16 ISSN 0216 - 3128

OPTIMASI PEMBUATAN KIT IRMA CA 125

Agus Ariyanto, dkk.

Agus Ariyanto., Siti Darwati, Gina Mondrida , Fitri Yunita, Puji Widayati, SriSetiyowati, sulaiman, V. Yulianti dan TriningsihPusat Pengembangan Teknologi Reaktor Riset, Serpong

ABSTRAK

OPTIMASI PEMBUATAN KIT IRMA CA-125. Telah dilakukan penelitian optimasi pembuatan kit

IRMA CA-125 yang meliputi pembuatan perunut monoklonal anti Ca-125 bertanda 1251 dan pembuatan

"coated tube". Oksidator yang digunakan adalah khloramin- T dan N-bromosuksinimid dengan

memvariasikan jumlah oksidator yang digunakan pada penandaan. Optimas( pembuatan "coated tube"dilakukan dengan memvariasikan volume larutan "coating", pengaruh pencucian,-peng;;'ruh penambahan

BSA, pengaruh bufer pelarut dan uji pcmas,mgan mo/wklo/wl anti CA-125. Hasil pcrcobaan memmjukkan

bahwa oksidator Kloramin T dapat digunakan wltuk pembuatan perunut monoklonal anti Ca-125 denganrendemen cukup tinggi yaitu 96.5 % dan kemumielll radiokimia 93.2 %. ]umlah oksidator yang optimal

adalah 10 ug. Optimasi pembuatan "coated tube" Imtuk monoklarzal anti Ca-125 memberiktlll volume yangoptimal 300 ul. Sedangka/I pencucielll dan penambahan BSA 0.1 % terlalu berpe/Igaruh terhadap nilai NSB.Bufer yang sesuai untuk pembuatan "coated tube" adalah bl~fer bicarbonat. Untuk pemasangan monoklonal

anti CA-125 diketahui bahwa monoklo/lal anti CA-125 M37203M dapat digwzakan sebagai peru nutsedangan monoklonal anti CA-125 M89694M sebagai "coating solution".

Kala kllllci : Optimasi, IRMA, monoklonal anti CA-125, penlm~t

ABSTRACT

OPTIMATION FOR CA-125 IRMA KIT PRODUCTION. Optimation 0/1 the production of CA-125IRMA kit has been studied. involving preparatio/I of 125/./abded monoclonal eII/ti CA-125 as a tracer alld

production of coated tubes. Cllioramin- T and N-bro,,!osuccinimide were used as oxidators by varying themin their quatity. Optimation on preparation of coated tube JI'tIScarried out usi/Ig <'ariation ill vollWle of

coating solution, effect of washing, addition of BSA 0.1 %, buffer and pairing test for the monoclonal anti

CA-125. The results show that cllioramin- T matched with the tracer of monoclonal anti CA-15 providing ahigh yield at about 96.5 % and radiochemical purity 93.2 %. Optimum oxidazing agent is 10 ug. Optimum

volume for preparating monoclonal a/lti CA-125 coated tube is 3011.ul The nOli specific binding (NSB) wasfound to be unaffected by washing step alld addition of BSA 0.1 % . A suitable buffer for coated tube

preparation was bicarbonat buffer. It JI'tISSllOlI'/1that the monoclonal anti CA-125 M37203M used fortracer can be paired with monoclonal anti CA-125 M89694M Iised for coating solutiO/I.

Key words .' Optima/ion, IRMA, monoclonal anti CA-/25, Tracer

PENDAHULUAN

Cancer Antigen 125 (CA-125) adalahsejenis glikoprotein yang bersifat antigenicsehingga dapat bereaksi dengan monoklonalantigen. CA-125 ini merupakan tumormarker yang dapat digunakan secara klinikuntuk memonitor pasien yang mempunyaipenyakit kanker ovarium (1).

Pada kondisi normal CA-125 dapatditemukan di dalam cairan amnion sebagaiderivat jaringan epitel "fetal coelemic".Antigen ini ditemukan pula pada jaringanwanita dewasa seperti jaringan epitel "tubafallopian", endomentrium, endocervix pleura,dan rongga perut(2).

