penapisan inhibitor tirosinase pada empat spesies … · 2012 di laboratorium kimia ... pada tahun...
TRANSCRIPT
1
PENAPISAN INHIBITOR TIROSINASE PADA EMPAT
SPESIES FAMILI ASTERACEAE Chrysantemum morifolium R,
Gerbera jamesonii A, Dahlia rosea Cav, DAN Tagetes erecta
MEYSI ANNA FRANSISKA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
2
ABSTRAK
MEYSI ANNA FRANSISKA. Penapisan Inhibitor Tirosinase pada Empat Spesies
Famili Asteraceae Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonii A, Dahlia
rosea Cav, dan Tagetes erecta. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan
LATIFAH K DARUSMAN
Tujuan penelitian ini adalah menapis potensi inhibitor tirosinase dari 4
spesies famili Asteraceae. Penapisan ini dilakukan pada daun dan bunga
Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonii A, Dahlia rosea Cav, dan
Tagetes erecta. Sampel dikeringkan, lalu diekstraksi dengan n-heksana, etil asetat,
dan metanol. Aktivitas inhibisi diuji menggunakan spektrofotometer microplate
reader pada panjang gelombang 492 nm. Ekstrak etil asetat bunga D. rosea Cav
paling berpotensi sebagai inhibitor tirosinase (IC50 untuk monofenolase 18.42
µg/mL dan untuk difenolase 687.79 µg/mL) dibandingkan dengan jenis
Asteraceae lainnya. Sementara minyak atsiri yang paling aktif sebagai inhibitor
tirosinase diperoleh dari bunga T. erecta (IC50 monofenolase 1882.62 µg/mL dan
difenolase 1884.33 µg/mL). Kontrol positif yang digunakan ialah asam kojat yang
memiliki nilai IC50 untuk monofenolase sebesar 11.024 µg/mL dan difenolase
sebesar 84.19 µg/mL. Fraksionasi ekstrak teraktif dengan kromatografi lapis tipis
preparatif dengan fase gerak kloroform menghasilkan 12 fraksi. Fraksi teraktif
memiliki IC50 5.55 µg/mL untuk monofenolase dan 109.96 µg/mL untuk
difenolase dan diidentifikasi sebagai flavonoid.
ABSTRACT
MEYSI ANNA FRANSISKA. Screening of Tyrosinase Inhibitor from Four
Species of Asteraceae Family Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonii A,
Dahlia rosea Cav, and Tagetes erecta. Supervised by IRMANIDA BATUBARA
and LATIFAH K DARUSMAN
The research was conducted to screen the potency of tyrosinase inhibitor
from 4 species of Asteraceae family. The screening was performed on the leaves
and flowers of Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonii A, Dahlia rosea
Cav, and Tagetes erecta. The samples were dried and then extracted with n-
hexane, ethyl acetate, and methanol. The inhibition activity was tested by a
microplate reader spectrophotometer in 492 nm. The ethyl acetate extract of D.
rosea Cav flower was the most potent tyrosinase inhibitor (IC50 for
monophenolase 18.42 µg/mL and for diphenolase 687.79 µg/mL) compared with
the other Asteraceae species. The most active essential oils as inhibitor of
tyrosinase was obtained from T. erecta flower (IC50 for monophenolase 1882.62
µg/mL and for diphenolase 1884.33 µg/mL). Positive control used was kojic acid
with IC50 value of 11.02 µg/mL for monophenolase and 84.19 µg/mL for
diphenolase. Fractionation of the extract by preparative thin layer chromatography
with chloroform as mobile phase gave 12 fractions. The most active fraction had
IC50 of 5.55 µg/mL for monophenolase and 109.96 µg/mL for diphenolase, and
was identified as flavonoid.
3
3
PENAPISAN INHIBITOR TIROSINASE PADA EMPAT
SPESIES FAMILI ASTERACEAE Chrysantemum morifolium R,
Gerbera jamesonii A, Dahlia rosea Cav, DAN Tagetes erecta
MEYSI ANNA FRANSISKA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
4
Judul Skripsi : Penapisan Inhibitor Tirosinase pada Empat Spesies Famili
Asteraceae Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonii
A, Dahlia rosea Cav, dan Tagetes erecta.
Nama : Meysi Anna Fransiska
NIM : G44096019
Disetujui,
Pembimbing I
Dr Irmanida Batubara, SSi, MSi
NIP 19750807 200501 2 001
Pembimbing II
Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS
NIP 19530824 197603 2 003
Diketahui,
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA
Tiada kata terindah selain ungkapan rasa syukur dan terima kasih penulis
pada Tuhan Sang Pencipta yang telah memberikan inspirasi pada penulis sehingga
dapat menyelesaikan karya ilmiah berjudul “Penapisan Inhibitor Tirosinase pada
Empat Spesies Famili Asteraceae Chrysantemum morifolium R, Gerbera
jamesonii A, Dahlia rosea Cav, dan Tagetes erecta”. Karya ilmiah ini disusun
berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 hingga Mei
2012 di Laboratorium Kimia Analitik Institut Pertanian Bogor (IPB) Dramaga dan
Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Taman Kencana.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Irmanida Batubara, SSi, MSi
dan Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing yang telah
memberikan arahan, pengetahuan, motivasi, bimbingan, saran, dan doa selama
penelitian. Terima kasih kepada Pusat Studi Biofarmaka (PSB) Taman Kencana
yang sudah memberikan kesempatan penulis untuk melakukan penelitian di
laboratorium PSB. Terima kasih kepada Bapak dan Mama tercinta untuk
dukungan, motivasi, doa, serta kasih sayang yang tak pernah berhenti diberikan.
Terima kasih juga buat abang dan kakak iparku tersayang Bang Jeffry dan Kak
Diana, Robby Parlo, dan kedua adikku yang kusayangi Leo dan Adi atas
dukungannya dan kesetiaannya membantu penulis dengan penuh kasih selama
masa studi hingga proses penyusunan karya ilmiah ini.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada para laboran Kimia
Analitik Bu Nunung, Om Eman, Pak Engkos, Pak Dede, kepada seluruh analis di
laboratorium PSB, Mba Salina, teman-temanku Diah Daru, Lia, Irma, Fitri Siddiq,
Gina, Kak Doni, Kak Yana, Lalu, Zuzu, Niati, Ichsan, dan Cahya dan teman kos
di Bagunde 14 (Kak Epi, Kak Fina, Dyanika, Wisty, Friska, Naomi, Besty, Icha,
Ana Barokah, Shelo, Lesmi, Dina, dan Tri), seluruh teman peneliti di
Laboratorium Kimia Analitik, dan semua teman seperjuanganku di Ekstensi
Kimia atas bantuan dan kebersamaannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2012
Meysi Anna Fransiska
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Medan pada tanggal 18 Mei 1988 dari pasangan Bapak
Bahtera Peranginangin dan Ibu Rantemalem Purba sebagai putri kedua dari empat
bersaudara. Penulis lulus dari SMA Negeri 10 Pekanbaru pada tahun 2006 dan
pada tahun yang sama diterima di Program Diploma 3 Analisis Kimia IPB melalui
jalur reguler. Penulis lulus pada tahun 2009 dan melanjutkan pendidikan S1
melalui Program Alih Jenis Departemen Kimia IPB pada tahun yang sama.
