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Programma Operativo Regionale 2007IT051PO007 FSE Puglia

Percorso di batteriologia

IPPOCRATE 2012

Dirigente Scolastico: Prof.ssa Giovanna Caretto D.S.G.A.: Dott. Valterluigi Carluccio Coordinatore log.co e org.vo e Responsabile piattaforma Ansas - Resp. Pubblicità: Prof. Rollo Antonio Facilitatore: Prof. Enrico Peccarisi

Tutor scolastiche: Prof.ssa Maria Rosaria Arlotta Prof.ssa Alessandra Galizia Prof.ssa Luciana Tesorone Prof.ssa Patrizia Tommasi

Gruppo di lavoro:

Valentina Pesce Barbara Irno Consalvo Roberta Iovino Francesca Erroi Katia Monteduro

Percorso di Batteriologia

Tutor d’azienda: Dott.ssa Carla Colaci

MICROBIOLOGIA  

Il batterio è un microrganismo unicellulare procariota.

La cellula procariotica si distingue da quella eucariotica per:

•  Assenza di una membrana nucleare •  Struttura priva di compartimenti •  Presenza di un unico filamento di DNA

circolare

I batteri in base alla particolare struttura

della loro parete batterica si

suddividono in due gruppi:

•  Gram + •  Gram -

LA COLORAZIONE DI GRAM

La  colorazione  di  Gram  è  un  esame  di  laboratorio  che  perme6e  la  classificazione  dei  ba6eri  in  gram-­‐posi:vi  e  gram-­‐nega:vi  (gram+  e  gram-­‐).  

Fu  messo  a  punto  dal  medico  danese  Hans  Joachim  Chris:an  Gram  (1884)  e  me6e  

in  evidenza  alcune  proprietà  fondamentali  della  parete  cellulare  dei  ba6eri.  

Le  fasi  della  colorazione  sono  le  seguen::  

1.  Preparare  un  soKle  striscio  di  materiale  

2.      Fissare  il  materiale  sul  vetrino  passando  3-­‐4  volte  il  vetrino  sulla  fiamma  di  un            becco  Bunsen  

3.      Ricoprire  la  superficie  con  il  colorante  cristalviole0o  (  o  viole6o  di  genziana)  e          lasciarlo  agire  per  1  minuto  

4.        Coprire  il  preparato  con  il  Lugol  (iodio  in  ioduro  di  potassio)  e  lasciare  agire  per  1  minuto.  Successivamente  risciacquare  con  acqua                                                                      

5.        Lavare  la  superficie  con  il  decolorante  a  base  alcolica  

6.        Lavare  con  acqua  e  ricoprire  il  vetrino  con  il  colorante  di  contrasto  fucsina  (  o  safranina)  per  1  minuto,  quindi  risciacquare  

7.        Esaminare  il  preparato  al  microscopio  con  obieKvo  100x  ad  immersione  

I GRAM + al microscopio appaiono colorati in BLU SCURO perché la parete essendo più spessa ha trattenuto il primo colorante

I GRAM – risultano invece colorati in ROSSO/ROSA in quanto la parete è più sottile

Un’indagine è clinicamente efficace se contribuisce a:  

•  Individuare o escludere una malattia •  Aiutare il processo decisionale: valutazione sulla

possibilità di iniziare la terapia o sulla necessità di eseguire ulteriori indagini

•  Determinare la sensibilità del microrganismo agli antibiotici

•  Valutare la prognosi •  Monitorare il decorso clinico

LE FASI DELL’ ITER DIAGNOSTICO FASE PRE-ANALITICA

• Richiesta • Accettazione del campione che consiste in tamponi del distretto interessato (faringeo, vaginale, uretrale, congiuntivale...) o feci, urine, cute, liquido seminale e sangue (nel caso di sospetta batteriemia)

• Associazione univoca tra il campione e il codice assegnatogli.    

FASE ANALITICA Consiste nell’approccio diretto con il materiale. Il campione prelevato viene analizzato dapprima con un esame microscopico e poi attraverso una coltura.

L’esame microscopico può essere di due diversi tipi: •  Esame microscopico a fresco che rivela la

mobilità e la morfologia del batterio. •  Esame microscopico dopo colorazione

FASE ANALITICA

     I microrganismi isolati in coltura, se ritenuti patogeni, devono essere identificati e sottoposti a saggio di sensibilità agli antibiotici.

L’identificazione biochimica è basata sullo studio delle attività metaboliche del microrganismo.

L’antibiogramma è un esame che permette di valutare se un batterio è sensibile o resistente ad un determinato antibiotico. Seguendo questo procedimento si può stabilire la terapia più adatta.

