Nuklearne metode za analizu bioloških materijala

Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

dr. sc. Ivančica Bogdanović Radović, viša znanstvena suradnica

iva@irb.hr

Laboratorij za interakcije ionskih snopova

Zavod za eksperimentalnu fiziku

Institut Ruđer Bošković

Zagreb, Croatia

http://www.irb.hr/hr/str/zef/z3labs/liis/

Uvod

O vrstama ionizirajućeg zračenja

Izvori zračenja u prirodi

Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja

Korištenje radioaktivnosti u svakodnevnom životu

Utjecaji zračenja na živi organizam

Međudjelovanje zračenja i materije, Nuklearne analitičke metode

Korištenje nuklearnih analitičkih metodaza karakterizaciju bioloških uzoraka

O vrstama ionizirajućeg zračenja

Vrste zračenja

Ionizirajućeionizira [izbacuje

elektrone iz atoma];

Neionizirajućeuključuje:

čestice-alpha-beta-neutron- itd.

Elektromagnetsko zračenje

Neionizirajuće zračenje- nema dovoljno energije za ionizaciju atoma (micanje elektrona iz atomskih ljusaka) - elektromagnetsko zračenje s nedovoljno energije za kidanje kemijskih veza preko netermičkih procesa- primjeri: radio, TV, mikrovalovi, radar;

infracrveno, vidljivo i ultraljubičasto svjetlo;

“Radioaktivan” vs. “Radijacija”

Radijacija(zračenje)

Ozračeni materijal

Radioaktivni izvor [radioaktivni

materijal]

Nestabilni atomi emitiraju zračenje

Zašto se neki atomi raspadaju:nuklearne sile i stabilnost

Jezgra se sastoji od protona i neutrona- nukleona. Jezgru karakteriziraju dva broja: A – maseni broj (ukupni broj nukleona)Z - atomski broj (broj protona)

Ovako to označavamo:

63 Be

Be - berilij6 – ukupan broj protona i neutrona3 – broj protona

jezgra elektroni

AZ X

Zašto se neki atomi raspadaju:nuklearne sile i stabilnost

Što drži jezgu na okupu?

Između protona djeluje odbojna elektrostatska sila (isti se naboji odbijaju), protoni su u jezgri jako blizu, jezgra je vrlo malih dimenzija (femtometri!).

Na nukleone u jezgri djeluje jaka nuklearna sila koja je kratkog dosega.

Jaka nuklearna sila je vrlo jaka privlačna sila za protone i neutrone odvojene nekoliko femtometara ali je zanemariva na većim udaljenostima.

Sile koje djeluju u 6Be jezgri

p

p

p

n n

n

Elektrostatskoodbijanje

Nuklearna sila

proton

neutron

Krivulja stabilnosti jezgri

Z (

bro

j p

roto

na

)- Što smo dalje od ravnotežnog stanja jezgre se brže raspadaju

N = Z

N ≈ 1.5 Z

nestabilne –previše protona

Nestabilne –previše neutrona

N (broj neutrona)

Alfa čestice

Alfa čestica se sastoji od 2 protona i 2 neutrona. To je u stvari atom helija kojem su maknuti elektroni pa je ostala samo jezgra. α

42 He

Opasnosti od α čestica

- koža će zaustaviti α čestice

- opasno ako izvor unesemo u sebe, udisanjem ili preko hrane

- kao zaštita od njih dovoljan je list papira, a zaustavit će se i u zraku

- mnogi radionuklidi koji se nalaze u zemlji, radon idrugi radioaktivni materijali raspadaju se emisijom α čestica

Beta čestice

βBeta čestice su elektroni visokih energija. Električki su negativni.Emitiraju se u beta raspadu.

β− raspad, neutron (n0) se pretvara u (p+) uz emisiju elektrona (e−) ianti-neutrina (νe):

40 4019 20K Ca e ν

−−→ + +

Opasnosti od beta čestica

- opasnost za kožu, oči ili ako se unesu u tijelo

- zaustavlja ih malo deblji materijal (recimo plastika)

- dolaze iz hrane, vode i zraka

γ ili x-zračenje

- fotoni (elektromagnetsko zračenje)

γ - zračenje kad nakon radioaktivnog raspada jezgra prelazi u osnovno stanje, vezano uz jezgrux – zračenje vezano uz atomsku ljusku, kod ionizacije elektrona iz unutarnjih ljuski atoma atom prelazi u osnovno stanje tako da neki elektron iz vanjske ljuske popuni nastalu šupljinu a zbog zakona o sačuvanju energije emitira se x-zračenje

γ or X-ray

Spektar elektromagnetskog zračenja

valna duljina, metri

frekvencija, Hz

energija fotona, eV

Izvori X - zračenja

Zakočno zračenje

Karakteristično x-zračenje

Izvori γ-zračenja

U nuklearnim reakcijama kad jezgra preko raspada prelazi u niže pobuđeno stanje

Centar naše galaksije kao i druge udaljene galaksije su također izvori γ-zračenja. Naša atmosfera štiti nas od većine γ-zračenja proizvedenog u svemiru.