Selama menjalani masa perkuliahan di IPB, Penulis pernah menjadi asisten
praktikum Kimia Analitik Layanan untuk Biokimia pada tahun ajaran 2011/2012.
Penulis juga pernah mengikuti Seminar Nasional Pokjanas TOI sebagai
pemakalah poster pada tahun 2012 di Unjani. Pada tahun 2009 penulis melakukan
praktik kerja lapangan di PT Smart Tbk dengan judul laporan “Perbandingan
Penentuan Karbon Organik Tanah Metode Black-Walkley secara Titrasi dan
Spektrofotometri UV-Vis”. Selain itu, penulis juga pernah melakukan magang di
LIPI Cibinong Bagian Mikrobiologi pada tahun 2008.
vi
vi
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ viii
PENDAHULUAN................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ................................................................................................ 1
Metode Penelitian ........................................................................................... 2
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identitas Sampel ............................................. Error! Bookmark not defined.
Kadar Air dan Abu .......................................................................................... 4
Ekstrak ............................................................................................................ 4
Aktivitas Inhibitor Tirosinase Ekstrak Kasar .................................................. 5
Fitokimia Ekstrak Kasar Aktif ........................................................................ 6
Hasil Analisis GC-MS .................................................................................... 6
Eluen Terbaik .................................................................................................. 7
Fraksi-fraksi KLTP ......................................................................................... 7
Analisis Spektrum FTIR Fraksi Teraktif ........................................................ 9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ......................................................................................................... 9
Saran ............................................................................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 9
LAMPIRAN .......................................................................................................... 12
vii
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kadar air dan abu famili Asteraceae ................................................................... 4
2 Rendemen ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol serta minyak atsiri
famili Asteraceae ................................................................................................ 4
3 IC50 ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol serta minyak atsiri
famili Asteraceae ................................................................................................ 5
4 Fitokimia ekstrak kasar dengan aktivitas inhibitor tirosinase ............................. 6
5 Senyawa dalam minyak atsiri bunga T. erecta.................................................... 7
6 Rendemen fraksi hasil pemisahan dengan KLTP ekstrak etil asetat
bunga D. rosea Cav ............................................................................................ 8
7 IC50 fraksi-fraksi hasil KLTP ekstrak etil asetat bunga D. rosea Cav ................ 8
8 Absorpsi inframerah gugus fungsi fraksi 1 (F1) pada ekstrak etil asetat
bunga D. rosea Cav ............................................................................................ 9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur piperiton dan piperitenon oksida ......................................................... 7
2 Struktur linalool . ................................................................................................ 7
3 Kromatogram ekstrak kasar etil asetat (*) dan 12 fraksi (F1–F12)
hasil KLTP. ......................................................................................................... 8
4 Warna hasil uji kualitatif flavonoid dengan KLT. Deteksi dilakukan
dengan sinar UV 365 nm dan dengan uap amonia. ............................................ 8
viii
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Prosedur penelitian ............................................................................................ 12
2 Identifikasi sampel famili Asteraceae ............................................................... 15
3 Kadar air serbuk daun dan bunga D. rosea Cav................................................ 18
4 Kadar abu serbuk daun dan bunga D. rosea Cav ............................................... 19
5 Rendemen ekstrak daun dan bunga D. rosea Cav............................................. 20
6 Contoh perhitungan IC50 monofenolase dan difenolase ekstrak
etil asetat bunga D. rosea Cav .......................................................................... 21
7 Kromatogram GC-MS minyak atsiri T. erecta ................................................. 22
8 Kromatogram eluen terbaik............................................................................... 22
9 Spektrum inframerah fraksi KLTP teraktif (Fraksi 1) ...................................... 23
1
1
PENDAHULUAN
Warna kulit bergantung pada 3 (tiga)
komponen menurut derajat yang bervariasi.
Jaringan memiliki warna inheren kekuningan
diakibatkan oleh kandungan karotena. Adanya
hemoglobin (Hb) beroksigen di dasar kapiler
dermis memberikan warna kemerahan. Warna
kecokelatan sampai kehitaman diakibatkan
oleh variasi jumlah pigmen melanin, satu-
satunya pigmen yang dihasilkan di kulit.
Prinsip utama dari produk pencerah kulit ialah
menghambat pembentukan melanin.
Enzim merupakan biokatalis yang
mampu meningkatkan laju reaksi kimia
tertentu tanpa ikut bereaksi (Montgomery et
al. 1993). Tirosinase merupakan enzim yang
mengatur biosintesis melanin. Pembentukan
melanin dapat dihambat dengan cara
menurunkan sintesis tirosinase atau
menghambat aktivitasnya (Hartanti &
Setiawan 2009). Enzim tirosinase bekerja
mengubah tirosin menjadi 3,4-
dihidroksifenilalanin (DOPA) dan kemudian
menjadi dopakuinon yang selanjutnya melalui
beberapa tahap transformasi dikonversi
menjadi melanin (Fitrie 2004).
Inhibitor tirosinase akan menghambat
reaksi pencokelatan atau pembentukan
melanin. Berbagai inhibitor tirosinase telah
banyak digunakan dalam bahan kosmetik
sebagai pencegah hiperpigmentasi, di
antaranya adalah asam askorbat, arbutin, asam
kojat, merkuri, dan hidrokuinon. Dari
beberapa senyawa tersebut, asam kojat
memiliki efek inhibisi dan kestabilan paling
besar, namun menurut Miyazawa dan Tamura
(2007), asam kojat bersifat karsinogenik.
Bunga famili Asteraceae memiliki ragam
yang sangat banyak di dunia maupun di
Indonesia sekalipun. Famili Asteraceae atau
Compositae diwakili oleh sekitar 900 genus
dan 13000 spesies antara lain
Chrysanthemum, Gerbera, Dahlia, dan
Tagetes. Bunga Chrysanthemum atau krisan
aslinya berasal dari negara-negara Asia
Timur, seperti Jepang, Cina, dan Korea.
Krisan memiliki sekitar 30 spesies tanaman
berbunga. Ekstrak bunga spesies Bellis
perennis (Daisy) yang termasuk ke dalam
genus Chrysantemum famili Asteraceae dapat
digunakan sebagai pencerah (pemutih) kulit
alami, membantu mengencangkan kulit,
mengontrol bintik-bintik akibat usia, dan
menyeimbangkan hiperpigmentasi (Jhon et al.
2005). Beberapa contoh spesies
Chrysanthemum ialah C. morifolium R, C.
indicum, dan C. daisy (Allison 2010).
Gerbera merupakan tanaman bunga hias
yang diduga berasal dari Afrika Selatan dan
Swaziland. Salah satunya ialah Gerbera
jamesonii (Mattjik 2010). Tanaman hias
Gerbera merupakan salah satu penghasil
minyak atsiri dan digunakan sebagai bahan
baku industri minyak atsiri dan digunakan
sebagai bahan baku industri minyak wangi,
sabun, dan kosmetik (Agronomi 2010).
Bunga Dahlia termasuk tanaman perdu
atau akar berumbi yang sifatnya tahunan,
salah satunya ialah Dahlia rosea Cav.
Tanaman dahlia memiliki kandungan kimia
flavonoid. Bila ditinjau dari sejarahnya,
Dahlia sudah sejak lama digunakan sebagai
tanaman obat (Mattjik 2010).
