nguyỄn trung thÀnh nghiÊn cỨu phƯƠng phÁp biẾn...

NGUYỄN TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH

DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT

HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

PTN CÔNG NGHỆ NANO

NGUYỄN TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH

DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT

HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1

Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

PTN CÔNG NGHỆ NANO

i

Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành

Lời cảm ơn

Công sinh thành, dưỡng dục, trao trọn yêu thương không bờ bến, một đời của cha mẹ

để con có được những ngày hôm nay, con xin tạc dạ. Cảm ơn người!

Ơn dạy dỗ tận tâm của thầy cô không thể nào đền đáp, em xin ghi lòng. Em xin cảm

ơn!

Xin gửi tới thầy giáo, cán bộ hướng dẫn em đề tài luận văn này, PGS.TS Nguyễn

Tiến Thắng lời cảm ơn chân thành nhất. Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dành thời gian quý

giá của mình để đọc và sửa nội dung khoa học của bài luận này.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đặng Mậu Chiến. Một người thầy, người

quản lý tận tâm vì sự phát triển của sự nghiệp khoa học nước nhà.

Xin gửi tới Thạc Sỹ Phan Nhật Thanh Khoa lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.

Anh là một người thầy, một người anh chưa bao giờ thiếu nhiệt tình và tâm huyết giúp đỡ

tôi hoàn thành luận văn này.

Cảm ơn Thạc sỹ Phạm Văn Bình, anh đã giúp tôi hiểu sâu hơn một số vấn đề liên

quan đến y sinh trong đề tài này.

Cảm ơn em Phạm Văn Thọ, các nghiên cứu viên, nhân viên của Phòng thí Nghiệm

Công nghệ Nano đã có những giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài ở LNT.

Chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Hội đồng bảo vệ luận văn này đã đọc,

phản biện giúp em hiểu rõ hơn những vấn đề chưa rõ.

Tôi cũng chân thành cảm ơn đề tài C2014-32-01 thực hiện tại PTN Công nghệ Nano,

Đai học Quốc gia Tp. HCM đã cho tôi cơ hội tham gia thực hiện nghiên cứu này.

Xin gửi lời chúc sức khoẻ, hạnh phúc tới quý thầy cô, anh chị và các bạn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014

Học viên cao học

Nguyễn Trung Thành

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã

được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Học viên thực hiện Luận văn

Nguyễn Trung Thành

iii


MỤC LỤC

Trang phụ bìa Trang

Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i

Lời cam đoan ....................................................................................................................... ii

Mục lục ............................................................................................................................... iii

Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. vii

Danh muc các bảng........................................................................................................... viii

Danh mục hình ảnh ............................................................................................................. ix

Mở đầu .............................................................................................................................. 01

1. Giới thiệu ...................................................................................................................... 01

2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài .................................................................................... 02

2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 02

2.2. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 02

3. Tóm tắt nội dung của đề tài ........................................................................................ 03

CHƢƠNG 1 ...................................................................................................................... 04

TỔNG QUAN

1.1. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ....................................................... 04

1.1.1. Cảm biến sinh học .......................................................................................... 04

1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học. ............................. 04

1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học ................. 05

1.1.1.3. Phân loại ........................................................................................... 06

1.1.2. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ............................................... 08

1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên

nguyên lý thanh dao động. .................................................................. 08

1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của cảm biến sinh học trên cơ

sở thanh dao động .......................................................................................... 10

1.2. Ung thƣ gan ............................................................................................................... 11

1.2.1. Thực trạng bệnh nhân ung thư gan trên thế giới ........................................... 14

1.2.2. Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư gan ................................... 16

iv


1.2.2.1. Phòng tránh bệnh ung thư gan .......................................................... 16

1.2.2.2. Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan ................................ 17

1.2.2.3. Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan ............................... 18

1.2.3. Hệ kháng thể-kháng nguyên .......................................................................... 20

1.2.4. Chất chỉ thị ung thư gan ............................................................................... 22

1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP .............................................................................. 22

1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1 ........................................................................... 23

1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong

việc phát hiện ung thƣ gan .............................................................................................. 24

1.3.1 Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ...................................................................... 24

1.3.2. Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx ................................................................. 25

1.3.2.1 Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx ................................... 25

1.3.2.2 Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 .................................. 26

1.3.2.2.1 Giới thiệu về plasma O2 ...................................................... 26

1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma ................................................ 26

1.3.2.2.3 Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx ............................ 29

1.4 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh

dao động............................................................................................................................ 29

1.4.1. Đánh giá các bước biến đổi bề mặt ................................................................ 29

1.4.1.1. Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang .............................................. 29

1.4.1.2 Phương pháp đo góc tiếp xúc .......................................................... 30

1.4.1.3. Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP ........................ 33

1.4.2. Phương pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học

................................................................................................................................... 33

CHƢƠNG 2 ...................................................................................................................... 36

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động ....................................................... 36

