organización del citoesqueleto de actina lamelipodio citoplasma en retracción (cola) citoesqueleto...
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Organización del citoesqueleto de actina
Revenu et al., Nature RMCB2004
Extensiones citoplasmáticas basadas en el citoesqueleto de actina
células epiteliales
intestinales, riñón
células sensoriales
del órgano de Corti
células mecano-sensoras
(Drosophila)
fibroblastos, conos de crecimiento neuronales
fasciculación y
entrecruzamiento
unión a
membrana
SEM SEM SEM
TEM
platinum replica EM
Lamelas, pliegues y filopodios son extensiones citoplasmáticasdinámicas observables en células migratorias
Extensiones planas y delgadas
adheridas al substrato se denominan
lamelas; extensiones
que no se adhieren y que se pliegan
sobre la parte ¨superior¨ de la célula se
denominan "ruffles".
Proyecciones con forma de aguja
adheridas al substrato se denominan
filopodios.
ruffles
VIDEO 5
filopodios
lamela
fibroblastolamelipodio
citoplasma
en retracción
(cola)
citoesqueleto de actina (rojo)
predominante en la lamela y
filopodios. Los microtúbulos (verde)
terminan en un dominio proximal.
Paglini et al JCB 1998
Suter & Forscher J. Neurobiol. 2000
lamela
filopodios
La marcación con falloidina fluorescente revela la abundancia de los filamentos de actina en filopodios, lamela y lamelipodio
axón
lamela
de
avance
Se denomina lamelipodio a una
franja rica en actina, de 2-4 mm
de ancho, adyacente al margen
de avance de la lamela.
Diferentes arreglos 3D: Fascículos y redes de microfilamentos
Los filamentos de actina adquieren diferentes arquitecturas que se asocian a las fuerzas de
compresión (flechas rojas) y tensión (flechas verdes) que enfrentan. Los filamentos en
lamelipodios y filopodios generan fuerzas protrusivas. Las redes corticales no alineadas por
debajo de la membrana plasmática y los fascículos de filamentos en las fibras de estrés
generan tensión. La decoración con el fragmento S1 de miosina revela la orientación de los
filamentos.
fas
cin
a
compresión
tensión
Varias proteínas se unen a actina
mediante dominios CH (Calponin-
Homology, azul). Proteínas
monoméricas con más de un dominio
CH (ej. fimbrina), o diméricas, con un
solo CH en cada monómero
(espectrina), contribuyen a
interconectar los filamentos de actina.
El número y ubicación de los dominios
CH en las proteínas que unen actina
determinan el arreglo tridimensional
que estabilizan. Alguna proteínas
contienen sitios de unión a Ca2+
(violeta) que es capaz de inhibir su
función a altas concentraciones.
Distrofina conecta filamentos de actina
a la membrana a través de la
interacción con distroglicano.
Numerosas proteínas contribuyen a la organización tridimensional de los filamentos de actina
α-actinina
Fimbrina
Espectrina
Filamina
Distrofina
microvellosidades
filopodios
adhesiones focales
fibras de stress
filopodios
línea Z (músculo)
corteza celular
frente de avance
fibras de stress
filopodios
enlace entre proteínas de
membrana y actina
cortical en músculo
membrana
plasmática
Localización
Organización 3D de los microfilamentos. Microscopía electrónica
Fascículos de microfilamentos
unidos por fimbrinaRedes de microfilamentos conectados por filamina tienen propiedades de geles laxos y viscosos
Lodish et al., MCB2004
El espaciamiento y capacidad contráctil de los filamentos de actina en los fascículos depende del tipo de proteínas accesorias
Alberts et al., MCB2002
Fascículo contráctilel mayor espaciamiento permite la
unión de miosina II entre los
filamentos. Ej. en fibras de estrés.
filamentos de actina
y a-actinin
F-actina
vinculina
Fascículo no contráctilel empaquetamiento denso de
microflamentos impide la
asociación de miosina. Ej. en
filopodios.
F-actina
tubulina
filamentos de actina
y fimbrina
Los conos de crecimientoneuronales son sitios deelongación de axones ydendritas
Dent & Gertler, Neuron, 2003
Los conos de crecimiento varían en
morfología, extienden una lamela con
numerosos filopodios.
