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Prctica 3 : Microscopa y Organizacin Celular

Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

I. - OBJETIVOS

Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de:

* Identificar y manejar las diferentes partes de un microscopio compuesto.

* Aprender a colocar el microscopio en posicin de trabajo.

* Aplicar los procedimientos para preparar materiales y observarlos en el microscopio.

* Identificar estructuras celulares y sus respectivas funciones.

* Realizar esquemas de las estructuras celulares y rotularlos adecuadamente utilizando el aumento del microscopio.

* Familiarizarse con el trabajo en el microscopio.

II. Introduccin

Segn la teora celular, la clula es la estructura biolgica ms pequea y simple que posee todas las

caractersticas bsicas de la vida. Todos los organismos vivos estn compuestos de una o ms clulas y

toda actividad que realiza un organismo vivo est relacionada con las actividades metablicas de las

clulas. As, para entender los procesos de la vida se necesita entender la estructura y la funcin de la

clula. Las clulas, sin embargo, se encuentran por debajo del lmite de la resolucin del ojo humano,

haciendo necesario la utilizacin de un instrumento con capacidad de amplificacin visual y alta

resolucin.

El microscopio es un instrumento diseado para hacer posible

la observacin y el examen de objetos muy pequeos, los

cuales no podran ser vistos sin la ayuda de lentes

amplificadores. Hay dos tipos de microscopio segn la fuente

utilizada para su funcionamiento: el microscopio de luz y el

microscopio electrnico. Dentro de los microscopios de luz

existen variaciones; los ms usados y conocidos son los

microscopios simples o lupa, el microscopio compuesto y el

microscopio binocular estereoscopio. Podemos encontrar otros

tipos de microscopios de uso ms especializado en

determinados campos de la biologa y otras ciencias, tales como

el microscopio de contraste de fase, de fluorescencia, UV, de

luz polarizada, confocal., etc.)

Los microscopios que se utilizan en entornos cientficos

cuentan con varias mejoras que permiten un estudio integral del

espcimen. El microscopio ptico comn est conformado por

tres sistemas: (a) sistema mecnico, constituido por una serie de

piezas en las que van instaladas las lentes, y que permiten el

movimiento para el enfoque, (b) sistema ptico que comprende

un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el

aumento de las imgenes que se observan a travs de ellas, y (c)

sistema de iluminacin que comprende las partes del


microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observacin a

travs del microscopio.

Para la formacin de la imagen, el microscopio ptico de luz dispone de una distribucin especfica de

grupos de lentes que permiten una gran amplificacin. La fuente luminosa es un filamento de tungsteno

cuya luz es dirigida hacia un slo punto mediante la lente condensadora. El haz luminoso incide por

debajo de la preparacin que debe ser lo bastante fina como para que la luz pueda atravesarla. Al pasar por

la muestra, parte de la luz es absorbida por sta y la diferencia de absorcin de la luz en diferentes partes

del espcimen produce contrastes que revelan detalles de su estructura. Tras atravesar la muestra, la luz

pasa a travs de los lentes objetivos localizados por encima de la preparacin. Existen diferentes lentes

objetivos con diferentes capacidades de amplificacin de la muestra y resolucin de la imagen que pueden

ir intercambindose a lo largo del estudio:

4X Este objetivo magnifica la imagen 4 veces su tamao real. Este objetivo es

utilizado para localizar el objeto que se va a estudiar, antes de observarlo con

mayor magnificacin.

10X Este es un objetivo de bajo poder que magnifica 10 veces la imagen

40X Este es un objetivo de alto poder que magnifica 40 veces la imagen.

Finalmente, la luz pasa a travs de los lentes oculares a travs de los cuales, el investigador observar la

preparacin. Los oculares amplan en 10 veces (10X) la imagen. Por lo tanto, la magnificacin total de

cualquier preparacin que se observa a travs del ocular ser el producto de la magnificacin del lente

ocular y del lente objetivo.

La mayora de los microscopios que se usan en los laboratorios de investigacin tienen un objetivo

adicional denominado 100X, que requiere la utilizacin de aceite de inmersin para obtener buena

resolucin y evitar dao al objetivo. Con este objetivo se obtiene una amplificacin de 100 veces el

tamao real de la imagen. En el laboratorio no vamos a usar este objetivo.