Valna duljina, metri

X-zračenje vs. γ - zračenje: - nema jasne granice što se tiče energije fotona

Definirane su preko izvora:γ-zračenje iz jezgri, x- zračenje iz atoma i drugih izvora.

frekvencija, Hz

Energija fotona, eV

X i γ zračenje su prodorna zračenja

zaustavlja ih olovo

prirodno prisutni u tlu i kao kozmičko zračenje

medicinska primjena

Neutroni

n- nemaju naboj i ne djeluju elektromagnetskom silom s okolinom no mogu direktno izbiti iz atoma česticu i na taj način ioniziraju atom

H HO Molekula vode

Ulazni neutron

Izbijeni proton

Izbijena čestica dalje ionizira atome oko sebe.

Pošto je čovjek građen uglavnom iz vode ova reakcija je česta.Iako gubitak molekule vode ne predstavlja problem sam po sebi, taj će proces kreirati kemijski reaktivne slobodne radikale kao što suH+ i OH- koji difundiraju kroz stanicu i izazivaju oštećenja.

Neutroni su izuzetno opasni jer su zbog neutralnosti najprodorniji i najviše međudjeluju s lakim atomima.

Različite vrste zračenja imaju različitu prodornost u materijalima

Vrijeme poluraspada radioaktivnih tvari

Najteži prirodni radioizotop je uran a vrijeme poluraspada mu je 4.5 x 109 godinaŠto je radioaktivni izotop nestabilniji kraće mu je vrijeme poluraspada

Vrijeme potrebno da bi se broj radioaktivnih atoma u nekom uzorku raspao na polaVrijeme poluraspada je fiksirano – nema veze koliko je velik uzorak, kolika je temperatura ili tlak, uvijek je to jednako vrijeme

Jedinice za radioaktivnost

Aktivnost – količina radioaktivnog materijala

1867-1934

curie (Ci): 3.7x1010 raspada/sekundi

• 1 Ci = velika aktivnost [bazirana na 1 g radija]

• odrastao čovjek ima u sebi ~0.1 mikrocuria (µCi) 14C 1859-1906

1852-1908

becquerel (Bq): 1 raspad/sekundi

• 1 Bq = mala aktivnost [SI jedinicat]

• odrastao čovjek ima ~3,700 Bq 14C

1 µCi = 37 kBq = 2.22x106 dpm [disintegration/minute]

Izvori zračenja u prirodi

Zračenje je svuda oko nas – prirodni izvori zračenja

Zemlja i živi organizmi na njoj stalno su izloženi zračenju koje dolazi iz svemira. To zračenje međudjeluje s atomima u atmosferi i kreira sekundarno zračenje (x-zračenje, p, n,e, itd.)

Radioaktivni materijal nalazi se svuda oko nas u prirodi (u zemlji, stijenama, vodi, zraku, biljkama pa i u nama samima). Prirodna radioaktivnost – posljedica raspadanja prirodno nestabilnih nuklida.

Glavni radionuklidi u prirodi su 40K, 238U i 232Th.Od rođenja Zemlje svi se oni raspadaju (imaju dug poluživot). Tako je 40K sad prisutan u dozi koja je otprilike za ½ manja od one koja je bila na početku rađanja Zemlje.

Izvori umjetnog zračenja

Medicinski – terapije, dijagnostikaProfesionalniCiklus nuklearnog gorivaOtpadIndustrijaDrugi

Prirodna radioaktivnost - građevinski materijali

(pCi/g)Potassium

(pCi/g)Thorium

(pCi/g)UraniumMaterial

320,221.7Granite

11.20.190.2Sandstone

6.40.571.2Cement

2.40.230.8concreteLimestone

2.40.230.3concreteSandstone

2.40.320.4Dry wallboard

0.21.785gypsumBy-product

40.20.4GypsumNatural

9000Wood181.23Clay Brick

Zračenje je svuda oko nas

Radon je plin koji nastaje kao produkt u raspadu 238U (koji se nalazi u zemlji i ima ga posvuda).

Koncentracija radona najveća je blizu tla, posebno u podrumima pa je provjetravanje prostorija vrlo važno.

Radon udišemo u pluća a kako se on dalje raspada na taj smo način unijeli izvor zračenja u sebe. Radon je najveći pojedinačni doprinos dozi koju čovjek dobije iz prirodnih izvora zračenja.

Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja

Malo o povijesti otkrića ionizirajućeg zračenja

Wilhelm Conrad Röntgen(1845-1923) – 8. studenog 1895.Röntgen otkriva X-zrake, i to otkriće je gotovo trenutno dovelo do promjena u fizici i medicini.U 1. godini nakon otkrića objavljeno na tu temu više od 1000 stručnih i znanstvenih članaka.Za svoje otkriće, Röntgen dobiva Nobelovu nagradu za fiziku 1901. godine.