Secara umum, Tagetes disebut bunga
marigold. Tanaman ini aslinya berasal dari
Amerika Utara dan Selatan. Tanaman ini
termasuk famili Asteraceae, beberapa spesies
di antaranya lebih dikenal dengan nama
“Tagette”. Selain itu, minyak ini dapat
diaplikasikan dalam produk makanan, antara
lain kola, minuman beralkohol, permen,
gelatin, puding, dan bumbu (Babu & Kaul
2007). Spesies Tagetes minuta diketahui
memiliki potensi sebagai inhibitor tirosinase
(Chairi et al. 2009). Beberapa spesies lainnya
dari genus ini ialah Tagetes erecta, T. filifolia,
T. lacera, T. lucida, T. patula, T. tenuifolia
(Sukarman & Chumaidi 2010).
Penelitian ini dilakukan untuk
menentukan senyawa aktif sebagai inhibitor
tirosinase pada beberapa spesies dalam famili
Asteraceae. Spesies yang diteliti meliputi C.
morifolium R, G. jamesonii A, D. rosea Cav,
dan T. erecta
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah peralatan
kaca, shaker, inkubator, oven, tanur, pelat
kromatografi lapis tipis (KLT), pelat 96
sumur, penguap putar, neraca analitik, multi-
well plate reader, vorteks, spektrofotometer
inframerah transformasi Fourier (FTIR)
(Brucker), dan lampu ultraviolet (UV) 254
dan 365 nm.
2
2
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain ialah bunga dan daun
C. morifolium Ramat, G. jamesonii Adlam, D.
rosea Cav dari Berastagi Sumatra Utara, dan
T. erecta dari daerah Cipanas, Jawa Barat,
metanol, etanol, kloroform p.a, etil asetat,
aseton, dietil eter, dimetil sulfoksida (DMSO),
bufer fosfat pH 6.5, dietil eter, serbuk Mg,
H2SO4 p.a, NH4OH, amil alkohol, n-heksana,
diklorometana, FeCl3 1 %, akuades, enzim
tirosinase dari jamur (Sigma, 333 unit/mL),
asam kojat, dan L-DOPA 2 mM atau L-tirosin
2 mM.
Metode Penelitian
Metode penelitian ini meliputi
penyulingan minyak atsiri, persiapan sampel,
uji pendahuluan, ekstraksi, uji fitokimia
(alkaloid, saponin, flavonoid, steroid, dan
tanin), penentuan eluen terbaik, uji inhibisi
tirosinase, analisis kromatografi gas-
spektrometri massa (GC-MS), serta
identifikasi gugus fungsi dengan FTIR.
Metode keseluruhan dapat dilihat pada
Lampiran 1
Penyulingan Minyak Atsiri (Harborne
1987).
Bunga atau daun T. erecta dan D. rosea
Cav yang telah dirajang dimasukkan dalam
labu bulat yang berisi air lalu direbus. Uap air
yang bercampur dengan minyak atsiri berubah
fase menjadi cair setelah melewati kondensor.
Minyak yang dihasilkan ditampung, lalu
dipartisi dengan etil asetat dan diuapkan
dengan penguap putar.
Preparasi dan Ekstraksi (Batubara et al.
2010)
Bagian daun dan bunga dipisahkan,
masing-masing dikeringkan kemudian
digiling. Setelah itu, sampel direndam dalam
n-heksana, etil asetat, dan metanol dengan
nisbah 1:10 selama 24 jam sebanyak 3 kali
ulangan. Ekstrak disaring dengan kertas
saring dan filtrat dipekatkan dengan penguap
putar pada suhu 30 oC. Rendemen tiap ekstrak
ditentukan.
Penentuan Kadar Air (Sulaiman et al.
2005)
Cawan porselen dikeringkan di dalam
oven 105 oC selama 30 menit, didinginkan
dalam desikator selama 30 menit dan
ditimbang (W1). Sebanyak 3 g sampel (W2)
dimasukkan dalam cawan lalu dikeringkan
dalam oven bersuhu 105 oC selama 4 jam,
didinginkan dalam desikator selama 15 menit,
dan ditimbang. Pengukuran bobot sampel ini
diulangi setiap 1 jam sampai diperoleh bobot
konstan (W3).
Kadar air (%) = %10012
32
WW
WW
Penetapan Kadar Abu (Sulaiman et al.
2005)
Cawan porselen dikeringkan di dalam
tanur 600 oC selama 30 menit, kemudian
didinginkan dalam desikator selama 30 menit
dan bobot awal ditimbang (X). Sebanyak 3 g
sampel (Y) dimasukkan ke dalam cawan,
dipijarkan di atas nyala pembakar Bunsen
sampai tidak berasap lagi, kemudian
dimasukkan ke dalam tanur 600 oC selama 30
menit. Cawan berisi abu ditimbang kembali
(Z).
Kadar abu (%) = %100Y
XZ
Uji Inhibisi Tirosinase (Batubara et al.
2010)
Ekstrak n-heksana, etil asetat, metanol
dan minyak atsiri yang sudah dipartisi dengan
etil asetat (daun dan bunga Asteraceae)
dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasi
10000 µg/mL. Larutan stok kemudian
disiapkan dengan melarutkan ekstrak ke
dalam bufer fosfat 50 mM (pH 6.5) hingga
diperoleh konsentrasi 2857 µg/mL.
Setelah itu, ekstrak dan asam kojat
sebagai kontrol positif diuji mulai konsentrasi
7.81 hingga 2000 µg/mL dalam pelat tetes 96
sumur. Sebanyak 70 µL ekstrak pengenceran
ini masing-masing digabungkan dengan 30
µL enzim tirosinase (Sigma, 333 unit/mL
dalam bufer fosfat). Pelat diinkubasi pada
suhu kamar selama 5 menit, kemudian
ditambahkan 110 µL substrat L-tirosin 2 mM
atau L-DOPA 2 mM dan diinkubasi kembali
selama 30 menit pada suhu kamar. Larutan
pada setiap sumur diukur dengan
menggunakan multi-well plate reader pada
panjang gelombang 492 nm untuk
menentukan persen inhibisi dan nilai
konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen
inhibisi dihitung dengan cara membandingkan
serapan sampel sebelum penambahan ekstrak
(A) dengan setelah penambahan ekstrak (B):
Inhibisi (%) = %100
A
BA
3
3
Uji Fitokimia
Uji fitokimia merupakan uji pendahuluan
untuk mengetahui kandungan kimia alkaloid,
steroid, saponin, flavonoid, tanin, dan fenol
secara kualitatif (Harborne 1987). Uji
fitokimia dilakukan terhadap ekstrak n-
heksana, etil asetat, dan metanol.
Uji Alkaloid. Ekstrak dengan bobot
tertentu dilarutkan dengan 10 mL kloroform
dan beberapa tetes NH4OH kemudian disaring
ke dalam tabung tertutup. Ekstrak kloroform
dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes
H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan
ke dalam tabung reaksi lain. Lapisan asam ini
diteteskan ke lempeng tetes dan ditambahkan
pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf
yang akan menimbulkan endapan dengan
warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah
jingga jika ekstrak mengandung alkaloid.