Los microscopios cuentan ademn con un lente condensador y un diafragma que se localizan justo

debajo de la platina. El primero permite capturar y enfocar la luz desde la lmpara, directamente hacia el

objeto en estudio, mientras el diafragma permite ajustar la cantidad de luz que pasa a travs de la

preparacin.

Dado que la imagen de la muestra es invertida y ampliada muchas veces, es difcil moverla de forma

manual. Por ello los soportes de los microscopios cientficos de alta potencia estn montados en una

plataforma que se puede mover con tornillos micromtricos. Algunos microscopios cuentan con soportes

giratorios.

El microscopio compuesto es utilizado con altos poderes de amplificacin para hacer observaciones de

objetos sumamente pequeos, los cuales tienen que estar finamente cortados y puestos sobre vidrios

especiales denominados portaobjetos. Adems, deben ser transparentes para que la luz pueda atravesarlos.

Es frecuente tambin cubrir los objetos con otros vidrios especiales ms pequeos que los anteriores

llamados cubreobjetos.

Cuando se trabaja en el laboratorio, es de gran importancia conocer el poder o grado de aumento, el

poder de resolucin y la distancia de trabajo. El grado de aumento es la magnificacin total que sufre la

imagen del objeto debido al efecto de los lentes oculares y objetivos. Se obtiene multiplicando el nmero

de veces que aumenta el lente ocular por el nmero de veces que aumenta el lente objetivo. Por ejemplo,

si el ocular aumenta 10 veces el tamao de una muestra observada con un objetivo 40X, la magnificacin

total en este caso ser: 10X x 40X = 400X. En la misma forma se procede cuando se trabaja con otros

lentes de mayor poder. Este resultado permite saber cuntas veces ms grande estamos viendo la imagen

de un objeto.


Igualmente importante es el poder de resolucin, que es la posibilidad de distinguir dos puntos muy

cercanos entre s. Cuanto mayor sea el poder de resolucin, menor ser la distancia entre dos puntos

pueden distinguirse como tales. El poder de resolucin de un microscopio compuesto depende de la

longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numrica (propiedad ptica de la lente). Cualquier

objeto cuyo dimetro sea menor que 0.1 mm es demasiado pequeo para poder ser observado a simple

vista. La mayor utilidad del microscopio es la capacidad de ampliar el poder de resolucin de la vista

humana para objetos cuyo dimetro es menor que 0.1mm. Por tanto, un microscopio sirve

fundamentalmente para dos cosas: primero provee aumento y, segundo, permite ver detalles de objetos tan

pequeos que no podran ser vistos normalmente. De esta forma, el poder de resolucin es quiz la

caracterstica ms importante de un buen microscopio ya que de nada sirve una imagen muy grande del

objeto, si sta se ve borrosa y no pueden distinguirse sus detalles.

Finalmente, se conoce como distancia de trabajo a la distancia comprendida entre los objetos en

observacin y el lente frontal del objetivo. Es inversamente proporcional al aumento; es decir, cuanto

mayor sea el aumento del lente objetivo menor ser la distancia de trabajo. El siguiente cuadro muestra las

distancia de trabajo para cada objetivo, en el microscopio disponible en el laboratorio.

Objetivo 4X 10X 40X 100X

Distancia de Trabajo (mm)

27.8 8.0 0.6 0.13

Las preparaciones biolgicas que se van a estudiar al microscopio se colocan sobre una lmina de vidrio

llamada portaobjetos. Los portaobjetos estn hechos de vidrio de borosilicato o silicato y generalmente se

utilizan junto con un vidrio pequeo y muy delgado llamado cubreobjetos, el cual mantiene la

preparacin fija y la protege de movimientos inadvertidos, al mismo tiempo que previene el contacto de la

preparacin con los objetivos.

Para obtener una imagen clara y ntida es importante que tanto el portaobjeto como el cubreobjeto estn

limpios y secos. Para limpiar el portaobjeto, tmelo con los dedos por los bordes, frtelo con un pauelo

limpio y seco o con una toalla absorbente. Los cubreobjetos son muy frgiles y deben ser tratados con

mucho cuidado.

Para observar una muestra al microscopio ptico podemos recurrir a:

A. Preparacin seca: para ste tipo de preparacin, se requiere de una seccin muy delgada de la muestra que se coloca en el centro del portaobjeto. En caso de tener una muestra opaca, es importante obtener

cortes muy delgados de la preparacin.

