plagiat merupakan tindakan tidak terpuji pdf/f. farmasi/farmasi/038114064_full.pdf · membantu...
TRANSCRIPT
-
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L.
YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus
Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm. ) Program Studi Farmasi
Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
NIM : 038114064
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Skripsi
ISOLASI DAN II}ENTTFIKASI BAKTERI ENDOFTTDALAM BATANG TANAMAN Artemisia AnnuaL.
YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYATERHADLP Eschericia co# DAN Staphylococcus aureils
Iliajukan Oleh :
Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
NIM:038114064
Telah disetujui oleh:
Pembimbing:
o{ t ^,s' , i I ( '
,'u!L--'Maria Dwibudi Jumpowati, S.Si.
Tanggaf , ?1 ..fov.*.,.i..*g.o8(,
I I I
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Pengesahan Skripsi
Berjudul:
ISOLASI DA}{ IDENTIFIKASI BAKTERI ENIX}FTTDALAM BATANG TANAMAN Artemisis Anw* L
YAITG DIUJI POTENSI ANTIBAKTEilNYATERAD AP Exhefcia coli DAlt Staphytoeorus sursus
OIetrAntonius Alfian Yuan Dias Priharta
NIM:038114S64
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji SlripsiFakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal : 15 Januari 3008
Fakultas FarmasiDharma
*r.rt., urt.Pembimbing:
MariaDwi Budi Jumpowafi, S.Si.
Panitia Pengr$i :
1. Mari*Dwi Budi Jumpowati, S.Si.
2. Y*stina Sri Hartini, M.Si., Apt.
3. Igl Y" Kristio Budiasmoro, M.Si.
Tanda Tangan
0&v44,,YTwr
1Y
Mengetahui
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Skripsi ini dipersembahkan untuk :
Yesus Kristus
Bapak Bernardinos Dias Sidharta
Ibu Caecilia Enita Amarwati
Crezensia Alfiora Dea Dema Dias Oktabenita
Felisita Anesti Kusumastuti
Without Love, Im Nothing . . . .
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
LEMBAR PER}IYATAA}{ PENSETilJUAI{PUBLIKASI KARYA ILMIAH T]NTUK KEPEI{TINGAI\I AI{ADEMIS
Yaag bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universias Sanata Dharma :
: Antonius Alfian Yuan Dias hihffa
Nomor lrdahasiswa : 038114064
Deui pengembangan ilmu pengetahuan, saya meilbtrikar ke,pada Perpustakaaa
Universitas Sanah Dharma karya ilmiah saya yang berjudtl :
"ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAIffSRI ENDOFIT DAI,AMBATAFIG TANAMAN Artenisin an $til L. YAFIG IIIUJI POTENSIANTIBAI(IERIIYYA TERIIADAP Escheria cotri DAF{ Str,phyloeweetsasteuf
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memkrikm
kpada Perpusakaan Universitas Sanata Dharua bak unt* mcnyimparq me-
ngnlihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bsh* pang*alan data
memdisribusikan scara terbatas, dan merrpublikasikannya di Internet dau media
tain untr* kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari $lya malryut
mcrrberikan rcyalti kepada saya selama ttap mencatrfimkm nama saya s*agai
pmulis. Derrikian psmyafaan ini yang saya buat dengru sebenarnya.
Dibnatdi Yoryaka*a
Padatanggal : 30 Jauuari 2008
Yrnn Dias Priharta)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan
berkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi yang penulis susun berjudul
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG
TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA
TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan
banyak terimakasih kepada :
1. Tuhan Yesus Kristus yang telah memberi rahmat dan berkat-Nya serta
perlindungan dan bimbingan-Nya pada setiap umat-Nya.
2. Bapak, Ibu, dan adik Dhea atas doa, kasih sayang, perhatian, dan
dukungannya baik moril maupun materiil yang selalu diberikan padaku.
3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing utama yang
telah memberikan bimbingan, pengarahan, waktu, kesabaran, dan saran hingga
skripsi ini dapat tersusun.
4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak
memberikan saran dan masukan kepada penulis.
5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen penguji yang telah
banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis.
6. Pihak BPTO Tawangmangu, terutama Bapak Agus. Terimakasih telah
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
membantu dalam pengadaan dan determinasi tanaman Artemisia annua L.
7. Eyang Putri beserta keluarga besar di Klaten, terimakasih atas doa, perhatian,
kasih sayang, nasehat, dan dukungan untukku.
8. Pakdhe dan Budhe beserta keluarga, terutama Budhe Erlin, terimakasih atas
perhatian, nasehat, dan dukungan untukku.
9. Felisita, terimakasih untuk doa, perhatian, cinta, kesabaran, serta dukungan
yang sangat berkesan untukku.
10. Pak Kartatmo, Pak Mukmin, Mas Narto selaku Staff Sekretariat Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, terimakasih telah membantu dalam
memperlancar administrasi hingga tersusunnya skripsi ini.
11. Mas Sarwanto, Mas Sigit, Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi
Farmasi, terimakasih atas semua bantuannya selama ini.
12. Teman-teman kelompok C 2003 : Anien, Siska, Eveline, Hartono, Komang,
Indhu, Devi, Titien, Ratna, Yulia, Madya, Punto, Esti, Tata, Budi, Rosa, Vera,
Ratih, dan Maria. Terimakasih atas kerjasama dan kebersamaannya selama ini.
Che 03 Never Die...
13. Anak-anak kontrakan : Abang Aan, Hengky, Manto, Irwan, Ndaroe, Topan,
dll. Thanks untuk kebersamaaannya. Keep the Spirit..
14. Anak-anak No Label cabang Teknik Sipil Atma Jaya, thanks untuk
kebersamaaannya. Tetap semangat mengejar wanita sampai Nirwana..
15. Teman-teman KKN USD XXXIII Gantiwarno Kelompok 29 : Mbak Non
(PBI), Valent (MIPA), Melinda (Psi), Sandra (S.Ing), Ika (P.Mat), Dika
(IKOM), Punto (PBI), dan Bu Parlan selaku Ibu Pondokan, terimakasih atas
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
bantuan, dukungan dan kebersamaannya selama ini.
16. Lukas Eko, teman skripsi Rosa, dan Bayu (PBI), terimakasih atas kerjasama,
bantuan, dan kebersamaannya selama ini.
17. Yoyok, thanks telah membawakan tanaman Artemisia annua L. dari
Tawangmangu sampai ke Jogja.
18. Teman-teman angkatan 2003 yang tidak mungkin saya sebutkan satu persatu,
terimakasih atas kebersamaannya selama ini.
19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis hingga
tersusunnya skripsi ini.
Penulis sangat menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat
kesalahan dan kekurangan, oleh karena itu saran dan kritik yang sifatnya
membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan ini.
Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi
pengembangan ilmu farmasi pada khususnya dan kemajuan ilmu pengetahuan
pada umumnya.
Yogyakarta, 21 November 2007
Hormat penulis
Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
PER}IYATAAH KEASLIAN PENELITIAI{
Saya menyatakan dengan sesuagguhnya bahwa slcripsi yang saya ftrlis tm
tidak memuat karya atau bgian karya orang lain, kecuali yarrg tetah disebrskan
dalam daftar pustaka sebgaimana layaknya karyailmiah.
Yogyakarfa, 21 November 2007
Antonius YuanDias Prihsrra
tx
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
INTISARI
Tanaman Artemisia annua L. merupakan tanaman yang digunakan sebagai
obat anti malaria. Pada tanaman A.annua L ini diketahui ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Mikrobia endofit diketahui dapat memperbaiki pertumbuhan tanaman karena kemampuannya menekan pertumbuhan mikrobia-mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman (Pudaritadesantamaria, 2004).
