제 2 장 바이오리액터( Bioreactor )

I. 서 론

동물세포의 대량배양 ⇒ 단세포군 항체나 치료용 단백질을 생산.

현재 약40-50개 종류의 단세포군 항체 와 조혈제(EPO) 및 혈전용해제(tPA)등이산업화되어 시판 중에 있는데, 미국의 경우 1994년 기준으로 약 50억 달러를 상회하였으며 앞으로 매년 20-30% 이상의 높은 증가추세를 보일 것으로 예상됨.

단백질의 경우에는 인체에 투여된 후 분자구조의 안정성과 높은 활성을 유지하기위하여 당쇄 부가(glycosylation)와 번역후 변형(post-translational modification)이 매우 중요한 과정인데, 미생물에서는 이러한 과정이 불완전하거나 거의 이루어지지 않기 때문에 동물세포의 이용이 증대되고 있음.

조직공학 기술 개발의 일반적인 전략은 소량의 인체세포를 효율적이고 안정적으로 필요한 만큼 충분히 증식시킨 후 생체내에 다시 이식하기 위한 목적으로 만들어지기 때문에 생물학적으로 적합한 천연 또는 인공재질에서 3차원적으로 배양하여 생체 내 특성을 그대로 가진 조직으로 분화시킬 수 있도록 특별히 제작되어야 한다.

이런 용도의 바이오리액터(생물반응기)를 설계하기 위해서는 세포의 성장과 분화에 영향을 미치는 지지체(Scaffold)관련 인자들과 생물반응기 내부의 물질전달(Mass Transfer) 그리고 기계적 자극(Mechanical Stimulation)을 고려해 주어야한다.

II. 동물세포 배양

1. 동물세포 배양공정의 특성

동물세포: 크기 약 10-30㎛, 성장속도가 느리며(doubling time 약 10-50시간)

세포벽이 없이 원형질막으로만 되어 있어서 외부의 기계적인 힘에 매우 약하다.

하이브리도마 세포처럼 부유상태(suspension)로 자라기도 하지만 많은 경우 세포

들은 표면에 부착(anchorage-dependent)하여 자라기 때문에 반응기내 유리, 플

라스틱 지지물질 또는 콜라젠 같은 천연 고분자 물질 등의 부착표면 필요

생장하는 동안 암모늄과 젖산 같은 유독한 대사물질을 생산, 세포의 영양요구성이

매우 복잡, 배지중에 아미노산, 비타민 등의 첨가가 필수적이고 대부분의 경우 성

장조절인자가 많이 들어있는 혈청을 사용하여야 한다.

첫째, 교반속도를 최소화: 세포의 기계적 손상(shear damage)을 최소화, 낮은

교반속도 에서도 산소전달을 극대화 시킬 수 있는 방법 필요.

둘째, 외부환경 조건, 온도, pH, DO(용존산소,dissolved oxygen), CO2가 보강된 공

기의 공급이 필요.

셋째, 부착의존성 세포를 위해서 지지물질의 표면 대 부피의 비가 클 필요가 있다.

넷째, 젖산(lactic acid), 암모늄 같은 유독한 대사산물의 축적을 최소화.

2. 동물세포 배양기의 종류 및 특성

새로운 세포주를 확보, 세포 morphology의 연구, 여러 가지 다른 시약의 영향, 시약 농도의 영향을 비교, 그리고 세포 성장과 대사를 연구하는데 있어서는 소규모의세포 배양으로 가능(약 1 L).

세포 성분 추출(7mg DNA를 얻기 위하여 약 109의 세포가 필요), 바이러스 백신 생산(batch당 평균 5×1010 세포) 기타 다른 제품을 생산하는 경우에(interferon, plasminogen activator, interleukins, hormones, enzymes, erythropoietin, antibodies) 세포의 대량배양이 필요.

동물세포 배양기는 1885년 Roux에 의하여 실험실용으로 Roux bottle(T-flask)이고안되어 사용된 것이 시초이고 Roller bottle의 개발로 약 10배 정도의 세포농도를증가 시킬 수 있었다. 그 후 높은 표면-부피비를 제공하기 위하여 미세담체(microcarrier) 시스템, 실관(hollow-fiber) 반응기, 세라믹 메트릭스 시스템 등이 부착 의존성 세포를 위해 사용되고 있다.