IDENTIFICAZIONE  Il sistema di identificazione API è stato il sistema manuale utilizzato per lungo

tempo per la identificazione di batteri gram positivi, gram negativi fermentanti e non, lieviti.

Attualmente l’introduzione di terreni cromogeni, come il CPS, sono di grande aiuto per una identificazione presuntiva di molti microrganismi, per cui l’esecuzione sulla colonia batterica di pochi test biochimici è sufficiente per definire la specie batterica.

SISTEMA AUTOMATICO Il VITEK 2 è uno strumento di microbiologia che garantisce sicurezza e rapidità dei risultati dei test di identificazione dei microrganismi e dei saggi di sensibilità agli antibiotici ; è in grado di saggiare 32 antibiotici per i cocchi Gram + e 46 antibiotici per i bacilli Gram-.

Le card VITEK per l’identificazione e l’antibiogramma presentano 64 pozzetti contenenti reagenti biochimici o antibiotici. Nella card è preinserito il tubicino di trasferimento della sospensione del microrganismo e un’etichetta con codice a barre che permette il collegamento tra card e numero di riferimento del paziente.

Produzione di un referto FASE POST-ANALITICA

I terreni di coltura •  Il terreno di coltura è il mezzo NEL quale o SUL quale può avvenire lo

sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo. Le sue caratteristiche principali sono :

-  Concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica. -  Adeguato grado di umidità. -  Reazione (pH) adatta. -  Sterilità e protezione da qualsiasi inquinamento.

In base allo STATO FISICO si distinguono:

- Terreni LIQUIDI in cui i componenti sono sciolti in acqua e sterilizzati.

- Terreni SOLIDI i quali possono essere naturalmente tali o vengono solidificanti per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina..)

In base alla FUNZIONE si distinguono: -  Terreni di ARRICHIMENTO (o elettivi) : la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Possibili arricchimenti sono sangue lisato, emoglobina ecc necessari per la crescita di batteri “esigenti” dal punto di vista nutrizionale. -  Terreni SELETTIVI: A concentrazione nota che inibiscono o ralletano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Sono utilizzati in casi di campioni particolarmente contaminati. -  Terreni DIFFERENZIALI: Contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso.

Hektoen Enteric Agar: a destra nel terreno selettivo si ha la crescita della Klebsiella (lac più), a sinistra Salmonella (lac meno).

Fattori influenzanti la crescita:

Con il termine crescita si indica generalmente l’acquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). A seconda dei fattori della crescita dei batteri essi si definiscono OBBLIGATI se una condizione è necessaria per la crescita batterica e FACOLTATIVI se il microrganismo può crescere in quella condizione sebbene non necessaria (ad esempio un termofilo facoltativo può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse). Fattori influenzanti sono la TEMPERATURA, pH e OSSIGENO. Nel primo caso la maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, poi si suddividono in:

  Psicrofili 0-20 °C   Mesofili 10-50°C   Termofili 40-75°C   Ipertermofili 70-110 °C

In base al pH:   Acidofili : crescono al di sotto di pH 6 come funghi e lieviti   Neutrofili crescono in un intervallo di pH tra 6-8 come nel caso della maggior parte dei batteri   Alcalofili crescono a pH >8

In base all’ossigeno : Batteri AEROBI OBBLIGATI Vivono solo in presenza di O2 Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI Vivono in presenza/assenza di O2 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI Vivono in assenza di O2 Batteri MICROAEROFILI Vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)

1: I batteri aerobi obbligati si sviluppano in suferficie, in modo da assorbire la maggior quantità possibile di ossigeno. 2: I batteri anaerobi obbligati si raccolgono sul fondo, per evitare l'ossigeno. 3: I batteri aerobi-anaerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno,per cui si distribuiscono nel terreno di coltura,concentrandosi in maggiore quantità in prossimità della superficie (aerobi facolt.) o sul fondo (anerobi facolt.) . 4: I microaerofili si raccolgono nella parte superiore della provetta, ma non in testa; essi richiedono infatti ossigeno a bassa concentrazione. 5: Il metabolismo dei batteri aerotolleranti non è influenzato dalla presenza di ossigeno

Terreni di coltura e tecniche di semina.. L’allestimento delle colture microbiche comporta il trasferimento dei microorganismi in esame negli opportuni mezzi di crescita. La scelta della tecnica di semina è determinata dalle condizioni in cui si presenta il campione e dallo scopo per cui vengono predisposte. Le più comuni tecniche di semina sono:

-  Semina per striscio.

-  Tecnica per infissione.