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya isolat bakteri endofit dalam batang tanaman A.annua L., menguji potensi antibakteri dari isolat bakteri endofit tersebut terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus serta mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif-deskriptif. Isolasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. dilakukan dengan metode streak plate, potensi antibakteri diuji dengan metode paper disc. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan pengamatan morfologi koloni, morfologi sel, dan uji biokimia.
Hasil dari penelitian ini adalah senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, serta diketahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut adalah genus Amphibacillus.
Kata kunci : Bakteri endofit, zona hambat, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ABSTRACT
Artemisia annua. L. is a plant which is used as antimalaria. At this A.annua. L. is known that is endophytic mikrobia forming colony in tissue at stem area until root (Simanjuntak et al, 2004). Endophytic mikrobia grew in vascular tissue from the plant (Stone et al, 2000). Endophytic microbia can fix up the development of the plant because its ability to suppress the pathogenic development in survival way, producing antibiotic compounds, or inducting the vurnability of the plant (Pudaritadesantamaria, 2004).
The purpose of this research was to find the endophytic bacteria isolate toward Eschericia coli and Staphylococcus aureus, and to find the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds.
This result was pure experimental research and it was an explorative descriptive research. The endophytic bacteria isolation from A.annua. L.s stem was used streak plate method, the antibacterial potential was tested using paper disc method. The identification of endophytic bacteria was using colony morphology observation, cell morphology, and biochemical test.
The result of this research were an antibacterial compounds which was produced by endophytic bacteria was isolated from A.annua. L, had the potential antibacteria to E.coli and S.aureus, and it was known that the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds was Amphibacillus.
Key words : endophytic bacteria, inhibition zone, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
DAFTAR ISI
Halaman Judul..................................................................................................... ii
Halaman Persetujuan Pembimbing...................................................................... iii
Halaman Pengesahan........................................................................................... iv
Halaman Persembahan........................................................................................ v
Prakata................................................................................................................. vi
Pernyataan Keaslian Karya................................................................................. ix
Intisari................................................................................................................. x
Abstract............................................................................................................... xi
Daftar Isi............................................................................................................. xii
Daftar Tabel....................................................................................................... xvi
Daftar Gambar................................................................................................... xvii
Daftar Lampiran................................................................................................ xviii
BAB I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang.................................................................................. 1
1. Permasalahan.............................................................................. 3
2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3
3. Manfaat Penelitian...................................................................... 4
B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
A. Antibiotik......................................................................................... 5
B. Mikrobia Endofit............................................................................. 7
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
C. Artemisia annua L. ......................................................................... 10
D. Rekombinasi Genetik..................................................................... 12
E. Bakteri Uji...................................................................................... 14
F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia........................ 16
G. Identifikasi Mikrobia...................................................................... 18
H. Keterangan Empiris....................................................................... 21
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian..................................................... 23
B. Variabel dan Definisi Operasional................................................. 23
C. Bahan dan Alat Penelitian.............................................................. 25
D. Tahapan Penelitian........................................................................ 28
1. Determinasi tanaman Artemisia annua L. ................................ 28
2. Pengumpulan batang Artemisia annua L. ................................. 28
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).............. 28
4. Disinfeksi Batang Artemisia annua L. .................................. 31
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium...... 31
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak
Plate........................................................................................... 32
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit
Terhadap E.coli dan S.aureus Secara Difusi Paper
disc............................................................................................. 32
8. Identifikasi Bakteri Endofit........................................................ 33
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
E. Analisis Hasil................................................................................. 40
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. ................................... 43
2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L. ..................... 43
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).................. 44
4. Disinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L. ...................... 46
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium........... 47
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate..................... 49
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap
S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc............................... 52
8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji
S.aureus.......................................................................................... 54
9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli......... 59
10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode
D............................................................................... 63
a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D.............................................................. 64
b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B
dan Bakteri Endofit kode D....................................................... 71
c. Uji Biokimia.............................................................................. 73
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan.................................................................................... 85
B. Saran.............................................................................................. 85
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 86
LAMPIRAN...................................................................................................... 90
BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 102
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 56
Tabel II. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 57
Tabel III. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 60
Tabel IV. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 61
Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit
kode D................................................................................................ 82
Tabel VI. Hasil Identifikasi Bakteri Endofit kode B, Bakteri Endofit kode D,
dan Bakteri Genus Amphibacillus .................................................. 84
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema Kerja Penelitian .................................................................. 42
Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu
Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 55
Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu
Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 57
Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi
24 Jam ........................................................................................... 60
Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi
24 Jam ........................................................................................... 61
Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 65
Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 66
Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 67
Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 68
Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B .................... 69
Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D .................... 70
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman A.annua L.................... 90
Lampiran 2. Tanaman A.annua L..................................................................... 92
Lampiran 3. Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu
Inkubasi 3 hari ............................................................................. 92
Lampiran 4. Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting
dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ................................................... 93
Lampiran 5. Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit
kode D pada Medium Semi Solid ................................................ 93
Lampiran 6. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrient Broth ............................................ 94
Lampiran 7. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak .................................. 94
Lampiran 8. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring .................................. 95
Lampiran 9. Hasil Uji Asam sulfida (H2S) ....................................................... 95
Lampiran 10. Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin ..................................................... 96
Lampiran 11. Hasil Uji Indol .............................................................................. 97
Lampiran 12. Hasil Uji Methylen Red (MR) ..................................................... 97
Lampiran 13. Hasil Uji Sitrat ............................................................................. 98
Lampiran 14. Hasil Uji Katalase ........................................................................ 99
Lampiran 15. Hasil Uji Oksidase ....................................................................... 99
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
Lampiran 16. Hasil Uji Gelatin .......................................................................... 100
Lampiran 17. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin .................... 100
Lampiran 18. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin ................. 101
xix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikrobia yang
dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh
mikrobia lain. Setiap antibiotika mempunyai aktivitas penghambatan hanya
terhadap kelompok mikrobia tertentu yang disebut spektrum penghambatan
(Suwandi, 1989)
Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang
membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil
identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa
(Simanjuntak, Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih, & Said, 2004).
Bacillus polymixa termasuk dalam genus Bacillus yang mempunyai ciri sel
berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, motil,
dan bersifat katalase positif (Holt, Krieg, Sneath, Staley, & Williams, 2000).
Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di jaringan tanaman pada
periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan
tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikrobia endofit tumbuh di jaringan
vaskular dari tanaman inangnya (Stone, Bacon, White, 2000). Setiap tanaman
tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Mikrobia endofit
tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer
genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
2
(Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi metabolit
sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat
besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia
endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Bakteri
endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman A.annua L., dapat
memproduksi metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria
(Simanjuntak, dkk, 2004).
Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan media yang dapat menyokong
pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, &
Maffei, 2001). Media Murashige-Skoog (MS) merupakan media yang digunakan
untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-
garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+
(Hendaryono,1994).
Staphylococcus aureus dapat menghemolisis darah dan mengkoagulasi
plasma, juga menginfeksi bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan
nanah. Eschericia coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, terjadinya diare,
sepsis, dan meningitis. (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). S.aureus (gram
positif) dan E.coli (gram negatif) dipilih untuk mengetahui keefektifan potensi
antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit terhadap bakteri
gram positif dan gram negatif, sehingga dapat diketahui spektrum penghambatan
dari senyawa antibakteri tersebut.
Jan G. Bruhn dan Lars Bohlin pada tahun 1997 memperkenalkan
molecular pharmacognosy, yang mendifinisikan pharmacognosy sebagai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
3
pengetahuan molekuler yang menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari
bahan-bahan alam dengan potensinya sebagai obat. Bahan-bahan alam yang
berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat
baru (Samuelsson, 1999). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan
pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu,
eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan
senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).