- Istraživanje luminiscencije uranovih soli

Antoine Henri Becquerel( 1852-1908) – Prvo je vjerovao da je energija sunca apsorbirana u uranu odgovorna za emisiju x-zračenja iz njega

Kasnije je shvatio da uran emitira zračenje bez nekog vanjskog izvora energije (kao što je npr. Sunce)

Becquerel je otkrio radioaktivnost, spontanuemisiju zračenja iz materijala.

Za to je otkriće 1903. godine dobio Nobelovu nagradu iz fizike.

Slika Becquerelove fotografske pločena kojoj se jasno vide zatamnjenja nastala kao posljedica izloženosti zračenja uranovim solima. Jasno se može vidjeti sjena metalnog Malteškog križa koji je bio postavljen između materijala i fotografske ploče.

Pierre Curie(1859-1906) Marie Curie(1867-1934) –Naziv ‘radioaktivnost’ prvi put spominje M. Curie.1895. g. Curievi su radili eksperiment kemijske ekstrakcije urana iz rude. Zaključili su da u rudi, uz uran, postoje još neki radioaktivni elementi. Novim elementima koje su otkrili dali su imena polonij i radij. Za svoj su rad dobili Nobelovu nagradu iz fizike a nekoliko godina kasnije Marie Curie je dobila i Nobelovu nagradu iz kemije.Bila je prva osoba koja je osvojila, ili podijeliladvije Nobelove nagrade. Jedna je od dvijeosobe koja je dobila Nobelovu nagradu u dvarazličita područja (drugi je Linus Pauling), i do listopada 2005. ostaje jedina žena koja jedobila dvije Nobelove nagrade. Umrla je od leukemije najvjerojatnije zbog prevelikogizlaganja radijaciji tijekom višegodišnjaistraživanja.

Ernst Rutherford je 1898. godine ustanovio da se zračenje iz urana sastoji od dviju komponenti. Jedne koja se lako absorbira u tvarima (nazvao ju je α-zračenje) i druge koja je prodornija (β-zračenje).

Otkrio je postojanje atomske jezgre (poznati pokus raspršenja α-čestica na tankoj foliji zlata)I razvio model atoma sličan solarnom sistemu . Jednako kao što planeti kruže oko Sunca, tako i elektroni kruže oko atomske jezgre.

Rutherford je prvi ‘alkemičar’ tj.čovjek koji je izveo nuklearnu reakciju (1919), on je pretvorio dušik u kisik.

1871 -1937

"All science is either physics or stamp collecting"

14 4 17 17 2 8 1N He O H+ = +

Korištenje radioaktivnosti u svakodnevnom životu

Korištenje radioaktivnosti za određivanje starosti

Datiranje pomoću 14C:Svi živi organizmi sadrže određeni udio radioizotopa ugljika 14 (14C)U trenutku kad biljke i životinje umru udio 14C počinje opadati, zato što raspadajući14C više nije zamjenjen s 14C koji unose u sebe preko npr. hraneVrijeme poluraspada 14C je5700 godinaZnanstvenici mogu odrediti starost organskih ostataka (npr. kosti) usporedbom iznosa 14C koji je preostao u uzorku prema onom koji bi bio u živom organizmu i koriste pri tome krivulju za poluraspad.

Korištenje radioaktivnosti – γ zračenje

Terapija zračenjem:Gama zračenje ubija stanice rakaOdređivanje potrebne doze je od velikog značaja – prevelika doza će ubiti i zdrave stanice, premala neće spriječiti širenje raka

Sterilizacija hrane i medicinske opreme 60Co:Produljuje vijek trajanja hrane, čajeva,lijekova,...Sterilizira se oprema koja bi inače bila uništena visokom temperaturom

Provjera kvalitete varovaZa visokotlačne posude, cjevovode,

plinovode, i sl.

Tracers:Za praćenje puta tvari kroz tijelo npr. da

se detektira blokirani bubreg

Korištenje radioaktivnosti – α i β zračenje

Detektori dima:Sadrže malu količinu 241Am koji emitira α zračenje. One ioniziraju zrak i tako teče struja.U trenutku kad dim uđe u detektor on absorbira α zračenje i to prekida strujni krug. Prekidanje strujnog kruga pokreće alarm.

Testiranje debljine:S jedne strane postavimo izvor β čestica a s druge Geiger brojač, između njih nalazi se papir čiju debljinu ispitujemo.Mjeri se količina β zračenja koja dođe u brojač kroz papirAko se premalo (previše) zračenja detektira

u brojaču to znači da je debljina papira prevelika (premala) i stroj se automatski podešava da napravi papir deblji (tanji).

