poligaracturonasa

Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología

Universidad Nacional de San Martín (UNSAM)

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de

Chascomús (IIB-INTECH)

Nombre: Natalia M. Villarreal

Directores: Dres. Pedro M. Civello y Gustavo A. Martínez

“Caracterización de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de variedades de frutilla con diferente velocidad de

ablandamiento”.

ii

A Agustín

iii

Agradecimientos

• A mis directores, los doctores Marcos Civello y Gustavo Martínez por la oportunidad de realizar mi tesis doctoral en la UB-4. Muchas gracias por el trato amable de todos los días, por el apoyo, por conservar la curiosidad y las ganas de seguir aprendiendo, y por la formación que recibí durante estos años.

• A la UNSAM, por el apoyo recibido. A la ANPCyT y al CONICET por

otorgarme una beca que permitió realizar mi doctorado.

• A todos los compañeros y amigos del INTECH, muchas gracias por compartir sus conocimientos conmigo, y por los momentos que vivimos. Particularmente agradezco a Mariela y Juan, Kari y Gustavo, Lis, Juli, Cori, Proli, Ana, Tini, Lean y Emi. A los queridos amigos que estuvieron siempre aun a la distancia, Naty y Pochy, y Maru y Diegui.

• A Marie Jean Watson y su hermosa familia (muchas gracias por todo amiga).

• A Claudia, muchísimas gracias por compartir conmigo la enorme cantidad de

cosas que sabés, tanto del laboratorio como de la vida (te admiro mucho amiga).

• A Teresita y a Tora por su amor siempre alegre.

• A la gente de UB-1/UB-3 por ser tan generosos siempre.

• Al grupo de tenis, gracias a Vero, Anita, María, Caro, Naty, y por supuesto a

nuestro profe Guille, por todos los momentos de risas, distensión (muy importante) y aprendizaje.

• A Cinty, Pablo, Vane, Ale, Vivi, Juan, Jackie, Manolo, y los nuevos integrantes

por su cariño y por la amistad de tantos, tantos años. A todos los amigos que están en distintas partes del mundo.

• A mi queridísimo amigo Guille, te extraño siempre, me hacés mucha falta.

• A mis cuñados, cuñadas, sobrinos, tíos y primos, gracias por todo.

• A mi hermana, muchas gracias Marcelita por todo, por cuidarme,

comprenderme y apoyarme siempre, te quiero muchísimo. A Sofía, por ser tan dulce y alegrar e iluminar nuestras vidas.

• A mi papá por transmitirme su cariño y respeto por el trabajo. A mi mamá por

ser tan dulce, atenta conmigo y con los demás, y un sol para mi vida. Gracias a ambos por el enorme apoyo de siempre. Y gracias a Brisa por estar siempre a mi lado.

• Finalmente agradezco a Agus, a quien dedico este trabajo, por ser mi amor,

porque somos un equipo, y por tu confianza en que todo va a salir bien.

iv

Publicaciones

Parte de los resultados presentados en esta tesis han sido publicados en

revistas internacionales y presentados como comunicaciones a congresos.

Revistas científicas:

§ Villarreal, N.M., Rosli, H.G., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2008.

“Polygalacturonase activity and expression of related genes during

ripening of strawberry cultivars with contrasting fruit firmness”.

Postharvest Biology and Technology 47, 141-150.

§ Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2009. “Influence of plant

growth regulators on polygalacturonase expression in strawberry fruit”.

Plant Science 176, 749-757.

§ Villarreal, N.M., Bustamante, C.A., Civello, P.M., Martínez, G.A. 2009.

“Effect of ethylene and 1-MCP treatments on strawberry fruit ripening”.

Journal of the Science of Food and Agriculture (Enviado, los dos

primeros autores contribuyeron de igual manera a este trabajo).

Congresos:

§ Segundas Jornadas de Biología y Tecnología de Post-Cosecha. 26-27

de agosto de 2004. Chascomús. “Estudio comparativo del metabolismo

v

de pectinas durante la maduración de variedades de frutilla con

diferentes niveles de firmeza”. Rosli, H.G., Villarreal, N.M., Martínez,

G.A., Civello, P.M.

§ XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 22-24 de

septiembre de 2004. Santa Rosa. “Metabolismo de pectinas durante la

maduración de frutillas”. Rosli, H., Villarreal, N., Martínez, G., Civello, M.

§ Congreso Internacional “Post Harvest Fruit: the path to success”. 7-11

de noviembre de 2004. Talca, Chile. “Differential expression of genes

and enzymes involved in cell wall degradation during ripening of

strawberry cultivars”. Martínez G.A., Rosli H.G., Villarreal N.M.,

Bustamante C., Dotto M.C., Civello P.M.

§ XLI reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica

y Biología Molecular (SAIB). 3-6 de diciembre de 2005. Pinamar.

“Cloning of two putative polygalacturonase genes and analysis of their

expression during rimpening of strawberry cultivars with contrasting

firmness fruits”. Villarreal, N.M.; Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVI Reunión de la Asociación Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV).

4-6 de octubre de 2006. Chascomús. “Efecto de reguladores del

crecimiento en la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla y

caracterización de la actividad enzimática correspondiente”. Villarreal,

N.M., Martínez G.A., Civello, P.M.

vi

§ IV Jornadas de Biología y Tecnología de Postcosecha y Primeras

Jornadas de Postcosecha del Cono Sur. 5-6 de julio de 2007. Buenos

Aires. “Análisis del efecto de diferentes reguladores del crecimiento

sobre la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla”. Villarreal,

N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVII reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 21-24 de

septiembre de 2008. Rosario. “Influencia del etileno el contenido de

pigmentos, azúcares y compuestos fenólicos, y actividad de enzimas de

degradación de pared celular de frutilla”. Bustamante, C.A., Villarreal,

N.M., Civello, P.M., Martínez, G.A.

§ XLIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación

Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). 8-11 de noviembre de 2008.

Córdoba. “Polygalacturonase on strawberry fruit ripening. Effects of plant

growth regulators”. Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

Índice

1

Índice Índice 1 Abreviaturas 5 Neologismos y términos tomados del inglés 7 1. Resumen 9 2. Introducción general 12 2.1. El fruto de frutilla 13 2.1.1. Crecimiento 15 2.1.2. Desarrollo y maduración 15 2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración 16 2.1.3.1. Azúcares 16 2.1.3.2. Ácidos 17 2.1.3.3. Fenoles y pigmentación 18 2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal 20 2.2. Pared celular vegetal 22 2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal 23 2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos 27 2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican polímeros de la pared celular 29 2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida 29 2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas 30 2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales 31 2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas 32 2.3. Características generales de las poligalacturonasas 33 2.3.1. Familias génicas 34 2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos 35 2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla 39 3. Hipótesis de trabajo y objetivos 41 3.1. Hipótesis de trabajo 41 3.2. Objetivo general 41 3.3. Objetivos particulares 41 4. Materiales y Métodos 42 4.1. Material Vegetal 42 4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG) 42 4.3. Extracción de ADN genómico 44 4.4. Extracción de ARN total 45

Índice

2

4.5. Cuantificación de ARN 47 4.6. Análisis de ARN total 47 4.7. Transcripción reversa 48 4.8. Reacciones de RT-PCR 49 4.9. Visualización de los productos de PCR 49 4.10. Purificación de los productos amplificados y cuantificación de ADN 50 4.11. Ligación de los productos de PCR 50 4.12. Obtención de células competentes 51 4.13. Transformación de células competentes 52 4.14. Extracción de ADN plasmídico 52 4.15. Reacciones empleando enzimas de restricción 54 4.16. Ensayos de Northern-blot 54 4.16.1. Transferencia de ARN a membranas de nailon 54 4.16.2. Preparación de las sondas a utilizar 55 4.16.2.1. Sonda para poligalacturonasas 55 4.16.2.2. Sonda para ARNr 18s 55 4.16.2.3. Marcado de sondas 56 4.16.3. Hibridación de membranas 57 4.17. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 57 4.18. Obtención de las secuencias completas de FaPG1 y T-PG 59 4.19. Secuenciación y análisis bioinformático de los clones obtenidos 60 4.20. Construcción de un árbol filogenético 60 4.21. Números de acceso 61 4.22. Expresión heteróloga 62 4.22.1. Purificación de la proteína recombinante FaPG1 62 4.22.2. Producción del antisuero anti-FaPG1 y purificación del anticuerpo 63 4.22.3. Western-blot 64 4.22.4. Ensayo de deglicosilación 65 4.23. Cuantificación de proteínas 66 4.24. Tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal 66 4.25. Antocianinas 68 4.26. Clorofilas 69 4.27. Contenido de azúcares reductores y totales 69 4.28. Compuestos fenólicos totales 70 4.29. Actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) 70 4.30. Análisis estadístico 71 4.31. Composición de buffers y soluciones utilizadas 71

Índice

3

5. Capítulo I. Análisis de la expresión y actividad poligalacturonasa durante la maduración de cultivares de frutilla con niveles de firmeza contrastantes 73 5.1. Introducción 73 5.2. Resultados 75 5.2.1. Actividad Poligalacturonasa 75 5.2.2. Análisis de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de frutilla 77 5.2.2.1 Clonado de los ADNc completos de FaPG1 y T-PG 77 5.2.2.2. Obtención de sondas para poligalacturonasa 81 5.2.2.3. Ensayos de Northern-blot 82 5.2.2.4. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 83 5.2.3. Acumulación de la proteína FaPG1 durante la maduración de frutilla 86 5.2.4. Análisis filogenético 90 5.3 Discusión 93 5.4. Conclusiones 100 6. Capítulo II. Análisis del posible fenómeno de splicing alternativo en el gen FaPG1 101 6.1. Introducción 101 6.1.1. Corte y empalme del ARNm precursor (pre ARNm) 101 6.1.2. Propiedades de los intrones de plantas 103 6.2. Resultados 113 6.2.1. Comparación de las secuencias no traducidas 5´ y 3´ de FaPG1 y T-PG 113 6.2.2. Acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG durante la maduración de cultivares de frutilla con diferente velocidad de ablandamiento. 117 6.2.3. Análisis del intrón II de FaPG1 en cultivares con niveles de firmeza contrastantes 119 6.3. Discusión 122 6.4. Conclusiones 127 7. Capítulo III. Influencia de reguladores del crecimiento vegetal en la expresión poligalacturonasa de frutilla. 128 7.1. Introducción 128 7.2. Resultados 130 7.2.1. Tratamiento con auxinas y giberelinas 130 7.2.2. Tratamiento con ácido abscícico 134 7.2.3. Tratamiento con óxido nítrico 135

Índice

4

7.2.4. Tratamiento con etileno 137 7.2.4.1. Efecto del etileno sobre la expresión PG 137 7.2.4.2. Efecto del etileno sobre parámetros de la calidad del fruto 140 7.2.4.2.1. Antocianinas, clorofilas y actividad PAL 141 7.3. Discusión 145 7.4. Conclusiones 152 8. Conclusión general 153 9. Referencias 154

Abreviaturas

5

Abreviaturas 1-MCP: 1-metilciclopropeno 32P-dATP: desoxiadenosina trifosfato marcada con 32P

α-ara: α-arabinofuranosidasa

β-xil: β-xilosidasa

ABA: ácido abscísico

AcH/NaAc: ácido acético/acetato de sodio

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario

ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ASB: albúmina sérica bovina

ATP: adenosina trifosfato

cps: cantidad suficiente para

CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio

DEPC: dietil pirocarbonato

DMF: dimetilformamida

DMSO: dimetilsulfóxido

DO: densidad óptica

DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminotetracético

ETEFÓN: ácido 2-cloroetilfosfónico

GA3: ácido giberélico

IAA: ácido 3-indol acético

IPTG: isopropil-tio-β-D-galactopiranósido

Abreviaturas

6

LB: medio Luria Bertani

NAA: ácido naftalén acético

PAL: fenilalanina amonio-liasa

pb: pares de bases

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction)

PEG: polietilenglicol

PG: poligalacturonasa

PL: pectato liasa

PME: pectin metilesterasa

PMSF: fluoruro de fenilmetil sulfonilo

ppm: parte por millón

PVP: polivinil pirrolidona

PVPP: polivinil polipirrolidona

RT-PCR: transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (reverse

transcription and polimerase chain reaction)

SDS: dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS

(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

UV: ultravioleta

Neologismos y términos tomados del inglés

7

Neologismos y términos tomados del inglés Buffer: solución reguladora de pH, constituida por un par ácido-base

conjugados.

Contig: secuencia de ADN resultante del solapamiento de fragmentos

contiguos provenientes de un mismo gen.

Enhancer: potenciador.

ESTs (expressed sequences tag): secuencias de ADN expresadas.

Non-sense mediated decay (NMD): decaimiento sin sentido del ARNm.

Northern-blot: técnica para medir cantidad y tamaño aproximado de un

transcripto específico en una mezcla compleja mediante hibridación a una

sonda complementaria de ADN o ARN marcada.

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends): amplificación rápida de los

extremos de ADNc.

Spliceosoma: complejo macromolecular responsable del corte y empalme del

pre ARNm.

Splicing: corte y empalme.

Neologismos y términos tomados del inglés

8

Southern-blot: técnica para detectar uno o varios fragmentos específicos de

ADN en una población mediante hibridación a una sonda complementaria de

ácido nucleico marcado.

UTR (untranslated region): region no traducida. Western-blot: técnica para detectar proteínas específicas de una mezcla mediante reconocimiento con un anticuerpo específico.

Resumen

9

1. Resumen La pared celular vegetal es una estructura dinámica que presenta

cambios durante la diferenciación y el desarrollo de los diferentes órganos de

las plantas. El ablandamiento que tiene lugar durante la maduración de los

frutos carnosos se encuentra asociado con la degradación de los diferentes

componentes de la pared.

Los frutos de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) poseen una elevada

velocidad de ablandamiento, la cual contribuye a su rápido decaimiento post-

cosecha. Las bases bioquímicas de la degradación de la pared celular de

estos frutos no se encuentran claramente establecidas aun, y se han

informado resultados contradictorios en diferentes cultivares. Es probable que

la mayor contribución al proceso de ablandamiento, y a las diferencias de

textura observadas entre variedades, provenga de la expresión y actividad

diferencial de genes y proteínas asociados con la degradación de la pared,

tales como poligalacturonasas (PGs), β-xilosidasas, expansinas, pectato liasas,

etc.

Un mecanismo importante de regulación de la expresión génica, es el

fenómeno de corte y empalme alternativo del pre-ARN mensajero (splicing

alternativo). En plantas, dicho proceso se encuentra asociado a funciones

biológicas, tales como crecimiento y desarrollo, respuestas a estrés biótico y

abiótico, resistencia a enfermedades, tiempo de floración, etc. Con respecto al

rol del splicing alternativo en el desarrollo y maduración de frutos, se reportó

la presencia de variantes de splicing en manzana, durazno, y papaya.

En este trabajo de tesis se aislaron dos ADNc completos a partir de

frutos de frutilla. Dichos clones, denominados FaPG1 y T-PG, son homólogos

Resumen

10

a genes de poligalacturonasas de plantas. De acuerdo a nuestras

observaciones, la expresión diferencial de ambos clones estaría asociada al

ablandamiento de frutillas, y a las diferencias de textura observadas entre

cultivares. Se determinó que el gen FaPG1 sufre un evento de splicing

alternativo que conduce a la formación de las variantes FaPG1 y T-PG

(números de acceso DQ458990 y DQ458991, respectivamente). La variante

FaPG1 codifica una proteína funcional (FaPG1), y tanto la acumulación del

mensajero como de la proteína fue mayor, y mas temprana, durante la

maduración de un cultivar que produce frutos blandos con respecto a un

cultivar que produce frutos más firmes. Asimismo, la variante T-PG codificaría

una proteína más corta que FaPG1, la cual carecería del sitio catalítico y los

sitios de N-glicosilación predichos para PGs de plantas. Esta variante de

splicing se acumula en mayor medida durante la maduración de cultivares que

producen frutos mas firmes.

Por otra parte, se observó que la expresión y actividad

poligalacturonasa podría encontrarse bajo la influencia de reguladores del

crecimiento vegetal. El tratamiento con ácido naftalén acético (NAA) redujo la

expresión de FaPG1 y T-PG, la acumulación de la proteína FaPG1, y

disminuyó la actividad PG. El tratamiento con ácido giberélico (GA3) produjo

efectos similares al NAA, si bien no fueron tan marcados. La aplicación de

ácido abscísico (ABA) incrementó ligeramente la expresión de PG, pero no

modificó significativamente la actividad enzimática. Por otra parte, la

acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG se incrementó

considerablemente en respuesta a los tratamientos con etileno y NO. Los

datos de Western-blot confirmaron estas tendencias, si bien la actividad PG

Resumen

11

total no se modificó significativamente por estos tratamientos. Sin embargo, la

aplicación de 1-MCP (un inhibidor de la percepción del etileno) redujo la

actividad y expresión PG, sugiriendo que el etileno podría desempeñar un rol

en la regulación de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de

frutilla.

Introducción general

12

2. Introducción general

Los frutos son de vital importancia para la mayoría de las plantas ya

que protegen a las semillas durante su desarrollo, y posteriormente facilitan la

dispersión de las mismas. Son importantes además para la alimentación de

los animales en general, y constituyen un componente esencial de la dieta de

los seres humanos.

Mientras que la relevancia de los frutos secos radica mayormente en

las semillas que contienen, en el caso de los frutos carnosos son los frutos

en sí mismos los que poseen un valor nutricional y económico intrínseco.

La maduración de los frutos puede definirse como un conjunto de

procesos físico-químicos que ocurren entre la finalización del desarrollo y el

principio de la senescencia, los cuales conducen a cambios en la textura,

aroma, sabor y color de los mismos. Este es el caso de frutos como tomate,

sin embargo en frutos como frutilla, la división entre desarrollo y maduración

no se encuentra claramente definida. Por lo tanto, la maduración puede

considerarse como un proceso de desarrollo continuo, en el cual varias etapas

fisiológicas pueden estar solapadas (Manning, 1993).

Los frutos carnosos son susceptibles al deterioro postcosecha (ya sea

por un ablandamiento excesivo o por el ataque de patógenos), lo que dificulta

el almacenamiento de los mismos y conduce a importantes pérdidas

económicas. Por esta razón, se realiza un gran esfuerzo para intentar

comprender los mecanismos moleculares y bioquímicos que regulan la

maduración de los frutos carnosos. Tal conocimiento se considera

particularmente útil para retrasar o, posiblemente, controlar este importante

proceso fisiológico.


13

2.1. El fruto de frutilla

La frutilla (género Fragaria, familia Rosacea) es un fruto carnoso que

suele agruparse dentro de los denominados frutos blandos, junto con las

moras, arándanos, frambuesas y grosellas. En general, dichos frutos son de

tamaño pequeño, tienen una textura delicada y poseen un tiempo de vida

post-cosecha corto. Desde el punto de vista botánico, la frutilla es un fruto

agregado o fruto falso, originado a partir de la expansión y desarrollo del

tejido denominado receptáculo (Coombe, 1976). Un número variable de

aquenios o frutos verdaderos se encuentran ubicados en la capa epidermal del

receptáculo y se conectan con el interior del mismo a través de fibras

vasculares (Lis y Antoszewski, 1979). Los aquenios son considerados una

combinación de tejido ovárico y semilla (Darrow, 1966). La parte comestible de

la frutilla es el receptáculo, el cual se desarrolla a partir de la base de la flor

(Perkins-Veazie, 1995) (Figura 1).

Receptáculo

AquenioHaz vascular

(A) (B)

Receptáculo

AquenioHaz vascular

ReceptáculoReceptáculoReceptáculo

AquenioHaz vascular

AquenioHaz vascular

AquenioAquenioHaz vascularHaz vascular

(A) (B)

Figura 1: (A) fruto de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) entero donde se señala el tejido

correspondiente al receptáculo y el aquenio; (B) corte longitudinal de un fruto en el que se

indica el tejido vascular y el aquenio.


14

En la actualidad se cree que existen en el mundo alrededor de 20

especies del género Fragaria, las cuales se agrupan de acuerdo a su ploidía

en: diploide (2n= 14), tetraploide (4n= 28), hexaploide (6n= 42) y octaploide

(8n= 56) (Staudt, 1989). Entre las especies más importantes puede

mencionarse:

- Fragaria vesca, especie diploide nativa de las regiones templadas de

Eurasia y Norteamérica. Posee frutos pequeños y aromáticos.

- Fragaria virginiana, especie octaploide nativa de Norteamérica. Por el

tamaño y sabor de sus frutos se hizo popular entre las tribus nativas y

entre los colonos europeos. A partir del año 1620 comenzó a ser

cultivada en Europa.

- Fragaria chiloensis, especie octaploide nativa de Alaska y California.

Posteriormente comenzó a colonizar ciertas áreas de Hawai, Chile y

Argentina. Las tribus araucanas de Chile domesticaron esta especie

antes de la llegada de los colonos españoles, seleccionando las

variedades que presentaran frutos de mayor tamaño. Los españoles

introdujeron esta especie en Europa en 1700.

- Fragaria x ananassa (o frutilla moderna), es una especie octaploide, y

un híbrido entre Fragaria virginiana (seleccionada por sus frutos

sabrosos) y Fragaria chiloensis (seleccionada por el gran tamaño de

sus frutos). Por la calidad y tamaño superior de sus frutos, es en la

actualidad la principal especie cultivada y comercializada. Existe una

gran cantidad de variedades de frutilla, entre las que podemos


15

mencionar: Camarosa, Pájaro, Toyonoka, Aroma, Selva, Cal Giant 3,

Cal Giant 4, Chandler, Elsanta, etc.

2.1.1. Crecimiento

Durante el desarrollo, los frutos presentan cinéticas de crecimiento

variables entre distintos cultivares de frutilla. En algunos casos son sigmoideas

simples, caracterizadas por un crecimiento inicial lento seguido por una fase

exponencial y luego un periodo en el que la velocidad de crecimiento declina

(Bollard, 1970; Woodward, 1972), y en otros casos son doble sigmoideas,

caracterizadas por dos periodos de crecimiento rápido con una fase intermedia

de crecimiento lento (Coombe, 1976; Perkins-Veazie y Huber, 1987). En

ambos casos, el desarrollo del fruto ocurre rápidamente y llega al tamaño

máximo aproximadamente 30 días después de la antesis (Manning, 1993).

2.1.2. Desarrollo y maduración

En frutilla, el crecimiento del receptáculo luego de la caída de los

pétalos se produce inicialmente debido a una combinación de división y

expansión celular. La proliferación de las células se completa

aproximadamente a los 7 días y posteriormente el crecimiento se produce por

un incremento en el volumen celular, el cual aumenta alrededor de 1000

veces durante el desarrollo (Knee y col., 1977).

Los diferentes estadios de desarrollo y maduración suelen clasificarse

según el tamaño y color superficial del fruto. De esta forma, se denominan

verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50%


16

rojo (50% R), 75% rojo (75% R), 100% rojo (100% R) y sobremaduro. Estos

últimos cinco estadios se refieren al porcentaje aproximado de superficie del

fruto que presenta coloración roja (Figura 2).

2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración

2.1.3.1. Azúcares

Al igual que otros frutos, las frutillas actúan como un sumidero para la

acumulación de los productos fotosintéticos generados en las hojas (Lis y

Antoszewski, 1979). Durante el desarrollo del fruto, una gran proporción de

fotosintatos es exportada desde las hojas hacia el receptáculo y una

proporción menor es dirigida hacia los aquenios (Nishizawa y Hori, 1988).

La sacarosa es el principal carbohidrato transportado al fruto (Forney y

50% R 75% R 100% R Sobremaduro

VP VG B 25% R


VP VG B 25% R


VP VG B 25% RVP VG B 25% R

Figura 2: Clasificación de los estadios de desarrollo y maduración de frutos de frutilla

de acuerdo al tamaño y color superficial de los mismos.


17

Breen, 1985a) y, en general, las velocidades de crecimiento se correlacionan

con las velocidades de captura de sacarosa (Forney y Breen, 1985b). En

frutos maduros, sacarosa, glucosa y fructosa constituyen más del 99% de los

azúcares totales solubles, mientras que sorbitol, xilitol y xilosa se encuentran

en muy bajos niveles (Manning, 1993; Cordenunsi y col., 2002). Se reportó

que el almidón se acumula durante las etapas muy tempranas del desarrollo

del fruto (7 días después de la caída de los pétalos), y que la degradación de

los gránulos de almidón predomina fuertemente durante el crecimiento del

receptáculo y en la maduración del mismo (Knee y col., 1977; Souleyre y col.,

2004). Se cree que el almidón es utilizado en las primeras etapas del

crecimiento del fruto hasta que los aquenios estén desarrollados.

Posteriormente, éstos inducen la rápida asimilación de nutrientes desde la

planta (Perkins-Veazie, 1995). Se observó que los frutos no acumulan

cantidades apreciables de azúcares después de la cosecha, ya que en frutos

maduros la degradación de almidón solo aportaría alrededor del 3% del azúcar

total (Cordenunsi y col., 2003; Souleyre y col., 2004). Por otra parte, si bien

los frutos verdes poseen la capacidad de realizar fotosíntesis, aún no se

determinó si este proceso contribuye a la acumulación de carbohidratos

(Perkins-Veazie, 1995).

2.1.3.2. Ácidos

Los ácidos orgánicos determinan el pH del fruto y contribuyen a la

estabilidad del color del mismo. Al igual que los azúcares, son componentes

importantes del sabor, y la relación ácido/azúcar es usada frecuentemente


18

como un índice de la calidad del fruto (Manning, 1993).

En frutilla, los ácidos principales son cítrico, málico y ascórbico, los

cuales son secuestrados en vacuolas y pueden ser utilizados en el proceso de

respiración o convertidos en azúcares (Perkins-Veazie, 1995). La acidez total

se incrementa durante el desarrollo hasta el estadio verde grande y luego

disminuye hasta un mínimo en el estadio sobremaduro, debido principalmente

a una reducción en el contenido de ácido málico (Manning, 1993). El pH de

los frutos maduros varía entre cultivares, en un rango de 3,6 a 4,1

(Cordenunsi y col., 2003).

2.1.3.3. Fenoles y pigmentación

En la actualidad se considera que una dieta rica en frutas y vegetales

está asociada con un menor riesgo de sufrir enfermedades mediadas por un

estrés oxidativo tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y

neurodegenerativas (Lampe, 1999; Zern y Fernández, 2005; Yeh y col., 2009).

Los efectos beneficiosos de las frutas y verduras para la salud son atribuidos,

en gran medida, a los elevados niveles de compuestos fenólicos, los cuales

comprenden un grupo diverso de sustancias, incluyendo entre otros a

polifenoles (taninos), pro-antocianinas (taninos condensados) y ésteres de

ácidos hidrobenzoico e hidroxicinámico (Manning, 1993). Frutos como frutilla,

frambuesa y arándano, contienen en general niveles elevados de compuestos

fenólicos (Kahkonen y col., 2001), y en el caso particular de frutilla, los

principales compuestos fenólicos identificados son: ácido elágico, ácido gálico,

flavonoides y ácido hidroxicinámico (Seeram y col., 2006). Se reportó que las


19

frutillas poseen propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatorias y

antineurodegenerativas (Hannum, 2004), si bien el contenido de antioxidantes y

la calidad nutricional de los frutos (aporte de vitaminas y minerales)

dependería de cada cultivar (da Silva Pinto y col., 2008; Tulipani y col., 2008).

El contenido total de compuestos fenólicos decrece continuamente durante la

maduración de frutilla, y la disminución más significativa se reportó desde el

estadio verde pequeño al blanco (Spayd y Morris, 1981; Martínez y col.,

2001).

Con respeto a los flavonoides, estos constituyen un grupo de

metabolitos secundarios sintetizados a partir de una molécula de fenilalanina y

tres moléculas de malonil-CoA, a través de lo que se conoce como "vía

biosintética de los flavonoides". La unidad estructural de los flavonoides es

una chalcona, y la acción de la enzima isomerasa la convierte en una

flavanona. El esqueleto básico C6-C3-C6, puede sufrir posteriormente muchas

modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que los flavonoides

son una familia muy diversa de compuestos, aunque todos los productos

finales se caracterizan por ser polifenólicos y solubles en agua (Winkel-Shirley,

2001).

Los principales flavonoides presentes en frutilla son las antocianinas,

pigmentos hidrosolubles de localización vacuolar, responsables del color rojo

de los frutos (Woodward, 1972). Las antocianinas actúan además como

agentes antioxidantes, y la cuantificación de las mismas se utiliza

habitualmente como un parámetro para evaluar el progreso de la maduración

de los frutos. Las antocianinas son sintetizadas por la ruta de los

fenilpropanoides, siendo la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico


20

la etapa inicial y una de las etapas reguladoras en la vía de los

fenilpropanoides. Esta reacción implica la eliminación de un grupo amino

catalizada por L-fenilalanina-amonio-liasa (PAL), una enzima clave en la

biosíntesis de compuestos fenólicos (Jones, 1984). La acumulación de

antocianinas en frutos maduros de frutilla se correlaciona con una elevada

actividad PAL (Given y col., 1988a). La síntesis de antocianinas comienza en

el estadio blanco y alcanza su máximo aproximadamente 30 días después de

la antesis (Cheng y Breen, 1991).