1. Permasalahan
Dari latar belakang yang telah diuraikan di atas, permasalahan yang
muncul dalam penelitian ini adalah :
a. Apakah bakteri endofit dapat diisolasi dari batang A.annua L. ?
b. Apakah senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang
A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus ?
c. Bagaimana identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri
terhadap E.coli dan S.aureus tersebut ?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal belum pernah dilakukan penelitian
tentang isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L.
yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S aureus. Penelitian
isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A annua L yang
mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus dilakukan
bersama dengan Rachmawati (2007). Perbedaan dari penelitian bersama ini
adalah digunakan bakteri uji yang berbeda, di mana Rachmawati (2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
4
menggunakan bakteri uji Bacillus subtilis dan Salmonella thypii.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang
senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dalam batang
A.annua L. yang memiliki potensi antibakteri.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menemukan isolat bakteri endofit
penghasil senyawa antibakteri yang dapat mendukung bidang kefarmasian
dan mampu memberikan informasi tentang senyawa antibakteri yang
dihasilkan oleh bakteri endofit sebagai model atau prekursor dalam rangka
penemuan obat baru di masa yang akan datang.
c. Manfaat metodologis
Metode yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan dan
terus dikembangkan dalam usaha pencarian bakteri endofit penghasil
senyawa antibakteri.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengisolasi bakteri endofit dalam batang A.annua L.
2. Menguji potensi senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari
batang A.annua L. terhadap E.coli dan S.aureus.
3. Mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap
E.coli dan S.aureus tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Antibiotik
Antibiotik didefinisikan sebagai produk metabolit yang dihasilkan oleh
organisme tertentu, yang dalam konsentrasi rendah bersifat merusak atau
menghambat mikrobia lain. Dengan kata lain, antibiotik merupakan zat kimia
yang dihasilkan oleh suatu mikrobia yang dapat menghambat mikrobia lain
(Pelczar & Chan, 1988)
Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri,
yang mempunyai khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan mikrobia,
sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Turunan zat tersebut yang
dibuat secara semi-sintetis termasuk kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis
dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotik (Pelczar & Chan, 1988).
Terjadinya resistensi mikrobia yang tadinya peka terhadap antibiotika
dapat terjadi melalui mutasi pada kromosomnya atau pertukaran materi genetik di
antara mikrobia. Pertukaran materi kromosomal sangat jarang, yang banyak
terjadi adalah pertukaran materi genetik ekstrakromosomal, baik berupa plasmid
konjugatif ataupun plasmid non konjugatif. Secara biokimiawi, resistensi bakteri
terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mekanisme: (i). Berkurangnya
permeabilitas mikrobia terhadap obat, (ii). inaktifasi antibiotika oleh enzim yang
dihasilkan bakteri, (iii). modifikasi reseptor obat, (iv). meningkatnya sintesa
senyawa yang antagonistik terhadap obat (Sjahrurachman, 1996)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
6
Resistensi mikrobia terhadap antibiotika akibat perubahan permeabilitas
dapat terjadi akibat perubahan pada reseptor obat, penurunan kapasitas transpor
obat dan perubahan struktur dinding sel. Mekanisme ini merupakan mekanisme
tersering dalam hal resistensi terhadap tetrasiklin dan sulfonamida. Resistensi
bakteri karena modifikasi obat secara enzimatik banyak ditemukan terhadap
antibiotika beta-laktam, kloramfenikol dan aminoglikosida. Enzim-enzim yang
memodifikasi antibiotika tersebut dapat disandi oleh gen kromosom maupun gen
ekstrakromosom, misalnya pada Staphylococcus yang resisten terhadap penisilin
G, menghasilkan laktamase yang merusak obat tersebut (Jawetz dkk, 1996).
Resistensi bakteri terhadap antibiotika karena perubahan reseptor dapat ditemukan
pada resistensi terhadap streptomisin. Telah diketahui bahwa pada bakteri yang
resisten, ribosomnya berbeda dibandingkan dengan bakteri yang sensitif terhadap
streptomisin. Hal ini disebabkan terjadinya mutasi noktah satu asam amino pada
ribosom 30S. Dampak klinis resistensi tipe ini tidak begitu penting karena sifatnya
tidak menyebar. Contoh lain resistensi jenis ini adalah resistensi terhadap penisilin
pada bakteri Neisseria gonorrhoeae sebagai akibat perubahan pada penicillin
binding protein (PBP) (Sjahrurachman, 1996).
Bahan-bahan alam telah sejak lama digunakan untuk pengobatan. Bahan
alam meliputi segala organisme seperti tanaman, hewan, dan mikroorganisme.
Obat-obat modern yang digunakan pada masa kini sekitar 40 persennya berasal
dari bahan-bahan alam. Obat-obatan dari bahan alam tersebut termasuk juga jenis
obat-obat penting seperti glikosida jantung, morfin, dan antibiotik. Beberapa jenis
antibiotik merupakan turunan dari bahan-bahan alam yang struktur kimianya telah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
7
dimodifikasi untuk menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis yang
diinginkan (Samuelsson, 1999).
B. Mikrobia Endofit
Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di dalam jaringan tanaman
pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan
tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Mikrobia endofit tumbuh
di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular
(pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar
dan tunas (Campbell, Reece, Mitchell, 2002). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat
mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa
biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat transfer genetik
(genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan &
Zou, 2001).
Kemampuan mikrobia endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder
sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat
diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang
diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Dari sekitar 300.000 jenis
tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung
satu atau lebih mikrobia endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel &
Daisy, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat
dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau
bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
8
aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu
yang relatif lama untuk dipanen (Radji, 2005).
Mikrobia endofit meningkatkan adaptasi ekologi inangnya dengan
menaikkan toleransi mereka pada stress lingkungan (lingkungan yang kurang
menguntungkan) dan juga menaikkan resistensi inangnya terhadap fitopatogen
dan atau herbivora termasuk serangga yang memakan tanaman inang. Mikrobia
endofit juga dapat melindungi inangnya dari serangan bakteri atau fungi patogen
dari lingkungan disekitarnya (Tan & Zou, 2001).
Berbagai jenis mikrobia endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman
inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam medium pembenihan yang sesuai.
Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrobia endofit tersebut
dapat diisolasi dan dimurnikan serta dielusidasi struktur molekulnya (Radji,
2005).
Beberapa penelitian terkait dengan mikrobia endofit yang berpotensi
sebagai antibiotik telah dilakukan. Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan
oleh mikrobia endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari
tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang
patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel,
Miller, Miller, Condron, Teplow, & Hess, 1999). Phomopsiahalasin merupakan
metabolit yang diisolasi dari mikrobia endofit Phomopsis spp.berkhasiat sebagai
antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, dan
dapat juga menghambat pertumbuhan fungi Candida tropicalis (Horn, Simmonds,
Schartz, & Blaney, 1995). Antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
9
dihasilkan oleh endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan
endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat
pertumbuhan Bacillus anthracis dan Mycobacterium tuberculosis yang
multiresisten terhadap berbagai obat anti TBC (Castillo et al, 2002).
Ditinjau dari hubungan tersebut, mikrobia endofit berpotensi untuk
digunakan pada pengobatan modern, pertanian, dan industri. Fungi dan bakteri
adalah mikrobia yang paling umum membentuk koloni pada jaringan tanaman,
yang selanjutnya disebut mikrobia endofit (Strobel & Daisy, 2003). Endofit
umumnya tidak ditemukan pada organ yang spesifik tetapi kebanyakan spesies
mikrobia endofit diisolasi dari batang dan juga dari daun (Anonim, 2005).
Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikrobia perlu dilakukan isolasi
untuk memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar & Chan (1986) setiap koloni
yang berlainan mewakili macam mikrobia yang berbeda sehingga hal ini dapat
digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikrobia. Untuk mengisolasi mikrobia
di bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang
akan memenuhi persyaratan tipe mikrobia tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan
dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi,
dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar & Chan,
1986).
Banyak prosedur untuk isolasi mikrobia endofit yang relatif mudah dan
biasa digunakan oleh orang yang terlatih dalam dasar teknik mikrobiologi. Setiap
tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Endofit
tidak menunjukkan tanda- tanda keberadaan mereka sehingga sulit dideteksi dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
10
hanya dapat diteliti dengan menggoreskan secara hati- hati permukaan jaringan
yang telah dibersihkan dengan etanol dan NaOCl (pemutih). Penambahan dan
waktu untuk pencelupan dalam NaOCl beragam sesuai dengan jaringan dari inang
(Anonim, 2005).
Mikrobia endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang
telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai. Pada
isolasi mikrobia endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong pertumbuhan
tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001).
Medium Murashige-Skoog (MS) merupakan medium yang digunakan untuk
hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-garam
mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ (Hendaryono,
1994). Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur
hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada
bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan serta
perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman
induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam tanaman tersebut, sehingga
pemberian unsur hara kedalam medium kultur untuk membantu eksplan supaya
dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang
meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan
(Katuuk, 1989)
C. Artemisia annua L.
Tanaman A.annua termasuk Familia Asteraceae ; Genus Artemisia ;
Spesies Artemisia annua L. Mempunyai nama daerah : Anuma (Irian Jaya);
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
11
Anuma (Jawa) (Anonim, 1999)
Tanaman A.annua L. merupakan terna semusim, tinggi 30100 cm.
Batang tegak, bulat persegi, berwarna hijau kecoklatan. Daun majemuk, bentuk
oval, lonjong, panjang 10-18 cm, lebar 6-15 cm, ujung runcing, pangkal tumpul,
anak daun bentuk oval, tepi bergerigi, pertulangan daun tegas, warna ungu
kehijauan, hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan, terletak di ujung batang,
panjang mencapai 30 cm, kelopak hijau, bentuk bintang, berlekuk lima, mahkota
halus mengelilingi cawan bunga tempat benang sari dan putik, diameter 2-3 mm,
warna putih gading. Biji berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar serabut,
berwarna putih kekuningan. Bagian daun dari tanaman A.annua L. biasa
digunakan sebagai obat demam (anti piretik) dan dapat juga digunakan sebagai
obat anti malaria. Kandungan kimia dari tanaman A.annua L. yaitu saponin,
flavonoida, polifenol, dan minyak atsiri (Anonim, 1999).
A.annua L. adalah tumbuhan obat berupa perdu berasal dari Cina. Di
Cina tumbuhan ini disebut qinghao. Di Amerika Serikat tumbuhan ini dikenal
dengan nama sweet annie atau wormwood. Sejak zaman dulu, menurut catatan
Chinese Handbook of Prescriptions for Emergency Treatments, yang dicetak
tahun 340 sebelum Masehi, orang Cina menggunakannya untuk mengobati
demam (Anonim, 2005).
Minyak atsiri yang dihasilkan tanaman Artemisia annua L diketahui
dapat menghambat dengan baik pertumbuhan bakteri Gram Positif Enterococcus.
Kandungan minyak atsiri dari A.annua L meliputi camphor (44%), germacrene D
(16%), trans-pinocarveol (11%), beta-selinene (9%), beta-caryophyllene (9%) and
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
12
artemisia ketone (3%) (Juteau, Masotti, Bessiere, Dherbomez, & Viano, 2002).
Minyak tersebut merupakan metabolit sekunder yang kaya akan senyawa
terpenoid. Contoh umum terpenoid adalah methanol, camphor (monoterpen),
famesol, dan artemisinin (sesquiterpenoid). Artemisinin dan derivatifnya alpha-
arteether digunakan sebagai antimalaria. Terpen atau terpenoid aktif terhadap
bakteri, fungi, virus, dan protozoa. Mekanisme kerja terpen belum diketahui
dengan baik dan dispekulasi terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa
lipofilik (Anonim, 2005). Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada
mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang
sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah
Bacillus polymixa (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit dapat memproduksi
senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya. Dari hasil
penelitian Simanjuntak (2004), diketahui bahwa mikrobia endofit (Bacillus
polymixa) hasil isolasi dari tanaman A.annua L dapat memproduksi senyawa
antimalaria artemisinin.
D. Rekombinasi Genetik
Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia
endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang
diduga sebagai akibat terjadinya transfer genetik (genetic recombination) dari
tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri endofit dari
tanaman Artemisia annua L. diduga melalui cara transformasi. Transformasi
merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Bessiere+JM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Dherbomez+M%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Viano+J%22%5BAuthor%5D
-
13
DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA
atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau organisme lainnya.
DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan
DNA bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan (Tjahjoleksono, 2005).
Proses transfer genetik ini melibatkan juga enzim restriksi, enzim restriksi
adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik
yang jumlahnya terbatas, potongan molekul DNA ini disebut fragmen restriksi.
Fragmen restriksi berupa fragmen DNA untai-ganda dengan sedikitnya satu ujung
untai-tunggal, yang disebut ujung lengket (Campbell et al, 2002). Ujung lengket
plasmid bakteri endofit akan berpasangan dengan ujung lengket yang
berkomplementer dari fragmen DNA A.annua L sehingga didapatkan plasmid
rekombinan. Sel bakteri endofit kemudian mengambil plasmid rekombinan
dengan mekanisme transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA
oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri
(DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari
sel bakteri lainnya atau organisme lainnya (Tjahjoleksono,2005). Menurut Radji
(2005), kemampuan bakteri endofit dalam memproduksi senyawa metabolit
sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan suatu koevolusi
antara bakteri endofit dengan tanaman inangnya. Koevolusi adalah pengaruh
mutual pada evolusi dari dua spesies berbeda yang berinteraksi satu sama lain dan
yang secara timbal balik saling mempengaruhi adaptasi masing-masing (Campbell
et al, 2002).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
14
E . Bakteri Uji
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif
dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena tetap mengikat
kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun diberi larutan pemucat
(alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks kristal
violet-yodium larut sewaktu pemberian larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh
cat lawan yang berwarna merah (Lay, 1994). Dalam penelitian ini, bakteri yang
digunakan sebagai bakteri uji bersifat gram positif yaitu Staphylococcus aureus
dan sebagai gram negatif adalah Eschericia coli.
1. Eschericia coli
E.coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang lurus,
bergerak dengan flagel atau tidak dapat bergerak, mudah tumbuh dengan
pembenihan sederhana. Pada pembiakan, E.coli membentuk koloni bulat
konveks, halus, dan pinggir-pinggir nyata (Jawetz et al, 1986). E.coli
termasuk dalam genus Eschericia, dengan ciri berukuran 1,1-1,5 m x 2,0-6,0
m, bersifat fakultatif anaerob, tumbuh dengan optimal pada suhu 37 0 C.
Memberikan reaksi negatif untuk tes oksidase, hidrolisis urea, tes H2S, dan tes
sitrat, mereduksi nitrat, memberikan reaksi positif untuk tes katalase dan tes
Methylen Red (Holt et al, 2000).