B. Preparacin hmeda. Se coloca la muestra en una suspensin (generalmente agua, glicerina, agua

salada o aceite de inmersin). Para observar la

muestra al microscopio, se coloca una gota la

suspensin en el portaobjeto, se posiciona el

cubreobjeto formando un ngulo con el portaobjeto

y lentamente se cubre la preparacin, evitando la

formacin de burbujas.

C. Preparacin fijada. Se coloca una suspensin homognea de la muestra en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes qumicos). Frecuentemente una vez fijada la

preparacin, se utilizan distintas tcnicas de tincin para aumentar el contraste en la imagen

microscpica

Las muestras que se observan al microscopio deben tener suficiente contraste para discriminar entre los

diferentes componentes celulares o tisulares. A diferencia de los tejidos de origen vegetal, los tejidos

cubreobjeto

portaobjeto suspension con la muestra


animales son en su gran mayora incoloros excepto aquellos que poseen algn tipo de pigmento. En las

plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales (clorofila, carotenos,

antocianinas, etc.) que, sumado a la presencia de una pared celular, facilita la delimitacin celular y la

discriminacin entre diferentes tejidos. En la mayor parte de los casos, el contraste de la muestra se

obtiene artificialmente mediante el uso de reacciones de tincin cuyo objetivo sea aumentar el contraste de

las estructuras biolgicas para facilitar su observacin e identificacin, segn la afinidad que tengan para

determinados colorantes.

TINCIONES

Un colorante es una sustancia que se adhiere por afinidad a un tipo celular o a una parte especfica de la

muestra. La coloracin resultante aumenta el contraste de la imagen al microscopio, permitiendo realizar

un anlisis ms detallado de la muestra.

Las tcnicas de tincin se basan en la afinidad diferencial de los colorantes a los distintos organismos o a

sus componentes celulares Los colorantes pueden aplicarse a organismos vivos (colorantes vitales) si el

tinte no altera la estructura o vitalidad del organismos estudiado; o pueden utilizarse una vez la muestra ha

sido previamente tratada con fijadores.

Los colorantes pueden ser de 3 tipos: catinico (azul de metileno, cristal violeta, azul de toluidina o

safranina) los cuales pueden penetrar al interior celular; distintos tipos; aninico (eosina, azul de anilina)

los cuales tien el contorno celular al no tener la capacidad de atravesar la membrana (son repelidos por la

carga negativa del citoplasma), y liposolubles (negro Sudn) los cuales reconocen los componentes

lipdicos de la membrana.

Las tinciones pueden ser:

A. Simples. es una tcnica que se basa en la utilizacin de un solo colorante con afinidad diferencial al tipo o componente celular (no al medio) y consiste en sumergir la muestra (fijada o no) en el

colorante, seguido por un proceso de lavado previo a su observacin al microscopio. En algunos casos

es necesario utilizar un compuesto qumico adicional que reacciona con el colorante para formar un

precipitado insoluble pero coloreado.

Es una tcnica muy til para estudiar la morfologa celular o la naturaleza de su contenido.

B. Diferenciales. esta tcnica utiliza dos o ms colorantes. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una

tincin. Al igual que la tincin simple, la tincin diferencial es muy til en estudios de morfologa

celular pero adicionalmente, provee informacin acerca de la composicin (grosor) de la membrana

celular. Un ejemplo muy conocido de esta tcnica es la tincin de Gram.

C. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej.; tincin con hematoxilina.-

eosina (el primer colorante tie el ncleo de una clula fijada, por ser catinico y el segundo tie el

citoplasma, por ser aninico).

Entre los colorantes o tintes ms comnmente utilizados en microscopa podemos mencionar:


Marrn Bismarck - Marrn Bismarck, le imparte un color amarillo a las mucinas cidas en tejido

vivo.

Carmn es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para

teir glicgeno, mientras que las sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al ncleo.

Las tinciones con carmn requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.

Azul Coomassie - conocido como azul brillante, es un colorante que tie en forma no especfica a

todas las protenas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente para teir las corridas de

protenas en las electroforesis en gel.

Cristal de Violeta - al ser combinado con un mordiente adecuado, tie las paredes celulares de color

prpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloracin de Gram.

Eosina - se utiliza ms frecuentemente como contracoloracin de la hematoxilina, impartiendo un

color que va del rosado al rojo al material citoplasmtico, membrana celular, y algunas estructuras

extracelulares.

Bromuro de Etidio - se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente, utilizado

para detectar clulas en apoptosis o muerte celular.

