nuovi derivati porfirinici: proprietà fotodinamiche e prospettive di applicazione

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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI CAMERINO

Scuola di Scienze del Farmaco e dei Prodotti della Salute

Nuovi derivati porfirinici: proprietà fotodinamiche e prospettive di

applicazione

RelatoriProf. Giulio LupidiProf.ssa Annette HabluetzelProf.ssa Piera Di Martino

LaureandoMarco Pigliacampo


Le PorfirineCosa sono:-composti macrociclici-Formano complessi molto stabili con metalli di transizione-Complessi metallici con importante ruolo nell’attività biologica-Presentano caratteristiche bande di assorbimento nella regione 400 – 500 nm chiamata Banda di Soret

Terapia fotodinamica (PDT)

Proprietà dei fotosensibilizzatori:I)massimo assorbimento nella regione 600-800; II)alti rendimenti quantici di 1O2; III)fotostabilità; IV)non-tossico e fototossico; V)specificità di ritenzione nel tessuto tumorale; VI)fluorescenza; VII)sufficiente solubilità del sensibilizzatore in mezzi acquosi


Le PorfirineMeccanismo della PDT

Generazione dell’ 1O2

1)la molecola di PS passa nella forma S02)rilassamento dell’S0 in forma radioattiva3)rilassamento per conversione interna (calore)4)Intersystem crossing verso lo stato T1


Le PorfirineTipo I: reazioni di trasferimento elettronico tra il PS nello stato T1 ed altre molecole. Si generano ROS dannosi per le cellule.Tipo II: scambio di spin elettronico tra il PS nello stato T1 e l’ossigeno tripletto 3O2. Si produce quindi un’ossigeno singoletto altamente citotossico (1O2).


Fotosensibilizzatori porfirinici- I generazione (HPD, Photofrin®)- II generazione - III generazione

1) Fotosensibilizzazione prolungata della pelle

2) Penetrazione non ottimale nei tessuti3) Scarsa purezza

Legati a vettori per garantirne un accumulo nel tessuto tumorale


Terapia fotodinamica (PDT)Terapia innovativa per la cura di neoplasie che coinvolge tre componenti chiave: la luce, l’ossigeno ed una sostanza fotosensibile (fotosensibilizzatore/PS).

Meccanismo biologico d’azione

1) Danno mitocondriale2) Danno al DNA e modifiche all’RNA3) Danno al tessuto vascolare

Apoptosi

Infiammazione acuta


Applicazioni chimiche e batteriologiche

Tumori

Agenti patogeni- Funghi- Insetti- Batteri

Vettori di agenti

patogeni (Malaria)


Scopo del lavoro

Malaria vaccino controllo vettori

La porfirina, utilizzata come fotosensibilizzatore per la PDT, permette un buon controllo dei focolai malarici che si possono sviluppare a causa del mancato controllo dei vettori.

I derivati meso-sostituiti sono i più adatti grazie alle loro proprietà

- Chimico-fisiche- Fotobiologiche- Biochimiche- Fisiologiche- Dosaggio ottimale


Procedimento utilizzato Condizioni di irraggiamentoluce nello spettro del visibile (400/800nm)

Studi fotofisici e fotochimiciporfirina irraggiata e controllata spettrofotometricamente

Potenziale della porfirina come fotosensibilizzatore misurato in base alla resa

quantica (WD) della genesi dell’ossigeno singoletto (1O2)

Studi di formulazione- pellet di cibo larvale (PFP) + C14/C12- formulato C12 + Eudragit S100

Esperimenti di fotosensitizzazione60 larve alimentate con EU-C12 vengono esposte alla

luce. Si effettua quindi il conteggio delle larve morte

Microscopia a fluorescenza utilizzata

per vedere la distribuzione del

formulato


Risultati ottenutiStudi fotofisici e fotochimici

Porfirina C14

Buona fotostabilità: rimaneva attivata fino

a concentrazioni di 1mM.

Produzione di 1O2 come le porfirine meso-sostituite


Tempo di incubazione(h)a (%) di larve sopravvissuteb

Proporzione di adulti emersi(%)c

(%) di adulti sopravvissuti dopo esposizione alla

luce d

3 100(0.0) 138/141(97.9) 100

8 99.3(1.2) 128/128(100) 100

24 100(0.0) 138/141(97.9) 100

control 99.4(1.1) 155/157(98.7) 100

Per larve di Ae. Aegipty:

Nessuna fototossicità al buio, anche a concentrazioni submicromolari

Hours of irradiation LC50 (mM) CI95% R2 χ2

1 0.46 0.39-0.53 0.94084 0.29375

6 0.25 0.16-0.35 0.99381 0.03925

12 0.22 0.17-0.28 0.93035 0.39925

12 light+12 dark 0.11 0.08-0.13 0-94142 0.31300



La mortalità aumenta con il passare dei giorni

92,1% ± 7,9%



Porfirina

idrofila: incapace di penetrare le membrane lipofile

lipofila: capacità di penetrare le membrane

formulazione in microparticelle disgreganti all’interno dell’intestino

C14 coniugata con un cibo proteico per larve, il PFP. PFP – C14

Risultati ottenutiStudi di formulazione



% di mortalità su tempo di incubazione*

Treatment 48h 1 week 2 weeks C14 (mg/tray)

Control† 0(0.0) 0(0.0) 0(0.0) 0

0.3μM† 100(0.0) 100(0.0) 0(0.0) 0.230

5 μM† 100(0.00) 100(0.0) 100(0.0) 3.8

C14PF-5‡ 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0(0.0 0.007

C14PF-50‡ 100(0.0) 99.7(0.6) 99.7(0.6) 0.352

- Il C14PF-50 mantiene l’attività larvicida fino a due settimane- Il C14PF-5 perde l’attività già dopo 48h



Esche larvicide-attivamente consumate dalle larve-compatibili con il rilascio in depositi di acqua domestica-non alterano le caratteristiche organolettiche dell’acqua

Modifiche fisiche portano alla sintesi di derivati utilizzabili

contro vettori di altre malattie (Anofele spp.)

Accettazione come antilarvale da parte della

comunità destinataria



Fattori chiave per lo scale-up della produzione

- costo della porfirina- formulazione con PFP insolubili

in acqua ma solubili nell’intestino

- modulazione della flottabilità in acqua

C14

troppo costoso

C12

molto più economico



Comparazione delle proprietà come fotoattivatori

C12 adatta allo scopo

Anfipaticità della porfirina (saggiata con legame alle albumine sieriche umane HSA)

la C12 si lega addirittura meglio



Esistendo larve con differenti modi di alimentazione, abbiamo la necessità di trovare un formulato in grado di adattarsi alle diverse condizioni di galleggiabilità che incontriamo.

E’ stato riscontrato che il PFP non galleggia

Nuovo formulato con l’Eudragit S100

- stabile a diversi range di pH

- buone proprietà di galleggiabilità

- la C12 vi si lega con alta efficienza

Successivamente si è provveduto a valutare i formulati sotto diversi aspetti chiave:-rilascio della porfirina-stabilità alla luce-galleggiabilità

il migliore composto è risultato essere l’EU-D

(50µM)


Risultati ottenutiEsperimenti di fotosensitizzazione

Trattamento

Mortalità delle larve dopo incubazione per tutta la notte

Mortalità delle larve dopo 30 min. di esposizione alla luce solare (70

mW/cm2)EU 0 % 0 %EU-C12 0 % 100 %EU-C12 transfer 0 % 100 %EU-C12 water 0 % 5 %

- il complesso Por-Eud non uccide in condizioni di buio- l’azione è correlata all’ingestione del formulato- una piccola mortalità è stata rilevata per acqua EU-C12 filtrata


Dose della formulazione

Tempo di esposizione alla luce solareSpecie di larve di

zanzara

0 h 0.5 h 3 h 8 h

50 µM EU-C1230 mg

0 94 ± 8 100 ± 1 100 ± 0An. gambiae

50 µM EU-C1230 mg

0 90 ± 2 91 ± 9 97 ± 4An. arabiensis

Risultati ottenutiEsperimenti di fotosensitizzazione

Dose della formulazione

Tempo di esposizione alla luce solareSiti di selezione di

Anopheles spp. larvae

0 h 0.5 h 3 h 8 h

50 µM EU-C1230 mg

0 93 ± 3 100 ± 0 100 ± 0 Soumousso

50 µM EU-C1230 mg

0 93 ± 3 100 ± 0 100 ± 0 Vallée du Kou

E’ da tenere comunque sempre in considerazione che molti altri fattori possono competere con la palatabilità del formulato, sul campo.


Conclusioni- le porfirine sostituite possono essere considerate come un efficace fotolarvicida- la porfirina C12 meso-sostituita può tranquillamente essere utilizzata al posto

della C14 (più costosa)- la C12, quando presente e quando esposta alla luce, fotoinattiva le larve di

Anopheles, anche in siti di allevamento naturale- l’Eudragit rilascia la C12 più facilmente nelle caecae larvali gastriche, anche se in

presenza di cibo più appetibile mostra una performance deludente

L’approccio della fotoinattivazione porfirina-mediato costituisce quindi un buon controllo per la proliferazione

dei vettori malarici

Sviluppi futuri prevederanno studi del formulato EU-C12 con esperimenti sul campo atti a validare l’attività in presenza di una molteplicità di condizioni naturali


Ringraziamenti


Grazie per la cortese attenzione

Marco Pigliacampo

nuovi derivati porfirinici: proprietà fotodinamiche e prospettive di applicazione

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