E.coli adalah anggota flora usus normal, umumnya tidak menyebabkan
penyakit bila masih dalam usus. E.coli dapat menyebabkan penyakit bila telah
mencapai jaringan di luar tractus digestivus, seperti saluran kemih, saluran
empedu, paru-paru, peritoneum, dan selaput otak (Jawetz et al, 1996).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
15
E.coli adalah penyebab yang paling lazim dari infeksi saluran kemih dan
merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90%
wanita muda. E.coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di
seluruh dunia, dan diklasifikasikan oleh ciri khas sifat-sifat virulensinya
(Jawetz et al, 1996).
Bila pertahanan inang normal tidak mencukupi, E.coli dapat memasuki
aliran darah dan menyebabkan sepsis. E.coli merupakan penyebab meningitis
pada bayi, dan E.coli merupakan penyebab pada sekitar 40% kasus meningitis
neonatal (Jawetz et al, 1996).
2. Staphylococcus aureus
S.aureus adalah jenis bakteri yang berbentuk bulat, berdiameter kurang
lebih 1 m, hidup bergerombol seperti buah anggur. Berdasar pengecatan
gram, S.aureus termasuk gram positif yang ditunjukkan dengan warna ungu.
S.aureus mempunyai ciri dapat memfermentasi manitol yang dapat
memberikan warna kuning keemasan pada tes biokimiawi, memberi reaksi
positif terhadap reaksi katalase dan koagulasi (Jawetz et al, 1996).
S.aureus termasuk dalam genus Staphylococcus yang mempunyai ciri non
motil, tidak mempunyai spora, dan bersifat fakultatif anaerob. Koloni dari
Staphylococcus tidak tembus cahaya (opaque), berwarna putih atau krem, dan
kadang berwarna kuning sampai orange, memberi reaksi negatif pada tes
oksidasi, mereduksi nitrat menjadi nitrit. Staphylococcus sering ditemukan
pada produk makanan, sampah, dan air (Holt et al, 2000).
S.aureus sering menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, densitas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
16
kolonisasi antara lain pada kulit dan selaput lendir manusia, juga menginfeksi
berupa bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah (Jawetz et
al, 1996).
Pada suhu 300C pertumbuhannya sangat cepat, sedangkan pembentukan
pigmen terbaik pada suhu 200C. Koloni pada pembenihan padat berbentuk
bulat, halus, menonjol, dan berkilauan, membentuk pigmen warna kuning.
S.aureus dapat menjadi resisten terhadap banyak zat antimikrobia dan
menyebabkan masalah pengobatan menjadi sulit. Penanahan setempat adalah
kekhususan infeksi S.aureus (Trihendrokesowo, 1986).
F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia
Potensi antimikrobia dapat ditetapkan dengan berbagai cara antara lain :
1. Metode Difusi
Cara ini berdasarkan kemampuan obat untuk berdifusi dalam medium
tempat mikrobia dapat berkembang biak secara optimal. Disk antibiotik
diletakkan di atas agar atau bila dengan metode sumuran antibiotik
dimasukkan dalam sumuran. Besarnya daerah difusi tergantung dengan
daerah pertumbuhan atau hambatan mikrobia uji dan sebanding dengan
kadar obat yang diberikan. Pada pelaksanaannya, metode difusi ada
beberapa cara, yaitu:
a. Cara Kirby Bouwer
Cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi mikrobia
tertentu, umumnya 106 Colony Forming Unit (CFU) per-ml pada
permukaan medium hingga merata. Kertas disk yang mengandung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
17
antibiotik diletakkan di atas medium lalu diinkubasikan pada suhu
37oC selama 18-24 jam, setelah itu dibaca hasilnya. Cara ini dikenal 2
macam zona, yaitu:
1). Zona radikal adalah suatu daerah di sekitar disk yang sama sekali
tidak ditemukan adanya pertumbuhan mikrobia.
2). Zona irradikal adalah suatu daerah disekitar disk yang
menunjukkan pertumbuhan mikrobia yang dihambat oleh
antibiotik tersebut tetapi tidak dimatikan (Hugo & Russel, 1987;
Anonim, 1986).
b. Cara paper disc
Cara ini adalah cara yang paling banyak digunakan untuk
menentukan kepekaan mikrobia terhadap berbagai macam obat-obatan.
Cara ini menggunakan cakram kertas saring atau tablet yang
mengandung suatu obat dengan kekuatan tertentu yang diletakkan pada
lempeng agar yang telah ditanami mikrobia yang akan diperiksa.
Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak memperlihatkan
adanya pertumbuhan mikrobia di sekitar cakram. Lebar hambatan ini
tergantung pada daya resap obat ke dalam agar dan kepekaan mikrobia
terhadap obat tersebut.
Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam. Pada keadaan
tertentu mungkin dapat dilakukan pembacaan pendahuluan setelah
inkubasi selama 6-8 jam, untuk menguatkan kemudian diulang setelah
18-24 jam. Daerah hambatan diukur dalam satuan milimeter, dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
18
mengukur seluruh garis tengah hambatan dan cakram (Bonang &
Koeswardono, 1982).
c. Cara sumuran
Penyiapan dilakukan seperti cara Kirby Bouwer. Setelah biakan
siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus terhadap
permukaan agar, ke dalam sumuran diteteskan larutan uji lalu
diinkubasi selama 24 jam 37oC, setelah itu hasilnya dibaca seperti cara
Kirby Bouwer (Hugo & Russel, 1987).
2. Metode dilusi
Metode ini menggunakan senyawa anti mikrobia dengan kadar
menurun secara bertahap, baik dengan medium cair atau padat. Kemudian
medium diinokulasikan mikrobia uji dan diinkubasi. Tahap akhir dilarutkan
senyawa antimikrobia dengan kadar yang menghambat atau mematikan.
Pada uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya
dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair dengan
menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai, namun kini
ada cara yang sederhana dan banyak dipakai yakni menggunakan
microdilution plate. Keuntungan mikrodilusi cair adalah bahwa uji ini
memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikrobia yang
dibutuhkan untuk mematikan mikrobia uji (Jawetz et al ,2001).
G. Identifikasi Mikrobia
Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni suatu mikrobia
hasil isolasi perlu ditentukan morfologi sel individual, morfologi koloni, dan sifat-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
19
sifat biokimianya (fisiologi), patogenisitas dan serologinya (Jutono, Soedarsono,
Hartadi, Kabirun, Suhadi & Soesanto,1980)
Pada identifikasi mikrobia mula-mula diamati morfologi individual
secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai medium. Karena suatu
bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasar sifat-sifat morfologinya saja,
maka perlu diteliti pula sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhannya. Mikrobia yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam
kebutuhan nutrisi serta persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH, dan
sebagainya). Patogenesis mikrobia patogen dapat dipakai untuk membantu
identifikasi dan determinasi bakteri tersebut. Apabila suatu bakteri memiliki sifat
yang hampir sama (terutama yang patogen), maka perlu diselidiki sifat ekologinya
(Jutono dkk,1980).
Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan baku determinasi
oleh Holt et al (2000), yang memuat sifat-sifat bakteri yang telah dikenal.
1. Sifat Morfologi
a. Morfologi sel individual, meliputi :
1) Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel.
2) Ada tidaknya spora dan kedudukan spora.
3) Ada tidaknya flagella, kedudukan dan jumlah flagella.
4) Ada tidaknya kapsula.