Uji Saponin dan Flavonoid. Ekstrak
dengan bobot tertentu dimasukkan ke dalam
gelas piala besar kemudian ditambahkan 100
mL air panas, dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan
untuk pengujian. Uji saponin dilakukan
dengan mengocok 10 mL filtrat di dalam
tabung reaksi tertutup selama 10 detik
kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya
saponin ditunjukkan dengan terbentuknya
buih stabil. Sebanyak 10 mL filtrat yang lain
ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 2 mL alkohol
klohidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95%
dengan volume yang sama), dan 20 mL amil
alkohol kemudian dikocok kuat-kuat.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan
jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan
adanya flavonoid.
Uji Steroid. Ekstrak dilarutkan dengan
25 mL etanol panas (50 oC) kemudian disaring
ke dalam pinggan porselen dan diuapkan
sampai kering. Residu ditambahkan eter,
dipindahkan ke lempeng tetes, lalu
ditambahkan 3 tetes anhidrida asam asetat dan
1 tetes H2SO4 pekat (uji Lieberman-Buchard).
Warna merah atau ungu atau biru
menunjukkan adanya steroid.
Uji Tanin dan Fenol. Ekstrak
ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan
selama 5 menit, dan disaring. Ke dalam
sebagian filtrat ditambahkan larutan FeCl3 1
%. Warna hitam kehijauan menunjukkan
adanya tanin, sedangkan warna ungu, biru tua,
atau hijau menunjukkan senyawa fenolik.
Penentuan Eluen Terbaik
Sedikit ekstrak pekat sampel ditotolkan
pada pelat KLT. Setelah kering, pelat dielusi
dalam bejana yang telah dijenuhkan oleh uap
eluen pengembang. Eluen yang digunakan
adalah metanol, aseton, etil asetat, kloroform,
diklorometana, dietil eter, dan n-heksana.
Pemisahan dilanjutkandengan berbagai nisbah
campuran eluen yang menghasilkan noda
banyak dan terpisah. Noda hasil elusi diamati
di bawah lampu UV pada panjang gelombang
254 dan 365 nm.
Pemisahan Secara Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif (Nohong 2009)
Ekstrak pekat sebanyak ±0.2000 g
dilarutkan dalam etil asetat. Ekstrak
ditotolkan 2 cm dari tepi bawah pelat KLT
preparatif berukuran 20 20 cm2 sebagai
fase diam, dan dielusi dengan eluen kloroform
p.a. Campuran akan terpisah menjadi
beberapa fraksi. Pelat KLT preparatif yang
telah dielusi dibiarkan kering udara dan
disinari dengan lampu UV pada panjang
gelombang 254 dan 365 nm. Pita-pita
pemisahan yang tampak ditandai dengan
pensil. Masing-masing dikerok, ditampung
dalam tabung reaksi, dan diekstraksi dengan
etil asetat. Residu disaring, filtrat
dikumpulkan dan diuapkan pelarutnya untuk
mendapatkan padatan.
Identifikasi Senyawa
Sebanyak ±0.8000 mg sampel dihaluskan
bersama dengan 0.2004 g KBr dalam mortar
agat. Setelah halus dan bercampur, serbuk
dimasukkan ke dalam alat pencetak.
Lempengan yang diperoleh dimasukkan ke
dalam spektrofotometer FTIR.
Penentuan Senyawa dalam Distilat Kasar
Minyak Atsiri dengan GC-MS
Distilat kasar minyak atsiri yang memiliki
daya inhibisi paling tinggi pada enzim
tirosinase diinjeksikan ke dalam GC-MS
(Shimadzu-QP-5050A) dengan kolom kapiler
HP-5MS (0.25 mm 60 m 0.25 m)
dengan gas pembawa helium dan laju alir 45.0
mL/menit. Suhu kolom diawali 100 oC dengan
laju kenaikan suhu 7 oC/menit, selanjutnya
laju kenaikan suhu 5 oC/menit hingga 250
oC,
suhu injektor 250 oC, injeksi split. Kondisi
MS: energi ionisasi 70 eV dan kisaran bobot
molekul 50–550 m/z.
4
4
Identifikasi senyawa dilakukan dengan
membandingkan puncak spektrum massa
dengan yang terdapat dalam library index MS
Wiley Library. Persentase komposisi dihitung
dari luas puncak kromatogram.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identitas Sampel
Sampel yang digunakan adalah berbagai
spesies dari famili Asteraceae yang diperoleh
dari Cipanas, Jawa Barat. Bagian batang,
bunga, dan daun diidentifikasi di Herbarium
Bogoriensis, Bidang Botani Pusat Penelitian
Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) Cibinong, Jawa Barat.
Berdasarkan hasil identifikasi, sampel
bunga krisan, Gerbera, dahlia, dan Tagetes
yang digunakan adalah Chrysanthemum
morifolium Ramat dengan nomor spesimen
1135/IPH.1.02/If.8/VIII/2011, Gerbera
jamesonii Adlam dengan nomor spesimen
1180/IPH.1.02/If.8/VIII/2011, Dahlia
rosea Cav dengan nomor spesimen
1532/IPH.1.02/If.8/XI/2011, dan Tagetes
erecta dengan nomor spesimen
1136/IPH.1.02/If.8/VIII/2011. Hasil
identifikasi terlampir (Lampiran 2).
Kadar Air dan Abu
Jumlah air yang terkandung dalam suatu
bahan berbeda-beda bergantung pada
perlakuan yang dialami serta kelembapan
tempat penyimpanan bahan tersebut (Harjadi
1986). Suatu sampel dikatakan baik dan dapat
disimpan dalam jangka waktu lama bila
memiliki kadar air <10% karena akan relatif
terhindar dari kerusakan oleh mikrob
(Winarno 1992). Penentuan kadar air juga
berguna sebagai faktor koreksi rendemen serta
untuk memperkirakan masa simpan bahan
serta ketahanannya terhadap mikrob.
Kandungan air pada serbuk kering daun dan
bunga Asteraceae berkisar antara 7.84 dan
16.56% (Tabel 1). Perhitungan kadar air dapat
dilihat pada Lampiran 3.
Kadar abu menunjukkan kandungan
mineral, kemurnian, serta kebersihan suatu
bahan. Kadar abu yang diperoleh berkisar
5.61–15.91% (Tabel 1). Kadar abu pada
sampel daun lebih tinggi dibandingkan
dengan sampel bunga, menunjukkan
kandungan mineral yang lebih besar pada
sampel serbuk daun. Perhitungan kadar abu
ditunjukkan pada Lampiran 4.
Tabel 1 Kadar air dan abu famili Asteraceae Spesies Bagian Kadar (%)
Air Abu
C. morifolium Daun 7.84±0.05 15.59±0.24
Bunga 12.36±0.01 8.70±0.05
G. jamesonii Daun 9.81±0.04 10.02±0.22
Bunga 16.56±0.13 5.61±0.16
D. rosea Cav Daun 8.12±0.01 12.47±0.13
Bunga 9.51±0.05 7.39±0.03
T. erecta Daun 9.76±0.42 15.91±0.41
Bunga 8.71±0.03 6.67±0.03
Ekstrak
Ekstraksi bertingkat secara maserasi
dilakukan dengan menggunakan pelarut n-
heksana, etil asetat, dan metanol secara
berturut-turut selama 24 jam. Banyaknya
senyawa yang terekstraksi dapat dilihat dari
persen rendemen yang diperoleh (Tabel 2).
Pelarut n-heksana non polar sehingga
diharapkan mampu mengekstraksi senyawa-
senyawa yang mempunyai kepolaran rendah.