Fucsina - utilizada para colorear colgeno, msculo liso o mitocondrias. Forma parte de la

coloracin tricrmica de Mallory donde se utiliza para colorear ncleo y citoplasma.

Hematoxilina es un colorante nuclear. Utilizado con un mordiente, la hematoxilina tie a los

ncleos celulares de color azul violeta a negro.

Iodo usado como indicador de almidn. Lugol o Lugol yoduro (IKI) es una solucin de color

marrn que se torna azul oscuro en presencia de almidones y puede ser utilizada para colorear

clulas.

Azul de Metileno - se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Es

tambin utilizado para teir los extendidos de sangre para ser utilizados en citologa.

Azul Nilo - tie a los ncleos de color azul en clulas vivas.

Sudan - se utiliza para destacar la presencia de lpidos en la muestra

Rodamina - es una tincin fluorescente especfica para protenas utilizada comnmente en

microscopa fluorescente.

Safranina - es un colorante nuclear. Colorea los ncleos celulares de rojo, y se utiliza

principalmente como contracoloracin. Tambin puede ser utilizada para darle una coloracin

amarilla al colgeno.

Azul de Toluidina - en suspensin presenta un color azul y cuando se expone a estructuras ricas en

enlaces amnicos (cromatina) tomando un color rojo.

III. Procedimiento en el laboratorio.

Durante esta sesin de laboratorio se realizarn cinco ejercicios que le permitirn adquirir habilidades y

destrezas necesarias para trabajar con un microscopio de luz compuesto. Para ello, cada subgrupo realizar

y analizar los 5 experimentos, siguiendo las indicaciones de su instructor.

Al finalizar los experimentos, se har una discusin de los resultados obtenidos. Cada subgrupo debe estar

preparado para discutir sus resultados.

Esta prctica tiene como objetivo principal, el desarrollar destrezas y habilidades en los participantes del

curso. Por lo tanto, no se requiere el diseo de hiptesis y predicciones; nicamente, seguir detenidamente

las indicaciones de su instructor y asistente.


Ejercicio 1

Este ejercicio lo realizarn simultneamente con el instructor al inicio del laboratorio.

A. Mtodo de trabajo y cuidados del microscopio.

1. Con la ayuda del instructor/asistente el estudiante identificar cada componente del microscopio y el estereoscopio y har una descripcin de sus

funciones. Rotule los esquemas que se presentan en el reporte.

2. Coloque el microscopio sobre la mesa de trabajo.

Cuando traslade el microscopio, hgalo sostenindolo con las dos manos, con

la derecha sujete firmemente el brazo y posicione la mano izquierda bajo la

base.

Los siguientes pasos deben ser seguidos en orden cada vez que utilice el microscopio a los largo del

presente ciclo lectivo

1. Antes de usar el microscopio, observe si todas sus partes se encuentran limpias y en buen estado. Si el ocular y los objetivos se encuentran sucios, proceda a limpiarlos cuidadosamente, utilizando un papel

de seda. No utilice cualquier tipo de papel o limpiador. Si an despus de haber limpiado los lentes

permanecen sucios u opacos, consulte con el asistente, quien proceder a limpiarlos siguiendo el

procedimiento descrito en el siguiente cuadro.

Cualquier dao debe ser informado inmediatamente al instructor.

Procedimiento de Limpieza Coloque los objetivos y/o oculares sobre una superficie libre de polvo (por ejemplo papel de

aluminio). Los dems componentes pticos que van a ser limpiados deben estar tan accesibles como

sea posible.

1. Remueva todas las partculas de polvo sueltas con un ventilador o con aire a presin. 2. Remueva toda la suciedad soluble en agua con agua destilada. Si esto resulta insuficiente, repita

usando una solucin diluida de jabn lquido para manos. Remueva cualquier residuo remanente

con un hisopo de algodn seco.

3. Para remover aceite, emplee inicialmente una solucin de jabn lquido para manos. Si esto no produce un resultado satisfactorio, repita la limpieza usando un solvente (85% de solucin de

limpieza para piezas pticas y %15 de isopropanol).

4. La grasa siempre debe ser removida usando un solvente. 5. La limpieza debe realizarse usando un movimiento en espiral desde el centro hacia el borde.

Nunca limpie usando movimientos en zig-zag ya que esto solo va a extender la suciedad. Con

superficies pticas ms grandes (por ejemplo lentes de tubo), el movimiento en espiral comienza

inicialmente en el borde antes de desplazarse hacia el medio y solo entonces es seguido por un

movimiento de limpieza desde el centro hacia el borde.