5) Reaksi- reaksi pengecatan.
b. Morfologi koloni, meliputi : pertumbuhan, bentuk, ukuran, tekstur, bau,
konsistensi, kilat dan ciri- ciri optik dari isolat koloni bakteri pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
20
beberapa tipe medium yaitu medium agar miring, tegak dan cair. Pada
medium agar miring koloni bakteri diinokulasikan sepanjang agar secara
goresan dengan ose, pada medium agar tegak koloni bakteri
diinokulasikan secara tusukan, dan pada medium cair koloni bekteri
diinokulasikan langsung pada medium (Jutono dkk, 1980).
2. Sifat Biokimia
Pengujian sifat biokimia meliputi :
a. Pembentukan asam sulfida (H2S)
Uji ini bertujuan untuk menunjukkan adanya pembentukan H2S pada
medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Jutono dkk, 1980).
b. Dekarboksilase lisin
Uji ini bertujuan menunjukkan kemampuan bakteri dalam
mendekarboksilasi berbagai asam amino (Lay, 1994).
c. Pembentukan Indol
Uji pembentukan Indol menunjukkan adanya indol dan triptofan (Jutono
dkk, 1980).
d. Uji Methylen Red (MR)
Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran (Lay, 1994).
e. Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai
satu- satunya sumber karbon dan energi. Digunakan medium Simmon-
sitrat berupa medium padat (Lay, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
21
f. Uji katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen
peroksida ( H2O2 ) menjadi air dan O2. Pada bakteri yang bersifat
katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni
(Lay, 1994)
g. Tes oksidase
Uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang
ditemukan pada mikrobia tertentu (Lay, 1994).
h. Uji pencairan gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh dari tulang, tulang rawan atau
tenunan ikat hewani lainnya. Hidrolisis gelatin oleh mikrobia tersebut
dikatalisis oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang dicerna
tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair (Lay, 1994).
i. Uji oksidasi fermentasi (OF)
Uji ini bertujuan untuk menentukan kemampuan mikrobia untuk
memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi (Lay, 1994).
H. Keterangan Empiris
Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia
endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang
diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke
dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).
A.annua L. telah diketahui merupakan tanaman yang menjadi inang
untuk mikrobia endofit, pada tanaman ini diketahui bahwa ada suatu spesies
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
22
bakteri yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar
(Simanjuntak, dkk, 2004). Selain itu minyak essensial yang dihasilkan tanaman
A.annua L. juga diketahui menunjukkan aktivitas antibiotik (Juteau et al, 2002).
Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau
prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 2000). Untuk memperoleh
antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi,
1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif
untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).
Pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri dalam medium
produksinya dilihat dengan mengukur diameter zona hambat. Data untuk
identifikasi isolat bakteri endofit tersebut berupa data-data morfologi koloni,
morfologi sel, dan sifat-sifat biokimianya. Data hasil identifikasi bakteri endofit
kemudian dideterminasi dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al,
2000) untuk mengetahui genus dari bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman
A.annua L tersebut. Penelitian ini ditujukan untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L, dan untuk
menguji potensi isolat bakteri endofit dari tanaman A.annua L terhadap E.coli
dan S.aureus.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat
eksploratif-deskriptif. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas : senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit
yang diisolasi dari batang tanaman A. annua L.
b. Variabel tergantung : diameter zona hambat (mm).
c. Variabel pengacau terkendali : waktu inkubasi 24, 48, 72, 120 jam, suhu
inkubasi 370C; medium kultur tanaman inang yaitu MS (Murashige-
Shoog) medium; medium isolasi bakteri endofit, medium pemeliharaan
bakteri endofit, E.coli, dan S.aureus yaitu NA (Nutrient Agar); medium
produksi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yaitu NB
(Nutrient Broth); batang tanaman A.annua L. yang sehat dan berumur 6
bulan; volume isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang
diinokulasikan dalam paper disk sebanyak 40 L; volume suspensi E.coli
dan S.aureus setara dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml)
sebanyak 1 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
24
2. Definisi operasional
a. Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat
(BPTO) Tawangmangu dan diketahui bahwa ada suatu spesies bakteri
yang membentuk koloni dalam jaringan vaskular daerah batang sampai
akar tanaman A.annua L. ini.
b. Senyawa antibakteri adalah substansi yang dihasilkan oleh isolat bakteri
endofit dalam tanaman A.annua L. yang mampu menghambat
pertumbuhan atau membunuh E. coli dan S.aureus.
c. Bakteri endofit dari tanaman A.annua L. adalah bakteri yang membentuk
koloni dalam suatu sistem jaringan vaskular dari tanaman A.annua L.
yang dapat ditumbuhkan di MS Medium dan dapat menghasilkan
senyawa yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan
S.aureus.
d. Potensi antibakteri adalah kemampuan suatu zat atau substansi yang
dihasilkan oleh bakteri endofit dari tanaman A.annua L. yang mampu
menghambat atau mematikan bakteri E.coli dan S.aureus, ditandai
dengan adanya area hambatan di sekitar paper disk.
e. Eshericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Gadjah Mada, adalah bakteri uji, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri
gram positif yang bersifat patogen terhadap manusia.
f. MS (Murashige-Shoog) medium adalah medium kultur tanaman A.annua
L. MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
25
untuk mendukung pertumbuhan eksplan ( batang tanaman A.annua L. )
dan mengandung senyawa nitrogen yang berguna dalam regenerasi sel
eksplan.
C. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan penelitian
a. Tanaman Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman
Obat (BPTO) Tawangmangu dan berumur 6 bulan.
b. Biakan murni Eschericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus
ATCC 25923 dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada.
c. Medium kultur tanaman A.annua L yaitu MS (Murashige-Shoog)
medium dengan komposisi : NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O,
MgSO4.7H2O, KH2PO4, unsur hara mikro, sukrosa, agar, vitamin,
hormon BAP dan 2,4 Diklorofenoksi Asetat, FeSO4.7H2O dan Na2
EDTA,
d. Medium isolasi bakteri endofit yaitu Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L
dengan komposisi (g/L) : Lab-lemco powder 1,0; yeast extract 2,0;
peptone 5,0; sodium chloride 5,0 agar 15,0.
e. Medium produksi senyawa anti bakteri yaitu medium Nutrient Broth
(Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : Lab-lemco powder
1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0.
f. Medium pemeliharaan E. coli, S. aureus, bakteri endofit dan medium
identifikasi bakteri endofit :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
26
1) Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L dengan komposisi (g/L) : Lab-
lemco powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride
5,0 agar 15,0.
2) Nutrien Broth (Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : Lab-
lemco powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride
5,0.
g. Bahan untuk uji biokimia :
1) Uji Oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine.
2) Uji Katalase : reagens hydrogen peroksida (H2O2).
3) Uji hydrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
(Oxoid).
4) Uji Dekarboksilasi lisin : medium LIA (Lisin Iron Agar) (Oxoid).
5) Uji Indol : medium peptone water dan reagens Kovac.
6) Uji MR : medium MR VP (Methyl Red Voges Proskauer), methyl
red.
7) Uji hidrolisis gelatin : dengan komposisi Nutrient Broth (Oxoid) dan
12% gelatin.
8) Uji Fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco).
9) Uji Sitrat : medium Simmons Citrate (Oxoid).
10) Uji Pergerakan mikrobia : Nutrient Broth (Oxoid), 0,2% 0,4% Agar
Bacteriologycal (Oxoid).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
27
h. Bahan untuk pengecatan bakteri :
1) Pengecatan Gram : kristal violet, larutan iodine, alkohol 95%,
safranin.
2) Pengecatan Spora : Malachite green 5%, safranin.
