.

El objetivo de inmersión deberá limpiarse tras su uso. Durante el uso este objetivo hay que

ser cuidadoso para no ensuciar con aceite los otros objetivos.

Observar el distinto comportamiento de las bacterias frente a la tinción. Hacer

observaciones referentes a la morfología, agrupación, tamaño, etc… de los

microorganismos.


Cuestiones:

1. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza el aceite de inmersión?

2. Identificar las morfologías de los distintos microorganismos observados, haciendo esquemas de las

distintas preparaciones. ¿Cómo crees que se originan este tipo de agrupaciones?

3. Describe brevemente las diferencias entre la célula procariota y la eucariota

Fig. 1-10 Essential Cell Biology (Garland 2010)

Las bacterias tienen distintos tamaños y formas

cocos bacilos espirilos

1 monococo2 diplococos 3 estafilococos 4 estreptococos 5 sarcina 6 tetradas


PRACTICA 4.

OBSERVACION DE TIPOS CELULARES EUCARIOTAS I: CÉLULA VEGETAL Y

ORGÁNULOS

OBJETIVOS:

- Confeccionar preparaciones temporales de tejidos vegetales.

- Aprendizaje de tinciones selectivas.

- Observación de orgánulos celulares en células diferenciadas de organismos pluricielulares

MATERIALES

- Cubre y portaobjetos.

-Túnica de cebolla.

- Lugol.

- Hojas de cola de zorro, tomate, patata.

4.1 OBSERVACIÓN DE PLASTIDIOS

A. CLOROPLASTOS.

PROCEDIMIENTO:

- Colocar una hoja (preferentemente joven) de cola de zorro (Ceratophylum demersum) bien

extendida en un porta.

- Añadir una gota de agua y montar el cubreobjetos.

- Observar al microscopio el tamaño, morfología, número de cloroplastos (fácilmente distinguibles

por el color verde de la clorofila).

B. CROMOPLASTOS.

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar una pequeña cantidad de la pulpa de un tomate y colocarla entre porta y cubreobjetos.

Comprimir suavemente para extender la muestra.


2. Se observarán células sueltas con los cromoplastos desperdigados en su interior en forma de

pequeños gránulos. Cada cromoplasto ofrece el aspecto de una esfera incolora, conteniendo pequeñas

agujas rojas de licopeno cristalizado.

C. AMILOPLASTOS:

PROCEDIMIENTO:

1. Raspar el material objeto de estudio (patata, cereales, legumbres) sobre un porta.

2. Añadir una gota de agua y otra de lugol. Poner el cubre y observar con el microscopio.

Cuestiones:

1. Dibujar y describir: cloroplastos, cromoplastos y amiloplastos

2. Describe brevemente las funciones de los orgánulos observados.


PRACTICA 5.

OBSERVACION DE TIPOS CELULARES EUCARIOTAS II: ELEMENTOS FORMES

SANGUÍNEOS

OBJETIVOS:

- Confeccionar preparaciones temporales de tejidos animales.


- Observación de orgánulos celulares en células diferenciadas de organismos pluricelulares.


- Vidrio de reloj; pinzas de madera; lancetas; aguja enmangada, mechero de alcohol.

- Cubre y portaobjetos.

- Metanol

-Solución de May-Grünwaland (eosinato de azul de metilo) y Solución Giemsa (azul de metilo, azur

eosina) diluida.

- Material biológico: muestra de sangre

TEJIDO SANGUINEO

Para la observación de elementos formes presentes en la sangre se utilizará el método panóptico. La

práctica comprende dos partes:

A. Obtención de un frotis sanguíneo

FROTIS: es una extensión de material suficientemente fina para poder ser observada al

microscopio con objetivo de gran aumento (en nuestro caso utilizaremos el objetivo de

inmersión).

B. Fijación y coloración de los elementos formes y células sanguíneas

A. Obtención de un frotis sanguíneo

1. Colocamos una gota de sangre en uno de los extremos del portaobjetos.


2. Colocamos el otro portaobjetos formando un ángulo de 45ºC, lo acercamos a la gota y esperamos

que al tocarla se extienda por capilaridad a lo largo de la superficie lateral. Arrastrar por todo el

portaobjetos.

3. Dejar secar a temperatura ambiente.

B. Coloración por el método panóptico

1. Verter 10 gotas de la solución de Eosinato de azul de metilo sobre el frotis, dejándolo actuar el

reactivo durante 3 minutos. Se debe evitar que la preparación se seque durante el tratamiento.