-  Tecnica becco di clarino.

SEMINA  PER  STRISCIO  

Si utilizzano piastre contenenti terreno già solidificato. Il prelievo dell’inoculo viene effettuato con un’ansa. Prima di effettuare il prelievo l’ansa va sterilizzata alla fiamma di un bunsen e fatta raffreddare per non rischiare di uccidere i microrganismi dell’inoculo. La semina viene eseguita strisciando delicatamente con movimenti a zig-zag l’ansa sul terreno della piastra.

SEMIN

A PER STR

ISCIO

TECNICA PER INFISSIONE   Avviene mediante un ago ed è utilizzata per inoculare nei terreni

già solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule batteriche lungo una linea verticale, in profondità e quindi permette lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorisce l’osservazione delle forme mobili che manifestano una crescita diffusa a partire dalla linea dell’inoculo.

TECNICA A BECCO DI CLARINO   Si lascia la provetta contenente il terreno in

posizione orizzontale e si fa raffreddare. Si semina il campione per striscio con un' ansa sulla superficie del terreno nella provetta.

COPROLOGIA  

         La  coprologia  è  un  se6ore  della  microbiologia  che  si  occupa  dell’esame  delle  feci.  Una  delle  metodologie  più  comunemente  u:lizzate  è  l’esame  chimico-­‐fisico  che  in  una  prima  fase  consiste  nello  studio  di:    

 Consistenza  (poltacea,  formata  e  liquida)   Colore  (nocciola,  marrone,  verdastro  ed  ocraceo)   Odore  (fermentazione,  putrefazione)   Presenza  di  muco   Analisi  del  pH              In  una  seconda  fase  si  procede  alla  ricerca  del  sangue  occulto  e  all’esame  parassitologico.  

         Consiste  nella  ricerca  di  tracce  di  sangue  umano  nelle  feci:  rappresenta  uno  dei  marker  più  significa:vi  per  le  patologie  infiammatorie  e  neoplas:che  dell’intes:no.  L’esame  è  effe6uato  tramite  un  test  rapido  immunocromatografico  che  si  basa  sull’interazione  tra  an:corpi  monoclonali  ed  emoglobina  umana  (per  escludere  la  presenza  di  sangue  proveniente  da  carne  animale  ingerita).    

 È  finalizzato  alla  ricerca  di  parassi:  a6raverso  l’osservazione  microscopica  “a  fresco”  di  un  campione  di  feci  che  inizialmente  viene  filtrato  e  mescolato  con  della  fisiologica  e  successivamente  viene  centrifugato.  Al  microscopio  è  possibile  osservare  diversi  parassi:  come  la  giardia,  le  amebe,  la  tenia,  le  uova  di  ossiuri.    

Malaria          Un  caso  di  malaria  è:  

  Importato  se  l’infezione  è  stata  contra6a  al  di  fuori  della  zona  in  cui  viene  diagnos:cato;  

  Autoctono  se  l’infezione  è  stata  contra6a  localmente                                                                                                                                                                                                                                                                  

       Gli  agen:  eziologici  della  malaria  sono  protozoi  appartenen:  al  genere  Plasmodium.  Se  ne  conoscono  più  di  cento  specie  di  cui  qua6ro  interessano  l’uomo:  

•  Plasmodium  falciparum                                                              

•  Plasmodium  vivax                                                                                                          

•  Plasmodium  ovale  •  Plasmodium  malariae  

I  plasmodi  si  mol8plicano  per  schizogonia  nelle  cellule  del  parenchima  epa8co  (ciclo  pre–eritrocitario)  e  poi  nei  globuli  rossi  (ciclo  eritrocitario);  qui  si  formano  anche  i  gametoci8  che  vengono  ingeri8  dall’inseJo  veJore.  Nello  stomaco  della  zanzara  i  gametoci8  maturano  a  game8  e  si  accoppiano  a  dare  uno  zigote  mobile  (oocinete).  Segue  la  formazione  di  una  oocis8  con  numerosi  sporozoi8  (ciclo  sporogonico)  che  raggiungono  le  ghiandole  salivari  e  da  qui  vengono  inieJa8  all’uomo.      

Plasmodium  falciparum           È   la   specie   più   comune   nelle   zone   tropicali   e  subtropicali,   occasionalmente   zone   temperate.  Questo  :po  di  plasmodium  è  l’agente  eziologico  della  terzana  maligna,  cosidde6a  perché  può  essere  letale.  Il  ciclo  schizogonico  ema:co  si  completa  in  48  ore  e  gli  accessi  febbrili  si  ripetono  ogni  terzo  giorno.    