3. 세포 고정화

고정화 세포는 단위 세포농도를 높일 수 있고, 안정성이 높으므로 오랫동안배양할 수 있으며 3차원 구조를 가진 조직 모사 가능

고정화 세포는 부유배양을 할 수 있으므로 관류식 배양(perfusion culture)방법을 적용하여 더욱 높은 세포농도를 얻을 수 있고 부착성 세포에 대한 단위표면적을 증가시켜 준다.

여러 가지 고정화 재질에 의하여 배지의 흐름에 의해 발생하는 전단응력으로부터 세포를 보호해 주는 역할도 한다.

세포 농도가 증가함에 따라 혈청에 의해 공급되는 많은 외부의 성장인자들의의존성을 줄일 수 있으므로 실제 비용을 절감할 수도 있다.

고정화 방법

- Hollow fiber, membrane, ceramic cartilage,

- cellulose fiber(DEAE：Diethylaminoethyl,

QAE：Diethyl-[2-hydroxypropyl]aminoethyl,

TEAE：Triethylaminoethyl)

- 다공성 미립담체나 sphere에 부착시키는 방법

이 반응기는 아래칸으로 공기가 주입되고 빠짐에 따라 맥동 형성

판막 형태의 지지체는 상부에 고정하여 배양.

맥동 압력과 유속을 점차 증가시켜 판막이나 동맥에 주어지는 기계적인 자극도

점차 증가되도록 반응기를 운전

조직에 맞는 형태의 생물 반응기가 제조되어야 하며 이때 물질전달, 전단력, 장

력(strain)등의 배양 환경 인자와 공학적인 설계가 고려

1) 생인공판막

- Hydrodynamic ForcusingBioreactor

원하는 조직으로 분화를 유도하기 위한 기계적인 자극 이용.

Tissue engineering of ligament(G Vunjak-Novakovic, MIT, Annu Rev Biomed Eng,2004)

Bioreactor system for ligament tissue engineering. (A) Functioning bioreactorsystem consisting of two units, each with 12 cartridges that can be used concurrently (e.g., 12 with loading, 12 without loading).(B) Cartridges containing ananchored silk scaffold during culture with human MSC. (C) Exploded view of the cartridgeassembly. (D) Schematic illustration of one cartridge with its flow loop andanchors for the transmission of mechanical forces (from Altman et al.with permission of ASME).

< ECM expression><Mechanical stimulation fostered

cell alignment.>Mechanical stimulation fostered cell alignment. Dynamic tension and torsion applied over 21 days of culture induced MSC in collagen gel to align in the direction of force. (A,B) H&E of stimulated and nonstimulated constructs, respectively. (C) Mechanical stimulation caused a 2.5-fold increase (p < 0.001) in cell alignment.

Mechanical Static

Ⅴ. 세포 기계 자극을 위한 기술

1. 압력 부하 (정압력) 시스템

압력판이 직접 배양액과 접촉하지 않기 때문에 배양기내에 가스가 압력 부하에대응하여 배양액 내에서 높은 산소와 이산화탄소압력을 형성하며 배양액의 물리화학적 성질(pH, O2, CO2) 변화.

2. 종향적 신장 시스템 단일축 방향으로 힘을 받았을 때 변형하는 물질을 이용하여 tension자극을 줌.

3. 만곡력을 이용한 시스템물질을 굽힐 때 표면에 수직되는 장력을 받는다는 현상을 이용한 것으로 four point bending system 이 대표적 . 낮은 장력을 균일하게 줄 수 있음.장력에 의한 변형 범위가 수백~3000με .

4. Out-of-plane circular substrate distension

면외 원형 기질 자극시스템.

쥐 두개골세포 배양에서 단백질과 DNA 합성이 촉진.

Flexercell변수: 진공크기, 파형, 주파수, 진공시간

5. In-plane substrate distension

면내 기질 자극시스템

배양디쉬의 위치에 따라 압력의 분산이 일정하지 않으므로 장력이 비등방성으로분포. 이러한 한계점을 극복하기 위하여 평평하고 원통형의 마찰력 없는 platen이 배양 바닥을 밀어 올리게 하므로 세포배양 면적에 동일한 크기의 힘이 분포.

Norton (1995) 등은 platen 바깥 쪽의 공간에 진공을 주어서 배양막을 일정하게당기는 시도.