Peningkatan level atau konsentrasi CA­125 di dalam darah sangat berhubungandengan adanya perkembangan kanker padapasien. Proses "gynecological" sepertiinflamasi pada pelvic, endometriosis danmenstruasi juga memberikan 'peningkatanadanya CA-125(2). Kandungan CA-125 didalam serum darah pasien yang normal ( <35D/ml).

Di Amerika kanker ovarium kanker

merupakan penyebab kematian yang nomoI' 5dan merupakan penyebab kematian palingtinggi pada kanker-kanker "gynecologic". DiIndonesia berdasarkan data dari YayasanKanker Indonesia tahun 1991 bahwa kanker

ovarium ini menduduki peringkat ke 6terbanyak(4)

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juti 2003

Ag/ls Ariyallto, dkk. ISSN 0216 - 3128 /7

anti-CA 125kloramin-T

Selain untuk pemeriksaan kankerovarium CA-125 dapat juga digunakan untukpemeriksaan kanker-kanker sbb :

- kanker leher rahim

- kanker corpus- kanker cervik- kanker endometrium

Teknik pemeriksaan CA-125 umumyadilakukan dengan ultra-sonografi secaralangsung atau melalui invitro assay denganmenentukan kadar atau levelnya pada serumdarah pasien (5). Dewasa ini telah banyakpereaksi atau kit yang beredar dipasaran baikyang non radioaktif maupun yang radioaktifuntukm pemeriksaan serum secara in vitro.Sebagian besar pereaksi tersebut merupakanproduk import yang harganya cukup mahal y,sehingga pemeriksaanj pendeteksian dinikanker tersebut sulit untuk dilaksanakan bagipasien berpenghasilan rendal1..

Dalam makalah ini dilaporkan optimasipembuatan kit IRMA CA-15 dalam upayapereaksi dapat dibuat di dalam negeri agarterjangkau oleh masyarakat

TATA KERJA

Bahan yang digUllakan

Monoklonal anti-CA-125 (BiodesignInternational USA), Human CA-125 antigencalibrator grade (Biodesign International)

, USA, Bovine serum albumin (Sigma), normalmouse serum (CIAE, China), Kit IRMA CA­125 (CIAE China), NaH2P04.H20 danNa2HP04.7H20 dari E Merck, Kolom PD-I0dari Pharmacia. Nal25I didapat dari NordionCanada dan P2RR Batan, NaHC03 dari Sigma,Tabung dasar bintang dari NUNC

Alat yang digullakall

Pencacah Gamma (Nucleus), Centrifuge(CS-15 Beckman), inkubator (Eyela) , berbagaimacam ukuran pipet eppendorf, vortex.

Cara Kerja

1. Penandaan Monoklonalmeng-gunakan metodedengan 1251

Kedalam tabung dimasukkan 10 ullarutan monoklonal anti-CA 125 (10 ug

larutan monoklonal anti CA-125 dalam 10 ul

larutan bufer fosfat salin 0,025 M pH 7,4) dantambahkan 20 ul bufer fosfat 0,2 M pH 7,4,dan 450 uCi larutan Nal25I, kemudiantambahkan Kloramin-T sesuai dengan variasi5, 10 , 20 ug . Selanjutnya campuran dikocokselama 2 menit menggunakan vorteks, laluditambahkan 10 ul larutan Na2~04 ( ImgNa2S204 dalam 1011bufer fosfat salin 0,25 MpH 7,4). Selanjutnya tambahkan 50 ullarutanKI 50 %. Campuran rekasi dibiarkan selama 2merlit. Hasil penandaan dimurnikan denganmenggunakn kolom PD-I0 yang telahdikondisikan dengan bufer fosfat 0,01 M pH7,4 dan dijenuhkan dengan 1 mllarutan BSA10 %. Kolom PD-10 kemudian dielusi denganbufer fosfat 0,01 M pH 7,4. Sebanyak 500 uleluat ditampung per fraksi dengan tabungreaksi . Eluat dalam tabung kemudian dicacahdengan pencacah gamma.