2. Verter sobre la superficie del frotis 10 gotas de agua destilada. Inclinado el portaobjetos para que

se mezcle bien el agua con el reactivo. Dejar actuar la mezcla durante 1 minuto.

3. Retirar el colorante anterior por deslizamiento y sin lavar verter sobre el frotis la solución de

Giemsa. Dejar actuar de 15-20 minutos.

4. Lavar rápidamente, evitando que la película del colorante quede adherida sobre la superficie del

frotis.

5. Dejar secar al aire la preparación.

6. Observar al microscopio. Es aconsejable una primera exploración de la preparación con una lente

de pequeño aumento con el objeto de localizar una buena zona. Después colocar una gota de acetite

de inmersión sobre la muestra y utilizar el objetivo de inmersión para la visualización de la misma.


Cuestiones:

1. ¿Qué es un frotis?, ¿Cómo se prepara?

2. Comenta brevemente el fundamento de la técnica de tinción utilizada

3. ¿Qué elementos o células son las más abundantes en la sangre?

4. ¿Qué tipo de glóbulos blancos son los que se ven con más frecuencia?

5. ¿Por qué los eritrocitos y las plaquetas no pueden ser considerados verdaderas células?


PRACTICA 6.

TRANSPORTE CELULAR: TURGENCIA Y PLASMÓLISIS

La capacidad de mover selectivamente iones y moléculas orgánicas a través de una

membrana es un proceso básico en la función celular. Algunas moléculas apolares y de

pequeño tamaño atraviesan la membrana por difusión simple. Sin embargo, para la mayoría

de los solutos este movimiento está mediado por proteínas transportadoras que permiten la

difusión facilitada o el transporte activo de los solutos a favor o en contra de gradiente de

concentración electroquímico respectivamente. Pero para comprender correctamente el

mecanismo de transporte de solutos, necesitamos entender también las fuerzas que actúan

sobre el agua y determinan su movimiento dentro y fuera de las células. El agua se mueve a

través de una membrana semipermeable (osmosis) impulsada por diferencias en la presión

osmática. Las disoluciones de igual osmolaridad que el citosol celular son isotónicas. Una

célula rodeada por una disolución isotónica no gana ni pierde agua. En una disolución

hipertónica, con osmolaridad mayor que el citosol, la célula se retrae y deshidrata al salir el

agua. En las células vegetales el movimiento de salida de agua facilita la separación entre la

membrana y la pared celular (plasmólisis) perdiendo su turgencia. Contrariamente, la célula

se hinchará en una solución hipotónica

OBJETIVOS:

-Comprender el proceso osmótico

-Diferenciar el proceso en células animales y vegetales, comparando el proceso in vitro, por

medio de la observación microscópica de preparaciones de sangre y elodea.


-Cubre y portaobjetos

-Pipetas Pasteur.

-Gradilla y tubos de ensayo.

-Placas Petri.

-Cristal violeta al 0.01%.

-Muestra de sangre

-Epidermis de cebolla

-Soluciones de NaCl al 0.6%, 0.9%, 1.2% y 4%.

PROCEDIMIENTO:

1. Añadir con una Pipeta Pasteur 3-4 gotas de sangre en los tubos de plástico de 1.5 mL con

las soluciones de NaCl al 0.6%, 0.9% y 1.2%.


2. Dejar reposar durante 2 minutos y realiza una preparación en un portaobjetos para cada

concentración de NaCl.

3. Observar al microscopio y comparar el tamaño que presentan los eritrocitos para cada

solución.

4. Prepara tres placas Petri con 10-15 mL de agua y de las soluciones de NaCl al 0.9% y 4%.

Corta varios trozos de epidermis de cebolla y coloca una en cada placa, espera 10 minutos.

4. Realizar una preparación para cada muestra de epidermis de cebolla procedente de

distintas concentraciones. Observa el estado de las células, si la membrana celular está

separada de la pared celular, la célula está plasmolizada. Opcionalmente y para facilitar la

observación de las células se puede añadir una gota de cristal violeta (solo una).

Cuestiones

1. ¿A qué se refieren los términos hipotónico, isotónico e hipertónico?