Utjecaji zračenja na živi organizam

Doza zračenja

Oštećenje organizma povezano je s količinom zračenja.Dozu možemo promatrati u kontekstu broja ionizacija proizvedenih po jedinici mase u ozračenom tkivu.

Energija potrebna za stvaranje ionskog para neovisna je o vrsti upadnog zračenja, mnogo je bolje izraziti dozu zračenja kao energiju absorbiranu u tkivu po jedinici mase.

1 Gray = absorbirana energija od 1 J/kg

[ Starija jedinica je “rad”: 1 Gray = 100 rad. ]

Ipak, broj ionizacija (ili absorbirana energija) nije jedini faktor. Ako je gustoća ionizacije velika biološko oštećenje bit će veće. Svakoj vrsti zračenja može se pridružiti tzv. ‘Quality Factor’, koji uzima u obzir taj efekt (veći ‘quality factor’ veće oštećenje biološkog materijala).

Vrsta zračenja Quality Factor

X- i γ-zračenje 1

β zračenje 1

α zračenje 20

neutroni 20

Ovisi o energiji neutrona

α i n rade 20 puta više oštećenja od β, X- i γ-zračenja!

Da bi se izmjerili efekti oštećenja izazvani radijacijom u ljudskom tijelu koristimo:

Ekvivalentna doza = Absorbirana doza (u Gray-ima) x Quality factor

To se mjeri u Sivertima (Sv)

[ stara jedinica “rem”, 1 Sv = 100 rem ]

Utjecaj na zdravlje –deterministički efekti

Utjecaj na zdravlje ne ovisi samo o primljenoj dozi nego i o vremenu u kojem smo tu dozu primili.Primanje iste doze ali kroz duže vremensko razdoblje je manje štetno zato jer tijelo ima više vremena za popravak štete.

Izloženost velikoj dozi zračenja u kratkom vremenu zovemo akutna ekspozicija.

Doza zračenja (Sv) Utjecaj na zdravlje

> 0.1 promjene u krvnoj slici

0.5 mučnina

0.75 povraćanje, gubitak kose

4 Smrt unutar 2 mjeseca ( za 50% ozračenih)

>6 Sigurna smrt

Ukupna doza Izvori za koje je zaslužan čovjek

Radon

Internal 11%

Cosmic 8% Terrestrial 6%

Man-Made 18%

55.0%Medical X-Rays

NuclearMedicine 4%

ConsumerProducts 3%

Other 1%

11

Godišnja doza zračenja koju primi čovjek

Natural (mSv)Radon 2Cosmic 0.27Terrestrial:-external 0.28-internal 0.39

Artificial (mSv)-Diag. X-rays 0.39-Nuc. Med. 0.14-Consumer Pro. 0.10-Other ~0.01

TOTAL ~ 3.6 mSv

Utjecaj na zdravlje – stohastički efekti

Dugotrajni efekti na zdravlje izazvani malim dozama zračenja kroz dulje vrijeme zovu se stohastički. To znači da se neposredno nakon izloženosti ne moraju pokazati trenutačni klinički efekti ali postoji određena vjerojatnost razvoja malignih bolesti kao što su leukemija ili rak kostiju.

Analiza ljudi koji su primili velike doze zračenja, kao što su preživjeli iz Hiroshime i Nagasakija, ljudi koji su živjeli blizu Chernobyla i pacijenti izloženi zračenju u okviru terapije, omogućuju nam da procijenimo vjerojatnost razvoja malignih bolesti u ovisnosti o primljenoj dozi:

Doza od 1 Sv ! Rizik od 1 na 50 (tj. 2%) od umiranja od raka.

Izloženost zračenju može također utjecati na nerođenu generaciju. Ako je npr. jedan roditelj bio izložen dozi od 1 Sv prije začeća, rizik ozbiljnog defekta pri porodu djece ili unuka je 4 na 1000 (0.4%).

Utjecaj zračenja: glavni kemijski efekti u tkivu – stvaranje slobodnih radikala

Primarne reakcije [unutar ~10-10 sekunde nakon prolaska ionizirajućeg zračenja] – Molekula vode se disocira na slobodne radikale

H2O → H + OH

Sekundarne reakcije [10-5 sekunde]

H + H → H2 (plin)

H + OH → H2O (voda)

OH + OH → H2O2 (vodikov peroksid)

Efekti oštećenja DNA

Genomic Instability

Sometimes DNA damage produces later changes which

may contribute to

cancer.

Gene Expression

A gene may respond to the

radiation by changing its

signal to produce

protein. This may be

protective or damaging.

Gene Mutation

Sometimes a specific gene is

changed so that it is

unable to make its

corresponding protein

properly

Chromosome Aberrations

Sometimes the damage effects

the entire chromosome,

causing it to break or recombine in

an abnormal way. Sometimes parts of two different chromosomes

may be combined

Cell Killing

Damaged DNA may trigger

apoptosis, or programmed cell death. If only a

few cells are affected, this

prevents reproduction of

damaged DNA and protects the tissue.