Rendemen, kemurnian radiokimia danaktifitivitas spesific ditentukan denganmenggunakan rumus berikut:

% Rendcmcn.: Na1251 dIm fraksi antibodi X 100 %

Total radioaktif yang digunakan

%Kemumian Radiokimia= Na1251 fraksi antibodi X 100 %

oakh\'itas dalam produk

Aktivitas Spesifik = HasH rendemenXTotal Radioakt.Massa dari antibodi

2. Penandaan MonoklonaI anti-CA 125meng-gunakan metode N-Bromo-suksini­mid dengan 1251

Kedalam tabung dimasukkan 10 ul anti­CA 125 (lihat tatakerja 1) lalu tambahkan 20ul larutan bufer fosfat 0,2 M pH 7,4 dan 450uCi larutan Na125I,kemudian tambahkan 10ullarutan N-Bromosuksinimid dengan variasilarutan N-Bromosuksinimid 5, 10, 20 ug .Campuran divortek selama 120 detik , lalukedalam larutan campuran ditatnbahkan 200ul larutan bufer fosfat salin 0,01 M pH 7,4.Kemudian tambahkan 50 ul larutan KI 50 %.

Campuran reaksi dibiarkan selama 2 menit.Hasil penandaan dimurnikan denganmemasukkan campuran reaksi kedalam kolomPD-I0 yang telah dikondisikan dengan larutanbufer fosfat 0,01 M pH 7,4 dan dijenuhkandengan 1 ml larutan BSA 10 % .. Kolomkemudian dielusi dengan larutan bufer fosfat0,01 M pH 7,4. Sebanyak 500 ul eluatditampung per fraksi dalam tabung reaksi .

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

18 ISSN 0216 - 3128 Agus Ariyallto, dkk.

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

No. Tabung

o

Gambar 1. Fraksi hasil penandaan monoklonal

anti CA-125 dwgan 1251.

oksidator N-memberikan rendeman

pada kloramin-T ( lihat

1000000

I w

'"800000

c:

600000'" .<:rJ'" 400000U

200000

No Jm) oksidatorRendemenKemumian(ug)

('x. )rddiokimia %

1.

5 35,994,22.

10 3,490

3.

20 1,280,4

Penggunaan 5 ug oksidator N­bromosuksinimid memberikan persentasehasil rendemen yang maksimum (35,9 %),tetapi lebih rendah jika dibandingkan denganoksidator kloramin-T. Hal ini disebabkan

karena . kloramin-T merupakan oksidatorkuat sehingga dapat mengoksidasi 1251­

menjadi 1251+secara optimal.

Tabel 3. memperlihatkan pengaruhjumlah volume larutan "coating" danpencucian pada pembuatan" coated tube"monoklonal anti CA 125. Nilai NSB dan

B/Tnya hampir tidak berbeda nyata, biladilakukan pencucian terhadap "coated tube"meskipun volume larutan "coating" bervariasi

TabeI 2. Pengaruh ju 111lalz oksidator N­brolllosllksinimid IIntlik penandaallIllonoklonal anti- CA 125

Sedangkanbromosu ksinim idlebih rendah dari

Tabel 2 berikut)

No JmloksidatorRendemenKemumian(ug)

%radiokimia %

1.

5 6093,62.

10 96.593.2

3.

20 88,897,2

TabeI 1. PenggUllaall oksidator klora11lin- Twltuk penalldaall 11lonokonal allti-CA125

No mJU/mlVol. Larutan stockVo. BSA I %

)

500 2500 ul2500 ul2

250 1000 ul3000 ul3

100 800 ul7200 ul4

50 400 ul7600 ul5

25 80 u)7920 ul6

0 o ul8000 ul

Dari hasil penandaan diketahui bahwajumlah oksidator akan berpengaruh terhadaphasil rendemen penandaan (Tabel I dan TabelII) Penggunaan 10 ug oksidator kloramin-Tmampu meningkatkan hasil rendemenpenandaan cukup tinggi sampai 96.5 %(lihat Gambar 1).