La estructura y dinámica de la región
periférica de los conos de crecimiento
(P) depende del citoesqueleto de actina
(en rojo). Los microtúbulos abundan en
la región central (C) del cono.
actina
microtúbulos
Los filopodios son estructuras dinámicas que muestrean el ambienteP
ag
lini e
t al J
CB
19
98
0.5' 2' 4'
22'20'18'
Rob
les e
t al, N
eu
ron
20
03
PTK inhibition
lamelipodio
filopodio
filopodio
radixin/moesin antisense oligonucleotides
tiempo
lamela de
keratinocito
Lamelas y lamelipodios exhiben redes de filamentos de actina
La parte distal de la lamela, denominada
lamelipodio, exhibe una red dendrítica
de filamentos de actina. En el frente de
avance se observan los extremos de
filamentos.
Svitkina et al, JCB 1997VIDEO 6 y 7
frente de avance
zona de transición
Imágenes de
microscopía electrónica
de filamentos orientados
perpendicularmente en
el lamelipodio. La
inmunotinción con oro
coloidal revela la
localización de filamina
en los sotios de unión de
filamentos
El complejo Arp2/3 y ADF/cofilina tienen actividades antagónicasen el lamelipodio de células migratorias
En el frente de avance del lamelipodio los
filamentos de actina están organizados en
rededes ramificadas. En las uniones en Y se
localizan los extremos (-), donde la
inmunotinción con partículas de oro coloidal
revela la presencia del complejo Arp2/3. El
factor de depolimerización de actina
(ADF/cofilina) queda excluido del frente de
avance.
Arp2/3
actina
ADF actina
ADF
Arp2/3
En el lamelipodio los complejos Arp2/3 se asocian a filamentos preexistentes y nuclean la polimerización de actina
EL modelo de nucleación dendrítica para la protrusión de lamelipodios implica el
treadmilling de un arreglo ramificado de filamentos de actina. El complejo Arp2/3 nuclea
nuevos filamentos que se integran a la red de actina en el frente de avance. Las proteínas
de capping terminan la elongación. ADF/cofilina promueve el desensamblado de
filementos en la zona posterior de la red.
Alberts et al., MCB2002
La fasciculación y elongación de filamentos de actina en la región distal de la lamela puede generar filopodios
Svitkina et al JCB 2003
los círculos señalan ramas a
partir de las cuales se originan
filamentos de actina que se
empaquetan y forman el
esqueleto del filopodio.
filopodio
red dendrítica
de actina
La flecha indica la elongación de un
filopodio. La línea de puntos marca
el borde de la célula.
Svitkina et al JCB 2003
La fasciculación de los filamentos de actina en los precursores de los filopodios depende de la proteína fascina
La clave para la iniciación de un
filopodio es la fasciculación
(mediada por fascina) de los
filamentos de actina y la
inhibición de los mecanismos que
bloquean la elongación, por
ejemplo, por asociación de
proteínas ENA/VASP que
antagonizan la función de las
proteínas de “capping”.
filo
pod
ia p
recu
rsors
lam
elli
po
diu
m
Yang et al Plos Biol 2007
Una formina elonga los filamentos de actina en la región distal de la lamela durante la formación de filopodios
0:00
0:50 1:30
GFPΔGBD-mDia2
(1) La nucleación dependiente de Arp2/3 forma la red de actina de lamelipodios. (2) Los extremos más de algunos
filamentos de actina se asocian con forminas o VASP. (3) La interacción entre los extremos de filamentos asociados con
forminas o VASP converge en la elongación de filamentos paralelos. (4) Entecruzamiento mediado por fascina. (5)
Disociación de Arp2/3 del extrremo menos.
Yang & Svitkina. Cell Adh Migr 2011
VIDEOS 8 y 9
En células epiteliales, el anclaje del citoesqueleto cortical de actina a la membrana plasmática es mediado por la familia de proteínas ERM
Ezrina, Radixina y Moesina son miembros de la familia de proteínas ERM. ERMs son
necesarias para el mantenimiento de la polaridad celular y están involucradas en
exocitosis y endocitosis.
La conformación activa de las proteínas ERM, que permite la unión a la actina por el C-t y a
proteínas de la membrana plasmática por el N-t es regulado por fosforilación y unión a
fosfoinosítidos fosforilados (PIP2).
Las interacciones entre la membrana y el citoesqueleto subcorticalde espectrina y actina es esencial para la función de los eritrocitos
s = spectrin
microscopía electrónica de la red cortical de espectrina
Espectrina es un heterodímero que se asocia cabeza con cabeza formando tetrámeros de unos 200 nm de
longitud. Los tetrámeros se unen a filamentos de actina en sitios denominados "nodos” o complejos de
anclaje formando una malla bidimensional. Espectrina se ancla a la membrana plasmática a través de su
unión a las proteínas periféricas ankirina y banda 4.1.
complejos de anclaje a actina o nodos
Complejo de anclaje:
Tropomiosina: unión a 6-
7 subunidades de actina
en el surco de un
filamento
Tropomodulina: cap del
extremo (-)
Gelsolina y severina inducen la fragmentación de los microfilamentos y el “capping” de los
extremos (+). La actividad de gelsolina es regulada positivamente por calcio. Gelsolina es
removida del extremo (+) por el aumento en PIP2.