Studije su pokazale da najveći dio zračenjem izazvanog DNK oštećenja tijelo može samo popraviti.

Međudjelovanje zračenja i materije:

Nuklearne analitičke metode

Međudjelovanje zračenja s materijom

Ionizacija: izbijanje elektrona iz atoma

Pobuđivanje: podizanje elektrona u orbitalama na više energijske nivoe dizanje u više orbitale tog istog atoma

Raspršenja: ulazni ioni rasprše se elastično ili neelastično na jezgrama atoma mete

Aktivacija: proces u kojem materijal postaje radioaktivan nakon što je izložen djelovanju neutrona, protona, ili neke druge vrste zračenja

Za nuklearne analitičke metode najčešće ne koristimo prirodne izvore zračenja već ubrzavamo različite ione (ionizirane atome različitih elemenata) da bi njima potaknuli reakcije u različitim uzorcima.

Ione dobivamo iz ionskih izvora a ubrzavamo ih na visoke energije pomoću akceleratora ili ubrzivača.

Nuklearne analitičke metode (Ion Beam Analysis)

Charge pulse

Recoil nuclei

Transmitted particles

Forward scattered particles

Light

X-rays

γ − rays

Backscattered particlesTARGET

Ion beam

Nuclear reactionproducts

Secondary electrons

ANALIZA (elementi, izotopi)koristeći ione MeV-skih energija -(nA, pA):- elementi – Z > 12 (PIXE)

- C,N,O (RBS)- H (ERDA)

- isotopi – nuklearne reakcijeγ - zrake (PIGE)čestice (NRA)

KARAKTERIZACIJA s MeV pojedinačnim ionima - (fA):

- gustoća - (STIM)- prijenos naboja - (IBIC)- kristalna struktura - channelling (RBS, STIM, PIXE)- morfologija – sekundarni elektroni (SEI)- Kemijske veze - svjetlost, x-zrake (IL, PIXE)

PIGE

NRA

PIXE

RBS

SEI

ERDA

STIM

IBIC

IL

Akceleratori ili ubrzivači – tvornice brzih iona

S1

S2

M1

M2

sw2

D1D2 Q1

tQ2

Q3

DM

E1E2

6.0 MV EN Tandem Van de Graaff

F1F2

F3

F3

tQ1 tS2 tM2

sw1

Direct extractionduoplasmatron

tM1

F1tS1

tE1 tL1

tS1

1.0 MV HVE Tandetron

Sputtering ionsource

Alphatross ionsource

S3

Nuclearmicroprobe

PIXE/RBS

TOF ERDANuclear

reactionsimplantation& HR PIXE

external beamPIXE

Sputtering ionsource

S4

Nuclear microprobe

Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

Zaustavljanje iona u materijalu

3 MeV protons x2

Range (µm)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

dE/d

x

0

10

20

30

40

50

60

4.5 MeV Li7 ions

• Mijenjanjem energije i vrste iona, IBA metode mogu se koristiti za ispitivanje različitih debljina uzorka.

• Doseg raznih iona u siliciju dan je kao primjer:- 1.5 MeV p - 30 mm, - 3.0 MeV p - 90 mm- 6.0 MeV p - 290 mm- 3.0 MeV Li6 - 6.5 mm- 3.0 MeV O16 - 2.7 mm

3 MeV protoni u zraku

Protonima inducirana emisija x-zračenja (PIXE)

Osnovni fizikalni principi:- ion prolaskom kroz materijal gubi energiju pobuđujući e- u atomu- ako je izbačen e- (K, L....) iz unutarnje ljuske – atom ostaje nestabilan- unutarnju ljusku popunjava vanjski e - u kratkom vremenu (t < 10-15 s)- zbog zakona sačuvanja energije – jedan način je emisija karakteristične x-zrake- Svi elementi (osim H) ima svoj zapis preko karakterističnih x-zrake pa ih mi koristimo da bi odredili elementni sastav uzorka.

- Mjerenjem intenziteta karakterističnih x-zraka mogu se odrediti koncentracije elemenata u uzorku s granicom detekcije ~ 1 ppm (part per million).

PIXE

- Za mjerenja se tipično koriste protoni energije 2-3 MeV dobiveni iz akceleratora- za detekciju X-zračenja koriste se poluvodički Si(Li) detektori - standardno se mogu odrediti elementi od Na do U (K i L x-zračenje)- metoda je multielementna i nedestruktivna!

Si

CuPb

ClSn

Fe

Cu

Pb

Sn

inte

nzite

t

energija (keV)

PIXE spektar arheološkog uzorka (Apoxiomenos).