Pelarut etil asetat dengan kepolaran sedang
diharapkan mampu mengekstraksi senyawa-
senyawa dengan kepolaran sedang, sedangkan
pelarut metanol dengan kepolaran yang tinggi
diharapkan dapat mengekstraksi senyawa-
senyawa berkepolaran tinggi.
Rendemen tertinggi diperoleh dari ekstrak
metanol bunga dan daun pada setiap jenis
tanaman famili Asteraceae. Sifat polar pelarut
metanol mampu mengekstraksi komponen
senyawa aktif yang larut dalam cairan
ekstraselular dan intraselular (Harborne 1987).
Rendemen terendah diperoleh pada pelarut
yang berbeda-beda, yang menandakan
perbedaan tingkat kepolaran senyawa yang
terkandung dalam setiap jenis. Perhitungan
rendemen diperlihatkan pada Lampiran 5.
5
5
Tabel 2 Rendemen ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol serta minyak atsiri famili
Asteraceae
Spesies Bagian Rendemen ekstrak kering (%b/b)
n-heksana Etil asetat Metanol Minyak atsiri
C. morifolium R Daun 5.64±0.42 2.49±0.25 11.84±0.30 (-)
Bunga 4.76±0.11 2.29±0.33 28.54±0.32 (-)
G. jamesonii A Daun 4.88±0.67 10.73±0.18 20.97±0.49 (-)
Bunga 2.90±0.11 6.35±0.32 49.61±1.09 (-)
D. rosea Cav Daun 2.18±0.01 1.94±0.09 13.89±1.29 0.0263
Bunga 5.52±0.06 1.71±0.06 40.75±0.83 0.0019
T. erecta Daun 1.61±0.08 3.58±0.02 8.18±0.11 0.0116
Bunga 6.69±0.01 3.52±0.16 24.27±0.27 0.0091
Keterangan: (-) tidak dilakukan
Minyak atsiri diperoleh dari bunga dan
daun D. rosea Cav dan T. erecta yang
memiliki aroma paling khas. Rendemen
paling tinggi diperoleh dari bagian daun
(Tabel 2). Rendemen tertinggi (0.2630%)
berasal dari daun D. rosea Cav, terendah
(0.0019%) berasal dari bunganya. Rendemen
minyak atsiri sangat kecil dibandingkan
dengan ekstrak kasar. Hal ini dapat
disebabkan jumlah minyak atsiri dalam
sampel sangat sedikit dan distilasi minyak
tidak menggunakan sampel basah.
Aktivitas Inhibitor Tirosinase
Ekstrak Kasar
Daya inhibisi tirosinase ekstrak dan
minyak atsiri diukur sebagai nilai IC50
terhadap monofenolase dan difenolase.
Ekstrak etil asetat bunga D. rosea Cav didapat
memiliki aktivitas tertinggi sebagai inhibitor
tirosinase. IC50-nya tidak jauh berbeda dengan
kontrol positif (asam kojat) (Tabel 3), yaitu
18.42 µg/mL untuk monofenolase dan 687.79
µg/mL untuk difenolase. Perhitungan nilai
IC50 ekstrak kasar diberikan pada Lampiran 6.
Tabel 3 menunjukkan bahwa minyak atsiri
bunga T. erecta memiliki aktivitas paling baik
bila dibandingkan dengan bunga/daun D.
rosea Cav, namun nilai IC50-nya sangat kecil,
yaitu 1882.62 µg/mL untuk monofenolase dan
1884.33 µg/mL untuk difenolase. Minyak
atsiri bunga T. erecta dianalisis lebih lanjut
dengan GC-MS.
Tabel 3 IC50 ekstrak n-heksana, etil asetat, metanol, dan minyak atsiri famili Asteraceae
Monofenolase (µg/mL) Difenolase (µg/mL)
Sampel Bagian Ekstrak Ekstrak Ekstrak Minyak Ekstrak Ekstrak Ekstrak Minyak
n-
heksana
Etil
asetat Metanol atsiri
n-
heksana
Etil
asetat Metanol atsiri
C. morifolium R Bunga (-) (-) 1213.93 (*) (-) (-) (-) (*)
Daun 1579.06 (-) (-) (*) 1762.35 705.99 (-) (*)
G. jamesonii A Bunga (-) (-) 1395.15 (*) (-) (-) 525.15 (*)
Daun (-) (-) (-) (*) (-) (-) (-) (*)
D. rosea Cav Bunga (-) 18.42 359.6 (-) (-) 687.79 1304.61 1135.65
Daun (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
T. erecta Bunga (-) 48.92 22.58 1882.62 (-) 396.4 109.85 1884.33
Daun (-) 1387.3 - (-) (-) - - (-)
Asam kojat 11.02 84.19
Keterangan : (-) tidak mencapai IC50 hingga konsentrasi 2000 µg/mL, (*) tidak dilakukan
6
6
Tabel 4 Fitokimia ekstrak kasar dengan aktivitas inhibitor tirosinase
Fitokimia C. morifolium R
G. jamesonii A
D. rosea Cav
T. erecta
Daun Bunga Daun Bunga Daun Bunga Daun Bunga
A1 (-) * * * * * * *
A2 (-) * * * * (+) * (+)
A3 * (+) * (+) * (+) (-) (+)
B1 (+) * * * * * * *
B2 (+) * * * * (+) * (+)
B3 * (+) * (+) * (+) (+) (+)
C1 (+) * * * * * * *
C2 (+) * * * * (-) * (+)
C3 * (+) * (+) * (+) (-) (-)
D1 (-) * * * * * * *
D2 (-) * * * * (-) * (+)
D3 * (+) * (+) * (-) (-) (+)
E1 (-) * * * * * * *
E2 (-) * * * * (-) * (+)
E3 * (+) * (+) * (+) (-) (+)
F1 (-) * * * * * * *
F2 (-) * * * * (-) * (-)
F3 * (-) * (-) * (-) (-) (-)
G1 (+) (*) * * * * * *
G2 (+) (*) * * * (-) * (-)
G3 * (-) * (-) * (-) (+) (-)
Keterangan: (A) flavonoid, (B) alkaloid, (C) saponin, (D) tanin, (E) fenol, (F) triterpenoid, (G) steroid
(1) ekstrak n-heksana, (2) ekstrak etil asetat, (3) ekstrak metanol
(*) tidak diuji karena nilai IC50 monofenolase dan difenolasenya melebihi 2000 µg/mL.
Fitokimia Ekstrak Kasar Aktif
Ekstrak yang aktif terhadap inhibitor
tirosinase (Tabel 3) diuji fitokimia, hasilnya
ditunjukkan pada Tabel 4. Alkaloid terdapat
pada ekstrak metanol bunga C. morifolium R,
G. jamesonii A, dan D. rosea Cav serta
ekstrak etil asetat dan metanol bunga T.
erecta. Flavonoid terdapat pada semua ekstrak
yang aktif terhadap inhibitor tirosinase.
Saponin terdapat pada semua ekstrak bunga C.
morifolium R dan G. jamesonii A, ekstrak
metanol bunga D. rosea Cav, dan ekstrak etil
asetat bunga T. erecta.