Los arreglos tridimensionales de actina son dinámicos y dependende la actividad de numerosas proteínas reguladoras
trombina receptor acoplado PLC ↑DAG/IP3 Ca++ ↑gelsolina
a proteína G
capping del extremo (+)
impide el crecimiento
(-)
(+)
el fragmento formado se
depolimeriza por el extremo (-)
Ca++
Vía de señalización
que activa a gelsolina
Dos subdominios de
gelsolina se unen a
sitios diferentes en la
subunidad de actina
↑ PIP2
La remodelación del citoesqueleto de actina en plaquetas es esencial para su función
plaqueta inactiva activa
La activación de plaquetas por trombina involucra cambios morfológicos rápidos que son promovidos
por la reorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso depende de proteínas como gelsolina
y profilina cuya actividad es coordinada por señales citosólicas como el Ca2+ y el PIP2.
lamela contracción mediada por miosina II
INACTIVATES
Cambios de forma y plasticidad del citoesqueleto de actina encélulas epiteliales
(a) En una célula epitelial en reposo la proteína villina se localiza en los ramilletes de microfilamentos en las
microvellosidades y también asociada a PIP2 en membranas. (b) En respuesta a la estimulación de ciertos
receptores (ej. EGFR) y activación de PLC, se hidroliza el PIP2 y aumenta el calcio citosólico. La liberación de
villina de la membrana y su unión a Ca++ activa su función de fragmentar filamentos de actina, promoviendo la
remodelación del arreglo tridimensional de la actina.
Revenu et al, Nature RMCB 2004
polarización
motilidad
Cambios en las concentraciones de calcio citosólico afectan la reorganización de la actina
La fluorescencia del compuesto Fura 2 incrementa proporcionalmente a su unión a Ca++.
Esta fluorescencia puede ser visualizada en un microscopio. Debajo se visualiza en
pseudocolor los niveles de fluorescencia (azul = min rojo = max) en un leucocito. La
existencia de un gradiente revela picos de niveles de calcio en la región de la célula opuesta
al margen de avance.
En el frente de avance de la célula, las bajas concentraciones de Ca2+ favorecen la formación de redes de
actina activando miosina I, inactivando proteínas que fragmentan filamentos de actina y revirtiendo la
inhibición de proteínas de cross-linking reguladas por Ca2+. El aumento de las concentraciones de Ca2+ en
la región opuesta al margen de avance favorece el desensamblado de redes de actina estimulando la
actividad de gelsolina y la contracción mediante la activación de miosina II.
margen de
avance
↑ Ca++
Las proteínas motoras convierten energía química en trabajo mecánico
Los motores moleculares
se mueven sobre
filamentos de actina
(miosinas) y microtúbulos
(kinesinas y dineínas)
Las proteínas motoras son
enzimas que hidrolizan
ATP para generar trabajo
mecánico
El acoplamiento de los
ciclos mecánico y químico
produce un ciclo que
genera “fuerza”
Cada ciclo de hidrólisis de
ATP está asociado a un
cambio conformacional
que resulta en el
movimiento de un “paso”
sobre el filamento
Kull & Endow (2013) JCS
kinesinamiosina
Kinesina y miosina comparten elementos estrucutrales
Miosina V es uno de los 20 tipos de
miosinas y kinesina 1 pertenece a una
familia de proteínas motoras.
Los dominios motores (azul) de kinesina y
miosina tienen un core catalítico común.
Una hélice (verde) comunica el sitio
catalítico con el sitio de unión al polímero
y el elemento mecánico (amarillo) que son
distintos para kinesina y dineína.
Las dineínas pertenecen a otra clase de
motores moleculares
Cabeza (dominio motor):
- hidrólisis de ATP
- unión a microfilamentos (miosina) y microtúbulos
(kinesina y dineína)
Cola:
- unión al cargo
- regulación
miosina V
kinesina-1
dineina
Carter (2013) JCS
Vale (2000) Science
Las miosinas constituyen una gran superfamilia de proteínas motoras asociadas a filamentos de actina
Todas las miosinas consisten de una
o dos cadenas pesadas y una o
varias cadenas livianas. Las
cadenas pesadas exhiben tres
dominios, cabeza, cuello y cola. Las
cabezas tienen actividad ATPasa y
junto con el cuello acoplan la
hidrólisis de ATP al movimiento a lo
largo de un filamento de actina. La
función de las miosinas in vivo está
determinada por la cola. Las colas
de las miosinas I y V interaccionan
con membranas. Las colas de las
miosinas II interaccionan entre si
formando filamentos gruesos
bipolares de cuyos extremos
proyectan las cabezas.