PIXE setup u vakuumu

PIXE setup s vanjskim snopom:

Si(Li) detector

beam sample

beam

Si(Li) detector

thin exit foil

Analiza u vakuumu:- manja absorbcija (važno za

x-zračenje niskih energija)- širenje snopa zbog

raspršenjaproblemi: veličina uzorka i

integritet

Analiza u zraku:- Korisno za umjetnost i arheologiju - veliki objekti- manje ostećenje uzorka zbog snopa- glavni problemi: smanjena je kvaliteta snopa (gubitak energije, širenje snopa u izlaznom prozoru i okolnom zraku).

sample

He or H gas flow

Komora za raspršenje s pripadnim detektorima

Čestični detektor

Detektor x-zračenja

Detektor za vodik

Si čestični detektori

RBS - Rutherford Backscattering spektroskopija

- Počiva na činjenici da energija iona koji su elastično raspršeni unatrag na atomima mete ovisi o masi atoma mete (kinematički faktor) i odubini na kojoj se je desilo raspršenje (gubitak energije ne putu u uzorak i natrag na putu iz uzorka prema detektoru).

Uzorak M2kinematički faktor:

Ulazni ion E0, M1

θE1

Čestični detektor

RBS - Rutherford Backscattering

mass scale! ~ laki ioni (p, α ili Li)

energije nekoliko MeV

RBS - Rutherford Backscattering

DETECTOR

IONBEAM

SAMPLE

Energy

Backscatteredparticle spectrum

M3

M2M1

pogodno za:- tanke filmove- teške elemente u lakim

matricama

problem:- laki elementi u teškim

matricama

ERDA – Elastic Recoil Detection Analysis- detekcija elastično izbijenih jezgri

ERDA

4He, 7Li, 12C Ili neki drugi teži ion

ERDA

- teži upadni ion izbije lakši atom iz mete- Zion > Zatom

-Ako postavimo čestični detektor u prednje kuteve možemo detektirati lakše izbijene atome- koristi se najčešće za detekciju H

Primarni ioni

H

NRA – Nuclear Reaction Analysis- analiza detekcijom nuklearnih reakcija

Ioni MeV-skih energija mogu izazvati nuklearne reakcije u jezgrama atoma koji se nalaze u uzorku.NRA se najviše koristi za analizu H, Li, Be, B, C, N, O,F, Na, Al, P.Prinos produkata reakcije (g, p, n, d, 3He, 4He, etc.) je proporcionalan koncentracijiodređenog elementa u uzorku.

NRA – Nuklearne reakcije

11B (p,α) 8BeQ = 8.582 MeV

O (RBS)Si (RBS)

Ge (RBS)

B (NRA)

- Isti čestični detektor kao i za RBS- RBS dio spektra dobro je odvojen od dijela koji pripada produktima

reakcije (for Q > 0)

PIGE - Protonima Inducirana Emisija γ-zračenja

D.D. Cohen et al. / Nucl. Instr. and Meth. in Phys. Res. B 219–220 (2004) 145–152

STIM – Scanning Transmission Ion Microscopy

Princip STIM metode - čestica prolaskom kroz uzorak gubi energiju u sudaru s elektronima. Mjerenjem gubitka energije individualnih čestica u transmitiranom snopu dobijemo informaciju o gustoći ili debljini uzorka.

STIM

proton

UzorakSekcija tkiva (nekoliko µm) izolirane stanice

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

X (µm)

Korištenje nuklearnih analitičkih metoda za

karakterizaciju bioloških uzoraka

Primjeri iz biologije:

Mikroproba konferencija ICNMTA 2004 - 99 znanstvenih publikacija objavljeno u Zborniku radova s konferencije od toga njih 31 je povezan s biomedicinskim aplikacijama

- Distribucija elemenata u stanicama

- Istraživanje neurodegenerativnih bolesti (Alzheimer, Parkinson) određivanjem distribucije elemenata u tkivu mozga

- Prostorna distribucija elemenata u tragovima s morfološkim osobinama arterosklerotičnih nakupina

- Distribucija metala u tkivima i organima nakon akutne izloženosti tim metalima

- Studije apsorbcije pojedinih spojeva iz kozmetičkih preparata u kožu (metalni oksidi

npr. TiO2 koji služi kao zaštitni faktor u kremama za sunčanje)

- Analiza metala u proteinima

- Proučavanje uloge Ca i ostalih bioloških elemenata u tragovima tijekom fotodinamičke

terapije tumora

-Proučavanje distribucije elemenata u bioindikatorima i bioakumulatorima kod mjerenja zagađenja zraka

elementalmaps

XY

protonbeam

scangenerator

XY

quadrupole doubletfocusing lens

sample

x-raydetector amplifier

X-rayenergyspectrum

object slits

Pb

Ca

S

Fe

Protonska mikroproba – što je to?

Komora za protonsku mikroprobu

2 mikroskopa

9 ulaza za detektore

load-lock komora

nosač uzoraka:- grijanje/hlađenje

- višepinski el. kontakt

xyz manipulator

goniometar

2x2 µm2 u modu velikih struja

500x500 nm2 u modu malih struja

Ruđer Bošković Institute, Zagreb, Croatia

2D distribucija elemenata

Micro-PIXE, RBS, ERDA – koncentracija i distribucija elemenata u raznim uzorcima.