2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal

Los frutos pueden ser clasificados como climatéricos y no-climatéricos

de acuerdo a su actividad respiratoria y producción de etileno. Los frutos

climatéricos (tomate, banana, manzana, etc.) presentan una gran actividad

respiratoria y un pico en la producción de etileno durante su maduración (Fan

y col., 1998; Liu y col., 1999; Alexander y Grierson, 2002). El etileno es una

hormona que desempeña un papel esencial en la regulación de la maduración

de los frutos climatéricos (Giovannoni, 2001). En tomate, la aplicación exógena

de etileno acelera el inicio de la maduración, induciendo un aumento tanto en

la síntesis de pigmentos como en la actividad de enzimas asociadas con la

maduración (Grierson y Tucker, 1983), mientras que la aplicación de

inhibidores de la percepción de dicha hormona (como el tiosulfato de plata o

el 1-MCP), produce el efecto contrario (Hobson y col., 1984, Hobson y

Grierson, 1993, Mostolfi y col., 2003).

La frutilla es clasificada como un fruto no-climatérico (al igual que, por


21

ejemplo, cítricos, uvas y pimientos) debido a que no presenta un incremento

notorio en la producción de etileno y prácticamente no muestra cambios en la

actividad respiratoria a medida que el fruto madura (Abeles y Takeda, 1990).

Sin bien las auxinas son importantes para el crecimiento y la expansión

del receptáculo, son también las hormonas claves que regulan la maduración

de frutilla ejerciendo un efecto inhibitorio (Given y col., 1988b). Estas

hormonas son producidas en los aquenios, y transportadas al receptáculo a

través de la extensa red de haces vasculares. Se reportó que la expresión de

muchos genes específicos de la maduración puede ser regulada negativamente

mediante la aplicación exógena de auxinas (Manning, 1994; Aharoni, 2002). La

auxina de mayor importancia biológica detectada en frutillas es el ácido 3-

indol-acético (IAA), si bien existen derivados del mismo tanto en los aquenios

como en el receptáculo. El contenido de la forma libre del IAA alcanza un

máximo 14 días después de la antesis y luego disminuye marcadamente a

partir del día 17 (Archbold y Dennis, 1984). Se comprobó que cuando los

aquenios son removidos de la mitad de un fruto verde, se produce un

aumento en la velocidad de maduración en la mitad deaquenada, que se

manifiesta a través de un incremento en la velocidad de degradación de

clorofilas, acumulación de antocianinas e inducción de PAL (Given y col.,

1988b, Manning, 1994). Este efecto puede ser revertido mediante la aplicación

de auxinas sintéticas, como el ácido 1-naftalen-acético (NAA), sobre la

superficie sin aquenios del fruto (Given y col., 1988b).

La información respecto a la regulación de la maduración de frutos no

climatéricos es escasa, pero los datos disponibles indicarían que no existe un

único modelo de regulación hormonal para todos estos frutos. En el caso de


22

frutilla, no parece haber un único regulador que desempeñe un papel positivo

análogo al desempeñado por el etileno en los frutos climatéricos. Inclusive, no

se descarta la influencia del etileno en la maduración de este fruto, y se

sugirió que una pequeña cantidad de etileno producida por los frutos de

frutilla, podría ser suficiente para disparar respuestas fisiológicas relacionadas

con la maduración (Tian y col., 1997; Trainotti y col., 2005).

Otros reguladores del crecimiento vegetal son el ácido giberélico y el

ácido abscísico. Se ha reportado que el ácido giberélico tiene un efecto

inhibitorio en la maduración de frutilla, evidenciado por un retraso en la

síntesis de antocianinas y en la degradación de clorofilas (Martínez y col.,

1994). Con respecto al ácido abscísico (ABA), se sugirió que el ABA

endógeno podría jugar un papel en el desarrollo de color de frutilla a través

de la regulación positiva de la síntesis de etileno y la actividad PAL (Jiang y

Joyce, 2003). Por otro lado, la aplicación de óxido nítrico (NO), una molécula

involucrada en diversos procesos fisiológicos (Leshem y Haramaty, 1996;

Leshem y Pinchasov, 2000; Neill y col., 2002; Gniazdowska y col., 2007),

podría extender la vida postcosecha de frutos de frutilla maduros (Wills y col.,

2000; Zhu y Zhou, 2007).

2.2. Pared celular vegetal

La pared celular de las plantas es una estructura que determina la

forma de las células y las mantiene unidas, provee fuerza mecánica y rigidez,

y actúa como una barrera contra el ataque de patógenos. La pared celular

primaria (característica de células en crecimiento) es una red de microfibrillas


23

de celulosa (donde regiones altamente cristalinas alternan con regiones menos

organizadas) embebida en una matriz hidrofílica de hemicelulosas y pectinas

(Cosgrove, 1998). En plantas dicotiledóneas, la composición general de la

pared celular primaria es aproximadamente: 30% de celulosa, 30% de

hemicelulosas, 35% de pectinas y 5% de proteínas estructurales, aunque en

paredes celulares de frutos el contenido de pectinas puede ser

sustancialmente mayor y el de proteínas menor (Knee y Bartley, 1981; Fry,

1988).

2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal

Celulosa: es un polímero lineal formado por residuos de D-glucosa

unidos por enlaces glicosídicos β-(1→4). Estos glucanos lineales se asocian

entre sí mediante enlaces por puente de hidrógeno para formar microfibrillas

de al menos 36 cadenas de glucano. La celulosa otorga resistencia mecánica

a la pared celular vegetal (Carpita, 1987).

Hemicelulosas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos

flexibles y fuertemente unidos a través de enlaces por puente de hidrógeno a

la superficie de las microfibrillas de celulosa (Varner y Lin, 1989). Las

hemicelulosas pueden unirse a dos microfibrillas de celulosa adyacentes de tal

manera de formar una red y evitar, por otro lado, contactos directos entre las

mismas.

Algunas hemicelulosas pueden quedar atrapadas dentro de las

microfibrillas de celulosa, disminuyendo el ordenamiento cristalino de las


24

mismas (Hayashi, 1989).

En paredes celulares primarias de plantas dicotiledóneas, la principal

hemicelulosa es el xiloglucano, un polímero formado por un esqueleto de

residuos de D-glucosa en uniones β-(1→4), al igual que la celulosa, pero

sustituido de forma regular por cadenas cortas de α-D-xilosa, β-D-galactosa y

α-L-fucosa en el carbono 6 de los residuos de glucosa del esqueleto de

glucano (Fry, 1988). En una proporción mucho menor se encuentran presentes

otras hemicelulosas que incluyen: xilanos (formados por un esqueleto de D-

xilosa en uniones β-(1→4), el cual puede contener ramificaciones de arabinosa

u otros azúcares), glucomananos y galactomananos (Fischer y Bennet, 1991).

Pectinas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos que se

caracterizan por contener azúcares acídicos, tales como ácido galacturónico, y

azúcares neutros, tales como ramnosa, galactosa y arabinosa. Las pectinas

son los polisacáridos más solubles de la pared celular, y pueden ser extraídas

con agua caliente, agentes quelantes o ácidos diluidos (Fischer y Bennett,

1991).

Las pectinas más importantes de la pared celular vegetal son:

- Homogalacturonanos: son polímeros lineales formados por residuos de

ácido D-galacturónico en uniones α-(1→4). El grupo carboxilo del C6 puede

estar esterificado con un grupo metilo. El proceso de de-esterificación permite

que las pectinas formen geles hidratados, en los cuales los grupos

carboxilatos de moléculas de homogalacturonanos vecinas se unen

iónicamente a través de puentes de Ca2+ en intervalos regulares (Fry, 1988).

- Ramnogalacturonanos I (RG I): son pectinas muy abundantes


25

constituidas por un largo esqueleto de subunidades repetidas de disacáridos

(1→2)-α-L-ramnosil-(1→4)-α-D-galacturónico, con largas cadenas laterales de

arabinanos y arabinogalactanos unidas a los residuos de ramnosa (Brummell y

Harpster, 2001).

- Ramnogalacturonanos II (RG II): son heteropolímeros altamente

complejos formados por un esqueto de (1→4)-α-D-galacturónico, como los

homogalacturonanos, pero con complejas cadenas laterales integradas por

varios tipos de azúcares neutros. Los RG II son componentes minoritarios de

la pared celular vegetal, pero la complejidad de los mismos sugiere que éstos

podrían tener otras funciones además de la estructural, pudiendo actuar como

moléculas de señalización celular (Brummell y Harpster, 2001; Cosgrove,

1998).

Proteínas estructurales: la pared celular vegetal contiene varios tipos de

proteínas estructurales, las cuales son clasificadas usualmente por su

composición predominante de aminoácidos en, por ejemplo, glicoproteínas ricas

en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, etc.

Estas proteínas presentan grandes variaciones en su abundancia dependiendo

del tipo celular, del estadio de desarrollo y de la estimulación previa que haya

recibido la planta (heridas, ataque por patógenos, etc.) (Cosgrove, 1998).

El modelo de arreglo tridimensional de pared celular vegetal primaria

actualmente más aceptado se representa en la figura 3. Este modelo postula

que la pared está formada por microfibrillas de celulosa recubiertas y

entrecruzadas por las hemicelulosas de la matriz, principalmente por


26

xiloglucano, el cual se une fuertemente a la celulosa a través de enlaces de

hidrógeno. Las moléculas de hemicelulosas pueden unir distintas microfibrillas

de celulosa adyacentes, actuando como puente y contribuyendo a que las

mismas se mantengan unidas. Las otras hemicelulosas, como xilanos,

glucomananos y galactomananos están presentes en cantidades menores y

entrecruzan a las microfibrillas mediante puentes de hidrógeno, aunque de

forma más débil que el xiloglucano. Los espacios en la red de celulosa/matriz

de glicano están rellenos por pectinas altamente hidratadas, las cuales

también forman una red que se mantiene unida por enlaces covalentes del

tipo éster, por enlaces por puente de hidrógeno y por interacciones de tipo

iónico. Las redes de celulosa/matriz de glicano y de pectinas podrían

mantenerse unidas por enlaces covalentes entre algunas moléculas de

xiloglucano y pectinas. Adicionalmente, las proteínas estructurales podrían

formar otra red (Carpita y McCann, 2000).


27

2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos

Durante la maduración de los frutos carnosos, los polímeros que

componen la pared celular sufren modificaciones progresivas, detectándose

tanto solubilización como depolimerización de los diferentes componentes. La

naturaleza y extensión de estos cambios varía entre las distintas especies y

aún entre variedades de una misma especie. El ablandamiento que sufren los

frutos durante la maduración está caracterizado por una disminución en la

firmeza de los tejidos (Wakabayashi, 2000). El proceso de ablandamiento de

la mayoría de los frutos es acompañado por la pérdida de adhesión celular, la

cual es producida por la degradación de la lámina media. Los polisacáridos

pécticos, y en particular los poliurónidos, son los constituyentes principales de

Proteínas estructurales

Microfibrilla de celulosa Hemicelulosas PectinasMicrofibrilla de celulosa Hemicelulosas Pectinas

Figura 3: Diagrama de la pared celular vegetal primaria. Se señalan las microfibrillas de

celulosa recubiertas y entrelazadas por las moléculas de hemicelulosa (principalmente por

xiloglucano). Las pectinas forman una red altamente hidratada a través de los diferentes

enlaces químicos mencionados en el texto. Se indican, además, las proteínas estructurales.

Adaptado de Carpita y McCann (2000).


28

la lámina media (figura 4). Actualmente se propone que la degradación de

xiloglucanos iniciaría el proceso de ablandamiento de los frutos, mientras que

la degradación de las pectinas contribuiría principalmente al ablandamiento

hacia el final de la maduración y en los estadios sobremaduros (Wakabayashi,

2000).

La velocidad de ablandamiento de los frutos es el principal factor que

determina el deterioro post-cosecha, el cual influencia la susceptibilidad al

ataque por patógenos, la frecuencia de cosecha y la vida útil de los frutos

una vez cosechados. El proceso de ablandamiento limita, además, el

transporte y almacenamiento de los frutos (Fischer y Bennett, 1991, Brummell

y Harpster, 2001).

Lámina Media

Zona rica en pectinas

Pared celular primaria

Lámina Media

Zona rica en pectinas

Pared celular primaria

Figura 4: Vista de la pared celular mediante microscopía electrónica de transmisión. La lámina

media se forma durante la división celular y crece coordinadamente a medida que la célula se

expande. Las células se mantienen en contacto a través de la lámina media, y las zonas de

confluencia de células de tejido jóvenes se encuentran ocupadas por polisacáridos ricos en

pectinas. Adaptado de Carpita y McCann (2000).


29

2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican

polímeros de la pared celular

Durante la maduración de los frutos, los cambios producidos en la

solubilidad y el tamaño molecular de los polímeros de la pared celular

implican la acción coordinada de distintas proteínas y enzimas con la

capacidad de degradar componentes específicos de la pared (Fischer y

Bennett, 1991; Brummell y Harpster, 2001).

2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida

Expansinas: estas proteínas, de actividad enzimática desconocida,

provocarían la ruptura reversible de los enlaces por puente de hidrógeno que

unen las microfibrillas de celulosa con las hemicelulosas de la pared celular

vegetal (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994, Cosgrove, 2000). De esta

manera, las expansinas serían importantes en los procesos que requieren

desmantelamiento de la pared celular, tales como el crecimiento de la raíz y

el tallo, la abscición de hojas, la germinación de las semillas y la maduración

de los frutos (Rose y col., 1997; Cosgrove, 2000). Se sugirió que la

acumulación de expansinas relacionadas con la maduración es un rasgo

común de este proceso en la mayoría de los frutos (Civello y col., 1999; Rose

y col., 2000).


30

2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas

Endo-(1→4)β-D-glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4): catalizan la hidrólisis

de los enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces β-(1→4),

adyacentes a residuos de D-glucosa no sustituidos. Es frecuente que se haga

referencia a estas enzimas como celulasas, sin embargo la mayoría de las

endoglucanasas de plantas superiores carecen del dominio de unión a

celulosa encontrado en celulasas microbianas, y por lo tanto no pueden

degradar microfibrillas cristalinas de celulosa (Brummell y col, 1994). De esta

forma, se sugiere que los sustratos naturales de estas enzimas son el

xiloglucano y las regiones no cristalinas de las microfibrillas de celulosa

(Brummell y Harpster, 2001). La actividad endoglucanasa aumenta durante la

maduración de frutilla y manzana (Abeles y Takeda, 1990). En el caso de

frutilla, se detectó una elevada expresión de genes que codifican endo-(1→4)β-

D-glucanasas putativas (Llop-Tous y col., 1999).

Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207): catalizan la

hidrólisis de los enlaces internos de los esqueletos β-(1→4)-D-glucano del

xiloglucano, transfiriendo el extremo reductor recién formado a la posición C-4

del extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano (Brummell y Harpster,

2001).

Endo-(1→4)β-mananasas (EC 3.2.1.78): catalizan la hidrólisis de los

enlaces glicosídicos β-(1→4) de glucomananos, galactoglucomananos y

galactomananos. La actividad de estas enzimas aumenta durante la


31

maduración de diversos frutos, tales como tomate, durazno y mandarina

(Bourgault y col., 2001). Se sugirió que las endo-β-mananasas desempeñan un

papel importante en el proceso de ablandamiento del fruto en tomate (Bewley

y col., 2000).

Endo-xilanasas (EC 3.2.1.8): catalizan la hidrólisis de los enlaces β-

(1→4) internos del esqueleto de los xilanos, generando xilo-oligosacáridos. En

general, actúan en sitios donde la cadena principal no se encuentra sustituida

(Cleemput y col., 1997).

β-D-Xilosidasas (EC 3.2.1.37): catalizan la liberación de xilosas a partir

de los extremos no reductores de los xilo-oligosacáridos generados por las

endo-xilanasas (Cleemput y col., 1997). En frutilla, se reportó actividad β-D-

xilosidasa y se sugirió que la misma tendría relación con las diferencias en la

velocidad de ablandamiento observadas entre cultivares (Martínez y col., 2004;

Bustamante y col., 2006).

2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales

β-D-galactosidasas (β-Gal, EC 3.2.1.23): en plantas superiores son del

tipo exo y remueven los residuos β-D-galactosilos a partir de los extremos no-

reductores de las cadenas laterales de los RG I, los cuales poseen la mayor

parte de los residuos de galactosa de la pared celular vegetal. Posiblemente

actúan de la misma forma sobre las cadenas laterales de los xiloglucanos. Se

ha sugerido que la actividad β-Gal produce un incremento en la solubilización


32

de las pectinas durante la maduración, la cual conduce a un mayor

ablandamiento de los frutos. Dicho efecto es producido de forma directa,

aumentando la solubilidad de los RG I, e indirecta, mediante el incremento de

la porosidad de la pared celular, facilitando el acceso de PME y PG a sus

sustratos (Brummell y Harpster, 2001).

α-L-arabinofuranosidasas (α-Ara, EC 3.2.1.55): actúan sobre diferentes

fracciones pécticas y hemicelulósicas liberando residuos de arabinosa a partir

del extremo no reductor (Tateishi y col., 1996). En frutilla, se reportó que

tanto la expresión como la actividad α-Ara, estarían asociadas a las

diferencias de textura observadas entre cultivares de frutilla (Rosli y col.,

2009).

2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas

Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2): catalizan la ruptura de pectinas de-

esterificadas a través de un mecanismo de eliminación beta. Las PLs requieren

la presencia de Ca2+ para ejercer su acción, y producen oligosacáridos con

residuos de ácido galacturónico no-saturados en el extremo no-reductor de los

mismos (Charnock y col., 2002). Se hallaron secuencias nucleotídicas

correspondientes a pectato liasas, tanto en frutos de banana como de frutilla

(Medina-Suarez y col., 1997; Medina-Escobar y col., 1997). En el caso de

frutilla se observó un aumento de la expresión del gen correspondiente

durante la maduración de los frutos (Medina-Escobar y col., 1997). La

supresión de la expresión de este gen en frutillas transgénicas resultó en una


33

menor degradación de pectinas y un mayor mantenimiento de la firmeza

respecto a los frutos control (Jiménez-Bermúdez y col., 2002).

Poligalacturonasas (PGs): catalizan la hidrólisis de las uniones α-(1→4)

que mantienen unidos a los residuos de ácido galacturónico. Estas enzimas

pueden ser de acción exo o endo. Las exo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.67)

remueven unidades simples de ácido galacturónico a partir del extremo no-

reductor del ácido poligalacturónico. En cambio, las endo-poligalacturonasas

(EC 3.2.1.15) rompen dicho polímero en posiciones internas al azar (Brummell

y Harpster, 2001). Se ha determinado que las PGs muestran una mayor

afinidad por la forma de-esterificada de las pectinas, por lo tanto se postula

que estas últimas serían primeramente de-metiladas de modo de convertirse

en un sustrato adecuado para la acción de las PGs (Brummell y Harpster,

2001).

Pectin metil esterasas (PME, EC 3.1.1.11): catalizan la de-metilación del

grupo carboxilo en la posición C-6 de los residuos de ácido galacturónico de

las pectinas de alta masa molecular. Esta de-metilación cambia el pH y la

carga de la pared celular, permitiendo la agregación de los poliurónidos a

través de puentes de Ca2+ y tornándolos más susceptibles a la degradación

por poligalacturonasas (Brummell y Harpster, 2001).

2.3. Características generales de las poligalacturonasas

Las poligalacturonasas se encuentran involucradas en el desensamblaje


34

de las pectinas de la pared celular que caracteriza distintos procesos del

desarrollo de las plantas. La actividad poligalacturonasa fue asociada a

procesos tales como la abscisión de órganos (Bonghi y col., 1992),

dehiscencia de vainas y anteras (Meakin y Roberts, 1991), maduración del

grano de polen y crecimiento del tubo polínico (Pressey y Reger, 1989,

Pressey, 1991), y especialmente con la maduración de los frutos (DellaPenna

y col., 1987; Hadfield y col., 1998; Brummell y Harpster, 2001; Asif y Nath,

2005).

2.3.1. Familias génicas

Si bien muchas de las secuencias aminoacídicas de PG muestran un

nivel relativamente elevado de divergencia, existen regiones que están

altamente conservadas entre todos los genes clonados de plantas y fuentes

microbianas. Estas similitudes se observan particularmente en la porción

carboxilo terminal de la enzima, dentro de la cual se encuentra un conjunto

de residuos de aminoácidos altamente conservados, los cuales determinan las

funciones catalíticas (Scott-Craig y col., 1990; Caprari y col., 1996).

Todas las PGs clonadas hasta el momento poseen una secuencia señal

N-terminal hidrofóbica (péptido señal) la cual dirige la proteína hacia el lumen

del retículo endoplasmático y probablemente hacia la pared celular. Sin

embargo, aparentemente sólo un subgrupo de PGs presenta una pre-

secuencia N-terminal a continuación del péptido señal. La función de la pre-

secuencia no es conocida, pero podría mantener a la proteína en un estado

inactivo hasta que ésta sea transportada hacia su destino final, o podría dirigir


35

a la misma hacia una posición específica dentro de la pared celular (Della

Penna y Bennett, 1988).

Las poligalacturonasas de plantas son agrupadas en tres clados, A, B y

C, de acuerdo a la comparación de sus secuencias de aminoácidos (Hadfield

y col., 1998). Sin embargo, esta clasificación no es absoluta, y podría no ser

suficiente, considerando el número creciente de secuencias de PGs en las

bases de datos. El clado A comprende genes que se expresan en frutos y

zonas de abscisión y dehiscencia, y los mismos codifican endo-PGs sin pre-

secuencia predicha. El clado B está formado por genes que codifican endo- y

exo-PGs con pre-secuencia y que actúan en los mismos tejidos y zonas de la

plantas que las proteínas del clado A. Finalmente, el clado C, comprende

genes que se sólo se expresarían en polen y aparentemente codifican para

exo-poligalacturonasas sin pre-secuencia predicha (Hadfield y col., 1998). Sin

embargo, es de destacar que existen reportes donde se detectó actividad exo-

poligalacturonasa asociada con la maduración de frutos (Pressey y Avants,

1978; Nogata y col., 1993; Brummell y col., 2004).

2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos

Las pectinas de la pared celular de frutos sufren un desensamblaje

particularmente extensivo durante los últimos estadios de maduración. Esta

importante depolimerización y degradación de pectinas está asociada con el

deterioro que sufren los frutos en los estadios sobremaduros (Huber y

O’Donoghue, 1993). Por otra parte, el desensamblaje de pectinas puede

incrementar la porosidad de la red de polisacáridos, dando lugar al


36

hinchamiento de la pared celular, fenómeno observado en numerosos frutos

durante el ablandamiento (Redgwell y col., 1997). Cabe destacar que, si bien

los cambios en la composición de los polisacáridos de pared son importantes

para las variaciones de textura observadas durante la maduración, no son los

únicos factores determinantes de la firmeza del fruto. Otros factores

contribuyentes deben ser tenidos en cuenta, particularmente la integridad de la

cutícula (Saladié y col., 2007) y la turgencia del fruto (Shackel y col., 1991,

Shiota y col., 2006).

El desensamblaje de pectinas dependiente de PG se estudió

principalmente durante la maduración de tomate, estableciéndose la

contribución de la actividad poligalacturonasa al ablandamiento asociado con la

maduración de este fruto. Si bien las PGs de plantas pueden ser parte de

grandes familias génicas (Hadfield y Bennett, 1998), en fruto de tomate el

ARNm de un solo miembro de la familia génica (PG2, número de acceso

P05117) se acumula durante la maduración. El aumento de la expresión de

dicho gen es paralelo al incremento de los niveles y actividad de la enzima

(Della Penna y col., 1986).

La poligalacturonasa de tomate fue la primera hidrolasa de pared

celular en ser examinada utilizando métodos transgénicos. En frutos en los

cuales la actividad PG fue suprimida mediante la expresión de un transgen

anti-sentido a niveles por debajo del 1% del valor presente en frutos salvajes,

la solubilidad de las pectinas no resultó afectada, pero no se observó

depolimerización de las pectinas solubilizadas (Smith y col., 1988). Estos frutos

transgénicos maduran normalmente, lo cual demuestra que no es necesaria

una actividad PG elevada para que se produzca la maduración del fruto. Por


37

otra parte, solo se observó una ligera disminución del ablandamiento de los

frutos transgénicos con respecto a los de tipo salvaje. A pesar de estos

resultados, se obtuvieron mejoras significativas en frutos transgénicos

procesados, y se observó un aumento en la viscosidad del jugo o de la pasta

preparada a partir de los mismos (Brummell y Labavitch, 1997).

En otros estudios orientados a determinar el papel de PG en el

metabolismo de la pared celular durante la maduración, se utilizaron tomates

rin (ripening inhibitor). Estas plantas presentan una mutación en un gen

MADS-box (LeMADS-RIN), el cual se encuentra corriente arriba del control de

la maduración por etileno. Dicha mutación es responsable de que los frutos

fallen en la producción autocatalítica de etileno, tanto en la maduración como

en respuesta a la aplicación de etileno exógeno (Vrebalov y col., 2002). En

rin, el ARNm del gen endógeno de PG se acumula en niveles muy reducidos.

El tratamiento de frutos rin con etileno, no incrementa la acumulación de los

ARNm de PG, como ocurre normalmente en frutos de tomate del tipo salvaje

(Della Penna y col., 1987). Por otro lado, estos mismos frutos se

transformaron con una construcción génica formada por el gen de PG

fusionado al promotor del gen E8, el cual responde a etileno y propileno

(Giovannoni y col., 1989). En los frutos rin-transgénicos, tanto la expresión

génica de PG, como la actividad enzimática y la solubilización y

depolimerización de pectinas fueron restauradas hasta alcanzar valores

cercanos a los de frutos salvajes. Sin embargo, estos frutos no se ablandaron

ni presentaron alteraciones en otros parámetros de maduración, tales como la

acumulación de pigmentos o la producción de etileno.

La supresión de la depolimerización de pectinas pero no de la solubilización


38

de las mismas en frutos transgénicos con PG antisentido, indica que estos

dos procesos poseen determinantes enzimáticos diferentes, siendo la

depolimerización, pero no la solubilización, debida principalmente a la acción

de PG. En contraste, en mutantes rin complementados con PG, las pectinas

fueron tanto solubilizadas como depolimerizadas. Estos datos sugieren que en

tomate, la actividad PG es necesaria y suficiente para la depolimerización de

pectinas, pero que puede ser solo una de múltiples y redundantes actividades

enzimáticas que solubilizan pectinas, y que el resto de ellas podría estar

ausente en los mutantes rin (Hadfield y Bennett, 1998). En un trabajo reciente,

se demostró que la supresión simultánea de PG y expansina en tomate,

redujo el desensamblaje de la pared celular, retrasó el ablandamiento, y

disminuyó la susceptibilidad de los frutos transgénicos al hongo patógeno

Botrytis cinerea (Cantu y col., 2008).

En frutos de banana, se detectó un incremento en la actividad y

expresión poligalacturonasa durante la maduración y la senescencia de los

frutos (Asif y Nath, 2005). En el caso de melón, se sugirió que la expresión

poligalacturonasa podría estar asociada con el desensamblaje de pectinas

asociado con la maduración (Hadfield y col., 1998). Por otra parte, en

duraznos se observó una actividad poligalacturonasa diferencial entre frutos de

textura denominada “no-melting” (de textura firme, utilizados para conserva) y

frutos de textura “melting” (de textura suave o blanda, destinados al consumo

en fresco) (Pressey y Avants, 1978). En un trabajo posterior, Callahan y col.

(2004) observaron que deleciones en un grupo de genes de poligalacturonasa

se correlacionan con la textura característica de los duraznos tipo “no-melting”.

La hipótesis actual acerca del papel de las poligalacturonasas en la


39

maduración de frutos señala que el desensamblaje de pectinas mediado por

PG no contribuye al ablandamiento temprano del fruto, pero cumple un rol

importante en la degradación de los tejidos durante los últimos estadios de

maduración y en los estadios sobremaduros.