Normalmente, se aconsejan, varias limpiezas en espiral. Se recomienda ter de petrleo puro

voltil o solucin de limpieza para piezas pticas.


Limpie utilizando un movimiento en espiral. Nunca use un movimiento en zig-zag!

6. Limpieza de las superficies pintadas: Evite el uso de cualquier solvente orgnico (por ejemplo disolvente, xileno, ter, alcohol, etc.) para la limpieza de las superficies pintadas del instrumento.

Estas superficies pueden limpiarse con un pao de microfibra apenas humedecido.

7. El polvo suelto y otras suciedades pueden removerse usando un cepillo de pelo suave el cual se emplee solo para este propsito.

Manual del usuario. Olympus CX22

2. Encienda la luz y ajuste la intensidad

3. Ponga el objetivo de bajo poder (4x) en lnea, haciendo girar el revlver suavemente hasta que el lente quede en posicin de trabajo. Nunca mueva los objetivos haciendo presin en los objetivos, use el

revlver.

4. Ponga la preparacin a estudiar sobre la platina, asegurndose de que est bien prensada y que no toque el lente frontal del objetivo. Mantenga seca la platina.

5. Examine el condensador en su microscopio y asegrese que est en una posicin lo ms cercano a la platina.

6. Verifique que la cantidad de luz regulada por el diafragma sea directamente proporcional al aumento utilizado. Mire por el lente ocular y ajuste el diafragma para que todo el campo ptico est

homogneamente iluminado.

7. Una vez hecha la observacin y antes de quitar la preparacin, coloque el objetivo de bajo poder en posicin de trabajo.

8. La luz debe permanecer apagada mientras el microscopio no est en uso.

9. Asegrese que el microscopio est limpio antes de entregarlo al concluir sus observaciones.

B. Procedimiento para enfocar correctamente el microscopio

1. Antes de iniciar, verifique que el lente objetivo y la platina estn a una distancia lo ms separado posible. Si no, utilice el macromtrico para separarlos. Recuerde iniciar la observacin de la muestra

con el objetivo 4X.

2. Ponga una lmina de prueba (cuadrado, letra, palabras, etc.) sobre la platina del microscopio, de tal manera que la porcin del portaobjetos que contiene la muestra quede directamente sobre la abertura

circular. Sujete el portaobjetos con las pinzas del carro.

3. Mientras observa por un lado del microscopio, mueva el macromtrico lentamente Observe el movimiento del sistema ptico o de la platina. cuando gire la perilla del macromtrico hacia delante o

hacia atrs (algunos modelos de microscopios estn construidos de tal forma que no es el tubo ptico

el que se acciona con las perillas del enfoque, sino que es la platina). Anote hacia cul direccin

debe girar el macromtrico para acercar o alejar la platina (y el portaobjeto) de la preparacin.

R E C U E R D E!

Siempre que monte o remueva laminillas de la platina, el lente objetivo

colocado en posicin vertical debe ser el de de 4x el de 10x. Los

objetivos de 40x o 100x quedan muy cerca del portaobjeto, lo que

aumenta grandemente la probabilidad de rayar el objetivo o romper el

portaobjeto.


4. Sin dejar de mirar por un lado del microscopio, gire la perilla del macromtrico hasta que el lente objetivo de bajo poder est lo ms cercano posible al portaobjeto, sin romperlo. Hasta este punto,

usted no ha utilizado los oculares para observar la preparacin.

5. Mirando ahora por el ocular, accione lentamente la perilla del macromtrico en la direccin contraria (objetivo de aleja de la preparacin). Gire el macromtrico hasta que aparezca claramente la imagen

de las letras impresas en el campo ptico.

6. A partir de entonces, ser el micromtrico el que se usar para apreciar los detalles y los planos de la preparacin. Con la perilla del micromtrico ajuste suavemente el foco hasta obtener una imagen

ntida de las letras. Nuevamente, anote hacia cual direccin debe girar el micromtrico para acercar la

platina con el portaobjeto al objetivo con la cual se est trabajando.

7. Mueva el carro de tal forma que la preparacin se mueva alejndose de usted y observe por el ocular. En qu direccin se observa el movimiento de la imagen?

8. Mueva ahora el carro de izquierda a derecha cul es la direccin del movimiento de la imagen observada por el ocular.

9. Ajuste la distancia interpupilar. Si la luz es demasiado intense, ajuste el diafragma hasta que la intensidad de la luz se siente confortable.