Kod bioloških uzoraka –vrlo važna je priprema uzoraka a nepravilna priprema može dovesti do kontaminacije uzorka, gubitka ili redistribucije elemenata.

Si

Ca

ClCl

Priprema uzoraka

Cilj je tako pripremiti uzorak da se sačuva distribucija elemenata koliko god je moguće sličnija onoj kakva je bila kod živog organizma.

Pravilna priprema uzoraka je od velike važnosti za mikroPIXE i nemar kod pripreme uzoraka može uzrokovati, kontaminaciju uzorka, gubitak elemenata iz uzorka ili redistribuciju elemenata.

MikroPIXE analiza se izvodi u vakuumu zato uzorak mora biti isušen i imobiliziran u svom funkcionalnom stanju kakvo je bilo prije analize.

- Također je važno i kolika je debljina uzorka prema debljini podloge na koju smo uzorak stavili jer je za šum ali i za RBS metodu jako važna ukupna količina materijala (masa uzorka + podloge). Nije dobro ako je masa podloge puno veća od mase uzorka. Debela podloga kvarit će granicu detekcije metode zbog šuma koji dolazi od zakočnog zračenja.

Priprema uzoraka – tehnike na niskoj temperaturi

Što kraće vrijeme između uzimanja uzoraka i smrzavanja jako bitno.

Preporučena metoda je niskotemperaturna obrada uzoraka smrzavanjem (cryofixation) nakon kojeg slijedi rezanje smrznutih uzoraka na tanke slojeve (cryosectioning) i liofilizacija (freez-drying).

Najčešći materijal na koji se stavljaju biološki uzorci za PIXE su tanki plastični filmovi.

Za kvantitativnu elementnu analizu važno je da su ti filmovi ‘spektroskopski čisti’ tj. da su sastavljeni od elemenata (C,H,N,O) koji se ne vide u spektru karakterističnog x-zračenja te da u sebi nemaju kontaminacije težim elementima (koji su vidljivi u spektru x-zračenja).

To je posebno važno za točno određivanje koncentracije elementa, kao što je npr.određivanje metala u proteinima u obliku isušenih kapljica na tankom filmu. Koncentracija metala je određena relativno prema koncentraciji sumpora (za proteine) ili fosfora (za DNA) u uzorku, tako da prisustvo tih elementa u filmu na koji se uzorci montiraju može značajno utjecati na rezultat.

Priprema uzoraka - podloga na koju se stavljaju uzorci

film debljina (µm)

Mylar 1 -3

pioloform 0.2-0.3

Analiza proteina pomoću mikroprobe

Mnoge molekule proteina sadrže mali broj metalnih atoma koji su bitni za biokemijsku funkciju pproteina. Poznavanje količine i vrste tih atoma može biti od presudnog značenja kako za razumijevanje funkcije tako i za interpretaciju strukturnih podataka koje dobivamo iz x-ray kristalografije.Kako je koncentracija metala mala a i količina uzorka mala (mikrolitri otopine), microPIXE je jedna od rijetkih tehnika pogodnih za dobivanje pouzdanih rezultata.

Kvantifikacija mjerenja se bazira na činjenici da većina proteina sadrži poznati iznos sumpora pa je dovoljno mjeriti omjer metala prema sumporu da bi odredili broj metalnih atoma po molekuli.

~1 µl Mylar foilTM

SampleAluminium frame

MylarTM folija

Aluminijski okvirić

Osušene kapljice proteinske otopine

Metallo-β-lactamase(double metal center)[C1278H2005N347O388S11] = 0,8 mg/ml (~60 µM)

Istovremena detekcija nekoliko metala u nepoznatim proteinima;

Vrlo dobre granice detekcije;Mali volumen uzorka je potreban;Mala koncentracija proteina;Ne trebaju dodatne kemikalije

kod pripreme uzoraka

H. Natal da Luz et al.,NIMB 231 (2005)308

Interakcija izmeđuInterakcija između kkarboplatinarboplatinee ((analogije analogije PPt za terapiju tomorat za terapiju tomora )) i i Cu Cu pod djelovanjem male doze zrapod djelovanjem male doze zraččenjaenja

Karboplatina se veže za DNK i stvara s njom ireverzibilne kovalentne veze i deformira strukturu DNK. Neke deformacije DNK se poprave a neke ne. Karboplatina uzrokuje zastoj staničnog ciklusa, te time dovodi do programiranestanične smrti.

Vjeruje se da mala doza zračenja može povećati međustaničnu koncentraciju karboplatine a s time i antitumorni efekt.

Određivanje Pt pomoću mikroPIXE metode je napravljeno na dvije grupe leukemijskih stanica koje su prošle tretman s carboplatinom:

1. samo tretman s carboplatinom2. kombinirani tretman s carboplatinom i dozom zračenja od 0.5 Gy.