2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla

En frutilla, los primeros estudios para detectar actividad

poligalacturonasa arrojaron resultados negativos (Barnes y Patchett, 1976;

Huber, 1984). Sin embargo, en un trabajo posterior se logró detectar actividad

PG en frutos rojos del cultivar Toyonoka (Nogata y col, 1993). Los autores de

este trabajo señalaron que la actividad PG se debía a tres enzimas que

pudieron distinguirse mediante cromatografía de intercambio catiónico. Una de

las enzimas (PG1) tendría una baja actividad endo-poligalacturonasa, mientras

PG2 y PG3 presentaron actividad exo-poligalacturonasa. Nogata y col. (1993)

señalaron además que la actividad exo-PG disminuye durante el desarrollo y

maduración de los frutos, resultado que contradice al papel sugerido para PG

en la maduración y ablandamiento de los frutos.

Posteriormente, se clonaron tres genes putativos de PG: spG (Redondo-

Nevado y col., 2001), D15 y B4 (Salentijn y col., 2003). Dos de estos clones,

spG y D15, corresponden al mismo gen (Salentijn y col., 2003), si bien se

reportaron datos contradictorios acerca de su expresión. Redondo-Nevado y

col. (2001) detectaron expresión poligalacturonasa sólo al comienzo de la

maduración de frutos del cultivar Chandler, y reportaron que la expresión de

sPG es regulada negativamente por auxinas. Los autores propusieron que la


40

enzima sPG tendría un papel en la liberación de oligosacarinas al comienzo

de la maduración del fruto, y que no desempeñaría un papel importante en el

ablandamiento del fruto durante la maduración. Sin embargo, en un trabajo

posterior, Salentijn y col. (2003) detectaron expresión de sPG (D15) en frutos

rojos pertenecientes a cultivares con diferentes niveles de firmeza. Mediante

ensayos de Northern-blot, observaron una elevada expresión de spG en frutos

pertenecientes a la variedad Gorella (firmeza baja); frutos pertenecientes al

cultivar Holliday (firmeza elevada) presentaron la menor expresión de sPG,

mientras que frutos de la variedad Elsanta (firmeza intermedia), presentaron un

nivel de expresión intermedio. Estos resultados, opuestos a los obtenidos por

Redondo-Nevado y col. (2001), sugieren un rol de sPG en las diferencias de

textura observadas entre cultivares. Por otro lado, Salentijn y col. (2003)

observaron un patrón de expresión similar para el gen B4 en los tres

cultivares analizados. Sin embargo, a diferencia de la proteína codificada por

sPG, en la proteína deducida a partir de B4 el sitio activo difiere del presente

en las proteínas PGs conocidas, por lo cual existen dudas acerca de si

realmente se trata de una poligalacturonasa.

Como se mencionó anteriormente, las PGs de plantas son agrupadas

en tres clados. En el caso de frutilla, Redondo-Nevado y col. (2001) ubican a

spG dentro del Clado A, sugiriendo que spG codificaría una endo-

poligalacturonasa (Redondo-Nevado y col., 2001), mientras Salejtijn y col.

(2003) clasifican a sPG como una exo-poligalacturonasa perteneciente al Clado

C.

Hipótesis de trabajo y objetivos

41

3. Hipótesis de trabajo y objetivos

3.1. Hipótesis de trabajo

“Existe una correlación entre la expresión y actividad poligalacturonasa y el

ablandamiento del fruto durante la maduración de frutilla”.

3.2. Objetivo general

Contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares y bioquímicos que

determinan el ablandamiento de frutilla.

3.3. Objetivos particulares

• Analizar la actividad PG total durante la maduración de variedades de

frutilla con diferente velocidad de ablandamiento.

• Caracterizar la expresión de genes de PGs durante la maduración de

variedades de frutilla con niveles de firmeza contrastantes.

• Obtener y clonar las secuencias completas de genes de PG de frutilla.

• Estudiar la acumulación de proteínas PGs durante la maduración de

variedades de frutilla con firmezas contrastantes.

• Evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento vegetal

sobre la expresión de genes de PGs de frutilla.

• Analizar la existencia del fenómeno de splicing alternativo en genes de

PGs de frutilla.

Materiales y Métodos

42

4. Materiales y Métodos

4.1. Material Vegetal

Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch.) de distintas

variedades cuyos frutos presentan diferentes niveles de firmeza. Se emplearon

los cultivares Camarosa (firmeza elevada), Pájaro (firmeza intermedia) y

Toyonoka (firmeza baja). Los datos de firmeza de las tres variedades se

tomaron de estudios previos a la realización de este trabajo de Tesis (Rosli y

col., 2004). Los frutos se obtuvieron de productores locales (La Plata,

Provincia de Buenos Aires) a partir de plantas cultivadas de acuerdo a

prácticas convencionales. Los frutos se recolectaron en distintos estadios de

desarrollo y maduración. Los estadios empleados fueron: verde grande (VG),

blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R) y 100% rojo (100% R) para

Camarosa, Pájaro y Toyonoka. Las muestras se lavaron, secaron, cortaron,

congelaron en N2(l) y se almacenaron a -80 °C hasta su utilización.

Para los ensayos con reguladores del crecimiento vegetal, se utilizaron

frutos de Camarosa y Toyonoka en el estadio blanco.

4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG)

La metodología que se utilizó para la obtención de extractos proteicos y

la medición de actividad PG se adaptó de Nogata y col. (1993). Para la

preparación de los extractos, se utilizaron frutos de frutilla de las variedades

Camarosa, Pájaro y Toyonoka de los estadios VG, B, 50% R y 100% R, y


43

frutos blancos de Camarosa sometidos a diferentes tratamientos con

reguladores del crecimiento vegetal. Los frutos congelados se cortaron en

trozos y se homogeneizaron en una licuadora (OCI Instruments, Modelo OMNI-

MIXER 17106) empleando 3 volúmenes del siguiente buffer de extracción:

AcH/NaAc 50 mM, pH 6,0 y PVPP 1% p/v. Luego se centrifugó a 12000 x g

durante 30 min a 4 °C, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó

con 3 volúmenes de buffer AcH/NaAc pH 6,0 (esta operación se realizó 2

veces). Posteriormente se centrifugó a 12000 x g durante 30 min a 4 °C, se

descartó el sobrenadante y se realizó una extracción sobre el precipitado con

3 volúmenes del siguiente buffer: AcH/NaAc 50 mM y NaCl 1 M pH 6,0,

agitando durante 2,5 h a 4 °C. Esta suspensión se centrigugó a 12000 x g

durante 30 min a 4 °C, y el sobrenadante se separó para medir la actividad

de la enzima. Previamente a la medida de la actividad poligalacturonasa total,

se dializó durante toda la noche para eliminar el NaCl contra buffer AcH/NaAc

50 mM pH 6,0, a 4 °C con agitación suave.

La actividad poligalacturonasa se determinó utilizando ácido

poligalacturónico como sustrato. Para la realización de las cinéticas de

reacción, se incubaron 700 µl de cada uno de los extractos a 37 °C con 700

µl de ácido poligalacturónico 0,3% p/v en buffer AcH/NaAc 50 mM, pH 6,0. De

cada una de las mezclas de reacción se tomaron 300 µl a los tiempos: 0, 6,

12 y 24 h. Inmediatamente se congeló en N2(l) y se mantuvo a -20 °C hasta

la determinación colorimétrica. Como blanco de reacción se utilizaron 700 µl

de ácido poligalacturónico 0,3% p/v y 700 µl de buffer AcH/NaAc 50 mM, pH

6,0.

La determinación del ácido galacturónico liberado por la acción


44

enzimática se realizó utilizando el método de la 2-cianoacetamida (Gross,

1982). Este método permite medir colorimétricamente el ácido galacturónico a

través de la formación de un compuesto luego de la reacción con la 2-

cianoacetamida, el cual absorbe a 270 nm. Se prepararon dos extractos para

cada estadio de maduración y cultivar analizado, y tanto las cinéticas como

las colorimetrías se realizaron por duplicado.

4.3. Extracción de ADN genómico

La metodología que se empleó para la extracción de ADN genómico se

adaptó de Kiefer y col. (2000). Como material vegetal se usaron 0,5 g de

hojas jóvenes de plantas de Toyonoka y Camarosa, las cuales se congelaron

en N2(l) y se molieron con pilón y mortero hasta obtener un fino polvo.

Inmediatamente después, se adicionaron 10 ml de buffer de extracción (CTAB

3% p/v, PVP 2% p/v, Tris HCl 1 M pH 8,0, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M), se

agregó β-mercaptoetanol (concentración final 2% v/v) y se incubó durante 30

min a 65 °C, mezclando por inversión cada 5 min. Luego se tomaron

alícuotas de 750 µl de las muestras y se repartieron en tubos de

microcentrífuga de 1,5 ml. Se agregó un volumen (750 µl) de

cloroformo:alcohol isoamílico en partes iguales, se mezcló por inversión, se

centrifugó a 10000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y se recolectó

cuidadosamente el sobrenadante. Se agregó igual volumen de isopropanol a -

20 °C y se dejó precipitar a –20 °C por 2 h. Luego se centrifugó a 10000 x g

por 10 min a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y el pellet se

dejó secar durante 10 min. Se resuspendió el pellet en 100 µl de agua


45

destilada estéril a 65 °C, se agregó 1 µl de RNAasa A (10 mg/ml, Promega)

y se incubó a 37 °C por 15 min. La reacción se detuvo agregando 100 µl de

cloroformo:alcohol isoamílico en partes iguales y 100 µl de fenol equilibrado

(pH 7,6) para limpiar las muestras. Luego se centrifugó a 10000 x g por 10

min a temperatura ambiente, se recuperó el sobrenadante y se agregaron 2,5

volúmenes de etanol a –20 °C. El ADN se precipitó a -20 °C por 2 h.

Posteriormente se centrifugaron las muestras a 10000 x g durante 20 min a

temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y el pellet se dejó secar a

temperatura ambiente. Finalmente el pellet se disolvió en 35 µl de agua

destilada estéril a 65 °C.

La integridad de las muestras de ADN se verificó en un gel de agarosa

al 0,8% p/v (en buffer TBE 0,5X) y la concentración de cada muestra se

determinó como se describe en el punto 4.10. Sobre cada muestra se realizó

una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos 5-TPG y 3-TPG (con las

condiciones del punto 4.8), los productos amplificados se purificaron de un gel

de agarosa 1% p/v (en buffer TBE 0,5X), se ligaron en el vector de pGEM-T

Easy (Promega) y se enviaron a secuenciar (puntos 4.9., 4.14. y 4.19.,

respectivamente).

4.4. Extracción de ARN total

El ARN total se aisló utilizando el método de extracción del borato

sódico en caliente (Wan y Wilkins, 1994). Se utilizaron frutos de las

variedades Camarosa, Pájaro y Toyonoka en los estadios de maduración VG,

B, 25% R, 50% R y 100% R, y frutos blancos de Camarosa sometidos a


46

diferentes tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal. Se trituró cada

muestra (aproximadamente 5 g de tejido) con pilón y mortero en N2(l) y se

homogenizó con 3,5 volúmenes de buffer de extracción (Bórax

(Na2B4O7.10H2O) 0,2 M, EDTA 30 mM, SDS 1% p/v, deoxicolato de sodio 1%

p/v, DEPC 0,1% v/v, pH 9,0) a una temperatura de 80 °C. Inmediatamente

antes de usar se agregó: DTT 10 mM, nonidet P-40 1% v/v y PVP-40 2%

p/v. Posteriormente se agregó a cada muestra 150 μl de proteinasa K (20

mg/ml) y se incubó a 42 °C con agitación constante durante 90 min. Luego

se adicionó 1 ml de KCl 2 M por cada 10 ml de buffer de extracción y se

incubó en hielo durante 60 min. Se centrifugó a 12000 x g durante 20 min a

4 °C, al sobrenadante se le adicionó 1/3 del volumen de LiCl 8 M y se

incubó a 4 °C durante toda la noche. Las muestras se centrifugaron a 12000

x g durante 20 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El precipitado se

lavó dos veces con 5 ml de LiCl 2 M a 4°C, se centrifugó a 12000 x g

durante 10 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante (estos pasos se

repitieron dos veces). El precipitado se resuspendió en 2 ml de Tris-HCl 10

mM (pH 7,5) y se centrifugó a 12000 x g durante 10 min a 4 °C. El

sobrenadante se trató con 200 μl de acetato de potasio 2 M (pH 5,5) y se

incubó durante 15 min a 0 °C. Posteriormente, se centrifugó a 12000 x g

durante 10 min a 4 °C para remover polisacáridos y al sobrenadante se le

adicionaron 2,5 volúmenes de etanol 100% v/v frío para precipitar el ARN. Se

incubó a –80 °C durante 2 h. Luego se centrifugó a 9700 x g durante 30 min

a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El ARN se lavó con 2 ml de etanol

70% v/v frío. Se centrifugó a 9700 x g durante 10 min a 4 °C y se descartó

el sobrenadante. El etanol residual se eliminó mediante vacío y el precipitado


47

se resuspendió en 200 μl de agua destilada tratada con DEPC 0,1% v/v. A

continuación se precipitó nuevamente el ARN con 1/10 volúmenes de acetato

de sodio 3 M, pH 6,0 y 2,5 volúmenes de etanol 100% v/v frío. Se incubó a –

20 °C durante toda la noche y posteriormente se centrifugó a 16100 x g

durante 20 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado

con 1 ml de etanol 70% v/v frío. Finalmente, luego de centrifugar a 16100 x g

durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante, el exceso de etanol se

extrajo mediante vacío y el ARN total se disolvió en agua destilada tratada

con DEPC 0,1% v/v. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su uso.

4.5. Cuantificación de ARN

La concentración del ARN total extraído se determinó

espectrofotométricamente midiendo absorbancia a una longitud de onda de 260

nm utilizando la conversión: 1 unidad de absorbancia= 40 µg ARN/ml.

4.6. Análisis de ARN total

Con el objeto de verificar la integridad del ARN total extraído, se

prepararon geles de agarosa 1,2% p/v en condiciones desnaturalizantes. Para

ello se disolvieron 0,5 g de agarosa en 43 ml de agua destilada tratada con

DEPC 0,1% v/v y luego se agregaron 5 ml de buffer MOPS 10X (MOPS 0,2

M pH 7,0, acetato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM pH 8,0) y 1,5 ml de

formaldehído (37% p/v). La presencia de bandas discretas correspondientes a

los ARN ribosomales permite determinar que el ARN total extraído no sufrió

degradación durante el proceso de extracción. Cada una de las muestras de


48

ARN total analizadas se procesaron de la siguiente manera: 3 μl de solución

conteniendo ARN total se mezclaron con 18 μl de una mezcla compuesta por

2,5 μl de buffer MOPS 10X, 12,5 μl de formamida, 5,0 μl de formaldehído

(37% p/v) y 3,0 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Se incubó a 65 °C

durante 10 min y se agregaron 2 μl de colorante de muestra 6X para ARN

(glicerol 50% p/v, EDTA 1 mM, azul de bromofenol 0,4% p/v, xilencianol 0,4%

p/v). Finalmente, las muestras se sembraron en el gel y la electroforesis se

realizó a 70 V durante 2 h en buffer MOPS 1X. Las bandas correspondientes

a los ARN ribosomales se visualizaron utilizando un transiluminador-UV.

4.7. Transcripción reversa

La síntesis de la primera hebra de ADNc se realizó sobre ARN total

obtenido a partir de las siguientes variedades y estadios de maduración:

Camarosa y Toyonoka, VG, B, 25% R, 50% R y 100% R, y frutos blancos de

Camarosa sometidos a diferentes tratamientos con reguladores del crecimiento

vegetal. Se utilizó 1 μg de ARN total, 0,03 mM de dNTPs, 1 μl de

transcriptasa reversa M-MLV (200 U/µl; Promega), 5 μl de buffer de reacción

M-MLV 5X (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT, pH

8,3), 330 pmoles de hexámeros (Biodynamics S.R.L., Buenos Aires, Argentina)

y agua destilada en cantidad suficiente para un volumen final de 25 μl. El

ARN, el agua y los hexámeros se incubaron durante 10 min en un baño a 70

°C e inmediatamente se incubó a 4 °C durante 2 min. Luego de una

incubación a temperatura ambiente durante 10 min se agregaron los dNTPs, el

buffer de reacción 5X y la transcriptasa reversa M-MLV (Promega). La mezcla


49

de reacción se incubó a 38 °C durante 1 h y luego a 95 °C durante 5 min

para inactivar la enzima.

4.8. Reacciones de RT-PCR

Dos secuencias parciales, FaPG1 (1008 pb) y T-PG (535 pb),

homólogas a genes de poligalacturonasa habían sido aisladas previamente en

nuestro laboratorio. A partir del alineamiento de estas dos secuencias y de

spG (Redondo-Nevado y col., 2001) se diseñó un par de cebadores

específicos, denominados 5T-PG (5’ ATACTGCAGGCGCCACCAATTG 3’) y 3T-

PG (5’ CATGACCTGGTCCACAACTTAC 3’). Por otro lado, en base a un

fragmento del gen correspondiente a ARNr 18s de frutilla clonado durante este

trabajo de tesis, se diseñó un par de cebadores específicos, denominados

Rib5 (5´ ACCGTAGTAATTCTAGAGCT 3´) y Rib3 (5´

CCACTATCCTACCATCGAAA 3´). Se realizó la reacción de PCR utilizando 1,5

µl de reacción de transcripción reversa para frutos 100% R de la variedad

Camarosa, 12,5 pmoles de cada cebador, 2,5 µl de buffer de reacción 10X

Taq polimerasa, 1 U de Taq polimerasa (Promega), 0,05 mM de dNTPs, 1,5

mM de MgCl2 y agua destilada estéril para un volumen final de 25 µl. El

programa de PCR empleado fue el siguiente: desnaturalización inicial a 94 °C,

4 min; 35 ciclos (94 °C, 1 min; 64 °C, 1 min; 72 °C, 1 min) y 72 °C, 7 min.

4.9. Visualización de los productos de PCR

Los productos de amplificación utilizando los cebadores específicos (5T-


50

PG y 3T-PG, Rib5 y Rib3) se visualizaron en un gel de agarosa de alto poder

de separación, de concentración 1,5% p/v, teñidos con bromuro de etidio

(concentración final 0,5 µg/ml) y preparados en buffer TBE 0,5X (Tris Base 54

g, ácido bórico 27,5 g, EDTA 0,5 M 20 ml, pH 8,0, cantidad suficiente de

agua destilada para 1 l). Se sembraron 24 µl de los productos de PCR a los

que se les agregó previamente 4 µl de buffer de muestra 6X ADN (azul de

bromofenol 0,25% p/v, xilen-cianol 0,25% p/v, glicerol 30% v/v). En la corrida

electroforética se utilizó buffer TBE 0,5X y un voltaje constante de 80 V.

4.10. Purificación de los productos amplificados y cuantificación de ADN

Las bandas de interés se cortaron de los geles de agarosa y se

purificaron utilizando columnas de purificación GFXTM (Amersham Biosciences).

La concentración de ADN se determinó espectrofotométricamente midiendo

absorbancia a 260 nm y empleando la conversión de 1 unidad de

absorbancia= 50 µg ADN/ml.

4.11. Ligación de los productos de PCR

La ligación de los productos purificados se realizó empleando el sistema

del vector pGEM-T Easy (Promega). En cada caso se utilizó una relación

inserto/vector de 5:1, 25 ng de vector, 1 µl de buffer de ligación 10X (Tris-HCl

300 mM, pH 7,8; MgCl2 100 mM; DTT 100 mM; ATP 10 mM), 3 U de T4

DNA Ligasa (Promega) y cantidad suficiente de agua destilada estéril para un

volumen final de 10 µl. Cada mezcla de ligación se incubó a 6 °C durante

toda la noche.


51

4.12. Obtención de células competentes

Se utilizó el método descrito por Inoue y col. (1990), que permite

obtener células bacterianas competentes con una eficiencia de transformación

de 1-3 x 109 UFC/μg de ADN plasmídico. Se tomaron células de Escherichia

coli pertenecientes a la cepa XL-1 Blue, congeladas a -80 °C y se sembraron

por agotamiento en placas de Petri con medio LB-agar (triptona 10 g, extracto

de levadura 5 g, NaCl 5 g, NaOH 1 N 1 ml, agar 15 g, agua destilada en

csp 1 l) más tetraciclina (concentración final= 12 μg/ml). La placa se incubó

durante toda la noche a una temperatura de 37 °C. Posteriormente se

tomaron 6 colonias que se inocularon en 100 ml de medio SOB (triptona 20

g, extracto de levadura 5 g, NaCl 0,5 g, KCl 250 mM 10 ml, MgCl2 2 M 5

ml, agua destilada en csp 1000 ml, pH 7,0) y se las creció a 18 °C, con

agitación vigorosa hasta alcanzar una densidad óptica de 0,6 (medida a una

longitud de onda de 600 nm). La suspensión celular se incubó a 4 °C durante

10 min y se centrifugó a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. El precipitado se

resuspendió en 32 ml de solución TB (pipes 10 mM, MnCl2 55 mM, CaCl2 15

mM, KCl 250 mM) fría y se incubó a 4 °C durante 10 min. Se centrifugó a

2500 x g durante 10 min a 4 °C y el precipitado se resuspendió en 8 ml de

solución TB, a la cual se adicionó DMSO hasta una concentración final de 7%

v/v. Se incubó a 4 °C durante 10 min y la suspensión celular se dividió en

alícuotas de 200 μl, las cuales se congelaron en N2(l) y se almacenaron a -80

°C hasta su utilización.


52

4.13. Transformación de células competentes

Una alícuota de 200 μl de células competentes se incubó a 4 °C

durante 30 min con 5 μl de mezcla de ligación. Posteriormente, la suspensión

se incubó 30 s a 42 °C y luego 10 min a 4 °C. Se agregó 1 ml de medio de

cultivo líquido LB (triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 5 g, NaOH 1

N 1 ml, agua destilada en csp 1 l) y se incubó a 37 °C con agitación durante

1 h. Por otro lado, se prepararon medios de cultivo sólidos en placas de Petri

conteniendo LB-agar con ampicilina (concentración final= 100 μg/ml). En cada

placa se sembraron 200 μl de la suspensión de células transformadas y se

incubaron a 37 °C durante toda la noche. Se seleccionaron colonias positivas

(con el fragmento de interés) mediante la técnica de PCR en colonia. A partir

de estas colonias se realizó la extracción de ADN plasmídico, para verificar

posteriormente la presencia del inserto de interés mediante cortes con enzimas

de restricción.

4.14. Extracción de ADN plasmídico

Para la extracción de ADN plasmídico se utilizó la técnica de lisis

alcalina (Ausubel y col., 1995). Se inocularon 3 ml de medio de cultivo LB

más el antibiótico adecuado con la colonia bacteriana de interés y se incubó a

37 °C con agitación constante durante toda la noche. La suspensión resultante

se centrifugó durante 1 min a 16000 x g, se descartó el sobrenadante y se

resuspendió el precipitado bacteriano en 200 μl de solución P1 (Tris-HCl 25

mM pH 8,0, EDTA 10 mM). Se agregaron 200 μl de solución desnaturalizante


53

P2 (NaOH 0,2 N, SDS 1% p/v), se mezcló por inversión e incubó a 4 °C

durante 5 min. Posteriormente se adicionaron 200 μl de solución P3 (acetato

de potasio 2,8 M pH 5,1). Se mezcló por inversión e incubó a 4 °C durante 5

min. Se centrifugó durante 15 min a temperatura ambiente y se recuperó el

sobrenadante. Se adicionó 1,5 μl de RNAsa A (10 mg/ml, Promega) y se

incubó a 37 °C durante 45 min. Posteriormente se agregaron 500 μl de

cloroformo, se mezclaron ambas fases agitando por inversión durante 30 s y

se centrifugó durante 1 min a 16100 x g para separarlas. Se tomó la fase

acuosa y se realizó una nueva extracción empleando 500 μl de cloroformo. A

partir de la fase acuosa, se precipitó el ADN plasmídico adicionando un

volumen de isopropanol. Luego se centrifugó durante 10 min a 16100 x g y el

precipitado se lavó con 500 μl de etanol 70% v/v y se centrifugó durante 5

min a 16100 x g, se descartó el sobrenadante y el precipitado se secó a 37

°C durante 5 min. El precipitado se disolvió en 30 μl de agua destilada estéril,

y en algunos casos este resultó el último paso de la extracción, mientras que

en otros se continuó con pasos adicionales de purificación. El ADN plasmídico

se precipitó nuevamente con 8 μl de NaCl 4 M y 40 μl de PEG8000 (13% p/v)

durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente, se centrifugó a 16100 x g

durante 25 min, se removió el sobrenadante y el precipitado se lavó con 500

μl de etanol 70% v/v. Se centrifugó durante 5 min a 16100 x g, se descartó

el sobrenadante y se eliminó el exceso de etanol mediante incubación durante

5 min a 37 °C. Finalmente, el ADN plasmídico se disolvió en 20 μl de agua

destilada estéril. Las muestras se cuantificaron espectrofotométricamente como

se señaló en el punto 4.10.


54

4.15. Reacciones empleando enzimas de restricción

Las reacciones con cada enzima de restricción se realizaron de acuerdo

a las indicaciones del fabricante (Promega). A una alícuota conteniendo 1 μg

de ADN plasmídico se le adicionaron 2 μl de buffer de reacción de la enzima

10X, 0,2 μl de albúmina sérica bovina (ASB) acetilada (10 μg/μl), 0,5 μl de

enzima de restricción (10 U/μl) y agua destilada estéril en cantidad suficiente

para un volumen final de 20 μl. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C

durante 2 a 4 h, dependiendo del fragmento a analizar.

4.16. Ensayos de Northern-blot

4.16.1. Transferencia de ARN a membranas de nailon

Se extrajo ARN total de frutos correspondientes a las variedades

Camarosa, Pájaro y Toyonoka en los estadios de maduración VG, B, 25% R,

50% R y 100% R, y fruto blancos de Camarosa sometidos a diferentes

tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal. Se sembraron 10 μg de

ARN total de cada muestra en geles desnaturalizantes de agarosa-

formaldehído al 1,2% p/v (ver 4.6). Luego de la corrida electroforética y

verificación de la integridad del ARN, el gel se lavó con agua destilada

durante 2 min para eliminar el exceso de formaldehído. Posteriormente, se

preparó un dispositivo para la transferencia del ARN a una membrana de

nailon Hybond N+ (Amersham) por capilaridad (Sambrook y col., 1989). La

transferencia se realizó durante toda la noche y se empleó SSC 20X (NaCl 3


55

M, citrato de sodio 0,3 M, pH 7,0) como buffer de transferencia. El ARN se

fijó a la membrana por irradiación UV usando un UV-Stratalinker Modelo 1800

(Stratagene).

4.16.2. Preparación de las sondas a utilizar

4.16.2.1. Sonda para poligalacturonasas

Se realizó una PCR empleando como molde 1,5 μl de mezcla de

transcripción reversa de frutos de la variedad Camarosa pertenecientes al

estadio 100% R. Se utilizaron 12,5 pmoles de cebadores específicos 5T-PG y

3T-PG, 2,5 μl de buffer 10X Taq polimerasa (500 mM KCl; 200 mM Tris-HCl;

pH 8,4), 0,05 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1 U de Taq polimerasa (Promega) y

agua destilada en cantidad suficiente para 25 μl de volumen final. Las

condiciones de amplificación fueron: 94 °C, 4 min; 35 ciclos (94 °C, 1 min; 66

°C, 1 min; 72 °C, 1 min) y una elongación final a 72 °C por 7 min. Las

mezclas de reacción se sembraron en un gel de agarosa 2% p/v, teñido con

bromuro de etidio y se obtuvieron 2 fragmentos de 460 pb y 375 pb. El

fragmento de 375 pb se cortó del gel, se purificó, cuantificó, se secuenció y

utilizó como molde para obtener una sonda marcada radiactivamente, como se

detalla en 4.16.2.3.

4.16.2.2. Sonda para ARNr 18s

Se realizó una PCR con los mismos componentes y condiciones


56

descritas en el punto 4.16.2.1., salvo que los oligonucleótidos utilizados fueron

Rib5 y Rib3. Estos cebadores permitieron amplificar un fragmento de

aproximadamente 200 pb correspondiente al gen de ARNr 18s de frutilla. Las

mezclas de reacción se sembraron en un gel de agarosa al 1,2% p/v (en

buffer TBE) y luego de la corrida electroforética se cortó el fragmento, se

purificó, cuantificó, secuenció y se utilizó como sonda.