2. ¿A qué concentración observas plasmólisis en las células de la epidermis de la cebolla?. En la

naturaleza ¿En qué casos se puede provocar plasmólisis en las plantas?.

3. ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si se hubiera empleado un alga marina en el

experimento?

4. En su medio natural, las células contienen generalmente concentraciones más elevadas de

biomoléculas e iones que sus alrededores, de forma que la presión osmótica tiende a impulsar agua

hacia el interior de las células. ¿Qué mecanismo han surgido a lo largo de la evolución en las células

procariotas y células eucariotas vegetales y animales para evitar la lisis osmótica?


PRACTICA 7.

OBSERVACIÓN DE NUCLEO INTERFÁSICO Y MITOSIS.

OBJETIVOS:

-Confeccionar preparaciones temporales de tejidos vegetales.


- Observación de orgánulos celulares en células diferenciadas de organismos pluricielulares

-Tinciones selectivas de cromosomas en preparaciones temporales de tejidos vegetales en

los que se encuentran células en división.

-Observación de cromosomas y figuras mitóticas.


-Papel de filtro

-Vidrio de reloj; pinzas de madera; lancetas; mechero de alcohol.

-Cubre y portaobjetos.

-Túnica y raicillas de cebolla.

-Orceína acética al 2% (orceína al 2 % en ácido acético).

-Orceína clohídrica (formada por 9 partes de una disolución de orceína acética al 2 % y 1

parte de HCl 1N).

7.1 OBSERVACION DE CELULAS VEGETALES EUCARIOTAS: NUCLEO

INTERFASICO EN TUNICA DE CEBOLLA

PROCEDIMIENTO:

1. Cortar un trozo de túnica de cebolla.

2. Colocarla sobre un vidrio de reloj

3. Cubrir la preparación con 5 ó 6 gotas de orceína.

4. Calentarla suavemente a la llama de un mechero hasta que se observe la aparición de humos

blancos muy tenues. Tener cuidado de que el reactivo no hierva ni se seque.

5. Pasar el material a un portaobjetos.

6. Añadir una gota de agua; colocar un cubre.


7. Eliminar el exceso de la mezcla de reactivo y agua sobre el cubre con papel de filtro.

8. La observación microscópica se realiza con objetivos de pequeño aumento, buscando la parte de la

preparación en la que se vean las células individualmente. Realizar observaciones relativas a la

forma y tamaño de las células, posición del núcleo, etc.

7.2 TINCIÓN RÁPIDA DE CROMOSOMAS: OBSERVACIÓN DE LA MITOSIS.

La mitosis es una etapa del proceso de división celular que permite que la dotación genética

de las células hijas se mantenga exactamente igual a la de la madre. En organismos

vegetales el material más adecuado son los meristemos en crecimiento, y en particular los de

la raíz, con una tasa de reproducción muy elevada en las células apicales.

PROCEDIMIENTO:

1. Para la observación de los cromosomas utilizamos una raicilla de cebolla (Allium cepa).

Tomad la raíz completa para evitar que otro compañero la considere intacta.

2. Cortar el ápice de la raíz, aproximadamente medio centímetro.

3. Colocar la raíz en un vidrio de reloj que contenga una pequeña cantidad de orceína

clorhídrica, pasando aquel sobre el mechero durante algunos segundos; este calentamiento

se repite de 3 a 5 veces, teniendo especial cuidado de que no llegue a ebullición ni se seque.

4. Una vez realizado este calentamiento, se toma la raicilla y se coloca sobre un porta. Acto

seguido se vierte un gota de agua y con la ayuda de la lanceta se extiende en el portaobjetos

y se desgarran los tejidos. Para terminar de montar la preparación se pondrá el cubreobjetos

y se aplastará fuertemente para terminar de extender lo muestra, recogiendo el exceso de

orceína acética si rezuma por los bordes del cubre.

5. Observar al microscopio y realizar un esquema.


Cuestiones:

1. Hacer observaciones relativas a la forma, tamaño y posición del núcleo en las preparaciones

observadas.

2. ¿Por qué se utiliza el ápice de raíz de cebolla para observar mitosis?. Comenta brevemente las

diferencias observadas entra las células presentes en túnica de cebolla y las del meristemo apical.

3. Esquema de las diferentes fases mitóticas que se observan

4. En este caso 2n=16. ¿Qué es lo que recibe cada una de las dos células hijas durante la mitosis? ¿Y

en la meiosis?

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