       Ha  la  stessa  distribuzione  di  P.  falciparum  ma  è  molto  meno  frequente;  è  responsabile,  infaO,  di  circa  il  5%  dei  casi  di  malaria  nel  mondo.  Esso  è  l’agente  eziologico  della  malaria  cosiddeJa  “quartana”,  perché  durante  gli  aJacchi  l’accesso  febbrile  si  verifica  ogni  72  ore.    

     

È  la  specie  più  diffusa  nelle  zone  temperate  ed  è  l’agente  eziologico    della  “terzana  benigna”,  responsabile  di  circa  il  40%  dei  casi  di  malaria  nel  mondo.  È  praticamente  assente  in  Africa  occidentale,  le  sue  infezioni  sono  caratterizzate  da  frequenti  ricadute;  la  malattia  è  raramente  letale.  

È  presente  in  Africa  tropicale  e  occasionalmente  nell’Oceano  Indiano  e  nel  Pacifico  occidentale  (Papua  e  Nuova  Guinea).  La  malattia  che  provoca  è  simile  a  quella  da  P.  vivax  ,  ma  più  benigna.  È  responsabile  di  una  bassa  percentuale  di  casi  di  malaria  nel  mondo  

           La  diagnosi  clinica  della  malaria  deve  essere  seguita  dalla  conferma      diagnos:ca  con  test  di  laboratorio.  Le  tecniche  diagnos:che  per  la  malaria  possono  essere  riunite  in:  

           metodi  dire8   diagnosi  microscopica  di  prepara:  ema:ci  colora:  con  Giemsa  o  con  fluorocromi  

 test  immunocromatografici   test  molecolari  

           metodi  indire8   test  immunologici                            Il  prelievo  deve  essere  fa6o  prima  che  il  paziente  inizi  la  terapia  e  tenendo  presente  che  i  parassi:  sono  più  numerosi  nel  sangue  qualche  ora  dopo  l’inizio  dell’accesso  febbrile.  Per  ogni  individuo  si  deve  alles:re  almeno  una  goccia  spessa  per  la  ricerca  del  parassita  e  uno  striscio  soKle  per  l’iden:ficazione  della  specie.        

L’inizio dell’era degli antibiotici.

La storia degli antibiotici comincia nel 1929 quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue colture aveva inibito intorno a sé la crescita del batterio. Inoltre, Fleming poté osservare che il brodo di coltura in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti altri microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica penicillina. Iniziava così l’era degli antibiotici il cui significato è letteralmente «contro la vita». Il termine nell'uso comune attuale indica un farmaco, di origine naturale (antibiotico in senso stretto) o di sintesi (chemioterapico),in grado di rallentare o fermare la proliferazione dei batteri. La loro caratteristica principale è la tossicità selettiva che gli permette di non agire sulle cellule eucariotiche (a differenza dei disinfettanti.)

L'antibiogramma (spesso indicato come ABG) è un esame in vitro che permette di valutare se un batterio è sensibile ad un determinato antibiotico.

•  inibizione della sintesi della parete cellulare (penicilline e cefalosporine)

•  alterazione delle membrane cellulari (polimixine)

•  inibizione della sintesi proteica (cloramfenicolo, eritromicina e tetracicline)

•  inibizione della sintesi degli acidi nucleici (actinomicina, mitomicine e acido nalidixico)

•  attività anti-metabolica o antagonismo competitivo (sulfamidici)

Resistenza antibiotica Acquisita: Si tratta di una

variazione informazionale e può essere cromosomica o endogena (quando il DNA batterico va incontro a mutazione) o extra-cromosomica (quando c’è trasferimento di materiale genetico da un microrganismo all’altro).

Naturale: si tratta di una resistenza naturale all’azione antibiotica, immutabile nel tempo, geneticamente determinata: es. resistenza di Klebsiella sp. ad ampicillina

Saggio di sensibilità agli antibiotici. Si possono utilizzare diverse tecniche di saggio di sensibilità agli antibiotici: - Antibiogramma secondo Kirby-Bauer -  Antibiogramma con il metodo delle diluizioni per la valutazione delle MIC (sistema automatico, E test)

MIC e MBC Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di

un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC).

-  MIC (Minimal Inhibitory Concentration ): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica.

-  MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri.  

Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare. 

• Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore.

• Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.

Interpretazione dei risultati.

L’interpretazione del saggio di sensibilità agli antibiotici permette di classificare il microrganismo come: - "sensibile" (l'antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati). - "intermedio“ (la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato). - "resistente" (l'antibiotico non ha effetto nei confronti del microrganismo).