4.16.2.3. Marcado de sondas

Las sondas obtenidas se marcaron radiactivamente empleando el

método de cebado al azar (random priming). Se utilizaron 150 ng de ADN

como molde (desnaturalizado a 100 °C durante 5 min e inmediatamente

enfriado a 4 °C durante 5 min), 5 μl de buffer de Klenow 10X (Tris-HCl 500

mM, pH 7,2; MgSO4 100 mM; DTT 1 mM), 2 μl de mezcla de dGTP, dCTP y

dTTP (concentración inicial= 500 μM), 558 pmoles de oligonucleótidos al azar

(Biodynamics), 2 μl de ASB acetilada (concentración inicial= 10 mg/ml), 1 μl

de fragmento Klenow (5 U/μl, Promega), 4 μl de α-32P-dATP (10 mCi/ml) y

agua destilada estéril para alcanzar un volumen final de 50 μl. La reacción de

polimerización se llevó a cabo a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, la mezcla

de reacción se sembró en una columna con Sephadex G-50 equilibrada en

buffer TE (EDTA 0,5 M, Tris-HCl 1 M, pH 8,0) y se centrifugó a 800 x g

durante 1 min con el fin de eliminar la marca radioactiva no incorporada a la

sonda. La sonda marcada se desnaturalizó mediante calentamiento durante 10

min a 100 °C, posteriormente se enfrió a 4 °C durante 5 min y se agregó a

los tubos de hibridación.


57

4.16.3. Hibridación de membranas

Las membranas con el ARN se incubaron en tubos de hibridación

conteniendo 25 ml de solución de hibridación y 250 μl de ADN de esperma

de salmón (agente bloqueante, 10 mg/ml; previamente desnaturalizado). Todos

estos componentes se incubaron durante 4 h a 42 °C en un horno de

hibridación. Luego se adicionó la sonda marcada y se volvió a incubar durante

toda la noche a 42 °C. Posteriormente, se realizó un lavado a 42 °C seguido

de 2 lavados a 50 °C, cada uno con una duración de 30 min, utilizando una

solución de SSC 1X y SDS 0,1% p/v. Finalmente, las membranas se

expusieron a placas radiográficas (X-OMAT, Kodak), se almacenaron a -80 °C

y se revelaron luego de 7 a 15 días de exposición.

La composición de la solución de hibridación fue: formamida 150 ml,

SSPE 20X 90 ml, Denhart 50X 30 ml, SDS 10% p/v, agua destilada 12 ml.

4.17. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa

Se realizó la síntesis de la primera hebra de ADNc sobre ARN total

aislado de las variedades Camarosa y Toyonoka en los estadios de

maduración VG, B, 25% R, 50% R y 100% R, y ARN total de frutos B de

Camarosa tratados con diferentes reguladores del crecimiento vegetal (ver

sección 4.7). La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción

de 40 μl conteniendo: 2,4 μl de los productos obtenidos en la reacción de

transcripción reversa, 4 μl de buffer 10X Taq polimerasa (500 mM KCl; 200

mM Tris-HCl; pH 8,4), 0,05 mM de dNTPS, 1,5 mM de MgCl2, 1 U de taq


58

polimerasa (Promega), y 12,5 pmoles de los cebadores 5T-PG y 3T-PG

correspondientes a poligalacturonasas o 12,5 pmoles de los cebadores Rib5 y

Rib3 correspondientes a ARNr 18s. Las condiciones de amplificación para los

cebadores de ribosomales fueron 15, 20, 25 y 30 ciclos (94 °C, 1 min; 64 °C,

1 min and 72 °C, 1 min) y una elongación final a 72 °C durante 7 min. En el

caso de PGs, la amplificación se realizó en las mismas condiciones, excepto

que los números de ciclos fueron 18, 22, 26 y 30. Los productos de

amplificación (20 μl) se sembraron en geles de agarosa (1,2% p/v y 2,0% p/v

para ribosomales y poligalacturonasas respectivamente) y los mismos fueron

teñidos con bromuro de etidio. Para detectar las bandas correspondientes a

poligalacturonasas y ARNr 18s, los geles se analizaron con un transiluminador

UV, o bien mediante la técnica de Southern blot (Sambrook y col., 1989),

siguiendo los pasos que se indican a continuación.

Una vez terminada la corrida electroforética, cada uno de los geles se

trató con una solución desnaturalizante (NaOH 0,5 N y NaCl 1,5 M) durante

15 min con agitación constante. Luego se realizó un lavado con agua

destilada y se incubó en solución de neutralización (Tris-HCl 0,5 M y NaCl 3

M) con agitación durante 15 min. La transferencia por capilaridad a

membranas de nailon y la hibridación de las membranas (con las sondas para

PGs y para ribosomales) se realizó de forma similar a la descripta en los

puntos 4.16.1. y 4.16.3., respectivamente.

Las bandas pertenecientes a los ARNr 18s obtenidas para cada estadio

de maduración de cada variedad se analizaron por densitometría (GelPRO

Analizer Versión 3.0). De este modo se corrigieron diferencias de carga y se

obtuvieron los volúmenes de mezcla de reacción de PCR que contenían


59

cantidades equivalentes de ARNr 18s. Estos mismos volúmenes fueron

tomados a partir de las mezclas de PCR con el producto de amplificación de

PGs, y se analizaron en un gel de agarosa al 2% p/v de modo de obtener el

patrón de expresión de poligalacturonasas.

4.18. Obtención de las secuencias completas de FaPG1 y T-PG

Como se mencionó en la sección 4.8., dos secuencias parciales,

FaPG1 y T-PG, correspondientes a genes putativos de poligalacturonasa se

habían aislado previamente en nuestro laboratorio. Durante la realización de

esta tesis, se procedió a la obtención de las secuencias completas de ambos

clones. Los extremos 5’ y 3´ de FaPG1 y T-PG se amplificaron a través de

una reacción de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) a partir de ARN

total de frutos 100% R de la variedad Camarosa y el kit de amplificación de

ADNc BD SmartTM (Clontech). La amplificación de los extremos 5’ se realizó

utilizando un oligonucleótido reverso específico de secuencia, 5´RACE (cuya

secuencia es idéntica al cebador 3T-PG, 5’ CATGACCTGGTCCACAACTTAC

3’), y una mezcla universal de oligonucleótidos A (Clontech). La amplificación

del extremo 3’ de T-PG se realizó utilizando el mismo kit que se detalla más

arriba y el cebador directo específico de secuencia 3´RACE (5´

GTGGTGGTCTAGCCATTGGTGTGAAC 3´). Los productos de la amplificación

por PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa. Las

bandas de interés se purificaron a partir del gel con el kit de purificación

GFXTM (Amersham Biosciences), se clonaron en el vector pGEM-T Easy

(Promega) y se secuenciaron.


60

4.19. Secuenciación y análisis bioinformático de los clones obtenidos

Las muestras de ADN plasmídico en las cuales se verificó la presencia

de inserto, se enviaron al servicio de secuenciación del IIB-INTECH (UNSAM)

o bien a la empresa Macrogen (USA), con el oligonucleótido adecuado de

acuerdo al vector utilizado. El análisis de cada secuencia se llevó a cabo

utilizando los programas EdiqSeq y Megalign incluidos en el software

DNASTAR 4.05. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de

aminoácidos se compararon con la base de datos del GenBank utilizando el

programa BLAST (Altschul y col., 1997). Por otro lado, se emplearon los

programas Seqman (DNASTAR 4.05), SignalP 3.0 y el banco de datos

PROSITE (http://www.expasy.org/prosite). Para predecir los sitios de splicing

5´y 3´ presentes en el clon genómico de FaPG1 (spG) se utilizó el programa

provisto por CNR-ITB, (www.itb.cnr.it/sun/webgene).

4.20. Construcción de un árbol filogenético

Las secuencias de proteínas deducidas se alinearon utilizando el

software CLUSTAL W versión 1.8 (Thompson y col., 1994). Para la

construcción de los árboles consenso, los alineamientos se analizaron usando

el método de la Máxima Parsimonia (MP) del programa TNT (Tree Analysis

Using New Technology. Version 1.0. P. Goloboff, J.S. Farris and K. Nixon) con

secuencias de adición al azar. A partir de los datos de secuencia, se

realizaron tres corridas independientes con el método de MP. El soporte

estadístico para los clados filogenéticos se calculó mediante un análisis con

http://www.expasy.org/prosite

http://www.itb.cnr.it/sun/webgene


61

muestreos sucesivos (bootstrap) de 1000 réplicas.

4.21. Números de acceso

Los números de acceso en el GenBank de las secuencias utilizadas en

este estudio son los siguientes: Alfalfa (Medicago sativa, Q40312), Algodón

(Gossypium hirsutum, Q39786), Oenothera (Oenothera organensis, P24548),

Tabaco (Nicotiana tabacum, Q05967), Maíz (Zea mays, P26216), Pga2,5

(Arabidopsis thaliana, O48729), FaPG1 (Fragaria x ananassa, DQ458990),

Pga1,5 (Arabidopsis thaliana, 3212847), Pga1,4 (Arabidopsis thaliana, O22816),

Pga1,2 (Arabidopsis thaliana, O22818), MPG2 (Cucumis melo, AF062466),

PRF5 (Cucumis melo, P48979), Pga1,1 (Arabidopsis thaliana, O22817), TAPG1

(Solanum lycopersicum, Q40135), TAPG2 (Solanum lycopersicum, Q96487),

TAPG3 (Solanum lycopersicum, O22310), TAPG4 (Solanum lycopersicum,

Q96488), TAPG5 (Solanum lycopersicum, O22313), Gen-durazno (Prunus

persica, Q43063), pGDPG (Malus x domestica, P48978), Kiwi (Actinidia

chinensis, P35336), Palta2 (Persea Americana, Q02096), pAVOpg (Persea

americana, L06094), TPG2 (Solanum lycopersicum, P05117), B. napus

(Brassica napus, Q42399), Pga1,6 (Arabidopsis thaliana, O23147), Pga1,7

(Arabidopsis thaliana, O22935), cedro (Cryptomeria japonica, P43212), D15

(Fragaria x ananassa, AY282613), B4 (Fragaria x ananassa, AY280662), spG

(Fragaria x ananassa, AF380299) ARNr 18 frutilla (Fragaria x ananassa,

X15590) y T-PG (Fragaria x ananassa, DQ458991).


62

4.22. Expresión heteróloga

Se amplificó un fragmento del ADNc de FaPG1 (890 pb) a partir de

una reacción de PCR utilizando como molde un plásmido conteniendo la

secuencia de 1008 pb de FaPG1, y los oligonucleótidos FaPG5 (5´

TGTAGGATCCGATGGCATACTGCAG3´) y FaPG3 (5´

TCAACTCGAGAATCGTGGGTTGCAC3´), los cuales incluyen los sitios de

restricción para las enzimas BamHI y XhoI (señalados en negrita; Promega).

El producto amplificado se digirió con las enzimas BamHI y XhoI y se clonó

en el vector de expresión pET-24a (+) (Novagen), digerido previamente con

las mismas enzimas. El vector pET-24a (+) permite obtener proteínas

recombinantes fusionadas a una cola de seis residuos de histidina en el

extremo carboxilo. Con esta construcción se transformaron células de E. coli,

cepa BL21 p-lys, las cuales se sembraron en placas LB-agar con el antibiótico

kanamicina (concentración final= 30 μg/ml). Se verificó la presencia del inserto

de interés en las células transformadas mediante la técnica de PCR en

colonia. Las células con la construcción deseada se cultivaron hasta una

DO600= 0,5, luego se indujeron con IPTG 1 mM a 37 °C y se cosecharon a

las 0, 1, 2, 4, 6 y 24 h de modo de obtener una curva de inducción. Para los

ensayos de purificación, se escogió el tiempo de inducción de 4 h, y el pellet

celular se almacenó a -20 °C hasta su uso.

4.22.1. Purificación de la proteína recombinante FaPG1

Con el objeto de obtener un fragmento de FaPG1 recombinante, se


63

lisaron células de E. coli (BL21 p-lys, transformadas con la construcción

indicada en 4.22) utilizando un buffer desnaturalizante (NaH2PO4 100 mM,

Tris-HCL 10 mM, Urea 8 M; pH 8,0). Posteriormente, se procedió a la

purificación de la proteína unida a una secuencia de 6 residuos de histidina,

mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina Ni-NTA (QIAGen) y

siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína se purificó mediante el

pasaje secuencial de buffers a distintos pH de modo de generar un gradiente.

Todas las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE.

Alternativamente, el fragmento FaPG1 se purificó por afinidad en

condiciones nativas. En este caso, las células se lisaron en un buffer no-

desnaturalizante (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0), y

posteriormente la proteína se purificó como se detalló más arriba, pero

utilizando el pasaje secuencial de buffers con distintas concentraciones de

imidazol (gradiente discontinuo). La actividad enzimática específica de

poligalacturonasa se midió utilizando el método de la 2-cianoacetamida (Gross,

1982), de acuerdo a lo descripto en 4.2.

4.22.2. Producción del antisuero anti-FaPG1 y purificación del anticuerpo

La proteína recombinante purificada se cuantificó y se utilizó en un

protocolo de inmunización para producir antisuero en conejo (Catty, 1988). El

anticuerpo se purificó a partir del antisuero de la siguiente manera: se

sembraron 10 µg de proteína recombinante FaPG1 (antígeno) por calle en un

gel de poliacrilamida 10% p/v. Las proteínas se transfirieron a una membrana

de nitrocelulosa (Amersham Biosciences) mediante transferencia electroforética


64

estándar, se tiñeron con el colorante rojo Ponceau S y se cortaron las bandas

de interés. La membrana, con la proteína recombinante, se bloqueó con TBS

(Tris 20 mM; NaCl 137 mM, pH 7,6) y caseína 5% p/v durante 1 h, y

posteriormente se realizaron dos lavados de 15 min con TBS. El antisuero se

adicionó a la membrana y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente;

finalizada la incubación, se realizaron dos lavados de 15 min con TBS. El

anticuerpo se eluyó de la membrana mediante la adición de 800 µl de glicina

25 mM (pH 3,0), incubando a temperatura ambiente durante 5 min (2 veces).

Las fracciones se colectaron y transfirieron a un tubo conteniendo un volumen

de Tris 25 mM (pH 10,0), el cual llevó la solución a un pH final de 7,0. Las

fracciones se agruparon para concentrar el anticuerpo purificado mediante

liofilización.

4.22.3. Western-blot

Se obtuvieron extractos proteicos utilizando una versión modificada del

método de Hurkman y Tanaka (1986). Frutos de frutilla congelados (10 g) de

las variedades Camarosa y Toyonoka (estadios VG, B, 25% R, 50% R y

100% R), así como frutos blancos de Camarosa tratados con diferentes

reguladores del crecimiento vegetal, se pulverizaron con pilón y mortero en

presencia de N2(l). El polvo resultante se homogenizó con 15 ml de fenol

equilibrado (pH 7,6) y 5 ml de buffer Tris 100 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM,

PMSF 2 mM y PVPP 1% p/v. Se incubó a 4 °C durante 15 min y se

centrifugó a 10000 x g durante 15 min a 4 °C. La fracción fenólica se mezcló

con 1 volumen de Tris 100 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y se centrifugó a


65

10000 x g durante 15 min a 4 °C. Se adicionaron 5 volúmenes de acetato de

amonio 0,1 M en metanol 100% v/v a la fracción fenólica, y se incubó durante

toda la noche a -20 °C. La suspensión se centrifugó a 10000 x g por 15 min

a 4 °C, el sobrenadante se descartó y el pellet de proteínas se lavó una vez

con acetato de amonio 0,1 M en metanol 100% v/v, y dos veces con acetona

80% v/v a -20 °C. El pellet de proteínas se disolvió en Tris 60 mM (pH 6,8),

glicerol 25% v/v, SDS 2% p/v y 2-mercaptoetanol 2 mM. Los extractos

conteniendo 20 μg de proteínas totales se separaron mediante SDS-PAGE

usando un gel de poliacrilamida 12% p/v (Laemmli, 1970) y se electro-

transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Biosciences). Las

membranas se bloquearon con buffer TBS-T (TBS, Tween20 0,1% v/v pH 7,6)

y caseína 5% p/v durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se

realizaron lavados con TBS-T (1 lavado de 15 min y 2 de 5 min). Luego se

incubaron durante 4 h con el anticuerpo primario purificado anti-FaPG1

(dilución 1:1000). Se realizaron lavados con buffer TBS-T (1 lavado de 15 min

y 2 de 5 min) y se incubó 1 h con el anticuerpo secundario anti-Ig de conejo

(Amersham Biosciences). Luego de los correspondientes lavados con TBS-T,

de modo similar a lo descrito anteriormente, se llevó a cabo la

inmunodetección utilizando una reacción de quimioluminiscencia (ECL Western

blotting análisis; Amersham-Pharmacia).

4.22.4. Ensayo de deglicosilación

Se preparó un extracto de frutos de Toyonoka 100% R como se indicó

en el punto 4.22.3., el cual se dializó contra buffer HAc/NaAc 50 mM pH 6,0


66

(para eliminar el SDS presente en el buffer de disolución de proteínas, el cual

inactiva las enzimas utilizadas para la deglicosilación), se concentró mediante

liofilización y se disolvió en el mínimo volumen posible de agua destilada.

Trescientos microgramos de proteínas contenidos en dicho extracto se

sometieron a deglicosilación enzimática utilizando el kit E-DEGLY (Sigma),

siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 h de incubación a

37 °C con las enzimas, la mezcla se concentró mediante precipitación con

acetona 100% v/v, y se redisolvió en buffer de muestra 1X (Tris 60 mM pH

6,8; glicerol 25% v/v; SDS 2% p/v y 2-mercaptoetanol 715 mM). Extractos

conteniendo 20 µg de proteínas totales se separaron electroforéticamente

mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida 12% y se electrotransfirieron

a una membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare). La inmunodetección se

llevó a cabo de la misma forma que se indica en el punto 4.22.3.

4.23. Cuantificación de proteínas

La concentración de los extractos proteicos se obtuvo mediante la

técnica de Lowry, modificada de acuerdo a Potty (1969). En el caso de

FaPG1 recombinante, se midió la concentración utilizando un minifluorómetro

(Qubit fluorometer; Invitrogen).

4.24. Tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal

Se utilizaron frutos blancos del cultivar Camarosa, sin daño físico y de

tamaño similar. El pedúnculo de cada fruto se cortó a una distancia de 3 cm


67

a partir de la base del receptáculo y se sumergió en tubos estériles para

microcentrífuga conteniendo soluciones de auxinas, giberelinas, o ácido

abscísico. Las soluciones de ácido naftalén acético (NAA) y ácido giberélico

(GA3) se prepararon en agua destilada a una concentración de 1 mM. Como

controles, los pedúnculos de un conjunto de frutos se sumergieron en agua

destilada. Para estudiar el efecto de auxinas endógenas, se eliminaron los

aquenios en una mitad del fruto, dejando la otra mitad intacta como control, y

los mismos se incubaron durante 72 h a 22 °C con el pedúnculo sumergido

en agua.

La solución de ácido abscísico (ABA) se preparó en etanol 2% v/v a

una concentración final de 1 mM. En este caso los pedúnculos de los frutos

control se sumergieron en una solución acuosa de etanol 2% v/v.

En el caso del tratamiento con etefón (ácido 2-cloroetilfosfónico) los

frutos completos se sumergieron durante 5 min en una solución 2 mM de

etefón en Tween 0,02% v/v y etanol 1% v/v, preparada inmediatamente antes

de usarla. Los frutos control se sumergieron durante el mismo tiempo en

Tween 0,02% v/v, etanol 1% v/v. El tratamiento con 1-MCP (1-

metilciclopropeno), se llevó a cabo incubando los frutos con 1-MCP 1 ppm

dentro de un contenedor hermético durante 10 h (se utilizaron 5,44 mg del

formulado SmartFreshTM AgroFresh Inc, para un volumen de 80 l; la liberación

del compuesto gaseoso se realizó mediante el agregado de 10 ml de H20d).

Los frutos control se mantuvieron en otro recipiente en condiciones similares

pero en ausencia de 1-MCP.

Finalmente, para los tratamientos con NO, los frutos se sumergieron en

soluciones acuosas de SNP (nitroprusiato de sodio) 5 y 10 µM durante 2 h,


68

mientras los frutos control se sumergieron en agua durante el mismo periodo.

Después de los tratamientos con etefón y NO, los pedúnculos de los frutos se

sumergieron en tubos de microcentrífuga estériles conteniendo agua destilada.

Los frutos sometidos a los distintos tratamientos se ubicaron en un

cuarto de incubación a 22 °C durante 48 h para los tratamientos con etefón,

1-MCP y NO; y durante 72 h para los tratamientos con NAA, GA3 y ABA.

Luego del almacenamiento, se removió el cáliz y el pedúnculo y tanto los

frutos tratados como los controles se cortaron, congelaron en nitrógeno líquido

y almacenaron a –20 °C hasta su uso. Se utilizaron quince frutos para cada

tratamiento o control, y cada ensayo se realizó por triplicado.

Observación: frutos blancos pertenecientes al cultivar Toyonoka se sometieron

a tratamiento con etefón y 1-MCP, de modo similar al descrito para frutos de

la variedad Camarosa.

4.25. Antocianinas

Frutillas congeladas (5 g) se trituraron con pilón y mortero en presencia

de N2(l). Se tomaron aproximadamente 0,3 g de tejido triturado y se agregaron

3 ml de HCl 1% v/v en metanol. Se incubó durante 10 min a 4 °C y se

centrifugó a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Se separó el sobrenadante y

se midió la absorbancia a 515 nm. La cantidad de antocianinas se expresó

como nmoles de pelargonidina-3-glucósido por kilogramo de fruto, usando un

Emolar= 3,6 x 10 6 mol L-1 m-1 (Woodward, 1972). Las medidas se realizaron

por cuadruplicado para cada muestra correspondiente a los tratamientos

analizados.


69

4.26. Clorofilas

La metodología utilizada para la medición del contenido de clorofilas se

adaptó de Inskeep y Bloom (1985). Frutos congelados (5 g) se trituraron con

pilón y mortero en presencia de N2(l), y 0,5 g del polvo resultante se

resuspendieron en 3 ml de dimetilformamida (DMF). La mezcla se centrifugó a

10000 x g durante 10 min a 4 °C, el sobrenadante se reservó y se midió la

absorbancia a 675 y 664,5 nm. Las medidas se realizaron por triplicado y los

resultados se expresaron como g de clorofilas por kg de fruto fresco,

utilizando la siguiente relación: Clorofila total= 17,90 x Abs647 + 8,08 x Abs664,5.

4.27. Contenido de azúcares reductores y totales

Frutos congelados (5 g) se trituraron con pilón y mortero en presencia

de N2(l), y 0,4 g del polvo resultante se resuspendieron en 6 ml de etanol. La

mezcla se centrifugó a 9000 x g durante 10 min a 4 °C, y 1 ml del

sobrenadante se llevó a 50 ml con agua destilada. El contenido de azúcares

reductores se determinó espectrofotométricamante a 540 nm usando una

modificación del método de Somogyi-Nelson (Southgate, 1976).

Para la determinación de azúcares totales, se mezclaron 0,1 ml de

extracto con 1 ml de antrona 0,2% p/v en H2SO4 72% v/v. La mezcla se

incubó a 100 °C durante 12 min, se llevó a temperatura ambiente en baño de

agua, y el contenido de azúcares se midió espectrofométricamente a 625 nm.

Las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron

como g de glucosa por kg de fruto fresco.


70

4.28. Compuestos fenólicos totales

Frutos congelados (5 g) se trituraron con pilón y mortero en presencia

de N2(l). Aproximadamente 1 g del polvo resultante se resuspendió en 6 ml de

etanol y la mezcla se centrifugó a 9000 x g durante 10 min a 4 °C. Un

mililitro del sobrenadante se llevó a un volumen final de 5 ml con agua

destilada y se utilizó para determinar compuestos fenólicos totales. A 100 μl

del extracto se le adicionaron 1,11 ml de agua destilada y 200 μl de reactivo

Folin-Ciocalteau 1 N. Después de 3 min a 25 °C, se adicionó 1,5 ml de

solución saturada de Na2CO3, y la mezcla de reacción se incubó durante 1 h

a la misma temperatura. Posteriormente, se midió la absorbancia a 760 nm. El

contenido de compuestos fenólicos totales se calculó utilizando fenol como

estándar. Las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados se

expresaron como g de fenol por kg de fruto fresco.

4.29. Actividad fenilalanina amonio liasa (PAL)

Aproximadamente 5 g de fruto se homogeneizaron en un Omnimixer

(OCI Instruments) a 4 °C con 4 volúmenes de buffer de la siguiente

composición: Na2B4O7.10 H2O 0,1 M (pH 8,8), 2-mercaptoetanol 0,05 M, EDTA

0,02 M, PVPP 3% p/v. La mezcla se agitó durante 1 h a 4 °C y

posteriormente se centrifugó a 10000 x g durante 20 min a 4 °C. La actividad

enzimática se midió en el sobrenadante con la siguiente mezcla de reacción:

Na2B4O7.10H2O 0,03 M (pH 8,8), L-fenilalanina 0,01 M y 1 ml de extracto

enzimático en un volumen final de 3 ml. La mezcla se incubó a 30 °C y la


71

reacción se evaluó a través del incremento en la absorbancia a 290 nm

causada por la producción de ácido transcinámico. Los resultados se

expresaron como el cambio en la densidad óptica (ΔOD) por s por kg de fruto

fresco.

4.30. Análisis estadístico

Los datos del contenido de antocianinas y de la actividad

poligalacturonasa total (para los ensayos con reguladores del crecimiento

vegetal) se analizaron mediante el Test t de Student. Los datos de actividad

poligalacturonasa total durante la maduración se analizaron mediante ANOVA.

En todos los casos, el nivel de significancia fue menor que 0,05 (P< 0,05).

4.31. Composición de buffers y soluciones utilizadas

- Buffer MOPS 10X: MOPS 0,2 M pH 7,0, acetato de sodio 20 mM, EDTA 10

mM pH 8,0.

- Colorante muestra 6X ARN: glicerol 50% p/v, EDTA 1 mM, azul de

bromofenol 0,4% p/v, xilen-cianol 0,4% p/v.

- Colorante muestra 6X ADN: glicerol 30% v/v, azul de bromofenol 0,25% p/v,

xilen-cianol 0,25% p/v.

- SSPE 20X: NaCl 3M, NaH2PO4 0,2 M, EDTA 20 mM, pH 7,4.


72

- TBE 5X: 0,44 M Trisma; 0,44 M ácido bórico, 0,01 M EDTA.

- Denhart 50X: Ficoll 1% p/v, PVP 1% p/v, ASB 1% p/v.

- SSC 20X: Citrato de sodio 0,3 M, NaCl 3 M, pH 7,0.

- Buffers para la purificación de FaPG1 en condiciones desnaturalizantes:

§ Buffer de Lisis: NaH2PO4 100 mM, TrisHCl 10 mM, urea 8 M, pH 8,0.

§ Buffer de lavado: NaH2PO4 100 mM, TrisHCl 10 mM, urea 8 M, pH 6,3.

§ Buffer de elución: NaH2PO4 100 mM, TrisHCl 10 mM, urea 8 M, pH

4,5.

- Buffers para la purificación de FaPG1 en condiciones nativas:

§ Buffer de Lisis: NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH

8,0.

§ Buffer de lavado: NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH

8,0.

§ Buffer de elución: NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM,

pH 8,0.

- TBS: Tris 20 mM; NaCl 137 mM pH 7,6.

Capítulo I

73

5. Capítulo I. Análisis de la expresión y actividad poligalacturonasa durante la maduración de cultivares de frutilla con niveles de firmeza contrastantes 5.1. Introducción

La pared celular vegetal es una estructura dinámica que presenta

cambios durante la diferenciación y el desarrollo de los diferentes órganos. El

ablandamiento que tiene lugar durante la maduración de los frutos carnosos

está asociado a la degradación de los diferentes componentes de la pared

(Brummell y Harpster, 2001).

Los frutos de frutilla poseen una elevada velocidad de ablandamiento, la

cual contribuye a su rápido decaimiento post-cosecha. Las bases bioquímicas

de la degradación de la pared celular de estos frutos aún no se encuentran

claramente establecidas, y se informaron resultados contradictorios en

diferentes cultivares. En el caso del metabolismo de hemicelulosas, se reportó

un incremento en la actividad celulasa (Abeles y Takeda, 1990) y en la

expresión de genes de endo-β-1,4-glucanasa (Llop-Tous y col., 1999) durante

la maduración. Por otra parte, si bien se observó depolimerización de

hemicelulosas en el cultivar Dover (Huber, 1984), esta fue indetectable o muy

baja en las variedades Camarosa y Pájaro, respectivamente (Rosli y col.,

2004).

Con respecto al metabolismo de pectinas, se observó un incremento en

la solubilidad en agua de estos componentes durante la maduración de frutilla

(Huber, 1984; Rosli y col., 2004), sin bien la magnitud de la depolimerización

fue dependiente del cultivar analizado (Rosli y col., 2004).