Microscopía electrónica freeze etch
Ensayos in vitro revelan el desplazamiento de filamentos de actina sobremoléculas de miosina en una manera dependiente de la hidrólisis de ATP
Filamentos de actina (1-3 en b) se desplazan sobre moléculas de miosina adsorbidas a un
vidrio. Las cabezas se desplazan hacia el extremo (+) de los filamentos de actina en un
proceso dependiente de ATP.
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
La fuerza de torque generada por la hidrólisis del ATP puede medirseempleando trampas láser
Empleando trampas ópticas láser se determinó que la miosina II se mueve en pasos
discretos de ~10 nm de largo y genera 3-5 picoNewton (pN) de fuerza. Los pasos discretos
indican que durante su movimiento la miosina II se une a monómeros sucesivos en los
protofilamentos. Las fuerzas determinadas son suficientes para mover cargos (ej.
vesículas) en el citoplasma.
La luz de un láser infrarojo se enfoca, a través del microscopio, sobre una partícula de látex,
reteniéndola en el centro del haz de luz. La fuerza ejercida por la molécula motora provoca un
desplazamiento de la partícula respecto del centro de la trampa que puede ser medido y
relacionado con la fuerza ejercida.
haz de láser esfera en el
centro de la
trampa
(2) En el estado unido a ADP-Pi la cabeza se une débilmente
a la actina
(3) La liberación del Pi de la cabeza motora incrementa la
afinidad por la actina e induce un cambio conformacional del
brazo móvil y una fuerza de torque que mueve al resto de la
molécula de miosina sobre el filamento de actina ~10 nm
(4) El reemplazo del ADP por ATP induce la disociación de la
miosina del microfilamento.
(1) Las cabezas motoras se conectan mediante un brazo
móvil a la región rígida coiled coil de las colas. La hidrólisis
del ATP extiende el brazo móvil ~ 10 nm hacia el extremo (+).
Vale & Milligan, Science 2000
Modelo del movimiento de la miosina II sobre el filamento de actina
(+) (-)
filamento de actina
Va
le (2
00
0) S
cie
nce
Miosina II es requerida en diversos eventos celulares
estructuras contráctiles formadas por actina y miosina II
miosina II
surco de
segmentaciónmiosina I
polo
Microscopía de fluorescencia de una
ameba Dictyostelium durante
citoquinesis. La localización de miosina
II en el surco de segmentación revela su
rol durante la citoquinesis
El sarcómero es la unidad estructural y funcional del músculo esqueléticoCada sarcómero contiene: filamentos gruesos de miosina II y filamentos finos de actina. Las moléculas de titina están
asociadas por un extremo con los filamentos gruesos de miosina y funcionan como un resorte. El disco Z (CapZ y α-actinina)
funciona como cap de los extremos más de los filamentos de actina. Nebulina funciona como un molde que determina la
longitud de los filamentos. Tropomodulina es el cap en el extremo menos de los filamentos finos.
+ATP, Ca2+
La contracción del músculo esquelético está regulada por Ca2+ y proteínas de unión a actina
En un ciclo de contracción la hidrólisis de ATP se acopla al movimiento de una cabeza de miosina hacia el dico Z (VIDEO). La
acción de las cabezas de miosina en los extremos opuestos del filamento grueso atrae a los filamentos finos hacia el centro del
sarcómero
La concentración de Ca2+
citosólico modula la interacción
de tropomiosina (TM) y troponina
(TN) con los filamentos de
actina. En ausencia de Ca2+ el
complejo TM-TN impide que la
miosina se deslice a lo largo del
filamento fino. La unión de Ca2+ a
la subunidad C de TN (TN-C)
gatilla un movimiento de TM que
expone los sitios de unión a
miosina en la actina.
En las células del músculo
esquelético, el retículo
sarcoplásmico es rico en Ca2+ y
bombas de Ca2+. La
señalización a través de una
célula nerviosa provoca la
depolimerización de la
membrana de la célula
muscular que a su vez
depolariza los túbulos T. Los
túbulos T están asociados al
retículo sarcoplásmico. La
depolarización de los túbulos T
permite la apertura de los
canales de Ca2+ del retículo
sarcoplásmico provocando un
aumento del Ca2+ citosólico.
El sarcómero es la unidad contractil en el contexto de las miofibrillas