Otimasi pembuatan dilakukan denganmemvariasikan volume larutan "coating"yang dimasukkan kedalam tabung (300 , 400 ,500 , 600 ul) yang telah ditentukan titernya.Tabung diinkubasikan semalam pada

temperatur 4° C. Pada tahap pencuciandilakukan juga variasi tanpa pencucian danpencucian dengan aqua demin. Tabung hasilpencucian dengan aqua demin sebagian diblok

dengan 300 U12,1utan BSA (0,1 %BSA dalam0,05 M PBS[ pH ,4) dan sebagian lain tanpadiblok. Kenlil ian tabung-tabung tersebutdiinkubasikan semalam pada temperatur 4° C.Tabung kemudian dicuci 300 ul larutan 0,05M PBS pH 7,4 sebanyak 2 kali.Pengaruhjumlah volume larutan "coating", pencuciandan penambahan larutan BSA 1 % akan diujisecara statistik menggunakan uji t. Pengaruhlarutan bufer terhadap larutan "coating" jugadiamati dengan menggunakan larutan yaitubufer fosfat 0.002 M pH 7,4 dan buferbicarbonat 0.01 M pH 8,5

4. Pembuatan standar

Konsentrasi larutan standar yangdisiapkan adalah 0, 25, 50, 100, 200 dan500 mIU/mi. Pembuatan larutan standard

CA-125 menggunakan Human CA-125calibrator grade (Biodesign USA) yangdilarutkan dengan Bovine Serum Albumin 1% dalam larutan 0,05 M PBS pH 7,4.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Eluat dalam tabung dicacah dengan pencacahgamma. Rendemen, kemurnian radiokimiadan aktifitivitas spesific ditentukan seperti 1.

3. Pembuatan "coated tube"

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

Agus Ariyal/to, dkk. ISSN 0216 - 3128 19

Penambahan Bovine Serum Albumin

(BSA) 1 % yang tujuannya untuk menurunkannilai NSB ditunjukan Tabel3.

Volume Dengan pencucianTanpa pencucian(ul)

% NSB% BIT% NSB% BIT

300

0.2810.00.259.9

400

0.289.80.279.8

500

0.349.60.409.6

600

0.289.60.349.6

antara 300 ul sampai 600 ul. Oari uji tdidapatkan nilai t dari perhitungan yaitu 0.5untuk NSB dan 0,17 lebih kecil dari t di tabel

(t(,,05= 2,45, t("Ol = 3,71)i dengan ini dapatdikatakan bahwa jumlah volume larutan"coating" dan pencucian dalam prosespembuatan "coated tube" tidak berpengaruhterhadap nilai NSB maupun % BIT.

Tabel 3. Pengaruhdigunakanpembuatanani CA 125

jumlah volume yangdan pencucian pada

"coated tube" manaklanal

Tabel 5. Pengaruh jenis bufer yang digunakansebagai pelarut manaklanal anti CA 125untuk "caaed tube"

Bufer %NSB% BIT

Bufer fosfat 0.002 M

0.1710.29Bufer bicarbonat 0.01 M

0.1516.93

Oari Tabel 5. juga diketahui bahwa nilai% NSB kedua bufer memberikan nilai yangrelatif tidak begitu berbeda sedangkanuntuk nilai % B/Tnya bufer bicarbonatmemberikan nilai % yang lebih tinggi (16.93%) dari sini dapat dikatakan bahwa buferbicarbonat lebih baik dari pada bufer fosfat.

Penggunaan monoklonal antibodi untukpembuatan pereaksi kit IRMA memerlukanpenelusuran jenis monoklonal yangmempunyai "binding site" yang cocok satusarna lain sehingga dapat memberikan nilai %NSB yang rendah dan nilai % BIT yang tinggi.Pada penelitian ini digunakan hanya 2 jenismonoklonal anti CA-125 masing-masingM37203M dan M86924M yang diperoleh dariBiodesign International Co.