En el caso de poligalacturonasa en frutilla, los datos reportados fueron

Capítulo I

74

contradictorios entre distintos trabajos, y la existencia de la enzima en este

fruto fue puesta en duda durante mucho tiempo. Estudios realizados en el

cultivar Dover no detectaron actividad PG (Huber y col., 1984), sin embargo

mas tarde se purificaron tres isoenzimas a partir del cultivar Toyonoka (Nogata

y col., 1993). Hasta el momento de la realización de esta Tesis Doctoral, se

había reportado el clonado de tres genes putativos de poligalacturonasas: spG

(Redondo-Nevado y col., 2001), D15 y B4 (Salentijn y col., 2003). Dos de

estos clones, spG y D15, corresponden al mismo gen (Salentijn y col., 2003),

si bien se reportaron datos contradictorios acerca de su expresión.

Con el fin de esclarecer el papel de PG en el ablandamiento del fruto

de frutilla, se evaluó la expresión y actividad poligalacturonasa durante la

maduración de cultivares con firmezas contrastantes.

Capítulo I

75

5.2. Resultados

5.2.1. Actividad Poligalacturonasa

Con el objetivo de detectar actividad poligalacturonasa total durante la

maduración de frutilla, se prepararon extractos proteicos de frutos de las

variedades Camarosa, Pájaro y Toyonoka, los cuales presentan niveles de

firmeza contrastantes (Tabla I).

Firmeza (N)

Estadio de

Maduración Camarosa Pájaro Toyonoka

Verde Grande 20,34a 14,89b 13,39c

Blanco 11,31a 3,79b 2,93c

25% rojo 3,62a 1,62b 1,16c

50% rojo 2,77a 1,42b 0,95c

75% rojo 2,00a 1,24b 0,89c

100% rojo 1,39a 0,87b 0,74c

Tabla I: cambios en la firmeza durante la maduración de frutos de frutilla de tres variedades.

Los valores con distintos superíndices indican diferencias significativas cuando las variedades

son comparadas entre sí en el mismo estadio de maduración (P < 0,05). Adaptado de Rosli y

col. (2004).

Capítulo I

76

Se utilizaron frutos en los estadios VG, B, 50% R y 100% R, y la

extracción de la enzima se realizó en presencia de un buffer con alta

concentración salina (NaCl 1 M), de modo de facilitar la liberación de la

misma de las paredes celulares. Sin embargo, dado el efecto inhibidor del

NaCl sobre la actividad enzimática de PG (Nogata y col., 1993), se realizó

una diálisis exhaustiva del extracto de modo de eliminar dicho compuesto.

Finalmente, la actividad se evaluó utilizando ácido poligalacturónico como

sustrato y evaluando la liberación de grupos reductores con 2-cianoacetamida.

En la figura 5 se representa la actividad poligalacturonasa total

(expresada como nmoles de ácido galacturónico liberados por segundo y por

kilogramo de fruto) en función de los diferentes estadios de maduración para

cada una de las variedades mencionadas anteriormente. Se detectó actividad

poligalacturonasa total en todos los cultivares y estadios de maduración

analizados, si bien en los estadios VG y B la actividad PG observada fue

baja. En el estadio 50% R los niveles de actividad PG en frutos de las

variedades Pájaro y Toyonoka fueron significativamente superiores a los

detectados en Camarosa. La mayor actividad para los tres cultivares se

observó hacia el final de la maduración, si bien los niveles más elevados se

detectaron en frutos pertenecientes a cultivares de firmeza baja e intermedia

(Toyonoka y Pájaro respectivamente).

Capítulo I

77

5.2.2. Análisis de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de

frutilla

5.2.2.1 Clonado de los ADNc completos de FaPG1 y T-PG

Previamente a la realización de esta Tesis, se había llevado a cabo

una búsqueda en una biblioteca de ADNc de frutos de frutilla 25% R y 100%

R de la variedad Chandler con el fin de obtener clones que codificasen

poligalacturonasas putativas. La utilización de una sonda heteróloga de tomate

(pTOM6, número de acceso A24194) permitió obtener un fragmento de ADNc

Estadios de maduración

Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

Camarosa Pájaro Toyonaka

VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab

Toyonoka

a

a a

b

a

b

b

a

b


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab

Toyonoka

a

a a

b

a

b

b

a


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab

Toyonoka

a

a a

b


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab

Toyonoka

a

a a


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab

Toyonoka


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

ab


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R


Act

ivid

ad P

G (n

mol

s -1

Kg

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7


VG B 50% R 100% R

a

b

aba

b

ab

Toyonoka

a

a a

a

a a

b

a

b

b

a

b

b

a

b

Figura 5: cambios en la actividad poligalacturonasa total durante la maduración de frutos de frutilla

de variedades con firmezas contrastantes. Los extractos proteicos se prepararon a partir de frutos

en los estadios VG, B, 50% R y 100% R. Los niveles de PG total se analizaron mediante

ANOVA, con P < 0,05. Las columnas con diferentes letras, indican diferencias significativas entre

cultivares al ser comparadas dentro de un mismo estadio.

Capítulo I

78

de 1008 pb, llamado FaPG1. Una búsqueda posterior por PCR permitió clonar

un fragmento de 535 pb denominado T-PG. A través del análisis de la

secuencias obtenidas se determinó que ambos fragmentos eran homólogos a

spG (Redondo-Nevado y col., 2001), y a D15 (Salentijn y col., 2003). Al

realizar el alineamiento de las secuencias de spG, D15, FaPG1 y T-PG, se

observó que tanto FaPG1 como T-PG incluían la secuencia: 5´

GGTCTAGCCATT 3´ en la posición 454 de spG, la cual corresponde a la

secuencia de residuos de aminoácidos: GLAI (figura 6). Esta secuencia

nucleotídica está presente en el clon genómico de spG, pero se reportó como

ausente en el ADNc predicho, debido a que los autores la consideraron como

parte de un intrón (Redondo-Nevado y col., 2001). Tanto los ADNc aislados

en nuestro laboratorio como el clon D15 presentaron esta secuencia, lo cual

indica que la misma corresponde a una región codificante del gen de PG.

Al analizar el fragmento correspondiente a T-PG, se observó además

que éste presentaba una deleción de 85 pb entre las posiciones 454 y 538

del ADNc predicho para spG (figura 6). La traducción de la secuencia de

residuos de nucleótidos de T-PG reveló que la proteína T-PG presentaba

identidad de secuencia con PGs hasta la posición anterior a la deleción, pero

que a partir de dicho punto no se observaba homología con la secuencia

proteica de poligalacturonasas.

Capítulo I

79

Se decidió entonces comenzar con la obtención de los ADNc completos

de FaPG1 y T-PG. Los extremos 5’ y 3’ de ambos clones se amplificaron

utilizando la técnica de RACE a partir de ARN total de frutos 100% R de la

variedad Camarosa. Es de destacar que los oligonucleótidos específicos de

secuencia se diseñaron corriente abajo (downstream, es decir hacia el extremo

3´ de un gen) de la deleción de 85 pb para la amplificación de los extremos

5´, y corriente arriba (upstream, es decir hacia el extremo 5´ de un gen) de

dicha deleción para la amplificación de los extremos 3´, a fines de poder

diferenciar entre los productos correspondientes a FaPG1 y a T-PG. En la

figura 7 se esquematiza la estrategia utilizada para la amplificación de los

extremos.

Figura 6: alineamiento de las secuencias de nucleótidos correspondiente a fragmentos de T-PG,

FaPG1, D15 y spG. La secuencia 5´GGTCTAGCCATT3´, destacada en la figura dentro del recuadro

en negro, fue predicha originalmente como parte de un intrón (Redondo Nevado y col., 2001). La

deleción de 85 pb en la secuencia de T-PG se señala en el recuadro gris.

Capítulo I

80

Posteriormente, se utilizó el programa Seqman incluido dentro del

software DNASTAR 4.05 para la obtención de los contigs (es decir, la

secuencia resultante del solapamiento de fragmentos contiguos de un gen) de

los clones obtenidos, de tal manera de obtener las secuencias completas de

FaPG1 y T-PG. El análisis bioinformático de los clones se realizó utilizando el

banco de datos de PROSITE (http://www.expasy.org/prosite) y el programa

SignalP 3.0. En la figura 8, se detalla el alineamiento de las secuencias de

residuos aminoácidos predicha para SPG, D15, FaPG1 y T-PG, y se señalan

algunos elementos característicos presentes en las secuencias de PGs. Es de

destacar que las cuatro secuencias poseen un péptido señal (con un sitio de

corte predicho entre los residuos de aminoácidos 22 y 23) que podría dirigirlas

hacia la pared celular, lo cual sugiere que tanto T-PG como FaPG1 son

conducidas hacia el apoplasto. Sin embargo, a diferencia de SPG, D15 y

FaPG1, la proteína T-PG putativa carecería del sitio activo característico de

PGs y de los sitios de N-glicosilación, ya que luego de la secuencia GLAI, no

guarda homología con PGs y presenta un codón de terminación prematuro.

La proteína FaPG1 madura posee 383 residuos de aminoácidos, una

Deleción 85 pbT-PG

FaPG1

3’ RACE

5’ RACE

Deleción 85 pbT-PG

FaPG1

3’ RACE

5’ RACE

Deleción 85 pbT-PG

FaPG1

3’ RACE

5’ RACE

T-PG

FaPG1

T-PG

FaPG1

T-PG

FaPG1

T-PG

FaPG1

3’ RACE

5’ RACE

3’ RACE

5’ RACE5’ RACE5’ RACE

Figura 7: esquema de la estrategia utilizada para amplificar los extremos 5’ y 3’ de FaPG1 y T-PG mediante la técnica de RACE. En la figura se indican ambos clones y los oligonucleótidos específicos de secuencia 5’ RACE (reverso) y 3’ RACE (directo) diseñados con el objetivo de diferenciar entre los extremos pertenecientes a FaPG1 y T-PG.


Capítulo I

81

masa molecular predicha de 40,9 kDa y un punto isoeléctrico de 8,13. Por

otra parte, la proteína putativa T-PG madura tendría una masa molecular de

18,2 kDa y un punto isoeléctrico de 8,16.

5.2.2.2. Obtención de sondas para poligalacturonasa

Se decidió estudiar la expresión poligalacturonasa durante la

maduración de cultivares de frutilla con firmezas contrastantes, para lo cual

primeramente se obtuvieron sondas para PG. Para tal fin, se diseñaron

oligonucleótidos específicos (5T-PG y 3T-PG) para amplificar una secuencia de

ADNc que flanqueara la zona correspondiente a la deleción de 85 pb,

observada en T-PG.

Figura 8: comparación de las proteínas predichas a partir de los clones spG, D15, FaPG1 y T-PG.

La caja indica la secuencia GLAI, la cual está predicha como ausente en sPG; la secuencia

subrayada en T-PG no guarda homología con poligalacturonasas. El sitio activo y los dos sitios de

N-glicosilación se indican en cajas con bordes punteados, mientras que la secuencia

correspondiente al péptido señal se indica con una caja de borde entrecortado. Los residuos de

cisteína conservados con otras PGs de plantas se señalan con puntos negros.

●

● ●

● ●

●

● ● ●

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● ●

● ●

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● ●

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● ● ●

Capítulo I

82

Ensayos de RT-PCR permitieron amplificar dos fragmentos de 375 y

460 pb a partir de frutos 100% R del cultivar Camarosa, los cuales se

purificaron, clonaron y secuenciaron, mostrando homología con T-PG y FaPG1,

respectivamente (figura 9). El fragmento más corto, el cual hibrida con ambos

clones, se usó como sonda en los experimentos de Northern-blot y RT-PCR

semicuantitativa.

5.2.2.3. Ensayos de Northern-blot

Se analizó el patrón de expresión de poligalacturonasa durante la

maduración de frutos de frutilla de tres cultivares con diferentes velocidades

de ablandamiento (figura 10). Los resultados de los ensayos de Northern-blot,

indican que la acumulación de ARNm de poligalacturonasa es diferente en

cada una de las tres variedades de frutilla estudiadas. En el caso del cultivar

Camarosa, el cual posee la mayor firmeza, se observó una ligera expresión

en el estadio 50% rojo, la cual aumenta marcadamente en el estadio 100%

rojo. En Pájaro, variedad de firmeza intermedia, la expresión comienza a partir

Figura 9: amplificación de FaPG1 y T-PG mediante PCR. Los oligonucleótidos usados, 5T-PG y 3T-

PG, flanquean la zona correspondiente a la deleción de 85 pb presente en T-PG. Calle 1: productos

de amplificación obtenidos utilizando la mezcla de RT-PCR obtenida de frutos 100% R del cultivar

Camarosa. Calles 2 y 3: controles positivos utilizando los clones parciales FaPG1 y T-PG

respectivamente como molde.

Capítulo I

83

del estadio blanco y luego aumenta gradualmente hasta el estadio 100% rojo.

Finalmente, en la variedad de menor firmeza, Toyonoka, se detecta una gran

expresión desde el estadio blanco, la cual se mantiene hasta el final de la

maduración.

5.2.2.4. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa

Debido a que las secuencias correspondientes a FaPG1 y T-PG son

prácticamente idénticas excepto por la deleción de 85 pb, la sonda utilizada

ARNr

PGs

Cam

aros

aTo

yona

kaPá

jaro PGs

PGs

ARNr

ARNr

VG B 25% R 50%R 100% R(A)

(B)

(C)

ARNr

PGs

Cam

aros

aTo

yona

kaPá

jaro PGs

PGs

ARNr

ARNr

VG B 25% R 50%R 100% R

ARNr

PGs

Cam

aros

aTo

yona

kaPá

jaro PGs

PGs

ARNr

ARNr

VG B 25% R 50%R 100% R

ARNr

PGs

Cam

aros

aTo

yona

kaPá

jaro PGs

PGs

ARNr

ARNr

VG B 25% R 50%R 100% R(A)

(B)

(C)

Figura 10: análisis mediante Northern-blot de la expresión poligalacturonasa durante la maduración

de frutillas de las variedades (A) Camarosa, (B) Pájaro y (C) Toyonoka. Para cada variedad se

utilizaron los estadios VG, B, 25% R, 50% R y 100% R. Para cada variedad, el panel inferior

muestra la tinción del gel con BrEt de las bandas de ARNr, las cuales se utilizaron como control

de carga.

Capítulo I

84

en el análisis de Northern-blot no permitió diferenciar la acumulación de cada

mensajero durante la maduración de frutilla. Esta dificultad se resolvió

mediante ensayos de RT-PCR semicuantitativa, utilizando oligonucleótidos que

flanquean la región correspondiente a la deleción (5T-PG y 3T-PG). Como

control interno se diseñaron cebadores (Rib5 y Rib3) que permitieron

amplificar una región de 200 pb del ARNr 18s de frutilla. Los ciclos utilizados

para determinar la zona de amplificación lineal fueron 15, 20, 25 y 30 para

ribosomales, y 18, 22, 26 y 30 para poligalacturonasas. Los productos de

amplificación obtenidos se transfirieron a una membrana de nailon y se

detectaron con las sondas para ribosomales y PGs, respectivamente. Las

intensidades de las bandas correspondientes a ARNr 18s y PGs de cada

estadio de maduración y variedad se obtuvieron empleando el programa

GELPRO Analyzer versión 3.0. Luego se graficó la intensidad de cada banda

versus el número de ciclos, lo cual permitió determinar la zona de

amplificación lineal.

Las intensidades de las bandas correspondientes a los productos de

amplificación de ARNr 18s del ciclo 25 para cada estadio y dentro de cada

variedad se compararon entre sí. Esto permitió corregir diferencias de carga y

obtener los volúmenes adecuados de mezcla de reacción de PCR

correspondientes a PGs (nº de ciclos= 26) a sembrar en un gel de agarosa

1,5% p/v, de modo de sembrar cantidades equivalentes de ARNr. Los

productos de amplificación sembrados en este gel se visualizaron empleando

la técnica de Southern blot, utilizando las sondas para ARNr y PGs,

respectivamente.

Se estudió la acumulación de ambos mensajeros en los estadios de

Capítulo I

85

maduración VG, B, 25% R, 50% R y 100% R de frutos de frutilla de las

variedades Camarosa y Toyonoka (figura 11). Vale la pena aclarar que se

decidió proseguir con el estudio de la expresión de PG en estos dos

cultivares debido a las grandes diferencias observadas en la tasa de

ablandamiento de sus frutos (Tabla I).

Ambos cultivares presentan patrones de expresión diferentes para

FaPG1 y T-PG. En Camarosa (figura 11A), la expresión de T-PG se

incrementó desde el estadio B hasta el 50% R, y disminuyó ligeramente en el

100% R. Un patrón similar se detectó para FaPG1; sin embargo, es de

destacar que la expresión de T-PG fue mayor a la de FaPG1 en todos los

estadios de maduración analizados en este cultivar. Por otro lado, en el

cultivar Toyonoka la cantidad de ARNm de FaPG1 fue considerablemente

mayor a la de T-PG durante la maduración de los frutos (figura 11B). La

expresión de FaPG1 fue baja en el estadio VG, se incrementó en el B y se

mantuvo a niveles elevados hasta el final de la maduración. Con respecto a

T-PG, su expresión fue muy baja en todos los estadios analizados de este

cultivar.

Capítulo I

86

5.2.3. Acumulación de la proteína FaPG1 durante la maduración de frutilla

La sobre-expresión de un fragmento de FaPG1 en E. coli permitió

obtener la proteína recombinante pura, la cual se utilizó en la producción de

suero anti-poligalacturonasa en conejo.

En la figura 12 se observa la curva de inducción de FaPG1. Asimismo,

en las figuras 13A y 13B se observa la purificación de las proteínas

recombinantes en forma desnaturalizada y nativa, respectivamente.

Figura 11: análisis de la expresión de FaPG1 y T-PG mediante RT-PCR semicuantitativa en

dos cultivares de frutilla con firmezas contrastantes: A) Camarosa (cultivar firme), B)

Toyonoka (cultivar blando). Se utilizaron los siguientes estadios de maduración: verde

grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R) y 100% rojo (100% R).

FaPG1

Toyo

naka

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)

T-PG

ARNr 18S

FaPG1

Toyo

naka

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)

T-PG

ARNr 18S

FaPG1

Toyo

naka

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)

T-PGFaPG1

Toyo

naka

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)To

yona

kaARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)To

yona

kaARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

ARNr 18S

FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)FaPG1

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A)

Cam

aros

a

VG B 25% R 50% R 100% R(A) VG B 25% R 50% R 100% RVG B 25% R 50% R 100% R(A)

(B)

T-PG

ARNr 18SARNr 18S

Capítulo I

87

Por otra parte, para verificar que el fragmento clonado codifica para

PG, se midió actividad poligalacturonasa en una fracción de la enzima

Figura 12: curva de inducción para la sobre-expresión de la proteína recombinante FaPG1 (34,5

KDa). La calle MM corresponde a los marcadores de masa molecular. Las calles restantes

corresponden a los distintos tiempos de inducción. El gel fue teñido con Coomasie-Blue R250.

MM 0 1 2 4 6 12 (h)

FaPG1

66

30

45

MM 0 1 2 4 6 12 (h)

FaPG1

66

30

45

MM 0 1 2 4 6 12 (h)

FaPG1

66

30

45FaPG1

66

30

45

66

30

45

66

30

45

Figura 13: purificación de la proteína recombinante FaPG1 (34,5 KDa) en condiciones

desnaturalizantes (A) y nativas (B), utilizando un gradiente de pH y de imidazol, respectivamente.

Línea 1: marcadores de masa molecular. Línea 2: pellet bacteriano. Línea 3 a 10: fracciones

recolectadas de la columna de afinidad utilizando diferentes condiciones de elución. Los geles se

tiñeron con el colorante Coomasie-Blue R250.

66

45

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

66

45

30

(A)

(B)

FaPG1

FaPG1

66

45

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

66

45

30

(A)

(B)

FaPG1

FaPG1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

66

45

30

(A)

(B)

FaPG1

FaPG1

Capítulo I

88

recombinante purificada mediante columna de afinidad utilizando un gradiente

de imidazol (Tabla II). Cabe señalar que el fragmento de FaPG1 recombinante

posee los residuos de aminoácidos del sitio activo característico de PGs

(GHG). En la tabla II se compara la actividad específica detectada para el

fragmento recombinante con un extracto de Toyonoka 100% R.

El anticuerpo producido contra FaPG1 se purificó del antisuero y se

utilizó en ensayos de Western-blot para detectar FaPG1 en extractos de

proteínas totales de los estadios VG, B, 25% R, 50% R y 100% R de frutos

de los cultivares Camarosa y Toyonoka. La concentración de proteínas totales

en los extractos se obtuvo mediante el método de Lowry (Potty, 1969), de

manera tal de sembrar la misma cantidad de proteínas totales en cada calle

(figura 14).

Fuente Enzimática Actividad PG específica (μmol AG h -1 mg -1)

Toyonoka 100% R

Fragmento FaPG1 recombinante

0,0584 ± 0,0081

0,0132 ± 0,0044

Fuente Enzimática Actividad PG específica (μmol AG h -1 mg -1)

Toyonoka 100% R

Fragmento FaPG1 recombinante

0,0584 ± 0,0081

0,0132 ± 0,0044

Tabla II: actividad específica PG en extractos de enzimas de pared obtenidos a partir de frutos

100% R de Toyonoka y del fragmento recombinante FaPG1 purificado.

Capítulo I

89

Teniendo en cuenta la secuencia de ADNc de FaPG1, la masa

molecular predicha para la proteína madura fue de 40,9 kDa. Sin embargo, el

ensayo de Western-blot permitió visualizar la presencia de dos bandas

inmunoreactivas, de masas moleculares estimadas en 45 y 50 kDa en ambos

cultivares (figura 15). En Camarosa, no se detectó la proteína FaPG1 en los

estadios VG y B, mientras que la expresión fue muy baja en el estadio 25%

R y se incrementó en los estadios 50% R y 100% R (figura 15A). Por el

contrario, en Toyonoka, la proteína FaPG1 se detectó claramente en el estadio

B y se observó una acumulación progresiva durante la maduración del fruto

(figura 15B).

Por otro lado, para determinar si la diferencia de tamaño entre las dos

bandas inmunoreactivas detectadas por Western-blot se debía a una

glicosilación diferencial de un único polipéptido, se llevó a cabo un ensayo de

deglicosilación enzimática. Este experimento permitió la detección de una única

VG B 25%R 50% R 100% R

ToyonokaCamarosa(A) (B)

VG B 25%R 50% R 100% RVG B 25%R 50% R 100% R

ToyonokaCamarosa(A) (B)

VG B 25%R 50% R 100% RVG B 25%R 50% R 100% R

ToyonokaCamarosa(A) (B) ToyonokaToyonokaCamarosa(A) (B)Camarosa(A) (B)

VG B 25%R 50% R 100% R

Figura 14: extractos proteicos de frutos de los cultivares Camarosa (A) y Toyonoka (B). En cada

caso se sembraron 20 µg de proteínas totales de los estadios VG, B, 25% R, 50% R y 100% R.

El gel fue teñido con el colorante Coomasie-Blue R250.

Capítulo I

90

banda inmunoreactiva con una masa molecular aparente de 41 kDa (figura

15C). Este tamaño se encuentra en concordancia con los 40,9 kDa deducidos

a partir de la secuencia nucleotídica para la proteína madura deglicosilada.

5.2.4. Análisis filogenético

El análisis filogenético de las secuencias proteicas de poligalacturonasas

ha permitido clasificarlas en tres grandes grupos o clados (A, B, y C)

(Hadfield y Bennett, 1998). Al comienzo de la realización de esta Tesis,

existían resultados controversiales acerca de la clasificación de sPG de frutilla.

Figura 15: detección de FaPG1 durante la maduración de frutos de frutilla mediante ensayos de

Western-blot. Los extractos proteicos se prepararon a partir de frutos VG, B, 25% R, 50% R y

100% R de los cultivares Camarosa (A) y Toyonoka (B). Un anticuerpo purificado, preparado a

partir de un fragmento de la proteína FaPG1, se utilizó como sonda en el análisis. Deglicosilación

enzimática e inmunodetección (C). Calles 1 y 2: 20 µg de extractos proteicos extraídos a partir de

frutos 100% R de Camarosa y Toyonoka respectivamente. Calle 3: deglicosilación de 20 µg de

proteínas extraídas a partir de frutos 100% R del cultivar Toyonoka. La posición del marcador de

masa molecular de 45 kDa se incluye como referencia.

Capítulo I

91

Redondo-Nevado y col. (2001) clasificaron a la proteína spG deducida como

perteneciente al Clado A de poligalacturonasas; mientras que Salentijn y col.

(2003) clasificaron a sPG (D15), como una PG perteneciente al Clado C.

Durante la realización de nuestro trabajo, reportamos la obtención del clon

completo de FaPG1, cuya secuencia es muy similar a spG y D15. Con el

objetivo de esclarecer la clasificación de FaPG1 (spG), la secuencia predicha

de residuos de aminoácidos de FaPG1, junto con la de otras 26 secuencias

de PGs de angiospermas y una de gimnosperma, fueron alineadas utilizando

el software CLUSTAL W versión 1.8 (Thompson y col., 1994). Un alineamiento

editado para representar la porción informativa de las secuencias, fue usado

para construir un árbol filogenético usando el método de la Máxima

Parsinomia, empleando el cedro como grupo externo (figura 16). La

confiabilidad estadística del árbol fue apoyada por un análisis de re-muestreo

(bootstrap) con 1000 réplicas. El resultado obtenido indicó que las secuencias

de 27 PGs usadas en el análisis se distribuyen en los tres clados

característicos de PG (A, B, C). El árbol filogenético ubicó a FaPG1 (spG) en

el Clado C, el cual incluye a los genes que se expresan en polen y que

codifican exo-poligalacturonasas. De este modo, este resultado concuerda con

la clasificación de spG propuesta por Salentijn y col. (2003).

Capítulo I

92

cedro

palta2

Gen-durazno

Tabaco

AlgodónAlfalfa

Clado B

Clado C

Clado A

cedro

palta2

Gen-durazno

Tabaco

AlgodónAlfalfa

Clado B

Clado C

Clado A

cedro

palta2

Gen-durazno

Tabaco

AlgodónAlfalfa

Clado B

Clado C

Clado A

cedro

palta2

Gen-durazno

Tabaco

AlgodónAlfalfa

Clado B

Clado C

Clado A

Figura 16: árbol filogenético inferido de los alineamientos de poligalacturonasas de plantas. El

árbol consenso se obtuvo mediante el método de Máxima Parsinomia (MP). Se realizó un análisis

de bootstrap de 1000 réplicas, y los porcentajes de los valores de bootstraps se indican en el

árbol.

Capítulo I

93

5.3 Discusión

La pérdida de firmeza de los frutos carnosos está asociada a la

solubilización y depolimerización de los polisacáridos de la pared celular (Rose

y col., 1998; Brummell y Harpster, 2001, Brummell y col., 2004). En el caso

particular de frutilla, la cantidad total de pared celular disminuye durante la

maduración, sin embargo no se ha encontrado una correlación clara entre el

contenido de pared celular y la velocidad de ablandamiento de cultivares con

firmeza contrastante (Rosli y col., 2004). En ese trabajo se reportó que frutos

de los cultivares Camarosa, Pájaro y Toyonoka poseen el mismo contenido de

pared celular en el estadio 100% R, lo cual indicaría que otros factores,

además de la cantidad de pared celular, deberían ser considerados al tratar

de comprender las diferencias de textura observadas entre cultivares. Rosli y

col. (2004), sugieren que el ablandamiento de frutilla podría estar asociado a

una disminución de las hemicelulosas hacia el final del desarrollo y el

comienzo de la maduración, y a la solubilización y depolimerización de

pectinas al final de la maduración. Más aún, los autores encontraron una

depolimerización significativa de pectinas en el cultivar más blando (Toyonoka)

mientras que no se detectó depolimerización de esta fracción en Camarosa.

El incremento en la actividad PG y su correspondiente expresión génica

durante la maduración fue reportado en diferentes frutos (DellaPenna y col.,

1986; Hadfield y col., 1998; Hadfield y Bennett, 1998; Asif y Nath, 2005). Sin

embargo, la presencia de actividad poligalacturonasa en frutilla fue

controversial durante mucho tiempo. Huber (1984) encontró un incremento en

la solubilización de poliurónidos y una depolimerización de pectinas limitada

Capítulo I

94

durante la maduración del cultivar Dover, si bien no detectó actividad PG. Sin

embargo, Nogata y col. (1993) detectaron una baja actividad PG en frutos del

cultivar Toyonoka, y describieron la presencia de tres isoenzimas. Estos

resultados contrastantes podrían deberse a la baja sensibilidad de las técnicas

utilizadas para la detección de actividad PG, y a la diferente actividad

poligalacturonasa presente en los cultivares utilizados en ambos trabajos.