PCuPt

9hr

CuPt P

Mali unosMali unos kkarboplatinarboplatine i e i Cu Cu u sluu sluččaju kad nije bilo dodatnog zraaju kad nije bilo dodatnog zraččenja (gore)enja (gore). . PovePoveććani unosani unos kkarboplatinarboplatinee uz dodatno zrauz dodatno zraččenjeenje (dolje)(dolje)..

S. Harada et al., predstavljeno na ICNMTA 2004 Konferenciji

Analiza elemenata u tragovima u serumu korištenjem PIXE metode

Analiza elemenata u tragovima userumu pacijenata koji boluju odsrčanih i bubrežnih bolesti.

Priprema uzoraka:Ag je korišten kao interni standard za kvantitativnu analizu. 100 µg otopine srebro nitrata kapne se u 1 ml seruma. 10 ml tog miješanog uozrka deponira se na podlogu i suši na sobnoj temperaturi.

Yoshinori Miura et al., PIXE10 2004

Distribucija koncentracija elemenata u serumu sakupljenih od pacijenata na hemodijalizi(HD) i pacijenata koji nisu na hemodijalizi ali s bubrežnim bolestima (RD). (a): HD/28

muškarci, (b): RD/6 muškarci, (c): (a) preklopljen preko (b)

Istraživanje neurodegenerativnih bolesti (Alzheimer, Parkinson) lokalizacija oboljelog tkiva i određivanje elemenata :

Elementni sastav lezija u mozgu koje su karakteristične za Alzheimerovu bolest -predmet istraživanja otkad je pretpostavljeno da elementi u tragovima (Al) bi mogli biti povezani s razvojem bolesti.

STIM slika neuronaidentificiranog u 5 µmdebelom tkivu mozga zahvaćenog AD

30x30 µm2

Energija protona 2 MeV: Transmitirani protonienergijski prozor 1.83-1.87 MeV

Shematski diagram NFT (neurofibrillary tangles) neuronai zdravog neurona

Preuzeto iz J. Makjanić, F. Watt, Nucl. Instr. and Meth. B 150 (1999) 167

Pronalaženje oboljelog tkiva bez bojanja -nema kontaminacije, oboljelo tkivo je gušće od zdravog i protoni gube prolaskom kroz njega više energije.

Prostorna distribucija elemenata u tragovima s morfološkim osobinama arterosklerotičnih nakupina :

F. Watt et al., Nucl. Instr. And Meth. B 249 (2006) 646

STIM i elementne mape ranih lezija (bijeli zečevi hranjeni 8 tjedana masnom hranom(1% kolesterol)). Na STIM slici lezija se prepoznaje preko veće gustoće i povećane koncentracije fosfora. Veličina mape je 1200 × 1200 µm2

Studije apsorbcije pojedinih spojeva iz kozmetičkih preparata u kožu

TiO2 se često koristi u kozmetičkim preparatima. Ipak, malo je eksperimenata napravljeno da bi se proučilo koliko duboko prodire kroz kožu i kakvi su njegovi efekti na organizam. Mikro-PIXE,RBS i STIM koriste se u kombinaciji za mapiranje elementnog sastava i idetifikaciju slojeva kože.

ClSTIM + Ti P S Ti

0 60000 0 20000 0 20000 0 60000

Zs. Kertesz et al., Nucl. Instr. and Meth. in Phys. Res. B 231 (2005) 106

Ozračavanje pojedinačnih stanica

- Mikroproba je posebno zanimljiva jer je u stanju predati stanici preciznu dozu zračenja

- Za istu dozu zračenja teže čestice su mnogo‘efektnije’ od lakših ili od x-zraka zbog veće gustoće ionizacije proizvode štetu koju je teže popraviti

- Proučavaju se efekti koje na stanicu i njezinu okolinu izazivaju pojedinačni teži ioni

-Proučavanje ‘bystander’ efekta – 1. put opazili Nagasawa i Little, Cancer Res. 52 (1992) 6392Iako je samo 1% stanica bio izložen snopu α česticaoštećenja kromosoma primjećena su u oko 30% stanica

Zaključak

- Protonska mikroproba s prostornim rezolucijom snopa od 2x2 µm2 i nuklearne analitičke tehnike PIXE, RBS, ERDA, STIM omogućuje 2D mapiranje gotovo svih elemenata u uzorcima s velikom osjetljivošću (u području ppm)

- Veliki je interes u svijetu za analizu različitih vrsta bioloških materijala na mikroprobi (otprilike 1/3 objavljenih radova vezanih za mikroprobu odnosi se na takve uzorke)

- Definicija problema + priprema uzorka (od izuzetne važnosti za uspjeh) -biolozi, medicinari, botaničari

- Posljednjih godina raste broj uređaja posvećenih ozračivanju pojedinačnih stanica