Tabel 4. Pcngaruh penambahalz landan 1 %(BSA) tcrlwdap nilai NSB dalz % Bjf

Volume BSA 1 %Tanpa BSA 1 %

(ul)% NSB% BIT% NSB% BIT

300

0.2810.00.313.01

400

0.289.80.412.5

500

0.349.60.312.5

600

0.289.60.413.12I

Tabel 4. memperlihat bahwapenambahan larutan BSA 1 % dan tanpapenambahan larutan BSA 1 % tidak begituberpengaruh terhadap penurunan nilai NSB%ini dapat dibuktikan secara uji t bahwa nilai tterhitung (1,447) lebih rendah dari t(,.05= 2,45atau t(,,01 = 3,71. Sedangkan untuk % BIT

ternyata berpengaruh, terlihat bahwa % BITpada penambahan larutan BSA 1 % lebih

rendah (rata-rata 9,8 %) dibandingkan dengantanpa penambahan BSA 1 % (rata-rata 12,8 %).Hal ini terjadi karena proses pencuciansebelum penambahan BSA 1 % kemungkinanada monoklonal anti CA 125 yang terbawasehingga menurunkan nilai % BIT. Secara uji tjuga didapat dibuktikan bahwa harga tterhitung (16,8) lebih tinggi dari pada hargat(,,05=2,45 atau t("Ol= 3,71

Tabel 6. Pengaruh pasangalz mOl/aklonal alztiCA 125 tcrlwdap Izilai % NSB dalz% Bjf.

Pasangan antibodi % NSB% BITPe~unut

coated tubeM37203M

M86924M0.2126.11M37203M

r-.n7203M0.3221.89M86924M

M37203M0.6216.16

Tabel 6 memperlihatkan bahwapasangan monoklonal M37203M sebagaiperu nut dan monoklonal M86924M sebagai"coated tube" merupakan pasangan yangpaling sesuai karena dapat memberikannilai % NSB (0.21 %) yang paling rendahdan nilai % BIT yang tertinggi (26.11 %).

KESIMPULAN

Dari penelitian ini dapat disimpulkanbahwa oksidator kloramin-T dapat digunakansebagai oksidator untuk menandai

monoklonal anti CA-125 menggunakan 1251dengan rendemen penandaan 96.5 % dankonsentrasi kloramin-T yang optimum adalahsebesar 10 ug. Sedangkan untuk volumelarutan "coating" yang baik adalah 300 ul danpencucian pada proses pembuatan "coated

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juli 2003

20 ISSN 0216 - 3128 Agus Ariyanto, dkk.

tube" tidak perlu dilakukan, begitu juga untukpenambahan BSA 1 %. Pasangan monolonalanti CA 125 yang cocok adalah M37203Msebagai peru nut dan M89624M sebagai"coated tube", sedangkan bufer yang baikuntuk pelarut monoklonal untuk "coating"adalah bufer bicarbonat 0.01 M.

DAFfARPUSTAKA

1. SCHARL A, CROMBACH G, VIERCHEMM, BOLTE A ; The use of CA 125 as atumor marker for adenocarcinomasofendocervix, endometrium and fallofiantube tumor diagnostic and theraphie, 10(1989): 17 - 20

2. VIJAY NA TH MD; Ovarium TumorMarkers : Cancer Antigen 125:

PersonalMD.com Medical Contributor, 24October 2000.·~;

3. LANDIS SH, MURRAY T, BOLDEN S, ETAL ; zCAncer Statistics, 1999. Ca-ACancer Journal for Clinicians 49(1):8 - 31,1999.

4. DIREKTORAT JENDRAL PELAYANANMEDIK DEPARTEMEN KESEHATAN R I

BADAN REGISTRASI KANKERlKATAN AHLI PATOLOGI INDONESIA,YAYASAN KANKER INDONESIA;Kanker di Indonesia Tahu 1991. Data

Histopatologik.

5. ROSE DAHER PhD; Cancer Antigen 125(CA 125) in Serum By MicroparticleEnzym Immunoassay (MEIA): LaboratoryMedicine 25(3); 146 -147 , 1994

Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi NuklirP3TM-BATAN Yogyakarta. 8 Juli 2003