En la presente tesis, la combinación de los cultivares analizados con el

método empleado para la determinación de la actividad poligalacturonasa,

permitió detectar actividad PG en todos los cultivares y estadios de

maduración analizados. En los estadios VG y B, la actividad PG fue baja en

todos los cultivares; sin embargo, en el estadio 50% R los niveles de

actividad PG en frutos de las variedades Pájaro y Toyonoka duplicaron al

detectado en Camarosa. Para los tres cultivares, la mayor actividad enzimática

se observó hacia el final de la maduración, siendo la actividad PG 1,8 veces

mayor en Toyonoka respecto al cultivar más firme.

De acuerdo a estos resultados, una mayor velocidad de ablandamiento

se correlaciona con una mayor actividad PG durante la maduración. Asimismo,

la mayor actividad poligalacturonasa detectada en el cultivar más blando,

guarda relación con el mayor nivel de depolimerización de pectinas observado

durante la maduración de Toyonoka (Rosli y col. 2004).

Una situación similar se describió en peras y duraznos. En el primer

caso, cultivares de pera con textura poco firme presentaron una mayor

depolimerización de pectinas y actividad PG con respecto a cultivares más

firmes (Hiwasa y col., 2004). En duraznos, variedades blandas (melting)

mostraron un incremento en la actividad PG durante la maduración, mientras

Capítulo I

95

que no se detectó actividad poligalacturonasa en cultivares de textura firme

(non-melting, Pressey y Avants, 1978).

Por otro lado, en el presente trabajo se analizó además la expresión de

genes de poligalacturonasa en tres variedades de frutilla con diferentes grados

de firmeza, utilizando para ello una sonda homóloga a spG (Redondo-Nevado

y col., 2001). En todas las variedades analizadas se observó un aumento de

la expresión génica durante la maduración, resultados que difieren de los

obtenidos por Redondo-Nevado y col. (2001) en el cultivar Chandler. En dicho

trabajo, los autores informaron que spG codifica una endo-PG específica de

fruto que sólo se expresa en el estadio de maduración blanco y sugieren que

la proteína spG no estaría involucrada en el metabolismo de degradación de

pectinas, sino en la producción de oligosacarinas, moléculas involucradas en la

inducción de la maduración (Dumville y Fry, 2000). Más recientemente,

Salentijn y col. (2003) clonaron dos genes de poligalacturonasa (D15 y B4,

siendo D15 homólogo a spG). Sin embargo, los resultados observados difieren

sustancialmente de los reportados previamente por Redondo-Nevado y col.

(2001), ya que los autores detectaron expresión de D15 en el estadio 100% R

de tres cultivares con diferente textura. Es importante destacar que la mayor

expresión de D15 se observó en frutos maduros del cultivar más blando

analizado (Gorella). Con respecto a B4, los autores hallaron que su expresión

también aumentaba en el cultivar más blando. Los autores reportaron que la

secuencia de residuos de aminoácidos deducida a partir del ADNc de B4

guarda homología con PGs de Arabidopsis thaliana y con PGs microbianas,

sin embargo el sitio activo de la proteína putativa difiere de aquel presente en

las poligalacturonasas conocidas (Salentijn y col., 2003).

Capítulo I

96

Los ensayos de Northern-blot realizados durante el presente trabajo

indican que la expresión de PGs comienza en el estadio blanco tanto en la

variedad de firmeza baja como en la de firmeza intermedia, Toyonoka y

Pájaro respectivamente. Sin embargo, en Toyonoka el nivel de expresión es

elevado desde el estadio blanco hasta el 100% rojo, a diferencia de Pájaro

donde la expresión se incrementa gradualmente durante la maduración. En la

variedad de firmeza elevada, Camarosa, se observa expresión a partir del

estadio 50% rojo y la misma aumenta marcadamente en el estadio 100% rojo.

Se describió que estas mismas variedades de frutilla presentan diferencias en

el grado de depolimerización de las diferentes fracciones de pectinas durante

la maduración (Rosli y col., 2004). Camarosa prácticamente no presenta

disminución en las masas moleculares de pectinas durante la maduración,

mientras que en Toyonoka se produce una importante depolimerización de

estos compuestos, y en Pájaro se observa un comportamiento intermedio

(Rosli y col., 2004). Nuestros resultados sugieren que tanto la expresión de

genes de poligalacturonasa como la actividad total de esta enzima podrían

estar relacionadas con las diferencias de firmeza observadas entre distintos

cultivares de frutilla. Es de destacar que los frutos de cultivares con mayor

tasa de ablandamiento (Toyonoka y Pájaro) presentan un aumento de la

actividad PG más temprano que los frutos del cultivar Camarosa.

Los clones FaPG1 y T-PG son idénticos excepto por una deleción de

85 pb en T-PG. Esta deleción causaría un corrimiento en el marco de lectura

y la aparición de un codón de terminación 105 pb después de la deleción, el

cual generaría una proteína más corta. La proteína T-PG predicha carecería

del sitio activo para PGs y de los sitios de N-glicosilación (patrones PS00502

Capítulo I

97

y PS00001 de la base de datos Prosite http://www.expasy.org/prosite,

respectivamente) así como de algunas secuencias consenso para PGs de

plantas (Torki y col., 2000). De este modo, los datos de secuencia permiten

predecir que T-PG codificaría para una proteína carente de la actividad

enzimática de poligalacturonasa. Dado que FaPG1 y T-PG son casi idénticas

excepto por la deleción de 85 pb, las sondas utilizadas en el análisis de

Northern-blot no permitieron diferenciar la acumulación de ambos transcriptos.

Por esta razón, se realizó un ensayo de RT-PCR semicuantitativa con

oligonucleótidos flanqueando la zona de la deleción, lo cual permitió detectar

la expresión de ambos clones durante la maduración de frutilla. Mediante el

ensayo de RT-PCR semicuantitativa se observó un patrón de expresión

diferente para FaPG1 y T-PG en los cultivares Toyonoka y Camarosa. Es

interesante señalar que Camarosa mostró una mayor acumulación de T-PG en

relación con FaPG1 en todos los estadios de maduración analizados. Una

situación similar se observó durante la maduración del cultivar Selva, el cual

posee frutos aun más firmes que los del cultivar Camarosa (datos no

mostrados). Por otro lado, en Toyonoka la expresión de FaPG1 fue mayor que

la de T-PG. Si se asume que el producto de FaPG1 es una PG activa

mientras que el de T-PG es una proteína que carece de actividad

poligalacturonasa, entonces la mayor acumulación del ARNm de FaPG1 en el

cultivar más blando se correlacionaría con una mayor actividad PG. Por el

contrario, Camarosa mostró una mayor acumulación del transcripto T-PG, el

cual produciría una proteína truncada sin actividad poligalacturonasa, hecho

que explicaría la menor actividad PG observada en frutos de este cultivar.

Cabe destacar que en frutos del cultivar Selva, la actividad PG detectada


Capítulo I

98

durante la maduración fue considerablemente menor a la observada en

cultivares de frutos más blandos (datos no mostrados).

De acuerdo a nuestro conocimiento, este es el primer reporte de la

acumulación de un transcripto en frutos que codificaría para una PG putativa

sin actividad enzimática. Sin embargo, una situación similar se encontró para

el caso de β-endo-mananasas de tomate. En la mayoría de los cultivares de

tomate, se produce un incremento en la actividad enzimática durante la

maduración. Sin embargo, el cultivar Walter no exhibe actividad β-endo-

mananasa, si bien se observó que el gen correspondiente (LeMAN4) se

transcribe en el fruto y que la proteína codificada por el mismo se localiza en

la pared celular (Banik y col. 2001). En el cultivar Walter la secuencia de

residuos de nucléotidos correspondiente a LeMAN4 presenta una deleción de

dos residuos nucleotídicos, la cual comienza en la posición 1.209 del gen y

provoca un corrimiento en el marco abierto de lectura, dando lugar a la

producción de una proteína truncada en el extremo carboxilo (Bourgault y

Bewley, 2002).

En tomate, tres isoenzimas son las responsables de la actividad PG

durante la maduración del fruto: PG2A (45 kDa), PG2B (46 kDa) y PG1 (100

kDa, un heterodímero de PG2A más la subunidad proteica β) (Brady y col.,

1983). Las isoenzimas PG2A y PG2B son producto de diferentes

modificaciones post-traduccionales de una única cadena polipeptídica

(DellaPenna y Bennett, 1988). Los autores reportaron que cuando la proteína

PG es purificada, dos isoenzimas (PG2A y PG2B) son detectadas mediante

SDS-PAGE. Cuando se deglicosiló químicamente la mezcla de estas dos

proteínas, los autores detectaron un único polipéptido de 42 kDa, en

Capítulo I

99

concordancia con los 41,8 kDa predichos para la secuencia completa del clon

de PG (DellaPenna y Bennett, 1988). En el caso de frutilla, la masa molecular

predicha para la proteína FaPG1 madura fue de 40,9 kDa. Sin embargo,

mediante ensayos de Western-blot, se visualizaron tanto en Camarosa como

en Toyonoka, dos bandas inmunoreactivas de masa molecular estimadas en

45 y 50 kDa. Cuando se deglicosilaron enzimáticamente extractos de frutos de

Toyonoka, se detectó una banda de masa molecular estimada en 41 kDa

mediante Western-blot. De este modo, es probable que una situación similar a

la de tomate esté ocurriendo en frutilla con la proteína FaPG1, donde este

polipéptido podría estar sufriendo una glicosilación diferencial luego de la

traducción, dando lugar a las dos bandas inmunoreactivas detectadas. De

acuerdo a nuestro conocimiento, este es el primer reporte de la

inmunodetección de poligalacturonasa durante la maduración de frutilla. Los

patrones obtenidos de la acumulación proteica están de acuerdo con aquellos

correspondientes a la expresión génica de PGs y a la variación en la

actividad poligalacturonasa total durante la maduración de frutos de Camarosa

y Toyonoka. Los ensayos de Western-blot mostraron que en Toyonoka, el

cultivar más blando, la acumulación de FaPG1 comenzó en el estadio blanco

y se mantuvo elevada hasta el final de la maduración, mientras que en

Camarosa la cantidad de FaPG1 fue muy baja en el estadio 25% R y se

incrementó en los estadios 50% R y 100% R.

Capítulo I

100

5.4. Conclusiones

• La actividad poligalacturonasa aumenta durante la maduración de

cultivares de frutilla con firmezas contrastantes. La actividad mayor, y

más temprana, se observó en cultivares de firmeza baja e intermedia

(Toyonoka y Pájaro, respectivamente).

• La expresión PG aumenta durante la maduración, detectándose una

acumulación más temprana de mensajeros en los cultivares de frutos

más blandos.

• Durante la maduración del cultivar más firme (Camarosa), se acumula

preferentemente un mensajero (T-PG) que codificaría una proteína sin

actividad poligalacturonasa. Por otro lado, en el cultivar más blando

(Toyonoka) se acumula preferentemente un mensajero (FaPG1) que

codifica una proteína con actividad PG.

• La acumulación de la proteína FaPG1 aumenta durante la maduración

de Camarosa y Toyonoka, observándose un patrón similar al detectado

mediante los ensayos de Northern-blot.

• El polipéptido FaPG1 sufriría modificaciones postraduccionales, dando

lugar a dos productos glicosilados diferencialmente.

• El análisis filogenético indica que FaPG1 (spG) es una

exopoligalacturonasa, perteneciente al clado C.

Capítulo II

101

6. Capítulo II. Análisis del posible fenómeno de splicing alternativo en el gen FaPG1

6.1. Introducción

6.1.1. Corte y empalme del ARNm precursor (pre ARNm)

La maduración de los ARN mensajeros de células eucariotas involucra

una serie de modificaciones del transcripto primario o pre ARNm (Sisodia y

col., 1987). Esto incluye la adición de un nucleótido de guanidina modificado

(7-metilguanosina trifosfato) en el extremo 5´ del pre ARNm; el clivaje y

posterior poliadenilación en el extremo 3´ (Sisodia y col., 1987); y el corte y

empalme (splicing) del ARNm precursor. Durante el proceso de splicing se

produce la remoción de los intrones presentes en los transcriptos primarios, y

los exones son ligados para producir ARN mensajeros maduros (Lorkovic y

col., 2000).

El splicing del pre ARNm constituye un paso fundamental en la

regulación de la expresión génica y, en líneas generales, el mecanismo de

escisión de intrones es similar en todos los organismos eucariotas. El

fenómeno de splicing es mediado por el “spliceosoma”, una compleja

maquinaria macromolecular formada por cerca de 300 proteínas, entre las que

se destacan partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNPs),

proteínas ricas en serina y arginina (SRs), ribonucleoproteínas heterogéneas

nucleares (hnRNPs), proteínas U2AF, ARN helicasas, etc. (Jurica y Moore,

2003). Si bien esta maquinaria proteica está muy bien caracterizada en

animales pluricelulares y levaduras, hasta el momento no se aislaron

Capítulo II

102

spliceosomas de plantas, y se desconoce su composición exacta (Reddy,

2007). Si embargo, la mayoría de los componentes del spliceosoma de

animales parece estar conservada dentro del reino vegetal (Wang y Brendel,

2004).

En líneas generales, el ensamblaje del spliceosoma comienza con el

reconocimiento y apareamiento de bases del pequeño ARN, presente en la

partícula snRNP U1, con el sitio 5´ de splicing (5´ ss o sitio dador) y el

reconocimiento de la región 3´ del intrón por el factor heterodimérico auxiliar

U2AF, generando de esta manera el llamado complejo E (Jurica y col., 2002).

El complejo A es generado por el reclutamiento de snRNP U2, a la región

donde se encuentra la adenosina del punto de ramificación, en una reacción

dependiente de ATP. Posteriormente se produce la formación de un complejo

entre las snRNPs U4 y U6, el cual se asocia con snRNP U5. El complejo

trimérico U4/U6/U5 se asocia, probablemente mediante interacciones proteína-

proteína, con el complejo previamente formado: pre ARNm/U1/U2, dando lugar

al complejo B, cuyo reordenamiento conduce a la formación del complejo C,

el cual cataliza dos reacciones de transesterificación (Jurica y col. 2002;

Sanford y Caceres, 2004). Luego de la segunda transesterificación, los exones

son ligados y se liberan del spliceosoma; el intrón en forma de lazo es

escindido y degradado, y las snRNPs y demás factores proteicos pueden

participar en un nuevo ciclo de splicing (Jurica y col. 2002; Stevens y col.,

2002; Sanford y Caceres, 2004). Todas estas últimas reacciones requieren del

uso de ATP. Es importante destacar que el proceso de splicing del pre-ARNm

es sumamente complejo, y que en él intervienen cientos de factores proteicos.

En la figura 17 se detallan los pasos más importantes mencionados.

Capítulo II

103

6.1.2. Propiedades de los intrones de plantas

La organización de los exones e intrones en los genes de plantas

superiores es similar a la de los vertebrados (Simpson y Filipowicz, 1996). La

mayor parte de los genes de plantas (80 a 85%) están interrumpidos por

intrones, y un único gen puede contener más de 40. Sin embargo, los

intrones de plantas son generalmente más cortos que los intrones de genes

Ensamblaje del spliceosomaEnsamblaje del spliceosomaEnsamblaje del spliceosoma

Figura 17: el ciclo del spliceosoma en mamíferos (el cual es similar en levaduras y

posiblemente en plantas). Se indica la formación de cada complejo y el empalme de los

exones con la consiguiente liberación del intrón en forma de lazo. U1, U2, U4, U5, U6:

partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNPs); SR: proteínas ricas en serina y

arginina, hnRNP: ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares; U2AF: factor auxiliar de U2.

Se indican solo algunas de las numerosas proteínas que llevan a cabo el proceso de

splicing del pre ARNm. Adaptado de Sanford y Cáceres (2004).

Capítulo II

104

de vertebrados. Aproximadamente 1/3 de los intrones de plantas tienen una

longitud menor a 150 pb, mientras que los intrones de vertebrados suelen

tener varias kilobases de longitud (Lorkovic y col., 2000). Las secuencias

consenso de los sitios de splicing 5´ y 3´ (5´ ss y 3´ ss respectivamente) en

plantas son similares a las de animales (figura 18). Como en otros

organismos, el splicing del pre ARNm de plantas involucra la formación del

spliceosoma, las dos reacciones de transesterificación y la formación de un

lazo en los intrones a ser escindidos. La región donde se encuentra el punto

de ramificación no posee una secuencia consenso tan definida como la de

levaduras y, al igual que en vertebrados, se encuentra aproximadamente a 30

pb del 3´ ss, si bien en plantas se conocen pocos ejemplos de puntos de

ramificación definidos experimentalmente (Lorkovic y col., 2000) (figura 18).

A pesar de las similitudes mencionadas, los requisitos para el

reconocimiento de los intrones en plantas difieren en algunos aspectos de

aquellos necesarios para otros eucariotas. Esto provoca que las células

vegetales generalmente no sean capaces de procesar pre-ARNm heterólogos

(Goodall y Filipowicz, 1989; Brown y Simpson, 1998). La diferencia más

importante es la presencia de secuencias ricas en UA- o en U- en los

intrones de plantas comparados con los de vertebrados y levaduras (figura

18). En promedio, los intrones de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas,

son aproximadamente 15% más ricos en secuencias UA- o U- que los exones

(Goodall y Filipowicz, 1989; Brown y Simpson, 1998). La distribución de estas

secuencias a lo largo de los intrones de plantas es requerida para la

selección de los sitios de splicing y el procesamiento eficiente del intrón.

Estas secuencias ricas en UA- o U- se distribuyen en distintas posiciones

Capítulo II

105

dentro de todo el intrón, a diferencia de lo que ocurre con las repeticiones de

polipirimidinas presentes en intrones de vertebrados, que están siempre

localizadas entre el punto de ramificación y el sitio de splicing 3’ (Lorkovic y

col., 2000) (figura 18). En plantas se ha hallado que los sitios 5´ ss y 3´ ss

preferentemente seleccionados para el splicing son aquellos que se encuentran

en regiones de transición entre secuencias ricas en UA y secuencias ricas en

GC (Lorkovic y col., 2000). Se reportó que la riqueza en secuencias UA

podría servir para minimizar la formación de estructuras secundarias dentro de

los intrones, ya que estructuras de tipo horquilla introducidas en intrones de

plantas tienen un efecto negativo en la eficiencia de splicing en plantas

dicotiledóneas (Liu y col., 1995). Sin embargo, se cree que el principal rol de

estas secuencias es actuar como blanco de reconocimiento de proteínas

hnRNPs, u otros factores proteicos relacionados, en las primeras etapas de

reconocimiento del intrón (Lambermon y col., 2000).

Capítulo II

106

Existen dos modelos que explican la selección de los sitios de splicing:

los esquemas de definición de intrón y de definición de exón (figura 19). El

esquema de definición de exón implica que los complejos proteicos, ya

posicionados en el 3´ ss de un intrón y el 5´ ss de otro intrón ubicado

corriente abajo, interaccionan a través del exón. Es importante mencionar que

en este caso los factores proteicos que forman el spliceosoma necesitan re-

arreglarse antes de catalizar las reacciones de splicing (Lorkovic y col., 2000;

Xiao-Qin y col., 2007). El modelo de definición de exón es adecuado para

genes con intrones de gran longitud (kilobases) y exones cortos (menos de

300 pb), como es el caso de los genes de vertebrados (Simpson y Filipowicz,

1996).

El esquema de definición de intrón implica que los factores proteicos

Plantas

Levaduras

Vertebrados

Plantas

Levaduras

Vertebrados

Plantas

Levaduras

Vertebrados

Plantas

Levaduras

Vertebrados

Figura 18: representación esquemática de señales de splicing importantes para intrones de

vertebrados, levaduras y plantas. Las cajas grises representan exones, mientras que las líneas

dobles representan intrones. Las cajas negras dentro de los exones representan potenciadores

exónicos del splicing (ESEs). Los números debajo de cada sitio consenso de splicing

representan el porcentaje de ocurrencia de la base indicada en cada posición en plantas

dicotiledóneas. Se indican las secuencias ricas en UA a lo largo del intrón de plantas y las

repeticiones de polipirimidinas (YYY) río arriba del 3´ ss en vertebrados. La adenosina del

punto de ramificación (BP) se marca con un asterisco. Adaptado de Lorkovic y col. (2000).

Capítulo II

107

involucrados en el splicing del intrón, se ubican en el 5´ ss y 3´ ss de un

intrón e interaccionan a través del mismo. Este modelo supone que los

complejos proteicos, ya posicionados en los 5´ ss y 3´ ss no necesitan re-

arreglarse antes de catalizar las reacciones de splicing (Simpson y Filipowicz,

1996). En plantas, se cree que el splicing ocurre mediante la utilización del

esquema de definición de intrón, ya que los intrones suelen ser de menos de

150 bp de longitud. Sin embargo, se reportó que ciertos intrones de plantas

podrían se procesados mediante el esquema de definición de exón (Brown y

col., 1996).

Definición de exón Definición de intrónDefinición de exón Definición de intrónDefinición de exón Definición de intrón

Figura 19: modelos de definición de exón y definición de intrón para el reconocimiento del pre-

ARNm. El modelo se basa en la información recopilada tanto del splicing en animales

pluricelulares como en plantas. Las interacciones entre snRNP U1 (en gris) con el 5´ ss y U2AF

(óvalo amarillo) con la región 3´ del intrón, son eventos tempranos en el reconocimiento de los

sitios de splicing, los cuales tienen lugar dentro del complejo E. Las proteínas hnRNPs (óvalos

verdes), junto con las proteínas SR (óvalos rojos) reconocen secuencias dentro del pre-ARNm, y

asisten tanto en la unión de snRNP U1 y U2AF al pre-ARNm, como en el establecimiento de

contactos a través del intrón o del exón entre los sitios de splicing. La proteína BBP/SF1 (en

azul), que interacciona con el punto de ramificación A, colabora en el posicionamiento de U2AF65

en las repeticiones de polipirimidinas (en vertebrados). Debido a que el gen que codifica una

proteína BBP/SF1 putativa se encuentra presente en Arabidopsis (número de acceso: AB023044),

es probable que esta interacción exista en plantas durante la formación del complejo E. Se indica

el factor U1-70K acompañando a snRNP U1 (óvalo gris). Adaptado de Xiao-Qin y col. (2007).

Capítulo II

108

6.1.3. Corte y empalme alternativo

El corte y empalme (splicing) alternativo del pre ARN mensajero es un

mecanismo importante en la regulación de la expresión génica de todos los

organismos eucariotas. Este proceso contribuye considerablemente a la

complejidad del proteoma, e incrementa el potencial codificante de un genoma

determinado. La inclusión o exclusión de la totalidad, o parte de exones o

intrones, puede conducir a que una proteína determinada vea alterados sus

dominios, su actividad, localización, sus interacciones con otras proteínas o

con su substrato, o sus modificaciones postraduccionales (Stamm, 2005). La

magnitud de los efectos del splicing alternativo va desde una pérdida completa

de función por parte del producto proteico, a la adquisición de una nueva

función (Stamm, 2005).

El splicing alternativo puede afectar, además, la estabilidad y el

recambio del ARNm ya que numerosos transcriptos procesados

alternativamente presentan codones de terminación prematuros. Dichos

transcriptos son substratos potenciales para el proceso de decaimiento sin

sentido del ARNm (non-sense mediated decay, NMD), el cual reconoce

codones de terminación prematuros y conduce a la degradación de los ARNm

que los contienen (Maquat, 2004). Sin embargo, cabe destacar que si bien

alrededor del 35% de los transcriptos que sufren splicing alternativo en

humanos contienen codones de terminación prematuros, el proceso de

decaimiento sin sentido del ARNm sólo regularía los niveles de una pequeña

proporción de transcriptos (Pan y col., 2006).

Los mecanismos de selección de los sitios de splicing alternativos

Capítulo II

109

involucran el reconocimiento de elementos en cis por parte de factores de

unión al ARN, de tal manera de promover o suprimir el uso de un sitio de

splicing en particular (Black, 2003). Estos elementos en cis son: las

repeticiones de polipirimidinas en animales, las secuencias ricas en AU en

plantas, y las secuencias denominadas potenciadores o supresores exónicos o

intrónicos (ESE: exonic splicing enhancers, ISE: intronic splicing enhancers,

ESS: exonic splicing suppressors, ISS: intronic splicing suppressors) (Simpson

y col., 2008). La selección del sitio de splicing es determinada en virtud de la

posición relativa del mismo respecto a sitios de splicing competidores, y/o a

través de interacciones o interferencias entre proteínas de unión al ARNm

(Simpson y col., 2008). Los principales factores involucrados en la regulación

de la selección de un sitio de splicing alternativo son las proteínas ricas en

serina y arginina (SRs), y las ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares

(hnRNPs) (Xiao-Qin y col, 2007, Simpson y col., 2008). Tanto las proteínas

SR como las hnRNPs son proteínas de unión al ARN y desempeñan roles

asociados con el splicing, el transporte y la traducción del ARNm.

Las proteínas SR usualmente contienen uno o más dominios de unión

al ARNm (dentro de los cuales se encuentran los denominados motivos de

reconocimiento del ARN, o RNA recognition motifs: RRM), y dominios ricos en

serina y arginina, los cuales pueden ser reversiblemente fosforilados y

permiten la interacción con otros factores proteicos. Las proteínas SR

generalmente reconocen secuencias ESE/ISE para promover la selección de

los sitios de splicing más cercanos al posicionamiento de las mismas (Xiao-

Qin y col., 2007).

Por otra parte, las proteínas hnRNP también contienen motivos de

Capítulo II

110

unión al ARN, pero generalmente interaccionan con secuencias en cis para

interferir e inhibir la selección de los sitios de splicing más cercanos. En

consecuencia, las proteínas SR y hnRNP frecuentemente actúan de forma

antagónica (Smith y Valcárcel, 2000). De esta manera, los niveles relativos de

transcriptos sometidos a splicing alternativo en un amplio rango de genes

reflejan las diferentes proporciones de factores proteicos interactuantes

(relación de concentración: SRs/hnRNPs) en las diferentes células, tejidos, o

condiciones fisiológicas. Esta situación es conocida como control combinatorio

(Smith y Valcárcel, 2000).

Durante un cierto tiempo se calculó que el número de genes de plantas

sometidos a splicing alternativo era de aproximadamente 7%, sin embargo, las

nuevas técnicas bioinformáticas estiman que el porcentaje de estos genes

puede superar el 35% (Wang y Brendel, 2004; Simpson y col., 2008). De esta

manera, si bien el splicing alternativo sería menos frecuente en plantas que

en animales, constituye un fenómeno significativo en el control de la expresión

génica, ya que afectaría a más de un tercio de los genes de plantas.

En la figura 20 se indican los modelos más comunes de splicing

alternativo, los cuales son: salteo de exón (exon skip), retención de intrón,

sitio dador alternativo (sitio 5’ ss alternativo), sitio aceptor alternativo (sitio 3´

ss alternativo), y exones mutuamente excluyentes. Asimismo, se indican los

porcentajes de ocurrencia de estos modelos en Arabidopsis, arroz, maíz y

humanos (Xiao-Qin y col., 2007, Barbazuk y col, 2008).

Capítulo II

111

El splicing alternativo de genes de plantas se encuentra involucrado en

una gran cantidad de funciones biológicas, tales como crecimiento y desarrollo,

respuestas a estrés biótico y abiótico, resistencia a enfermedades, tiempo de

floración, etc. (Dinesh-Kumar y Baker, 2000; Eckardt, 2002; Zhang y

Gassmann, 2007; Simpson y col., 2008). Sin embargo, el conocimiento actual

del posible rol de este fenómeno en el desarrollo y maduración de los frutos

es escaso, si bien existen algunos reportes de genes sometidos a splicing

alternativo en frutos tales como durazno, manzana, y papaya (Bassett y col.,

2002; Zhang y col., 2003; Hidalgo y col. 2005).

Figura 20: modelos básicos de eventos de splicing alternativo. Las cajas representas

exones, mientras que las líneas indican intrones. Se indican los porcentajes de

ocurrencia de cada tipo de evento en genes de Arabidopsis, arroz, maíz y humanos.

Adaptado de Barbazuk y col. (2008).

Capítulo II

112

En el presente capítulo, se detallan los ensayos realizados a fines de

determinar si el gen FaPG1 es sometido a corte y empalme alternativo, y si

dicho fenómeno se encuentra asociado con las diferencias en los niveles de

firmeza observadas entre cultivares de frutilla.

Capítulo II

113

6.2. Resultados

6.2.1. Comparación de las secuencias no traducidas 5´ y 3´ de FaPG1 y T-

PG

Tal como se mencionó en el Capítulo I de este trabajo, los extremos 5’

y 3´ de FaPG1 y T-PG se amplificaron utilizando la técnica de RACE a partir

de ARN total de frutos 100% R de la variedad Camarosa, y se utilizaron

oligonucleótidos específicos de secuencia que permitieran diferenciar ambos

clones. Se clonaron 94 pb del 5´ UTR de FaPG1 y 95 pb del 5´ UTR de T-

PG, y se observó un 100% de identidad entre estas secuencias (figura 21).