3) Pengecatan Acid Fast : cat Ziehl Neelson Carbolfuchsin, methylen
blue, alkohol 95%.
i. Paper disc dengan diameter 6 mm.
j. Kontrol positif : Amoxicilin untuk injeksi (Danoxilin)
k. Kontrol negatif yaitu medium Nutrien Broth tanpa inokulasi mikrobia
endofit.
l. Larutan standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri 6.108
CFU/ml).
m. Aquadest steril.
n. Alkohol 70%.
o. Minyak emersi.
p. Sodium hipoklorit (Bayclin) untuk pembersihan batang A.annua L.
q. Tween 80 sebagai wetting agent pada proses pembersihan batang
A.annua L.
2. Alat penelitian
Autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd. Midorigouka Kamurashi, Tokyo,
Japan), Microbioogical Safety Cabinet (lokal), Inkubator (Memmert, tipe BE
400, Swahabach FRG, Germany), Vortex (Stuart Scientific); Neraca analitik
(Mettler Pc 2000); Sentrifuge (Heraeus Christ); Oven (WTC Binder);
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
28
Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30); mikropipet (Nichiryo 5000 DG),
Shaker Resiprok (Imorius Utrecht); beker glass (Pyrex), lemari pendingin
(Sharp, Japan), Cawan petri (Pyrex), kaca steril, pisau, botol kultur, Pipet
volume, Pipet tetes, glass firm, Tabung sentrifuge, Tabung reaksi, kaca arloji,
Erlenmeyer, Pinset, lampu spiritus, jarum inokulasi, penggaris, jarum ose, dan
alat- alat gelas.
D. Tahapan Penelitian
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.
Determinasi tanaman A.annua L. dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman
Obat ( BPTO ), Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dengan
menggunakan kunci determinasi menurut Backer ( 1968 )
2. Pengumpulan Batang Artemisia annua L.
Sampel batang yang sehat (bagus/ tidak rapuh) tanaman A.annua L. yang
diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ) Tawangmangu,
Karanganyar, Jawa Tengah, dipilih yang telah berumur dewasa, yakni yang
berumur 6 bulan. Sampel yang berupa batang disimpan di dalam kantong
plastik untuk mengurangi penguapan selama perjalanan dan penyimpanan
sementara.
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
a. Penimbangan unsur makro
Ditimbang bahan-bahan untuk unsur makro, antara lain : 1,65 g
NH4NO3 ; 1,9 g KNO3 ; 0,44 g CaCl2.2H2O ; 0,37 g MgSO4.7H2O ; 0,17
g KH2PO4.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
29
b. Pembuatan larutan stok
1) Pembuatan larutan stok hara mikro
Ditimbang bahan-bahan untuk stok mikro, antara lain : 41,5 mg
kalium iodida; 310,0 mg asam borat; 845,0 mg mangansulfat-
tetrahidrat; 430,0 mg sengsulfat-heptahidrat; 1,25 mg tembaga (II)
sulfat; 12,5 mg natriummolibdat-dihidrat; 1,25 mg kobalt (II) klorida-
heksahidrat.
Masing-masing bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam
Beaker Glass 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest, diaduk
hingga larut. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml,
diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium
dibutuhkan 5 ml larutan stok ini.
2) Pembuatan larutan stok besi
Besi (II) sulfat-heptahidrat ditimbang sebanyak 139 mg dan 186,5
mg natrium etilen diamin tetra asetat. Dilarutkan dalam aquadest
masing-masing 15 ml secara terpisah. Untuk natrium etilen diamin
tetra asetat dibantu dengan pemanasan. Setelah larut dicampur dalam
Erlenmeyer dan diaduk rata. Larutan tersebut kemudian dipindahkan
ke dalam labu ukur 50 ml. Erlenmeyer tersebut dibilas dengan sisa
aquadest dan masukkan dalam labu ukur tersebut sampai tanda. Untuk
1 liter medium dibutuhkan 5 ml stok ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
30
3) Pembuatan larutan stok vitamin
Erlenmeyer diisi dengan 50 ml aquadest, kemudian berturut-turut
dimasukkan 250,0 mg asam nikotinat; 250,0 mg piridoksin; 50,0 mg
tiamin; dan 100,0 mg glisin. Diaduk hingga jernih, kemudian
dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml. Ditambahkan aquadest
sampai tanda. Untuk 1 liter medium membutuhkan 5 ml larutan stok.
4) Pembuatan larutan stok mio-inositol
Ditimbang 10,0 mg mio-inositol, kemudian dimasukkan ke dalam
Beaker Glass satu liter yang terlebih dahulu telah diisi dengan 700 ml
aquadest. Setelah larut, dipindahkan ke dalam labu ukur 1 liter dan
diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium
dibutuhkan larutan stok sebanyak 10,0 ml.
c. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker
Glass 1000 ml, kemudian bahan- bahan nutrisi makro dimasukkan ke
dalam Beaker Glass, sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer.
Selanjutnya berturut-turut dimasukkan 5 ml larutan stok hara mikro; 5 ml
larutan stok besi; 5 ml larutan stok vitamin; serta 10 ml larutan stok mio-
inositol dalam campuran medium. Kemudian dimasukkan campuran 30 g
sukrosa dan 8-10 g agar. Aquadest ditambahkan sampai kurang lebih 1000
ml, diaduk, dan dipanaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih,
Beaker Glass diangkat dari pemanas. Zat pengatur tumbuh golongan
sitokinin yaitu BAP (Benzilaminopurin) ditambahkan sebanyak 1 ppm dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
31
medium dibagi menjadi tiga bagian untuk membuat variasi zat pengatur
tumbuh. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D). pH
larutan medium diatur 5,2- 5,6. Jika terlalu alkali ditambahkan HCl 1N,
tetapi jika terlalu asam ditambahkan KOH 1N. Larutan medium
dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan medium kurang lebih
satu cm. Botol tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil,
kemudian disterilisasi dengan autoklaf (121 C, 15 menit). Medium yang
telah disterilkan tersebut selanjutnya disimpan ke dalam inkubator.
4. Desinfeksi Batang Artemisia annua L.
Batang dicuci dengan air mengalir selama 5-10 menit. Setelah itu,
batang dicuci dalam 10 ml bayclin (commercial bleaching yang mengandung
5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian bilas dengan
aquadest steril sampai bersih.
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium
Batang tanaman Artemisia annua L. yang telah dibersihkan ditanam secara
aseptis ke dalam MS medium. Penanaman dilakukan dengan menggunakan
pinset steril dan batang yang telah dibersihkan dipotong sepanjang 0,5-0,8
cm dan ditanamkan ke permukaan MS medium dengan hati-hati. Penanaman
batang dalam posisi horisontal dengan bekas potongan tertanam di permukaan
MS medium, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, akan
tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
32
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate
Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan
isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk
mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Satu ose mikrobia yang didapat
diinokulasikan pada nutrient agar secara streak plate. Diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 24 jam. Akan didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah.
Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam
medium NA miring untuk stok mikrobia.
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli
dan S.aureus Secara Difusi Paper disc
a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Diambil 1 ose dari stok bakteri uji dari biakan murni E.coli ATCC
35218 dan S.aureus ATCC 25923, kemudian diinokulasikan pada Nutrien
Broth (NB) 9 ml sampai konsentrasi 6 x 108 CFU/ml (Larutan Standar
Mac Farland II).
b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap
E.coli dan S.aureus
Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 6 diuji potensi
antibakterinya terhadap E.coli dan S.aureus dengan metode Paper Disc
Agar Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian
ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth dan digojog menggunakan
shaker inkubator pada suhu 37 C dengan kecepatan 170 rpm selama 3-4
hari. Pemisahan biomassa sel dengan medium Nutrient Broth yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
33
mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam, supernatan
dipakai untuk skrining bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri.
Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 l
supernatan. Untuk mengurangi ekses air, paper disc dikeringanginkan di
atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1 jam. Mikrobia uji yaitu E.coli
dan S.aureus ditumbuhkan dalam NA secara pour platting pada petri yang
berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri uji E.coli dan S.aureus
sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Agar
yang sedang mencair pada temperatur 50oC lalu dituang ke dalam cawan
petri dan digoyang perlahan- lahan untuk mencampur kultur bakteri
dengan agar. Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi
supernatan ditempatkan di permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada
suhu 37oC selama 24 jam atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar
paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan mengukur diameter zona
jernihnya menggunakan penggaris.
8. Identifikasi Bakteri Endofit
a. Morfologi sel
1) Pengecatan Gram
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam,
difiksasi di atas pembakar spiritus. Diteteskan cat kristal violet dan
didiamkan selama 45 detik. Sisa cat dicuci dengan air mengalir lalu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
34
ditetesi larutan iodine dan didiamkan selama 1,5 menit. Dicuci dengan
air mengalir dan diberi larutan peluntur safranin, didiamkan selama 20
detik, kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan
menggunakan minyak immersi. Jika sel bakteri berwarna ungu berarti
isolat bakteri endofit yang diisolasi termasuk bakteri gram positif.
Tetapi jika sel bakteri berwarna merah berarti isolat bakteri endofit
termasuk bakteri gram negatif.
2) Pengecatan Spora
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dan
difiksasi di atas pembakar spiritus. Ditetesi dengan malachite green
dan dipanasi selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir lalu diberi cat
safranin dan didiamkan selama 30 detik kemudian dicuci di bawah air
mengalir lalu dikeringanginkan dan diamati di bawah mikroskop
dengan perbesaran kuat 1000X dengan minyak immersi. Spora
berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.
3) Pengecatan Acid Fast
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada
kaca obyek dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Lalu ditutup
dengan sepotong kertas filter, ditambah larutan carbolfuchsin dan
dipanaskan di atas pembakar spiritus dengan nyala api kecil.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
35
Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Dicuci
dengan larutan peluntur sambil digoyang- goyangkan sampai seluruh
warna dari carbolfuchsin tidak tampak. Dicuci dengan air mengalir dan
dikeringkan. Setelah itu ditambahkan dengan metylen biru selama 20-
30 detik. Dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat 1000X.
Bakteri yang tidak tahan terhadap pencucian asam akan berwarna biru
sedangkan bakteri yang tahan asam akan berwarna merah.
4) Uji pergerakan
Isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan
paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam diinokulasi dengan
cara tusukan dalam agar tegak dengan kandungan agar 0,2% 0,4%.
Akan tampak pergerakan bakteri yang berupa serabut- serabut halus
disekitar tusukan, pergerakan bakteri ini disebabkan karena bakteri
memiliki flagela.
b. Morfologi Koloni
Diinokulasikan biakan bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 ke dalam medium cair ( Nutrient
Broth), NA tegak dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan,
dan NA miring secara goresan dengan jarum ose. Diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 24 jam. Pada medium cair diamati pertumbuhan pada
permukaan, endapan yang terjadi, bau, dan kekeruhan. Pada NA tegak
diamati tingkat pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan.
Pada NA miring diamati tingkat pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
36
bekas tusukan, kilat, topografi, warna, ciri- ciri optik, bau, konsistensi dan
warna medium.
c. Uji biokimia
1) Uji pembentukan H2S
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dengan jarum inokulasi secara tusukan pada medium TSIA miring
dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan dengan
menggunakan ose. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC.
Pengamatan uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium
yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa
inokulasi bakteri endofit). Pembentukan H2S ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan hitam yang berarti bakteri mampu menghasilkan
senyawa desulfurase, selain itu dapat digunakan untuk mengamati
fermentasi gula. Jika pada bagian bawah medium berwarna kuning
sedang bagian atas berwarna merah berarti terjadi fermentasi glukosa.
Jika baik pada bagian atas ataupun bawah medium berwarna kuning
dan kadangkala disertai pembentukan gas berarti laktosa atau sukrosa
atau keduanya difermentasikan. Dan jika seluruh medium berwarna
merah berarti ketiga macam gula tidak difermentasikan.
2) Uji dekarboksilasi lisin
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
37
jam dengan cara tusukan dalam medium Lysin Iron Agar (LIA)
kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam.
Pengamatan uji dekarboksilasi lisin dilakukan dengan membandingkan
medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap
kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Hasil
diamati, positif bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning
pada umur 24 jam dan kemudian berwarna ungu kembali. Perubahan
warna menjadi kuning menandakan bakteri dapat melakukan
fermentasi dan kembali berwarna ungu yang berarti lisin mengalami
dekarboksilasi.
3) Uji Indol
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dalam masing- masing tabung reaksi yang berisi medium tripton
water. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu
ditambahkan reagen Kovac. Pengamatan uji Indol dilakukan dengan
membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit
terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Memberikan hasil
positif apabila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan
medium. Hal ini dikarenakan bakteri dapat menghasilkan enzim
triptofanase.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
38
4) Uji Methyl Red
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dengan jarum inokulasi pada masing- masing tabung yang berbeda
berisi medium MR-VP. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
Pengamatan uji Methyl Red dilakukan dengan membandingkan
medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol
(tanpa inokulasi bakteri endofit). Pada uji MR ditambah reagen methyl
red. Bakteri yang tidak dapat memfermentasikan gula akan merubah
warna menjadi merah pada uji MR. Sedangkan apabila terjadi
fermentasi gula, medium akan berubah menjadi kuning.
5) Uji sitrat
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam pada medium simmons citrate secara miring. Diinkubasi pada
suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan uji sitrat dilakukan dengan
membandingkan medium simmons citrate yang diinokulasikan isolat
bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).
Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri
mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon.
6) Uji katalase
Satu ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 diletakkan pada gelas benda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
39
Ditambahkan 1 tetes 30% H2O2. diamati dengan melihat terjadi atau
tidaknya pembentukan gelembung udara di sekitar koloni bakteri
endofit setelah diberi reagens 30% H2O2 dan dibandingkan dengan
kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). jika terjadi gelembung udara
berarti bakteri memiliki enzim katalase.
7) Uji Oksidase
Pada kertas saring diteteskan reagens tetrametil paraphenildiamin.
Pada kertas saring yang diberi reagens diletakkan 1 ose kultur isolat
bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik
pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam. Diamati hasilnya dengan melihat
apakah terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu tua
setelah diberi reagens dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa
inokulasi bakteri endofit). Jika terjadi warna ungu tua setelah
didiamkan selama 10 menit berarti hasil positif bahwa bakteri uji
memiliki enzim oksidase sitokrom. Sedangkan hasil negatif ditandai
dengan tidak terjadinya perubahan warna.
8) Uji hidrolisis gelatin
Diinokulasi kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam secara
tusukan pada medium dengan komposisi gelatin 12% dan nutrient
broth dengan takaran 13 gram/L kemudian diinkubasikan selama 72
jam. Setelah 72 jam, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30
menit. Diamati apakah terjadi pencairan gelatin atau tidak dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
40
dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).
Apabila terjadi pencairan gelatin berarti bakteri mampu menghasilkan
eksoenzim gelatinase.
9) Uji fermentasi karbohidrat
Dua tabung berisi medium O-F diinokulasi dengan kultur isolat
bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik
pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam menggunakan jarum inokulasi
secara tusukan dan dua tabung sebagai kontrol (tanpa inokulasi bakteri
endofit), tabung pertama ditetesi parafin dan tabung kedua tanpa
ditetesi parafin kemudian diinkubasikan pada