Tanin terdapat pada ekstrak metanol
bunga C. morifolium R dan bunga G.
jamesonii A, serta ekstrak etil asetat dan
metanol bunga T. erecta. Senyawa fenolik
terdapat pada ekstrak metanol bunga C.
morifolium R, G. jamesonii A, dan D. rosea
Cav serta ekstrak etil asetat dan metanol
bunga T. erecta. Senyawa triterpenoid tidak
ada pada semua ekstrak yang aktif terhadap
inhibitor tirosinase. Senyawa steroid
ditemukan pada seluruh ekstrak daun T.
erecta. Dalam penelitian Chang (2009)
dinyatakan bahwa kandungan flavonoid dalam
ekstrak diduga akan memberikan efek inhibisi
yang cukup besar terhadap enzim tirosinase.
Hasil Analisis GC-MS
Identifikasi kandungan senyawa dalam
minyak atsiri bunga T. erecta dilakukan
dengan menggunakan instrumen GC-MS
(Shimadzu-QP-5050A) dan menghasilkan
kromatogram seperti ditunjukkan pada
Lampiran 7. Analisis kandungan senyawa
dilakukan dengan membandingkan m/z
puncak-puncak yang diperoleh dengan yang
terdapat dalam library index MS Wiley
Library. Data pada Tabel 5 diambil
berdasarkan persentase kemiripan yang paling
tinggi dengan data pada library.
7
7
Tabel 5 Senyawa dalam minyak atsiri bunga
T. erecta
Waktu
Komponen retensi Area (%)
(menit)
Linalool 4.27 0.78
cis-epoksi-osimena 4.71 2.51
Silana 5.23 0.52
Terpineol 5.28 2.97
Piperiton 6.00 15.34
β-Pinena 6.23 2.64
Fenol 6.31 0.34
Ketol 6.39 2.22
Isotimol 6.53 5.85
3-Terpinolenon 6.81 3.49
Eugenol 6.97 0.27
Piperitenon oksida 7.08 9.22
Prenitena 7.29 4.43
Sinerolon 7.37 0.34
α-Kurkumen 8.04 0.40
Spatulenol 8.96 0.69
β-Selinena 9.02 1.35
t-Muurolol 9.57 1.37
3-Oktabesena 10.51 1.65
Asam miristinat 11.81 1.73
Stearol 12.13 0.14
Heneikosana 12.68 1.35
Fitol 12.79 0.22
Trikosana 13.94 2.10
Lain-lain - Hingga 100%
Distilat kasar minyak atsiri bunga T.
erecta memiliki 90 senyawa dengan
komponen paling besar ialah piperiton
(15.34%) dan piperitenon oksida (9.22%)
(Gambar 1). Menurut laporan Jose dan
Rajalakshmi (2004), kandungan utama
minyak atsiri dalam T. erecta ialah linalool
(Gambar 2) yang tergolong monoterpena
asiklik (Harborne 1987).
Piperiton dan piperitenon oksida
berfungsi meningkatkan aktivitas antijamur
(Romagnoli et al. 2005). Sementara senyawa
linalool dilaporkan dapat menghambat enzim
tirosinase dengan nilai inhibisi 50.50%
(Nakatsu 2000). Oleh karena itu, senyawa
linalool pada minyak atsiri bunga T. erecta
diduga berperan sebagai inhibitor tirosinase.
. .
O
.
. .
O
O.
.CH4
Gambar 1 Struktur piperiton (a) dan
piperitenon oksida (b) (Brown
2010).
.
.
. .
OH
Gambar 2 Struktur linalool (Nakatsu et
al. 2010).
Eluen Terbaik
Pemilihan pelarut untuk fase gerak KLTP
dimulai dengan menguji 7 pelarut tunggal,
yaitu aseton, n-heksana, etil asetat, metanol,
diklorometana, kloroform, dan dietil eter.
Sampel yang digunakan ialah ekstrak yang
teraktif sebagai inhibitor tirosinase, yaitu
ekstrak kasar etil asetat bunga D. rosea Cav
dengan deteksi noda menggunakan lampu UV
254 dan 365 nm. Terlihat pada Lampiran 8,
pelarut kloroform menghasilkan noda
terbanyak dan terpisah dengan baik,
berjumlah 12 noda, maka dipilih sebagai eluen
terbaik.
Fraksi-fraksi KLTP
Fraksionasi ekstrak etil asetat bunga D.
rosea Cav dengan KLTP menggunakan eluen
kloroform menghasilkan 12 fraksi (Gambar
3). Noda hasil KLTP dikerok lalu dilarutkan
kembali dengan pelarutnya sampai tidak
berwarna. Setelah itu, dipekatkan dan dihitung
rendemennya (Tabel 6).
8
8
Gambar 3 Kromatogram ekstrak kasar etil
asetat (*) dan 12 fraksi (F1–F12)
hasil KLTP.
Tabel 6 Rendemen fraksi hasil pemisahan
dengan KLTP ekstrak etil asetat
bunga D. rosea Cav
Fraksi Jumlah Nilai Rf Bobot Rendemen
KLTP noda
(g) (%)
1
2
0.06, 0.14
0.0382
15.33
2
3
5
4
0.03, 0.05,
0.13, 1.17,
0.21
0.04, 0.11,
0.23, 0.26
0.0135
0.0135
0.0079
0.0079
5.42
3.17
3.17
4
4
0.04, 0.09,
0.14, 0.33
0.0111
4.45
5
6
2
6
0.04, 0.09
0.04, 0.15,
0.0089
0.0130
3.57
5.22
0.24, 0.53,
0.67, 0.81
7
5
0.04, 0.09,
0.58, 0.72,
0.0131
5.26
8 6
0.77
0.04, 0.71, 0.0086 3.45
0.77, 0.84,
0.86, 0.91
9
6
0.04, 0.09,
0.13, 0.84,
0.017
6.82
10 4
0.86, 0.91
0.03, 0.13, 0.0127 5.10
0.86, 0.91,
0.86, 0.91
0.0127
11
6
0.03, 0.06,
0.12, 0.15,
0.0148
5.94
12 8
0.15, 0.99
0.03, 0.13, 0.0103 4.13
0.14, 0.18,
0.23, 0.40,
0.78, 0.93
Fraksi hasil KLTP kemudian diuji
aktivitas inhibitor tirosinasenya dan
dibandingkan dengan ekstrak kasar. Fraksi 1
(F1) memiliki daya inhibisi paling besar, IC50
sebesar 5.55 µg/mL untuk monofenolase dan
109.96 µg/mL untuk difenolase (Tabel 7).
Aktivitas inhibitor tirosinase fraksi 1 (F1)
lebih besar daripada ekstrak kasarnya. Hal ini
menunjukkan bahwa pemisahan komponen-
komponen ekstrak akan menghasilkan
senyawa lebih murni dan lebih berpotensi
sebagai inhibitor tirosinase.
Tabel 7 IC50 fraksi-fraksi hasil KLTP ekstrak
etil asetat bunga D. rosea Cav
Fraksi KLTP IC50 (µg/mL)
Monofenolase Difenolase
F1 5.55
109.96
F5 326.67
-
F9 -
-
Ekstrak kasar
etil asetat 18.42
687.79
Asam kojat 11.02 84.19
Keterangan: (-) tidak mencapai IC50 hingga konsentrasi
2000 µg/mL.
Uji fitokimia lanjutan dilakukan dan
diperoleh bahwa F1 mengandung flavonoid.