10. Una vez que haya centrado y enfocado claramente la preparacin con el objetivo de menor aumento (4X) rote el revolver hasta colocar el objetivo de mediano aumento (10X) en lnea con la preparacin.

Cuando el lente est en la posicin correcta, queda aprisionado por una pieza mecnica que sujeta el

revlver al cuerpo del microscopio.

11. Utilize cuidadosamente el micromtrico hasta enfocar la preparacin con este objetivo.

12. Repita los pasos 9 y 10 con el objetivo del alto poder (40x).

13. Cuando se observa con lentes de mayor aumento, es la iluminacin igual, mayor o menor, que cuando se observa con el lente de bajo poder? Recuerde hacer los cambios y ajustes necesarios con el

diafragma para obtener una iluminacin ptima.

14. Complete las preguntas del ejercicio 1 del reporte

C. Procedimiento para enfocar correctamente el estereoscopio

El microscopio estereoscpico tiene dos lentes objetivos y posee una profundidad de foco mucho

mayor que la del microscopio compuesto; ambas caractersticas le permiten producir imgenes

tridimensionales. El poder de resolucin y de aumento del estereoscopio son mucho menores que las

del microscopio compuesto y por esta razn el estereoscopio se usa para estudiar objetos y

especmenes relativamente grandes (razn por la cual tambin se le llama microscopio de diseccin).

Las partes de este microscopio son prcticamente las mismas que las discutidas para el microscopio

compuesto. En este ejercicio se aprender el uso correcto del estereoscopio.

Siga la explicacin dada por el Instructor/Asistente

R E C U E R D E!

En general el micromtrico no debe moverse ms de 2 vueltas para

obtener una imagen ntida.

NUNCA DEBE GIRAR EL MACROMTRICO USANDO UN

OBJETIVO DE ALTO PODER.


1. Escoja un espcimen. Puede ser una hoja, una flor o un insecto.

2. Ponga el espcimen en el campo de observacin (platina). Si est hmedo colquelo sobre una placa Petri o una laminilla.

3. Encienda y ajuste la fuente de luz. Algunos estereoscopios tienen la fuente de luz integrada mientras que otros la tienen aparte. Asegrese de que la fuente de luz est iluminando su espcimen.

4. Enfoque el objeto que desea ver y muvalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados. Hacia dnde se mueve la imagen? Puede explicar estas observaciones?

Ejercicio 2

Medidas microscpicas

1. Haga un dibujo en el reporte de la preparacin (lmina con letra) utilizando un lente objetivo de bajo y alto aumento.

2. Haga un dibujo en el reporte de la preparacin utilizando el lente de bajo aumento (4x) y el de alto aumento (40x).

Para cada ilustracin, reporte el aumento total (aumento del ocular x aumento del objetivo)

Cuando observamos un objeto al microscopio su tamao aparece tantas veces mayor cuantas veces

sea el aumento del microscopio. Por ello para calcular el aumento real de lo que observamos al

microscopio bastar dividir el tamao aparente con que lo

vemos por el aumento.

La unidad de medicin del microscopio es la micra o micrn

(una milsima de un milmetro, 0.001 mm) y se designa con

la letra griega . En los laboratorios de investigacin se

utiliza el micrmetro para realizar las mediciones

microscpicas.

Supongamos que vemos un organismo al microscopio con un

tamao aparente de 0.4 mm, y que el aparato est equipado

con un objetivo 20x y un ocular 10x (aumento=200),

entonces, el tamao real del organismo ser:

Tamao real = tamao aparente = 0,4 = 0,002 mm = 2,0m.

Aumento 200

En nuestro caso, por no poseer micrmetros, se puede conocer el tamao real de la preparacin

considerando el tamao del campo ptico, el cul mide el rea iluminada de observacin a travs de los

oculares. El tamao del campo ptico es inversamente proporcional al aumento total:

Magnificacin Tamao del campo visual

40X

100X

400X


Para averiguar el tamao aproximado del campo ptico, realice los siguientes pasos:

1. Colocar en la platina una lmina preparada con cuadriculado.

2. Utilizando el objetivo de bajo poder (BP), mida el tamao del campo visual haciendo coincidir una de las lneas del papel milimetrado con el borde del campo visual.