Para ambos clones, se obtuvieron los 3´ UTRs completos hasta las colas de

poli A (figura 21). Tanto FaPG1 como T-PG presentan un 100% de identidad

de secuencia en el extremo 3´ no traducido de FaPG1. Con respecto a T-PG,

dicho clon posee un codón de terminación prematuro en la posición 573

desde el codón de inicio, dando lugar a una secuencia 3´ no traducida de

638 pb, la cual guarda un 99,4% de identidad de secuencia con FaPG1.

Capítulo II

114

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1

Marco abierto de lectura (ORF)STOP

3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

3ÚTR (638 bp)

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

3ÚTR (638 bp)

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

3ÚTR (638 bp)

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

(B)

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

5ÚTR (95 pb)T-PG

5ÚTR (95 pb)T-PG

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

TERMINACIÓN

TERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTRTERMINACIÓN

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pbATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


3ÚTR (84 pb)

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1

Marco abierto de lectura (ORF)

ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1


ATG

ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1

Marco abierto de lectura (ORF)ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1

Marco abierto de lectura (ORF)ATG5ÚTR (94 pb)

FaPG1

Marco abierto de lectura (ORF)5ÚTR (94 pb)

FaPG1

5ÚTR (94 pb)

FaPG1

5ÚTR (94 pb)

FaPG1FaPG1


3ÚTR (84 pb)3ÚTR (84 pb)

GAP 85 pb

3ÚTR3ÚTR

TERMINACIÓN

3ÚTR (638 bp)

Figura 20: alineamiento de las secuencias completas de FaPG1 y T-PG. (A) Se indica en caja roja el alineamiento de residuos de nucleótidos correspondientes a la región 5´ no traducida clonada para FaPG1 y T-PG, y en caja verde (continua para FaPG1 y punteada y continua para T-PG) se indican las secuencias 3´ no traducidas. Las secuencias correspondientes a los codones de terminación para ambos clones se encuentran subrayadas en rojo. (B) Representación esquemática del alineamiento indicado en (A).

Deleción 85 pb

Capítulo II

115

Las secuencias prácticamente idénticas halladas en las regiones 5’ y 3’

UTR de los dos ADNc sugieren que FaPG1 y T-PG serían los productos del

procesamiento alternativo de un único gen.

Para analizar esta posibilidad, se recurrió al estudio bioinformático del

clon genómico de FaPG1 (spG) reportado por Redondo-Nevado y col. (2001).

Dicho clon posee 4 exones y 3 intrones (figura 22), y el procesamiento de

sus intrones daría lugar al mensajero FaPG1.

Se decidió entonces utilizar una herramienta bioinformática para predecir

las secuencias donantes (5´ ss) y aceptoras (3´ ss) presentes en el clon

genómico que permitirían la remoción de los intrones (CNR-ITB,

www.itb.cnr.it/sun/webgene). El análisis realizado permitió obtener dichas

secuencias, y el programa predijo además un sitio aceptor alternativo ubicado

85 pb desde el inicio del exón III de FaPG1. La utilización de este sitio

aceptor alternativo daría lugar al transcripto T-PG.

En la tabla III se indican los sitios dadores y aceptores predichos, los

cuales darían lugar a los mensajeros FaPG1 y T-PG.

http://www.itb.cnr.it/sun/webgene

Capítulo II

116

En la figura 22 se señala la organización del clon genómico FaPG1

(spG, Redondo-Nevado y col., 2001), el cual cuenta con cuatro exones y tres

intrones predichos. La longitud de los mismos es la siguiente: exón I, 153 pb;

intrón I, 79 pb; exón II, 312 pb; intrón II, 153 bp; exón III, 519 pb; intrón III,

171 pb; exón IV, 231 pb. La remoción de los intrones mediante la utilización

de los sitios D1/A1, D2/A2 y D3/A3, dará lugar al mensajero FaPG1, mientras

que la utilización de los sitios D1/A1, D2/A2´ y D3/A3, dará lugar al mensajero

T-PG.

Clon genómico: FaPG1 (spG, Redondo-Nevado y col., 2001)

Longitud: 2523 pb

Sitios Dadores (posición pb) Exón - Intrón Puntaje

Dador 1 (D1) 998 GAG GTAAAC 89

Dador 2 (D2) 1389 ATT GTAAGC 82

Dador 3 (D3) 2061 CAG GTAATC 88

Sitios Aceptores (posición pb) Intrón - Exón Puntaje

Aceptor 1 (A1) 1078 TGTACATAG CCTT 78

Aceptor 2 (A2) 1543 TATGTGCAG AATG 79

Aceptor 2´ alternativo (A2´) 1628 ATATTTTAG GGTG 76

Aceptor 3 (A3) 2233 TGCTCGAAG ATTC 72

Tabla III: sitios dadores y aceptores predichos para el procesamiento del clon genómico FaPG1 (spG, Redondo-Nevado y col., 2001). Se indica la posición y la secuencia de los mismos dentro de FaPG1.

Capítulo II

117

6.2.2. Acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG durante la maduración

de cultivares de frutilla con diferente velocidad de ablandamiento.

Como se mencionó en el Capítulo I, sección 5.2.2.4., se analizó la

acumulación de FaPG1 y T-PG durante la maduración de Camarosa y

Toyonoka mediante la técnica de RT-PCR semicuantitativa. Debido a que el

cultivar más firme presentó una acumulación mayor de T-PG, y en el cultivar

más blando se observó una mayor acumulación de FaPG1, se realizó una

cuantificación de la acumulación de ambos transcriptos durante la maduración

de los dos cultivares utilizando el programa GelPRO Analizer Versión 3.0. En

la figura 23 se muestran los resultados obtenidos por RT-PCR (A) y se indica

la relación entre las intensidades relativas de FaPG1/T-PG para Camarosa y

Toyonoka (B). En el caso de la maduración de Camarosa, la intensidad

relativa de FaPG1 fue aproximadamente cuatro veces menor a la de T-PG

ATATTTTAG GGTGTATGTGCAG AATG

D2

FaPG1E II E IIIE I E IV

E II E IIIE I E IV T-PG

A2Á2

ATT GTAAGC

I IIII III IE I E II E III E IV FaPG1(spG)85 pb


D2



A2Á2

ATT GTAAGC



D2



A2Á2

ATT GTAAGC


ATATTTTAG GGTGATATTTTAG GGTGTATGTGCAG AATG

D2



A2Á2

ATT GTAAGC


TATGTGCAG AATGTATGTGCAG AATG

D2



A2Á2

ATT GTAAGC


D2



A2Á2

ATT GTAAGC


FaPG1E II E IIIE I E IV FaPG1E II E IIIE I E IV FaPG1E II E IIIE I E IVE II E IIIE I E IVE II E IIIE I E IVE II E IIIE I E II E IIIE I E IV


A2Á2

ATT GTAAGC


E II E IIIE I E IV T-PGE II E IIIE I E IV T-PGE II E IIIE I E IVE II E IIIE I E IV T-PG

A2Á2

ATT GTAAGC


A2Á2

ATT GTAAGC

I IIII III IE I E II E III E IV FaPG1(spG)

A2Á2

ATT GTAAGC


A2Á2

ATT GTAAGC

I IIII III IE I E II E III E IV FaPG1(spG)ATT GTAAGC

I IIII III IE I E II E III E IV FaPG1(spG)ATT GTAAGCATT GTAAGC


I IIII III IE I E II E III E IVI IIII III IE I E II E III I IIII III IE I E II E III I IIII III IE I E II E IIII III IE I E II E IIII III IE I E II I III IE I E III IE I I IE IE I E II E III E IV FaPG1(spG)85 pb

Figura 22: organización del clon genómico FaPG1 (spG, Redondo-Nevado y col., 2001). En la

figura se señalan en cajas rojas los 4 exones (E I, E II, E III, E IV), y en líneas negras los 3

intrones (I I, I II, I III) predichos del gen. Se muestran además el sitio dador 2 (D2) y el sitio

aceptor 2 (A2), así como el sitio aceptor 2 alternativo (A2´), cuya utilización da lugar al

mensajero T-PG. El tamaño de las cajas y líneas no reflejan la longitud real de cada elemento.

Capítulo II

118

desde el estadio B al 100% R. En cambio, durante la maduración de

Toyonoka la acumulación de FaPG1 fue aproximadamente 10 veces mayor a

la de T-PG desde el estadio B hasta el final de la maduración. En el estadio

VG de Camarosa no se detectó expresión, mientras en Toyonoka la misma

fue muy baja. A partir del estadio B, la relación entre ambas variantes de

splicing se mantuvo a niveles similares dentro de cada cultivar. Sin embargo,

la proporción entre FaPG1 y T-PG es distninta en ambos cultivares,

observándose una acumulación preferencial de FaPG1 en el cultivar más

blando y de T-PG en el cultivar más firme.

Estadios maduración

VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

0

2

4

6

8

10


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG

Camarosa Toyonoka(A) (B)

ND Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

0

2

4

6

8

10


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG


ND


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

0

2

4

6

8

10


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG



VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

0

2

4

6

8

10


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG



VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

0

2

4

6

8

10


VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG



VG B 25% R 50% R 100% R

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG)

0

2

4

6

8

10

FaPG1

T-PG


FaPG1

T-PG

FaPG1

T-PG

Camarosa Toyonoka(A) (B)Camarosa Toyonoka(A) (B)Camarosa Toyonoka(A) (B)

ND Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

Inte

nsid

ad re

lativ

a (F

aPG

1/T-

PG

)

Figura 23: relación entre las intensidades relativas de FaPG1/T-PG durante la maduración de: (A) Camarosa, y (B) Toyonoka.

Capítulo II

119

6.2.3. Análisis del intrón II de FaPG1 en cultivares con niveles de firmeza

contrastantes

Con el objeto de continuar con el análisis del fenómeno de splicing

alternativo que sufre el gen FaPG1, se decidió analizar el intrón II y las

regiones flanqueantes en los exones II y III. Para ello se extrajo ADN

genómico de hojas jóvenes de plantas de Camarosa y Toyonoka. La

integridad del ADN genómico extraído se verificó sembrando los productos en

un gel de agarosa al 0,8% p/v (figura 24).

Posteriormente, se realizó la amplificación de la zona de interés

mediante PCR. Se utilizaron los oligonucleótidos específicos 5T-PG y 3T-PG,

los cuales hibridan en el exón II y, dentro del exón III, río abajo de las 85 pb

ausentes en T-PG. Esto permitió amplificar un fragmento de aproximadamente

610 bp que contenía parte de los exones II y III y el intrón II completo. En la

figura 25 se observan los productos de amplificación para Camarosa y

Toyonoka.

Cam Toy MM

1434 pb

1000 pb900 pb800 pb

Cam Toy MM

1434 pb

1000 pb900 pb800 pb

Cam Toy MM

1434 pb

1000 pb900 pb800 pb

1434 pb

1000 pb900 pb800 pb

Figura 24: verificación de la integridad del ADN genómico extraído de hojas jóvenes de

Camarosa (Cam) y Toyonoka (Toy). La calle MM indica los marcadores de masa molecular

utilizados.

Capítulo II

120

Los productos amplificados se purificaron, clonaron y enviaron a

secuenciar. El análisis de las secuencias obtenidas arrojó como resultado que

el intrón II de FaPG1 posee un elevado contenido de AT en ambos cultivares.

Sin embargo, al alinear las secuencias correspondientes de ambos cultivares,

se observó que el cultivar más firme, Camarosa, posee 11 repiticiones AT

más que Toyonoka, ubicadas a 27 pb del sitio aceptor 2 de FaPG1. Además,

el intrón II de Camarosa presentó 8 repeticiones AT más que Chandler

(cultivar utilizado por Redondo-Nevado y col., para obtener el clon genómico

completo) (figura 26).

MM Cam Toy

700 pb600 pb

MM Cam Toy

700 pb600 pb

MM Cam Toy

700 pb600 pb

MM Cam Toy

700 pb600 pb

Figura 25: productos de amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos 5T-PG y 3T-

PG sobre ADN genómico de Camarosa (Cam) y Toyonoka (Toy). La calle MM indica los

marcadores de masa molecular utilizados.

Capítulo II

121

GT A T CAGGT ACT GGAA CAT T T GAT GGT CA AGGA CAAA AT T CT T GGA AAGA CAACGACT GCAAT AAAA AT CCAAACT GT GG

10 20 30 40 50 60 70 80

GT A T CAGGT ACT GGAA CAT T T GAT GGT CA AGGA CAAA AT T CT T GGA AAGA CAACGACT GCAAT AAAA AT CCAAACT GT GG 1GT A T CAGGT ACT GGAA CAT T T GAT GGT CA AGGA CAAA AT T CT T GGA AAGA CAACGACT GCAAT AAAA AT CCAAACT GT GG 1GT A T CAGGT ACT GGAA CAT T T GAT GGT CA AGGA CAAA AT T CT T GGA AAGA CAACGACT GCAAT AAAA AT CCAAACT GT GG 1

AGGT CT A GCCA T T GT A AGCT AAT A T AGCCCT CT T CT CT GT T T T AT T T AT T T AT T T AT T T T T T GAT GA AT T GCAT T T CGT G

90 100 110 120 130 140 150 160

AGGT CT A GCCA T T GT A AGCT AAT A T AGCCCT CT T CT CT GT T T T AT T T AT T T AT T T AT T T T T T GAT GA AT T GCAT T T CGT G 81AGGT CT A GCCA T T GT A AGCT AAT A T AGCCCT CT T CT CT GT T T - AT T T AT T T AT T T AT T T T T T GAT GT AT T GCAT T T CGT G 81AGGT CT A GCCA T T GT A AGCT AAT A CAGCCCT CT T CT CT GT T T T AT T T AT T T AT T T AT T T T T T T AT GA AT T GCAT T T CGT G 81

CT A AT T T GT T T CAGGT AACCCT GA T T T ACAT T T T CAA GAT A T AT T GAT AT AT AT AT AT A T - - - - - - - - - - - - - - - - GT CG

170 180 190 200 210 220 230 240

CT A AT T T GT T T CAGGT AACCCT GA T T T ACAT T T T CAA GAT A T AT T GAT AT AT AT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - GT CT 161CT A AT T T GT T T CAGGT AACCCT GA T T T ACAT T T T CAA GAT A T AT T GAT AT AT AT AT AT A T - - - - - - - - - - - - - - - - GT CG 160CT A AT T T GT T T CAGGT AACCCT GA T T T ACAT T T T CAA GAT A T AT T GAT AT AT AT AT AT A T AT A T AT A T AT A T AT AT GT CG 161

T GCT GCT T T CT CAT T A T GT GCAGA AT GT GAGAT T CGA CAGA GT GAA AAAT T CAT T AGT A AGGGAT GT GACA T CACT T AAC

250 260 270 280 290 300 310 320

T GCT GCT T T CT CAT CA T GT GCAGA AT GT GAGAT T CGA CAAA GT GAA AAAT T CAT T AGT A AGGGAT GT GACA T CACT T AAC 219T GCT GCT T T CT CAT T A T GT GCAGA AT GT GAGAT T CGA CAGA GT GAA AAAT T CGT T AGT A AGGGAT GT GACA T CACT T AAC 224T GCT GCT T T CT CAT T A T GT GCAGA AT GT GAGAT T CGA CAGA GT GAA AAAT T CAT T AGT A AGGGAT GT GACA T CACT T AAC 241

AGCAAAA AT T T CCACT T CAA T AT T T T AGGGT GT GAACAT CT T ACAT T CCA ACAT GT CACCGT CAAAGCACCGGGAGAT AG

330 340 350 360 370 380 390 400

AGCAAAA AT T T CCACT T CAA T AT T T T AGGGT GT GAACAT CT T ACAT T CCA ACAT GT CACCGT CAAAGCACCGGGAGAT AG 299AGCAAAA AT T T CCACT T CAA T AT T T T AGGGT GT GAACAT CT T ACAT T CCA ACAT GT CAT CGT CAAAGCACCGGGAGAT AG 304AGCAAAA AT T T CCACT T CAA T AT T T T AGGGT GT GAACAT CT T ACAT T CCA ACAT GT CACCGT CAAAGCACCGGGAGAT AG 321

FaPG1 (Toy)spG (Ch)FaPG1(Cam)





D2

A2

A2´


10 20 30 40 50 60 70 80



90 100 110 120 130 140 150 160



170 180 190 200 210 220 230 240



250 260 270 280 290 300 310 320



330 340 350 360 370 380 390 400







D2

A2

A2´


10 20 30 40 50 60 70 80



90 100 110 120 130 140 150 160



170 180 190 200 210 220 230 240



250 260 270 280 290 300 310 320



330 340 350 360 370 380 390 400







D2

A2

A2´


10 20 30 40 50 60 70 80



90 100 110 120 130 140 150 160



170 180 190 200 210 220 230 240



250 260 270 280 290 300 310 320



330 340 350 360 370 380 390 400








10 20 30 40 50 60 70 80



90 100 110 120 130 140 150 160



170 180 190 200 210 220 230 240



250 260 270 280 290 300 310 320



330 340 350 360 370 380 390 400












D2

A2

A2´

Figura 26: alineamiento de secuencias parciales de FaPG1 genómico para los cultivares

Toyonoka, Chandler y Camarosa. En la figura se indican el sitio dador D2, el sitio aceptor A2, y

el sitio aceptor alternativo A2´. En caja verde se indica el intrón II, y en caja naranja las 85 pb

correspondientes a la deleción del transcripto T-PG. Toyonoka posee 3 repeticiones AT menos

que Chandler y 11 menos que Camarosa (secuencias subrayadas en rojo).

Capítulo II

122

6.3. Discusión

El splicing alternativo produce más de un ARNm a partir de un único

gen a través de la selección y utilización de sitios de splicing alternativos en

el pre-ARNm (Black, 2003). Este proceso está ampliamente distribuido entre

los organismos eucariotas, con más del 74% de los genes de humanos

conteniendo uno o más eventos de splicing alternativo (Modrek y Lee, 2002).

Este fenómeno se encuentra menos estudiado en plantas con respecto a

animales. Sin embargo, datos recientemente disponibles de la secuencia de

diferentes genomas vegetales, y colecciones cada vez mayores de secuencias

de ADN expresadas (expressed sequences tag, ESTs), están posibilitando un

análisis global del splicing alternativo en varias especies de plantas (Simpson

y col., 2008; Wang y col., 2008). De acuerdo a los datos obtenidos mediante

la utilización de genómica comparativa, en promedio más de un 20% de los

genes de plantas presentan uno o más eventos de splicing alternativo, y si

bien la mayoría de los mismos no se encuentran caracterizados

funcionalmente, existe evidencia que sugiere que el splicing alternativo

participa en funciones importantes en plantas (Simpson y col., 2008). Por

ejemplo, el uso de un 5´ ss alternativo en el pre-ARNm de la Rubisco

activasa, produce dos proteínas que difieren sólo en el extremo carboxilo.

Ambas isoformas pueden activar a la enzima Rubisco en Arabidopsis y

espinaca, pero sólo la proteína más larga es regulada por el ambiente rédox

de la célula (Werneke y col., 1989). Asimismo, se reportó que la presencia de

todas las variantes de splicing alternativo de ciertos genes de defensa es

necesaria para la resistencia completa contra el ataque por patógenos en

Capítulo II

123

plantas de tabaco (Dinesh-Kumar y Baker, 2000; Zhang y Gassmann, 2007).

Con respecto al rol fisiológico del splicing alternativo en el desarrollo y

maduración de frutos, se reportó la presencia de dos variantes de splicing del

gen de espermidina sintasa (SPDS) de manzana (Zhang y col., 2003). Los

autores reportaron que los transcriptos MdSPDS2a y MdSPDS2b, se acumulan

diferencialmente en hojas jóvenes y maduras, en tallos, y durante el desarrollo

y maduración del fruto de manzana.

Por otra parte, Bassett y col. (2002) clonaron y caracterizaron un

homólogo del receptor de etileno ETR1 en frutos maduros de durazno. Los

autores detectaron tres variantes de ARNm provenientes del splicing alternativo

del gen PpETR1. Los eventos de splicing alternativo detectados fueron la

utilización de un sitio de splicing 3´ alternativo en uno de los clones, y la

retención de un intrón en otro. Los autores no observaron grandes diferencias

en la acumulación de los distintos mensajeros durante la maduración de frutos

de distintos cultivares. Sin embargo, observaron un gran incremento en la

acumulación del transcripto que presenta retención de un intrón en frutos pre-

climatéricos pertenecientes a un cultivar que tiene una tasa de maduración

más lenta. Además, se observaron variaciones en la acumulación de los

distintos transcriptos en ensayos donde los frutos eran sometidos a daño,

sugiriendo que el splicing alternativo del gen PpETR1 podría estar involucrado

en cambios en la sensibilidad hacia el etileno en frutos dañados.

Hidalgo y col. (2005) reportaron la presencia de eventos de splicing

alternativo en un gen de ACC sintasa 1 de frutos maduros de papaya. Los

autores sugieren un posible rol del fenómeno de splicing alternativo en la

modulación de la expresión de genes relevantes para la maduración de los

Capítulo II

124

frutos.

Con respecto a poligalacturonasa de frutilla, en este trabajo de tesis se

reporta que el gen FaPG1 sufre un evento de splicing alternativo (elección de

un 3´ ss alternativo) que conduce a la formación de dos variantes de splicing

(FaPG1 y T-PG). La variante FaPG1 codifica una proteína funcional, cuya

acumulación fue evaluada durante la maduración de cultivares con firmezas

contrastantes (Camarosa y Toyonoka), observándose una acumulación más

temprana y mayor en el cultivar más blando (Capítulo I). Por otra parte, la

variante T-PG codificaría una proteína más corta que FaPG1, la cual carecería

del sitio catalítico y de los sitios de N-glicosilación predichos para PGs de

plantas. Es importante mencionar que el análisis de la acumulación de ambos

transcriptos durante la maduración de frutilla reveló un patrón diferencial para

cada variante en cultivares de frutilla con firmezas contrastantes. Se estimó

que durante la maduración de Camarosa, la acumulación del mensajero

FaPG1 es aproximadamente cuatro veces menor que la de T-PG. Por otra

parte, durante la maduración de Toyonoka se estimó que la acumulación de

FaPG1 fue aproximadamente 10 veces mayor a la de T-PG. Estos resultados

correlacionan directamente con la mayor actividad PG detectada en el cultivar

más blando, tal como se menciona en el Capítulo I.

El splicing alternativo de los ARNm precursores es un mecanismo

versátil de regulación de la expresión génica, el cual aumenta

considerablemente la complejidad proteómica de los organismos eucariotas. Su

modulación es lograda gracias a la interacción combinada de señales

reguladoras positivas y negativas presentes en el pre-ARNm. Dichas

secuencias son reconocidas por complejos proteicos constituidos por miembros

Capítulo II

125

de las familias de proteínas hnRNP y SR (Smith y Valcárcel, 2000).

Al analizar las secuencias de ADN genómico correspondientes al intrón

II y a los exones flanqueantes de FaPG1 en Camarosa y Toyonoka, se

observó que dicho intrón posee una gran cantidad de secuencias AT en toda

su extensión en ambos cultivares, las cuales darán origen a las

correspondientes secuencias AU en el pre-ARNm. Dicho rasgo es

característico de los intrones de plantas (Goodall y Filipowicz, 1989; Brown y

Simpson, 1998); sin embargo, en Camarosa se observó la presencia de 11

repeticiones AT más que en Toyonoka. Es posible que esta secuencia AT (AU

en los transcriptos) de 22 nucleótidos presente en Camarosa, sea reconocida

por proteínas hnRNP, las cuales interferirían en la promoción de la elección

del sitio aceptor 2 (A2) por parte de proteínas SR unidas a secuencias ESE

dentro del exón III. Esta situación favorecería la elección del sitio aceptor 2

alternativo (A2´), dando lugar a una mayor acumulación de la variante de

splicing T-PG con respecto a FaPG1 en frutos de Camarosa. Además de la

presencia del elemento en cis de 11 dinucleótidos AT en el intrón II, no debe

descartarse la posibilidad de que en frutos de Camarosa haya una relación de

concentraciones de elementos de acción en trans (proteínas hnRNP y SR)

diferente a la presente en frutos de Toyonoka.

Estudios recientes realizados en plantas de frutilla transgénicas

antisentido en el gen FaPG1, confirmaron un papel importante para

poligalacturonasa en el ablandamiento de frutos del cultivar Chandler (Quesada

y col., 2009). En ese trabajo se determinó que el ablandamiento postcosecha

de frutos antisentido en FaPG1, con expresión reducida de este gen, era

menor comparado con el ablandamiento de los frutos del tipo salvaje.

Capítulo II

126

Si se asume que PG desempeña un papel importante en el

ablandamiento de los frutos durante la maduración de frutilla, y en las

diferencias de firmeza observadas entre cultivares, es posible asignarle un rol

biológico al splicing alternativo observado en FaPG1. Un cultivar de frutos

firmes, Camarosa, acumula una mayor cantidad de un transcripto que

codificaría para un producto sin actividad PG, mientras que un cultivar de

frutos muy blandos, Toyonoka, acumula mayoritariamente una variante de

splicing que da lugar a una proteína con actividad poligalacturonasa.

Capítulo II

127

6.4. Conclusiones

• El gen FaPG1 es sometido a splicing alternativo, dando lugar a los

transcriptos maduros FaPG1 y T-PG.

• Frutos de cultivares con firmezas contrastantes presentan diferencias en

la acumulación de cada variante de splicing durante la maduración.

• Se detectó variabilidad en la secuencia de nucleótidos del gen FaPG1

entre los cultivares Camarosa y Toyonoka. La mayor acumulación de la

variante T-PG durante la maduración del cultivar más firme, podría ser

consecuencia de un mayor contenido de repeticiones AT en el intrón II

del gen FaPG1 repecto del cultivar menos firme.

Capítulo III

128

7. Capítulo III. Influencia de reguladores del crecimiento vegetal en la expresión poligalacturonasa de frutilla.

7.1. Introducción

La maduración de los frutos carnosos es un proceso caracterizado por

un número de eventos fisiológicos y bioquímicos que conducen a cambios en

el color, sabor, aroma y textura (Prasanna y col., 2007). A medida que los

frutos maduran, se produce un ablandamiento extensivo debido, en gran parte,

a la acción coordinada de diferentes proteínas sobre los componentes de la

pared celular (Brummell y Harpster, 2001). Los polisacáridos de la pared que

sufren las modificaciones más importantes durante la maduración son las

pectinas y las hemicelulosas. Las pectinas constituyen uno de los

componentes más importantes de la pared celular y la lámina media. Su

degradación por enzimas como las endo y exo poligalacturonasas, parece

tener un efecto en el ablandamiento de los tejidos durante o hacia el final de

la maduración en una gran variedad de frutos climatéricos (Hadfield y Bennett,

1998; Rose y col., 1998; Hiwasa y col., 2004; Callahan y col., 2004; Asif y

Nath, 2005).

Si bien las poligalacturonasas podrían tener un papel en la degradación

de la pared celular durante el ablandamiento de frutilla, no se conoce

demasiado acerca de la regulación hormonal de la expresión de PG y la

correspondiente síntesis de proteínas. Ha sido claramente documentado que

las auxinas retrasan la maduración de frutilla (Given y col., 1988b) y que la

expresión de muchos genes asociados con la maduración son regulados

negativamente por esta hormona (Manning, 1994; Aharoni y col., 2002). Sin

Capítulo III

129

embargo, no se dispone aún de un conocimiento detallado acerca del modo

de regulación de la maduración en estos frutos, especialmente de la existencia

de una hormona vegetal que ejerza una regulación positiva. En particular, no

está claramente establecido si el etileno ejerce alguna influencia sobre la

maduración de este fruto no-climatérico.

En el presente capítulo, se investigó el efecto de tratamientos exógenos

con auxinas, giberelinas, ABA, NO y etileno sobre la expresión de PG, la

acumulación de la proteína FaPG1 y la actividad poligalacturonasa total en

frutos blancos pertenecientes al cultivar Camarosa. Finalmente, se analizó el

efecto del etileno en otros aspectos de la maduración no relacionados con el

ablandamiento, tales como la acumulación de pigmentos, azúcares,

compuestos fenólicos y actividad PAL.