Hasil ini didukung dengan analisis kualitatif
KLT menggunakkan eluen terbaik. Warna
noda yang tampak ketika disinari dengan
lampu UV 365 nm ialah kuning pucat
(Gambar 4a) dan setelah diuapi dengan
amonia menjadi kuning kunyit (kuning
semakin pekat) (Gambar 4b). Berdasarkan
hasil ini, F1 diduga merupakan golongan
flavon (Harborne 1987).
(a) (b)
Gambar 4 Warna hasil uji kualitatif flavonoid
dengan KLT. Deteksi dilakukan
dengan sinar UV 365 nm (a) dan
dengan uap amonia (b).
* F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 *
9
9
Analisis Spektrum FTIR Fraksi Teraktif
Fraksi F1 kemudian dianalisis dengan
spektrofotometer FTIR untuk menentukan
gugus-gugus fungsi yang ada. Serapan yang
dihasilkan memperkuat dugaan bahwa F1
tersebut merupakan flavonoid. Spektrum
FTIR dari F1 dapat dilihat pada Lampiran 9.
Analisis pada Tabel 8 menunjukkan serapan
ulur OH fenol, ulur C-H, C=O (ulur), C=C
aromatik, ulur C-O, dan C-C aromatik
(tekuk). Beberapa golongan senyawa
flavonoid yang diketahui dapat menginhibisi
enzim tirosinase di antaranya ialah flavanon,
flavonol, flavon, isoflavon, kalkon, dan
isoflavon (Chang 2009).
Tabel 8 Absorpsi inframerah gugus fungsi
fraksi 1 (F1) pada ekstrak etil asetat
bunga D. rosea Cav
Bilangan Literatur*
Gugus
Gelombang (cm-1) Dugaan
3383.63 3650–3300 ulur OH fenol
2851.55–2921.85 2700–3000 ulur C-H
1512.93 1550–1900 C=O (ulur)
1630.84 1400–1600 C=C aromatik
1165.42
795.17
1150–1200
675–900
uluran C-O
C-C aromatik
(tekuk)
Keterangan: * Pavia et al. (2001).
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak kasar etil asetat bunga D. rosea
Cav merupakan inhibitor tirosinase teraktif
dibandingkan dengan ekstrak dan minyak
atsiri spesies Asteraceae lainnya yang
diujikan. IC50 monofenolase dan difenolase
berturut-turut 18.42 dan 687.79 µg/mL.
Fraksionasi ekstrak tersebut dengan KLTP
menghasilkan fraksi 1 (Rf 0.06 dan 0.14)
sebagai inhibitor tirosinase teraktif dengan
IC50 monofenolase dan difenolase sebesar
5.55 dan 109.96 µg/mL dan diduga
mengandung flavonoid.
Saran
Perlu dilakukan uji lebih lanjut agar
diperoleh senyawa yang berperan dalam
menghambat enzim tirosinase pada fraksi dan
minyak atsiri yang teraktif.
DAFTAR PUSTAKA
Agronomi R. 2010. Tip Merawat Tanaman
Hias. Jakarta: AgroMedia Pustaka.
Allison R. 2010. Cosmeuceutical Skin
Nutrition Workbook. America: Wheeler
Pr.
Babu KG, Kaul VK. 2007. Variations in
quantitative and qualitative characteristics
of wild marigold (Tagetes minuta L.) oils
distilled under vacuum and at NTP.
Industrial Crops and Product: An Int J
26:241-251.
Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T,
Rahminiwati M, Djauhari E. 2010.
Potency of Indonesia medicinal plant as
tyrosinase inhibitor and antioxidant agent.
J Biol Sci 10:138-144.
Brown GW. 2010. The biosynthesis of
artemisinin (Qinghaosu) and the
phytochemistry of Artemisia annua L.
(Qinghao). Molecules 15:7603-7698.
Chang TS. 2009. An updated review of
tyrosinase inhibitor. J Mol Sci 10:2440-
2475.
Chairi ME, Joray MB, Ruiz G, Palacios SM,
Carpinella MC. 2010. Tyrosinase
inhibitory activity of native plants from
central Argentina: Isolation of an active
principle from Lithrea molleoides. Food
Chem 120:10-14.
Fitrie AA. 2004. Histologi dari melanosit. e-
USU Repository Universitas Sumatera
Utara 5:1-6.
Harborne. 1987. Metode Fitokimia.
Padmawinata K, penerjemah; Bandung:
Penerbit ITB. Terjemahan dari:
Phytochemical Methods.
Harjadi W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar.
Jakarta: Gramedia.
Hartanti L, Setiawan HK. 2009. Inhibitory
potential of some synthetic cinnamic acid
derivatives towards tyrosinase enzyme.
Indo J Chem 9:158-168.
Jhon S, Lorenz P, Petersen RD, Heldermann
M, Borchert S. 2005. Skin-lightening
agent with different pathways of action
on melanogenesis. SOFW-J 131:40-49.
10
10
Jose J, Rajalakshmi R. 2004.
Karyomorphometrical analysis and
chemical polymorphism in Tagetes erecta
and Tagetes patula. Philippine J
Sci.133:135-144. Mattjik NA. 2010.
Budidaya Bunga dan Tanaman Hias.
Bogor: IPB Pr.
Miyazawa M, Tamura N. 2007. Inhibitory
compound of tyrosinase activity from the
sprout of Polygonum hydropiper L.
(Benitade). Biol Pharm Bull 30:595-597.
Montgomery R, Conway TW, Spector AA.
1993. Biokimia Berorientasi pada Kasus-
Klinik. Staf Pengajar FKUI, penerjemah;
Jakarta: Binarupa Aksara. Terjemahan
dari: Biochemistry: A Case-Oriented
Approarch.
Nakatsu T, Lupo AT, Chinn JW, Kang RK.
2000. Biological activity of essential oils
and their constituents. Studies Nat Prod
Chem 21:571-631.
Nohong. 2009. Skrining fitokimia
Ophiopogon jaburan Lodd dari
Kabupaten Kolaka Provinsi Sulawesi
Tenggara. J Pembelajaran Sains 5:172-
178.
Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS. 2001.
Introduction of Spectroscopy: a Guide for
Student of Organic Chemistry. Ed ke-2.
Philadelphia: Saunders Coll.
Romagnoli C, Bruni R, Andreotti E, Rai MK,
Vicentini CB, Mares D. 2005. Chemical
characterization and antifungal activity of
essential oil of capitula from wild Indian
Tagetes patula L. Protoplasma 225:57-
65.
Sukarman, Chumaidi. 2010. Bunga tai kotok
(Tagetas sp.) sebagai sumber karotenoid
pada ikan hias. Di dalam: Perkembangan
Teknologi Pertanian. Prosiding Forum
Inovasi Teknologi Akuakultur; Yoyakarta,
25 Apr 2010. Yogyakarta: Perhimpunan
Teknologi Indonesia. hlm 803-807.
Sulaiman, Suparto, Eviati. 2005. Petunjuk
Teknis Analisis Kimia Tanah, Tanaman,
Air, dan Pupuk. Bogor: Balai Penelitian
Tanah.
Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi.
Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
12
12
LAMPIRAN
12
12
- Diidentifikasi (determinasi)
- Dipisahkan
Pengeringan dan pembuatan serbuk
Lampiran 1 Prosedur penelitian
a Preparasi sampel
Famili Asteraceae
Bunga
Serbuk bunga
Daun
Serbuk Daun
Penentuan kadar air
Penentuan kadar abu
13
Maserasi dengan n-heksana
Maserasi dengan etil asetat
Maserasi dengan
metanol
-Uji aktivitas inhibitor tirosinase
Didistilasi
b. Ekstraksi, distilasi, dan uji aktivitas awal sampel (lanjutan)
Serbuk bunga Serbuk daun
Ekstrak n-heksana
bunga dan daun Ampas
Ekstrak etil asetat
bunga dan daun Ampas
Ekstrak metanol
bunga dan daun Ampas
Ekstrak teraktif
inhibitor tirosinase
Bunga Daun
Minyak
atsiri bunga
Minyak atsiri teraktif
inhibitor tirosinase
Minyak
atsiri daun
Identifikasi
GC-MS
Senyawa
Inhibitor tirosinase
14
14
- Uji fitokimia
- Penentuan eluen terbaik
- Fraksionasi dengan KLTP
Uji aktivitas
- Uji kualitatif fitokimia
- Identifikasi dengan spektrofotometer IR
c. Fraksionasi ekstrak teraktif inhibitor tirosinase (lanjutan)
Ekstrak teraktif
inhibitor tirosinase
Fraksi hasil KLT
preparatif
Fraksi KLTP teraktif
Inhibitor tirosinase
15
15
Lampiran 2 Identifikasi sampel famili Asteraceae
(a) Hasil identifikasi bunga T. erecta dan C. morifolium R
16
16
(b) Hasil identifikasi bunga G. jamesonii A
17
17
(c) Hasil identifikasi bunga D. rosea Cav
18
Lampiran 3 Kadar air serbuk daun dan bunga D. rosea Cav
Sampel
Ulangan
Bobot (g)
Kadar air
(%b/b)
Rerata
kadar air
(%b/b)
SD
Cawan
kosong
Contoh
awal
Cawan+contoh
kering
Contoh
kering
Daun 1 1.9154 3.0109 4.6818 2.7664 8.12 8.12 0.01
2 1.9265 3.0225 4.7033 2.7768 8.13
3 1.9531 3.0248 4.7323 2.7792 8.12
Bunga 1 1.9157 3.0245 4.6543 2.7386 9.45 9.51 0.05
2 1.9260 3.0227 4.6612 2.7352 9.51
3 1.9533 3.0810 4.7400 2.7867 9.55
Contoh perhitungan kadar air:
Sampel daun D. rosea Cav (ulangan 1)
Bobot kering = (bobot kering bahan + bobot cawan kosong) - (bobot cawan kosong)
= 4.6818 g - 1.9154 g
= 2.7664 g
%100bahanbasah bobot
keringbobot -bahan basah bobot airKadar
= %100g 3.0109
g 2.7664- g 3.0109
= 8.12%
3n
i
i
n
xx
3
%12.8%13.8%12.8
%12.8
32
1 SD
n
i
i
n
xx
13
12.812.812.813.812.812.8 = SD
222
01.0 SD
19
19
Lampiran 4 Kadar abu serbuk daun dan bunga D. rosea Cav
Sampel Ulangan
Bobot (g) Kadar abu
(%b/b)
(%b/b)
Rerata
kadar abu
(%b/b)
SD Cawan
kosong
Contoh
awal
Cawan+contoh
kering
Contoh
kering
Daun 1 25.2091 3.0238 25.5841 0.375 12.4 12.47 0.13
2 28.6702 3.0015 29.0419 0.3717 12.38
3 28.1068 3.0145 28.487 0.3802 12.61
Bunga 1 22.8908 3.0044 23.1133 0.2225 7.41 7.39 0.03
2 27.9965 3.0020 28.2175 0.2210 7.36
3 26.7722 3.0085 26.9951 0.2229 7.41
Contoh perhitngan kadar abu:
Sampel daun D. rosea Cav (ulangan 1)
Bobot abu = (bobot cawan + bobot sampel) - (bobot cawan kosong)
= 25.5841 g – 25.5841 g
= 0.3750 g
%100sampelbobot
abu bobot abuKadar
%1000238.3
3750.0
%40.12
3n
i
i
n
xx
3
%61.12%38.12%40.12
%47.12
3 2
1 SD
n
i
i
n
xx
13
47.1261.1247.1238.1247.1240.12 SD
222
13.0 SD
20
20
Lampiran 5 Rendemen ekstrak daun dan bunga D. rosea Cav
Bobot (g)
Faktor
koreksi
kadar air
Rendemen (%) Rata-rata (%b/b) SD
Sampel Ulangan
Sampel
Ekstrak Ekstrak Ekstrak ekstrak
n-
Heksana
Etil
asetat Metanol
n-
Heksana
Etil
asetat Metanol
n-
Heksana
Etil
asetat Metanol
n-
heksana
Etil
asetat Metanol
Daun 1 10.0028 0.2002 0.1845 1.3371 0.0812 2.18 2.01 14.55 2.12 1.94 13.89 0.01 0.09 1.29
2 10.0087 0.2013 0.1685 1.1410 0.0812 2.19 1.83 12.41
3 10.0105 0.1991 0.1815 1.3539 0.0812 2.16 1.97 14.72
Bunga 1 10.0097 0.1601 0.1601 3.6709 0.0951 1.77 1.77 40.53 1.71 1.71 40.75 0.05 0.06 0.83
2 10.0056 0.1554 0.1554 3.7733 0.0951 1.72 1.72 41.67
3 10.0008 0.1498 0.1498 3.6255 0.0951 1.66 1.66 40.06
Contoh perhitungan rendemen ekstrak n-heksana daun D. rosea Cav (ulangan 1)
%100
sampelbobot airkadar koreksifaktor 1
kasarekstrak bobot Rendemen
%100
g0028.10)0812.01(
g2002.0
%18.2
3n
i
i
n
xx
3
%16.2%19.2%18.2 %12.2
21
21
Lampiran 6 Contoh perhitungan IC50 monofenolase dan difenolase ekstrak etil
asetat bunga D. rosea Cav
Kurva inhibisi monofenolase
y = 12.04 ln x + 14.92
50 = 12.04 ln x + 14.92
ln x = (50 – 14.92) / 12.04
x = 18.42 µg/mL (IC50 monofenolase)
Kurva inhibisi difenolase
y = 15.14 ln x – 48.92
50 = 15.14 ln x – 48.92
ln x = (50 + 48.92) /15.14
x = 687.79 µg/mL (IC50 difenolase)
Konsentrasi Inhibisi (%)
(µg/mL) monofenolase difenolase
2000 95.38 67.90
1000 96.31 56.81
500 95.69 52.80
250 92.00 21.65
125 82.31 23.02
62.50 67.08 8.55
31.25 41.38 12.04
22
22
Lampiran 7 Kromatogram GC-MS minyak atsiri T. erecta
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0
2 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0
1 e + 0 7
1 . 2 e + 0 7
1 . 4 e + 0 7
1 . 6 e + 0 7
1 . 8 e + 0 7
2 e + 0 7
2 . 2 e + 0 7
2 . 4 e + 0 7
2 . 6 e + 0 7
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : S A M P E L . D
Lampiran 8 Kromatogram eluen terbaik
etil asetat aseton metanol diklorometana heksana dietileter kloroform
Time (minute)
23
23
Lampiran 9 Spektrum inframerah fraksi KLTP teraktif (Fraksi 1)