Esto da la medida del dimetro del campo visual (DBP) para ste aumento (AMPBP)

3. Para calcular el dimetro del campo visual en aumentos mayores (DAP), hay que recordar que cuanto mayor sea el aumento, el campo visual ser proporcionalmente menor, es decir

DAP = DBP * AMPBP/ AMPAP

4. Una vez calculado el campo visual, se puede obtener el tamao aproximado del objeto observado dividiendo el valor del dimetro del campo visual entre

el nmero de veces que el objeto cabe en ese campo.

Por ejemplo, si se observa el siguiente espcimen con una magnificacin

total de 500X y el dimetro del campo ptico es de 360 m,

es posible estimar que:

1.- Aproximadamente 4 especmenes de igual longitud cubriran el campo ptico

en sentido horizontal, y

2.- Aproximadamente ~10 especmenes del mismo grosor,

cubriran el campo ptico en sentido vertical

En ste caso, se estima que el tamao de ste espcimen es de 90 m de

longitud y 36: m de ancho

5. Determine el tamao del campo ptico para cada uno de los aumentos restante.

6. Examine una lmina preparada que le entregar el instructor y estime la longitud y grosor de la preparacin.

7.

Ejercicio 3

Poder de resolucin y distancia de trabajo

La distancia de trabajo es la distancia precisa entre el objetivo y la muestra donde se obtiene un enfoque correcto

Debido a que cada objetivo vara en longitud, la distancia de trabajo ser diferente al cambiar de un objetivo al

siguiente.

papel milimetrado

campo ptico


La distancia de trabajo de un objetivo esta grabada en el barril del

objetivo junto con otras especificaciones. La distancia de trabajo

se hace ms pequea con el poder de aumento del objetivo.En

general, la distancia de trabajo se hace ms pequea conforme la

apertura numrica. incrementa.

El lmite de resolucin de un instrumento ptico define la mnima distancia que debe existir entre dos

objetos muy cercanos a partir del cual pueden ser discriminados

como puntos diferentes. El poder de resolucin de un microscopio

depende de la longitud de onda de la luz y de una propiedad de las

lentes conocidas como la apertura numrica (AN). AN a su vez

depende del ndice de refraccin del medio que llena el espacio entre

el objeto y la parte frontal del objetivo, y del ngulo que forman los

rayos de luz ms oblicuos que puedan entrar al objetivo. Al igual que

la distancia de trabajo, AN est indicada siempre en la parte frontal

de la lente.

El lmite del poder de resolucin de un microscopio es

aproximadamente igual a 0.61/AN que para un microscopio ptico es de alrededor de 200 nm

(nanmetros).

Siguiendo los pasos anteriores, utilice la lmina que tiene un trocito de papel con puntos, cuente el nmero

de puntos presentes en los tres poderes del microscopio; note las diferencias. Haga dibujos esquemticos.

Este ejercicio es un ejemplo del poder de resolucin del microscopio.

Ejercicio 4

Preparacin del material de estudio.- Tincin simple

En este ejercicio utilizaremos la tcnica de tincin selectiva para observar las clulas de la raz de cebolla

(Allium cepa).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Examine una lmina preparada de un corte longitudinal de la raz de cebolla usando un objetivo de bajo poder, o un esquema rotulado donde se muestren las partes de la raz. Complete el diagrama

incluido en el reporte.

2. Localice e identifique cada una de las regiones de crecimiento Encuentre la regin con la punta ms redondeada

e identifique la cpsula (caliptra). Inmediatamente superior a

esta regin se encuentra el meristemo radical.

3. Una vez que se haya familiarizado con la organizacin estructural de la raz, proceda a hacer una preparacin de

meristemo radical de cebolla

4. Su instructor le va a entregar un par de races ya tratada con el fijador Carnoy (mezcla etanol: cido actico glacial en

AN

magnificacin

distancia de

trabajo

lente de inmersin


proporciones de 3:1).

5. Lave la preparacin 1-3 veces con etanol al 70% (fro) para eliminar residuos de cido actico (la presencia de cido actico reduce la habilidad del colorante de marcar cromosomas).

6. Lave 3 veces el meristemo (agregue 3 gotas de dH2O, squelas con papel de filtro).

7. Sobre un portaobjetos, coloque las races y haga un corte hasta que tenga slo 2 mm de la punta (meristemo radicular) y descarte el resto.

8. Coloque las races en un beaker pequeo y aada 2 ml de HCl 18%. Coloque el beaker con el cido y las races en bao Mara por 6-7 minutos.