6. 유체 전단 시스템 유체전단력 : 혈액에 의하여 혈관 내피세포가 기계적 자극을 받고

생리적 반응을 유발, 또는 조직 세포들 사이에 존재하는 세포외액이

체액의 흐름에 의하여 세포 반응 변화하는데 이때 발생되는 마찰력 .

세포배양에서 중요한 기계적 자극으로 인식

1) Cone & plate system 원뿔-평면 자극 시스템

평평한 디쉬의 표면에 수직인 원뿔 축에 대해 회전하는 시스템.

국소적인 상대 속도와 각각의 표면에서 동질의 유체 전단력 도달.

원추의 뾰족함과 각속도에 의존.

2) Parallel plate flow chamber 평판흐름 챔버 시스템

배양기의 각 끝에 두 개의 틈 사이에 다양한 압력을 생성.

유동 자극 배양: 혈관 조직공학에 적용

Ⅵ. 기계적 자극 때 고려해야 할 사항들

1. 지지체 콜라젠 / ECM기질 등: 기계적 자극 감응 이온채널에 기질이나 직접적으로

미세구조에 변화전달

아가로즈 / 알지네이트 등: 새로운 기질이 생성되기 전까지 기계적 자극이

세포내로 전달되기 어려움

2. 기계적 자극의 기간 기계적 자극의 투여 방법

1) 일정한 기간 동안 지속적으로 자극을 주는 경우

2) 간헐적으로 자극을 주는 경우 뼈 조직, 연골 조직

3. 기계적 자극의 세기/주파수 세포의 형태와 특성의 변화를 야기 시킬 수 있는 기계적 자극은 다양.

적정 자극을 선정하여 세포 분화 효과 향상(KPa, Hz, strain).

Ⅶ. 새로운 기계 자극 시스템의 연구 동향

1. Ultrasound 초음파 : 임상에서 사용되는 주파수는 3~10 MHz .

임상에서의 초음파 : 진단용(영상)과 치료용 .

치료목적의 초음파 제원은 그 목적에 적합하도록 다양한 종류의 강도와

주파수를 가짐 . 효과적으로 골절 부위를 아물게 하는 치료효과는 오래

전부터 임상결과에서 나타났고, 최근에는 연골치료에까지 영역 넓힘 .

초음파의 응용연구로서는 유전자 전달 및 약물 전달분야가 있음. 효과적인

유전자 전달을 위해, 특정 유전자를 기존의 방법과는 달리 초음파를

이용해서 세포막의 투과성을 일시적으로 높여 필요한 유전자를 세포 내로

전달하는 방식 . 초음파 사용에서 우려되는 세포손상은 거의 없는 저주파

초음파 (20~10 kHz)가 사용. . 피부를 통한 약물 전달 및 무릎 관절

내 활액막에서 고분자 약물의 투과성 증가.

높은 세기의 초음파 : 조직에 의해 흡수되어 조직을 가열시키는 열작용의

효과가 있어 관절염 환자에서 물리 치료의 도구로 널리 사용.

DNA 합성과 단백질의 증가, 세포막의 투과도의 변화 등에 의한 뼈,

근육, 연골 등의 각종 연결조직의 수복에 유리.

“기질 증가”

초음파에 의해 활성화된 연골세포에서 골형성 관련 유전자 (TGF-β,

오스테오칼신, 알칼라인 포스파테이즈, α1(I)-프로콜라겐 gene)의

발현보다 단백당이나 제2형 교원질 등 연골 형성 유전자의 발현을

상승시켜 연골의 구조를 유지하고 있는 콜라젠을 보호함으로써 연골의

파괴나 분해를 방지하는 효과.

저강도 초음파가 중간엽 줄기세포의 삼차원적인 펠렛 배양 시 TGF-β

첨가하였을 때 연골화 분화를

유도.

초음파 처리를 함께 처리 해주었을 연골화 분화 촉진

Ⅷ. 결론

기계적 자극이 분자 기전에서 어떻게 정확한 과정을 거쳐 세포에게

영향을 주어 분화 과정을 진행시키는지는 정확하지 않음.

기계적-생화학적 전사와 번역조절에 대한 연구가 더 필요하며

실제적인 다양한 자극 인가를 통한 세포외기질과 세포 사이의 부착

수용체 및 성장인자 수용체 등이 조절 되는 연골화 분화 연구가

진행되어야 함.