Capítulo III

130

7.2. Resultados

7.2.1. Tratamiento con auxinas y giberelinas

La influencia de auxinas y giberelinas en la expresión y síntesis de PG

se analizó mediante la aplicación de ácido naftalén acético (NAA) y ácido

giberélico (GA3) a frutos blancos del cultivar Camarosa. El efecto de estas

hormonas en la maduración del fruto se evaluó midiendo la cantidad de

antocianinas producidas. Ambos tratamientos retrasaron la acumulación de

antocianinas después de 72 h de incubación a 22 °C (figura 27 A). El efecto

inhibitorio de las auxinas fue intenso y se observó un contenido tres veces

menor de estos pigmentos en frutos tratados con respecto a los controles. En

el caso del tratamiento con giberelinas, el retraso en la acumulación de

antocianinas fue menos evidente. El efecto de NAA y GA3 en la expresión de

PG se analizó mediante Northern-blot (figura 27 B). La acumulación de ARNm

de PGs se redujo considerablemente en los frutos tratados con NAA

comparados con los controles, mientras la expresión de PG se redujo

ligeramente por el tratamiento con GA3.

Para el análisis de la acumulación de FaPG1 y T-PG, se realizaron

ensayos de RT-PCR semicuantitativa. Los resultados de la figura 27 C indican

un patrón de expresión diferente para ambos ARNm en cada tratamiento,

siendo la acumulación de T-PG mayor a la correspondiente a FaPG1, tanto en

frutos tratados como controles, en coincidencia con lo detallado en los

capítulos I y II para el cultivar Camarosa. Los ensayos de RT-PCR

semicuantitativa revelaron una acumulación mucho menor de ambos

Capítulo III

131

mensajeros en frutos tratados con NAA en relación a los controles

(aproximadamente cinco veces menos). Es destacable que los frutos tratados

con NAA no presentaron niveles detectables de FaPG1, mientras que la

cantidad de T-PG se redujo claramente. Con respecto al ensayo con GA3, se

encontró una menor acumulación de FaPG1 y T-PG en frutos tratados con

respecto a los controles.

Mediante ensayos de Western-blot se observó que la acumulación de la

proteína FaPG1 seguía un patrón similar al detectado para los ARNm en los

ensayos de Northern-blot (figura 27 D). Finalmente, con el objeto de validar

los ensayos de expresión de PG y acumulación de la proteína FaPG1, se

realizaron medidas de la actividad poligalacturonasa total (figura 27 E). La

actividad PG total en frutos tratados con NAA fue considerablemente menor a

la observada en los controles. Una situación similar se observó en los frutos

tratados con GA3.

Capítulo III

132

Por otra parte, se realizaron ensayos de deaquenación, para eliminar la

fuente endógena de auxinas. Se deaquenaron mitades de frutos blancos de

Camarosa, dejando las mitades restantes como control. Los frutos se

incubaron durante 72 h a 22 °C, las mitades se separaron y congelaron en N2

(l), y sobre estas muestras se midió el contenido de antocianinas y la

expresión de poligalacturonasa mediante ensayos de Northern-blot (figura 28).

La eliminación de la fuente de auxinas endógenas en las mitades

Figura 27: efecto de la aplicación de NAA y GA3 1 mM sobre: (A) contenido de antocianinas, (B)

acumulación de ARNm de PGs (Northern-blot), (C) expresión de FaPG1 y T-PG (RT-PCR

semicuantitativa), (D) acumulación de FaPG1 (Western-blot), y (E) actividad PG total de frutos B de

Camarosa luego de 72 h de incubación post-tratamiento a 22 °C. Las barras en (A) y (E) indican

desviaciones estándar. Los datos de la cantidad de antocianinas y de actividad PG total se

analizaron mediante el Test de Student, con P < 0,05. Las diferencias estadísticas entre frutos

controles y tratados se indican con un asterisco (*).

Capítulo III

133

deaquenadas provocó un ligero aumento de la expresión de

poligalacturonasas, en comparación con las mitades de frutos que conservaron

los aquenios. Al menos en el cultivar Camarosa, el efecto inhibitorio ejercido

por las auxinas sobre la expresión PG y la acumulación de antocianinas, se

observó más claramente en los experimentos de aplicación exógena de una

auxina sintética que en los ensayos de deaquenación.

CONTROL DEAQ.

PGs

ARNr

(A)

(B)

Con

teni

do d

e an

toci

anin

as (μ

mol

Kg

-1)

0

20

40

60

80

100

*

CONTROL DEAQ.

PGs

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(A)

(B)

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e an

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CONTROL DEAQ.

PGs

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(A)

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Kg

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0

20

40

60

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100

*

0

20

40

60

80

100

*

Figura 28: efecto de la deaquenación de mitades de frutos blancos de Camarosa, y posterior

incubación durante 72 h a 22 °C sobre: (A) contenido de antocianinas, y (B) acumulación de

ARNm de PGs (Northern-blot). Las barras en (A) indican desviaciones estándar. Los datos de la

cantidad de antocianinas se analizaron mediante el Test de Student, con P < 0,05. Las diferencias

estadísticas entre frutos controles y tratado se indican con un asterisco (*).

Capítulo III

134

7.2.2. Tratamiento con ácido abscícico

Para determinar si la exposición a ácido abscísico exógeno podría

regular la acumulación de ARNm de PG y la acumulación de la proteína

FaPG1, se trataron frutos blancos del cultivar Camarosa con ABA 1 mM. Este

tratamiento no afectó significativamente la acumulación de antocianinas en los

frutos tratados respecto a los controles (figura 29 A). En relación a la

expresión génica, el análisis por densitometría de las bandas obtenidas

mediante Northern-blot permitió determinar que la acumulación de los ARNm

de PG fue un 25% mayor en frutos tratados con ABA comparado con los

controles (figura 29 B).

Los ensayos de RT-PCR semicuantitativa y de Western-blot, mostraron

un patrón similar al detectado por Northern-blot (figura 28 C). Es de destacar

que la cantidad de ARNm de T-PG fue considerablemente mayor a la de

FaPG1, tanto en los frutos tratados como en los controles. En este caso

también fue posible observar la doble banda de proteínas en los ensayos de

Western-blot (figura 29 D), producto de la probable glicosilación diferencial de

la proteína según se discutió previamente en el Capítulo I. Respecto a la

actividad enzimática, tanto los frutos tratados como los controles presentaron

una actividad PG similar y no se observaron diferencias significativas entre

ellos (figura 29 E).

Capítulo III

135

7.2.3. Tratamiento con óxido nítrico

Para intentar comprender el efecto del óxido nítrico (NO) en la

expresión de PG y en la síntesis de FaPG1, se trataron frutos blancos de

Camarosa con nitroprusiato de sodio (SNP) 5 y 10 µM, el cual actúa como

dador de NO. Tanto el tratamiento con SNP 5 µM como con SNP 10 µM

aceleró la acumulación de antocianinas (figura 30). Sin embargo, el mayor

Figura 29: efecto de la aplicación de ABA 1 mM sobre: (A) contenido de antocianinas, (B)


semicuantitativa), (D) acumulación de FaPG1 (Western-blot), y (E) actividad PG total de frutos B

de Camarosa, luego de 72 h de incubación post-tratamiento a 22 °C. Las barras en (A) y (E)

indican desviaciones estándar. Los datos de la cantidad de antocianinas y actividad PG total se

analizaron mediante el Test de Student, con P < 0,05. No se encontraron diferencias significativas

entre frutos controles y tratados.

Capítulo III

136

efecto se observó para los frutos tratados con SNP 5 µM, por lo tanto se

escogió esta concentración para continuar con la evaluación de los demás

parámetros. Se detectó que los niveles de ARNm de PGs y de la proteína

FaPG1 fueron casi el doble en frutos tratados comparados con los controles

(figura 31 B, C, D). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas

en la actividad poligalacturonasa total entre frutos tratados y controles (figura

31 E).

Figura 30: efecto de la aplicación de SNP 5 y 10 μM sobre el contenido de antocianinas de frutos

B del cultivar Camarosa, luego de 48 h de incubación post-tratamiento a 22 °C. Los datos se

analizaron mediante el Test de Student, con P < 0,05. Las diferencias significativas se indican con

un asterisco (*).

Tratamiento

Control SNP 10uM SNP 5uM

Y D

ata

0

20

40

60

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Con

teni

do d

e an

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*

*

Tratamiento


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do d

e an

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as (μ

mol

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*

*

Tratamiento


Y D

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20

40

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teni

do d

e an

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anin

as (μ

mol

Kg

-1)

*

*

Capítulo III

137

7.2.4. Tratamiento con etileno

7.2.4.1. Efecto del etileno sobre la expresión PG

El efecto del etileno sobre la expresión poligalacturonasa se estudió

mediante la aplicación de etefón, un compuesto químico que libera etileno una

vez que se pone en contacto con los tejidos vegetales.

El contenido de antocianinas se incrementó significativamente en frutos

Figura 31: efecto de la aplicación de SNP 5 μM sobre: (A) contenido de antocianinas, (B)



de Camarosa los cuales se incubaron 48 h a 22 °C. Las barras en (A) y (E) indican desviaciones

estándar. Los datos de la cantidad de antocianinas y actividad PG total se analizaron mediante el

Test de Student, con P < 0,05. Las diferencias significativas se indican con un asterisco (*).

Capítulo III

138

tratados respecto a los controles (figura 32 A). Una situación similar se

observó en los ensayos de Northern-blot y Western-blot, donde la acumulación

de los ARNm de PG y de la proteína FaPG1 en los frutos tratados con etefón

fue dos veces mayor que en los controles (figura 32 B, D). La discriminación

en la acumulación de FaPG1 y T-PG mediante RT-PCR semicuantitativa indicó

que ambos ARNm aumentaron su acumulación en respuesta al tratamiento

con etefón, siendo los niveles de T-PG mayores a los de FaPG1 (figura 32

C). Con respecto a la actividad PG total, no se observaron diferencias

significativas en la actividad poligalacturonasa entre los frutos tratados con

etefón y los controles luego de 48 horas de almacenamiento a 22 °C (figura

32 E).

Capítulo III

139

Por otro lado, el efecto del etileno se analizó también mediante la

aplicación de 1-MCP, un compuesto inhibidor de la percepción del etileno. Se

observó una acumulación de antocianinas seis veces menor en frutos tratados

con 1-MCP respecto a los controles (figura 33 A). Asimismo, es de destacar

que el tratamiento con 1-MCP disminuyó la expresión de PG (figura 33 B), y

se detectó una disminución significativa en la actividad poligalacturonasa total

comparada con los controles (figura 33 C).

Figura 32: efecto de la aplicación de etefón 2 mM sobre: (A) contenido de antocianinas, (B)



de Camarosa luego de 48 h de incubación post-tratamiento a 22 °C. Las barras en (A) y (E)

indican desviaciones estándar. Los datos de la cantidad de antocianinas y actividad PG total se

analizaron mediante Test de Student, P < 0,05. Las diferencias significativas se indican con un

asterisco (*).

Capítulo III

140

7.2.4.2. Efecto del etileno sobre parámetros de la calidad del fruto

Con el objeto de investigar la posible influencia del etileno sobre

parámetros de la maduración relacionados con la calidad de frutillas, se

trataron frutos blancos del cultivar Toyonoka con etefón (2 mM) y 1-MCP (1

ppm).

Figura 33: efecto de la aplicación de 1-MCP sobre: (A) contenido de antocianinas, (B) acumulación de ARNm de PGs (Northern-blot), y (C) actividad PG total de frutos B de Camarosa luego de 48 h de incubación post-tratamiento a 22 °C. Las barras en (A) y (C) indican desviaciones estándar. Los datos de la cantidad de antocianinas y actividad PG total se analizaron mediante el Test de Student, con un nivel de significancia de P < 0,05. Las diferencias significativas se indican con un asterico (*).

Capítulo III

141

7.2.4.2.1. Antocianinas, clorofilas y actividad PAL

Se detectó un incremento en el contenido de antocianinas y en la

actividad PAL en todos los frutos luego de 48 h de incubación a 22 °C, en

comparación con los valores encontrados en el estadio blanco inicial (figura 34

A, B).

Los frutos tratados con etefón acumularon más antocianinas que los

correspondientes controles, mientras que lo opuesto se observó en frutos

tratados con 1-MCP (figura 34 A). En concordancia con estos resultados, la

actividad PAL se incrementó significativamente en frutos tratados con etefón

respecto a los controles, mientras que en los frutos tratados con 1-MCP la

actividad fue 3 veces menor a los controles (figura 34 B).

Por otro lado, se detectó una degradación de clorofilas en los frutos

luego de 48 h a 22 °C. Más aun, el decaimiento en los niveles de clorofila

fue más pronunciado en frutos tratados con etefón con respecto a los

controles, y la situación opuesta se observó en frutos tratados con 1-MCP

(figura 34 C).

Capítulo III

142

Ant

ocia

nina

s (μ

mol

Kg

-1)

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B + 2 d, 22 °C

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)C

loro

filas

(g K

g-1

)

B C E E C 1-MCP 1-MCP

B + 2 d, 22 °C

Figura 34: efecto del tratamiento con etefón y 1-MCP sobre el contenido de antocianinas (A),

actividad PAL (B) y niveles de clorofilas (C). Frutos blancos del cultivar Toyonoka se trataron con

etefón (2 mM) y 1-MCP (1 ppm) y se incubaron durante 2 días a 22 °C. Las barras indican

desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante el Test ANOVA, con P < 0,05. Las

diferencias significativas respecto al control se indican con un asterisco (*). CE: control del

tratamiento con etefón; E: tratamiento con etefón; C1-MCP: control del tratamiento con 1-MCP; 1-

MCP: tratamiento con 1-MCP.

Capítulo III

143

7.2.4.2.2. Azúcares y compuestos fenólicos

Los niveles de azúcares totales en frutos controles se mantuvieron

aproximadamente constantes luego de 48 h de incubación a 22 °C, y no se

registraron incrementos respecto a los valores iniciales (figura 35 A). Sin

embargo, los frutos tratados con etefón acumularon una mayor cantidad de

azúcares totales con respecto a los controles, y la situación opuesta se

observó en frutos tratados con 1-MCP (figura 35 A). Con respecto al

contenido de azúcares reductores, si bien se observaron tendencias similares

a las presentadas en la medición del contenido de azúcares totales, no se

detectaron diferencias significativas entre frutos tratados y controles en ningún

caso (figura 35 B).

Se detectó una disminución en el contenido de compuestos fenólicos en

frutos tratados con etefón y controles luego de 48 h de incubación respecto al

valor obtenido al inicio del experimento (figura 35 C). Sin embargo, luego de 2

d de incubación a 22 °C no se observaron diferencias entre frutos tratados y

controles. Los frutos tratados con 1-MCP mantuvieron los mismos niveles de

compuestos fenólicos que los frutos blancos iniciales luego de 2 d de

incubación, mientras que los correspondientes controles presentaron una

disminución en dichos niveles. En consecuencia, el tratamiento con 1-MCP

provocó un retraso en la disminución del contenido de compuestos fenólicos

durante el período de incubación.

Capítulo III

144

Figura 35: efecto del tratamiento con etefón y 1-MCP sobre el contenido de azúcares totales (A),

azúcares reductores (B), y compuestos fenólicos totales (C). Frutos blancos (B) del cultivar

Toyonoka se trataron con etefón (2 mM) o con 1-MCP (1 ppm) y se incubaron durante 2 días a

22 °C. Las barras indican desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante el Test

ANOVA, con un nivel de significancia de P < 0,05. Las diferencias significativas entre frutos

tratados y sus respectivos controles se indican con un asterisco (*). CE: control del tratamiento

con etefón; E: tratamiento con etefón; C1-MCP: control del tratamiento con 1-MCP; 1-MCP:

tratamiento con 1-MCP.

Capítulo III

145

7.3. Discusión

En un intento de obtener información acerca del control hormonal de

PG al comienzo de la maduración de frutilla, se realizaron ensayos con

diferentes reguladores del crecimiento vegetal. En la actualidad, se sabe que

las auxinas regulan negativamente la maduración del receptáculo de frutilla

(Given y col., 1988b) y que tienen un efecto inhibitorio en la expresión de un

gran número de genes relacionados con el metabolismo de la pared celular,

tales como pectato liasa (Bemítez-Burraco y col., 2003), β- xilosidasa (Martínez

y col., 2004) y expansina (Civello y col., 1999).

En el presente trabajo de Tesis, se detectó un efecto inhibitorio de las

auxinas en la acumulación de antocianinas y en la expresión de la enzima

poligalacturonasa. Asimismo, la aplicación exógena de una auxina sintética

disminuyó la síntesis de la proteína FaPG1 y la actividad PG total en frutos

del cultivar Camarosa.

Además de las auxinas, se sugirió que las giberelinas podrían actuar

como inhibidores de la maduración de frutilla (Martínez y col., 1996). En este

trabajo de Tesis, se observó que el tratamiento con GA3 redujo los niveles de

antocianinas, así como la acumulación de ARNm de PG y de la proteína

FaPG1, si bien el efecto inhibitorio no fue tan marcado como el producido por

el NAA. Por otra parte, la actividad poligalacturonasa total se redujo

visiblemente en frutos tratados con GA3 en comparación con los controles.

Los resultados obtenidos están de acuerdo con la hipótesis de que las

auxinas son las hormonas claves que inhiben la maduración de frutilla. Sin

embargo, a diferencia de lo que ocurre durante la maduración de frutos

Capítulo III

146

climatéricos, no hay un claro entendimiento de los mecanismos que regulan

positivamente la maduración de frutos no climatéricos.

Con respecto al ABA, Jiang y Joyce (2003) sugirieron que el efecto

positivo de este regulador en el desarrollo del color del fruto de frutilla es

mediado por el etileno a través del aumento en la actividad PAL. Sin

embargo, nuestros resultados no mostraron diferencias significativas en los

niveles de antocianinas ni en la actividad PG total cuando frutos blancos del

cultivar Camarosa se trataron con ABA. Por otro lado, la expresión y la

síntesis de FaPG1 fueron solo ligeramente aumentadas por este tratamiento.

Se sugirió que el tratamiento con NO podría extender la vida

postcosecha de frutillas (Wills y col., 2000), y estudios realizados en frutos

maduros proponen que el NO podría prevenir la síntesis de ácido

aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) mediante la desactivación de la enzima

ACC sintasa (Zhu y Zhou, 2007). Los autores utilizaron SNP como agente

liberador de NO, y reportaron que el efecto más marcado se obtuvo con una

solución 5 µM de SNP, mientras que concentraciones menores no tuvieron un

efecto apreciable en extender la vida de estantería del fruto, y concentraciones

mayores produjeron efectos negativos como el pardeado alrededor del cáliz.

La medición del contenido de NO y etileno endógenos en frutillas en los

estadios verde y 100% rojo indicaron que la maduración está acompañada por

una gran disminución del contenido de NO junto con un aumento en los

niveles de etileno, si bien los contenidos de este último son bajos en

comparación con el hallado en frutos climatéricos (Leshem y Pinchasov, 2000).

Se reportó que la administración de sustancias que liberan NO a plantas de

tabaco indujo la expresión del gen que codifica para la enzima PAL (Durner y

Capítulo III

147

col., 1998), la cual es clave en la síntesis de antocianinas y diferentes

compuestos relacionados con la defensa de la planta (Boss y col., 1996). De

acuerdo a los resultados obtenidos en nuestro caso, es posible que el

incremento en los niveles de antocianinas detectados luego del tratamiento

con NO se deba a la inducción de genes que codifican PAL.

Como se mencionó anteriormente, el etileno no tendría un papel central

como regulador del crecimiento en frutos no climatéricos. Sin embargo, los

tratamientos con etileno exógeno pueden acelerar la maduración y estimular la

síntesis de antocianinas en algunos frutos no climatéricos como pimientos y

uvas (Armitage, 1989; El-Kereamy y col., 2003). En el caso de frutilla, se

reportaron resultados contradictorios acerca del efecto del etileno en la

maduración (Bower y col., 2003; Iannetta y col., 2006). Las investigaciones

realizadas por Given y col. (1988b) señalaron que la frutilla sería insensible al

etileno. Sin embargo, trabajos más recientes indicaron que los frutos de frutilla

sintetizan una pequeña cantidad de etileno, la cual podría influenciar el

proceso de maduración (Tian y col., 1997; Trainotti y col., 2005). Se reportó el

clonado y la caracterización de la expresión de tres ADNc que codifican

diferentes receptores de etileno en frutilla (Trainotti y col., 2005). Dos de ellos,

FaEtr1 (número de acceso AJ297511) y FaEtr2 (número de acceso AJ297513)

se expresan fuertemente en el estadio blanco, y FaEtr2 responde en mayor

medida a la aplicación de etileno en frutos del estadio blanco que en frutos

maduros (100% R). Estos trabajos, tomados en conjunto, llevan a la necesidad

de replantear el rol del etileno en la maduración de frutillas y, probablemente,

en otros frutos no-climatéricos.

En el presente trabajo, se detectó que el tratamiento con etileno en

Capítulo III

148

frutos blancos de Camarosa produjo un efecto positivo en la síntesis de

antocianinas. Por otra parte, se observó que la expresión génica de PG fue

estimulada por la aplicación exógena de la hormona, y que la acumulación de

la proteína FaPG1 se incrementó respecto a los controles. Estos aumentos en

la expresión génica y en la cantidad de proteína no estuvieron asociados con

el incremento esperado en la actividad poligalacturonasa total, y los frutos

tratados con etefón presentaron una actividad PG similar a los controles luego

de 48 horas de incubación. Sin embargo, cuando los frutos se trataron con un

inhibidor de la percepción del etileno (1-MCP), tanto los niveles de

antocianinas, como la expresión PG y la actividad poligalacturonasa total se

redujeron marcadamente con respecto a los controles.

Los resultados contradictorios reportados en la bibliografía con respecto

al efecto del etileno en la maduración de frutilla podrían deberse a la diferente

sensibilidad a la hormona en los distintos cultivares utilizados, o en los

diferentes estadios de maduración en el cual se realizó la aplicación. En el

caso de la actividad poligalacturonasa, el tratamiento hormonal incrementó la

expresión de genes relacionados, pero no modificó significativamente la

actividad enzimática. Sin embargo, la exposición a un inhibidor de la

percepción del etileno como el 1-MCP, proporcionó evidencias de que la

hormona etileno tiene influencia en la expresión poligalacturonasa, y en este

caso se encontró un incremento en la actividad PG total. Una posible

explicación es que los bajos niveles de etileno presentes en el fruto sean

suficientes para que se verifique la acción de la hormona, por lo cual el

exceso proporcionado por la aplicación externa no provocaría variaciones

posteriores. En cambio, la aplicación de un potente inhibidor de la acción del

Capítulo III

149

etileno como el 1-MCP podría interferir con los bajos niveles de la hormona

presentes en el fruto, y por lo tanto provocar variaciones detectables de los

distintos parámetros de maduración medidos. Vale la pena mencionar que los

datos procedentes de los análisis de expresión no siempre coincidieron con la

actividad PG medida, particularmente en los ensayos realizados con GA3.

Mediante los ensayos de Northern-blot y RT-PCR semicuantitativas, se estaría

detectando solamente la acumulación de los ARNm correspondientes a FaPG1

y T-PG, así como los ensayos de Western-blot detectarían únicamente a la

proteína FaPG1. En cambio, los ensayos de actividad PG permiten medir la

actividad poligalacturonasa total. Distintos trabajos reportaron la presencia de

familias de PGs en diferentes frutos (Hiwasa y col., 2004; Asif y Nath, 2005),

por lo cual es posible que en nuestro caso se estuviera detectando la

actividad de otras isoenzimas además de FaPG1. Esto podría explicar las

diferencias observadas entre la expresión poligalacturonasa, la acumulación de

FaPG1 y los valores de actividad PG total obtenidos.

Por otra parte, durante el presente trabajo se decidió profundizar el

estudio del efecto del etileno sobre la maduración de frutilla, evaluando ciertos

parámetros que determinan la calidad del fruto. Para ello, frutos de Toyonoka

del estadio blanco se trataron con etefón 2 mM y 1-MCP 1 ppm. Se detectó

un efecto positivo en la acumulación de antocianinas y en la actividad PAL en

frutos tratados con etefón, mientras que el efecto contrario se observó con el

tratamiento con 1-MCP. En otro fruto no-climatérico como la uva, se reportó

que tratamientos con etileno exógeno fueron capaces de estimular la

acumulación de antocianinas y la expresión de genes relacionados con la

biosíntesis de dichos pigmentos (El-Kereamy y col., 2003).

Capítulo III

150

Además del incremento en el contenido de antocianinas, la maduración

de frutilla está acompañada por una disminución en los niveles de clorofilas

(Given y col., 1988a). En nuestro caso, detectamos una disminución en el

contenido de clorofilas luego de 2 días de incubación, y dicho efecto fue más

marcado en frutos tratados con etefón respecto a los controles. Nuestros

resultados refuerzan la idea de que el etileno podría desempeñar un rol en la

regulación de la maduración de frutilla. En particular, esta hormona podría

estimular la acumulación de antocianinas y la degradación de clorofilas en el

fruto.

Trabajos previos demostraron que los frutos de frutilla no acumulan

cantidades apreciables de azúcares una vez cosechados (Cordenunsi y col.,

2003). De forma similar, en nuestro trabajo no detectamos un incremento

significativo en los niveles de azúcares totales luego de 2 días de incubación.

Sin embargo, los frutos tratados con etefón acumularon una mayor cantidad

de azúcares que los controles, y una situación opuesta se observó en frutos

tratados con 1-MCP respecto a los controles. Se reportó que frutos de uva in

planta tratados con 1-MCP acumulan menos sacarosa que los controles,

sugiriendo un papel del etileno en la acumulación de azúcares en frutos no-

climatéricos (Chervin y col., 2006). En nuestro caso, es probable que el

etileno regule de forma positiva algún mecanismo relacionado con la

acumulación de azúcares luego de la cosecha, probablemente a través de

enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular como PG.

El contenido de compuestos fenólicos disminuye continuamente durante

la maduración de frutilla, y la caída más significativa se observa desde el

estadio VG al B (Martínez y col., 2001). En nuestro trabajo detectamos una

Capítulo III

151

disminución en el contenido de compuestos fenólicos después de 2 días de

incubación. Cabe destacar que luego de 2 días de incubación los frutos

tratados con 1-MCP mantuvieron los niveles de compuestos fenólicos en

valores similares a los hallados en frutos blancos.

De esta manera, ciertos aspectos de la maduración de frutilla podrían

estar modulados por la acción del etileno, por lo que resultaría de interés

continuar con el estudio del rol de esta hormona en la maduración de este

fruto no-climatérico.

Capítulo III

152

7.4. Conclusiones

• Tanto la expresión poligalacturonasa, como la acumulación de FaPG1 y

la actividad PG total es regulada negativamente por auxinas, y en

menor medida por giberelinas.

• ABA no tendría un efecto considerable sobre la expresión de

poligalacturonasa.

• La expresión de PG estaría regulada positivamente por NO y etileno.

• Ciertos aspectos de la maduración de frutilla como la síntesis de

antocianinas, degradación de clorofilas, actividad PAL y acumulación de

azúcares, son acelerados por la aplicación de etileno, mientras que

dicha hormona ejercería un efecto negativo sobre la acumulación de

compuestos fenólicos.

Conclusión general

153

8. Conclusión general

Tomadas en conjunto, nuestras observaciones concuerdan con el rol

propuesto para las poligalacturonasas en la degradación de la pared celular

hacia el final de la maduración de los frutos carnosos. Postulamos además,

que la actividad de PG contribuye significativamente al ablandamiento de

frutilla y que su nivel de expresión es diferente en cultivares que presentan

diferentes velocidades de ablandamiento del fruto. Una menor firmeza del fruto

correlaciona con un mayor grado de expresión de PG durante la maduración.

El gen objeto de este estudio, FaPG1, produce dos transcriptos

mediante splicing alternativo, lo cual daría lugar a una proteína funcional con

actividad poligalacturonasa (FaPG1) y a una variante truncada, muy

probablemente sin actividad enzimática. La expresión relativa de estas dos

variantes, FaPG1 y T-PG, es diferente en cultivares con firmeza contrastante.

De este modo, los cultivares que producen frutos más firmes acumulan

preferentemente la variante T-PG durante la maduración, mientras que los

cultivares que producen frutos más blandos expresan mayoritariamente la

variante funcional FaPG1.

Finalmente, cabe destacar que el etileno ejercería un efecto positivo no

sólo sobre la expresión de PG, sino sobre otros aspectos de la maduración

de frutilla no relacionados con el ablandamiento, tales como acumulación de

antocianinas, azúcares y aumento de la actividad PAL. Esto indica que el

etileno es capaz de modificar diversos aspectos relacionados a la maduración

de la frutilla, y sugiere que es necesario reevaluar su posible rol en la

regulación de la maduración de este fruto no-climatérico.

Referencias

154

9. Referencias

§ Abeles, F.B., Takeda, F. 1990. Cellulase activity and ethylene in

ripening strawberry and apple fruits. Sci. Hortic. 42, 269-275.

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Muñoz-Blanco, J., Bois, G., Smit, P., De Vos, R.C.H., O'Connell, A.P.

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§ Alexander, L., Grierson, D. 2002. Ethylene biosynthesis and action in

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2055.

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