9. Transfiera las races a un portaobjetos. Enjuague la preparacin utilizando agua destilada y un gotero. Seque las races utilizando papel absorbente sin tocarlas. Enjuague 3 veces ms la muestra.

10. Macere la preparacin utilizando alfileres, la muestra debe estar suave y romperse con facilidad.

11. Coloree el tejido con azul de toluidina al 0,5% por 2 minutos. Coloque un cubreobjetos y remueva el exceso de colorante utilizando papel absorbente.

Nota: invierta la preparacin sobre un papel de filtro y apriete el cubreobjetos contra el

portaobjetos para eliminar el exceso de tincin sobre el meristemo (no permita que el

cubreobjetos se mueva).

12. Observe las clulas al microscopio. Utilice la siguiente figura para identificar las distintas fases de la divisin celular (mitosis)


Mitosis en clulas de la punta de la raiz de Lilium regale. a)Interfase, b) Profase temprana, c) Profase tarda, d)

Metafase, e)Anafase,f) Telofase. (De J. McLeish y B. Noad, Looking at chromosomes. Copyright. 1958.

Macmillan.)

13. Haga un esquema en su reporte de las clulas de las fases observadas.

PARA FINALIZAR EL EXPERIMENTO

1. Limpie el rea de trabajo.

2. Recoja todos los materiales utilizados y regrselos a su sitio original

3. Verifique que los oculares y objetivos estn limpios.

Ejercicio 5

Preparacin del material de estudio.- Tincin diferencial

En este ejercicio utilizaremos la tcnica de Tincin de Gram como un ejemplo de tincin diferencial. Este

ejercicio lo realizarn simultneamente con el instructor.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

FIJACIN

1. En un portaobjetos colocar una gota de agua destilada 2. Con un asa previamente esterilizada con la llama del mechero, coloque sobre la gota de agua

una pequea cantidad de cultivo de bacterias disponible.

3. Dispersar el material con el asa sobre la gota de agua. 4. Pasar rpida y varias veces el portaobjetos sobre la llama. No deje el portaobjetos sobre la

llama porque se puede quebrar.

5. Dejar enfriar.

COLORACIN. Este paso debe ser realizado con mucho cuidado y sobre una bandeja para evitar manchar el mesn de trabajo con colorante

6. Despus de enfriar, colocar una o dos gotas de Cristal de Violeta (violeta genciana) sobre la preparacin en el portaobjetos y djelo 2-3 minutos.

7. Despus de este tiempo decantar el colorante cuidadosamente sobre papel absorbente. 8. Lavar rpidamente el portaobjetos con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. En

este punto, todas las clulas se observarn de color prpura

MORDIENTE

9. Poner una-o dos gotas de solucin Lugol sobre la preparacin y dejar por un minuto. 10. Decantar el exceso de Lugol y lavar con agua destilada

DECOLORACIN. Este paso es muy importante ya que si se aplica demasiado alcohol, seguido de un lavado extenso del tinte, producir una coloracin final muy dbil.

11. Lavar con alcohol-acetona hasta eliminar el color violeta. 12. Las bacterias Gram + permanecern prpura y las Gram no retendrn ninguna coloracin. 13. Lavar rpidamente con agua destilada.

TINCIN DIFERENCIAL

14. Coloque una gota de safranina y djelo por 30 segundos.


15. Decante el exceso de tintura y lvelo rpidamente con agua destilada. 16. Deje secar la preparacin al aire o cuidadosamente con un papel.

La tincin diferencial colorea tanto las Gram como Gram +. Sin embargo, la presencia de la

coloracin prpura en las gram + no se altera por la presencia de safranina

17. Cuando la preparacin est completamente seca, observe al microscopio siguiendo el procedimiento correcto

18. Haga un dibujo de sus observaciones, e identifique las bacteris Gram+ y Gram-. Utilice lpices de colores, para representar su observaciones. NO USE CUBREOBJETOS.

19. En caso de ser necesario, aada una gota de aceite de inmersin y observarla al microscopio con el objetivo de inmersin (100 x).

PARA FINALIZAR EL EXPERIMENTO

1. Limpie el rea de trabajo.

2. Recoja todos los materiales utilizados y regrselos a su sitio original

3. Verifique que los oculares y objetivos estn limpios.

Aplicacin de Aplicacin de Decoloracin Coloracin con Violeta de Genciana Ioduro (alcohol-acetona) Safranina

practica 03.pdf

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