2.1.1. Quy trình xuất phát từ Au ............................................................................ 36

v


2.1.1.1. Khảo sát trên wafer .......................................................................... 36

2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP ..................... 37

2.1.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2 ...................................................... 39

2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx ......... 39

2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 .................................................. 43

2.1.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ............................................ 44

2.1.2.4. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với

GOPTS ........................................................................................................... 44

2.1.2.5. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với

APTES +GAD ............................................................................................... 44

2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1 .......................... 45

2.2 Các phƣơng pháp, thiết bị khảo sát và hoá chất sử dụng trong đề tài ................. 47

2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang ............................................................ 47

2.2.2. Máy đo góc tiếp xúc ..................................................................................... 48

2.2.3. Khảo sát bằng enzim HRP ............................................................................ 48

2.2.4. Đo độ lệch ..................................................................................................... 49

2.2.5. Các hoá chất sử dụng trong đề tài ................................................................. 49

CHƢƠNG 3 ...................................................................................................................... 51

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ............................................ 51

3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD ...................................................................... 51

3.1.2 Khảo sát nồng độ GAD ................................................................................. 54

3.1.3 Đánh giá hiệu quả quy trình tối ưu thông qua góc tiếp xúc ......................... 55

3.1.4 Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP ................................. 56

3.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO2 ................................................................ 57

3.2.1 Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 và bề mặt SiO2 ... 57

3.2.2. Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx bằng phương pháp xử lý plasma

oxy .......................................................................................................................... 58

3.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ....................................................... 59

3.2.3.1. Thời gian xử lý plasma ................................................................... 59

3.2.3.2. Ảnh hưởng của lưu lượng khí oxy .................................................. 61

3.2.3.3. Ảnh hưởng của công suất plasma ................................................... 64

3.2.3.4. Các thông số xử lý plasma tối ưu ................................................... 65

3.2.4. Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ưu ........ 66

3.2.5. Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề

mặt SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1 ...................................................... 68

vi


CHƢƠNG 4 ...................................................................................................................... 70

KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI

4.1. Kết luận .................................................................................................................... 70

4.2. Hướng phát triển của đề tài. ..................................................................................... 70

Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 71

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Stt Chữ viết tắt Diễn giải

1 AFP

Alpha-fetoprotein

2 Anti-AFP Anti-Alpha-fetoprotein

3 Anti-DKK1 Anti-Dickkopf-1

4 APTES 3-Aminopropyl triethoxysilane

5 BSA Bovine serum albumin

6 CAT Computerized Axial Tomography

7 CCP Capacitively coupled plasma

8 CT Computerized Tomography

9 DKK1 Dickkopf-1

10 DNA Deoxyribonucleic acid

11 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

12 FITC Fluorescein isothiocyanate

13 F-LCA Fluorescein isothiocyanate-Lens culinaris agglutinin

14 GAD Glutaraldehyde

15 GOPTS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane

16 GP73 Golgi Protein 73

17 HCC Hepatocellular carcinoma

18 HCV Hepatitis C

19 HRP Horseradish peroxidase

20 ICP Inductively Coupled Plasma

21 IgA Immunoglobulin A

22 IgD Immunoglobulin D

23 IgE Immunoglobulin E

24 IgG Immunoglobulin G

25 IgM Immunoglobulin M

26 LCA Lens culinaris agglutinin

27 LNT Laboratory for Nanotechnology

28 MRI Magnetic Resonance Imaging

29 PBS Phosphate buffered saline

30 RNA Ribonucleic acid

31 SPR Surface plasmon reconance

32 UV-Vis Ultraviolet–visible spectroscopy

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học. ......................................... 6

Bảng 2.2.1. Danh mục các hóa chất .................................................................................. 49

Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD. ..................................................................... 51

Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD. ................................................................................ 54

Bảng 3.1.3: Kết quả đo góc tiếp xúc nước. ....................................................................... 56

Bảng 3.2.1: Các thông số của quá trình xử lý plasma oxy ............................................... 58

Bảng 3.2.2: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy ...................................................... 60

Bảng 3.2.3: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy ...................................................... 61

Bảng 3.2.4: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy. ..................................................... 64

Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma oxy ..................................... 65

ix


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tên hình ảnh Trang

Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động khi đã nhận

kháng nguyên ..................................................................................................................... 01

Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên .......................................................................... 04

Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học. .................................................... 06

Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh học

và các chất phân tích riêng tương ứng. .............................................................................. 07

Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ

dày màng thay đổi.............................................................................................................. 08

Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt

độ thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao

động cộng hưởng khi thay đổi khối lượng ........................................................................ 09

Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất bề

mặt khác nhau. a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén. ............................................................. 09

Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống ...................................... 10

Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động ............................................. 10

Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư ........................................ 11

Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan .......................................................................... 12




Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế giới trung

bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ. ......................................................................... 14

Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng trên

thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới. ......................... 15

Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể ........................................................... 21

x


Hình 1.2.9: Bề mặt của kháng thể IgG. ............................................................................ 21

Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể. .......................................................... 22

Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẩu thuật liên

hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC ...................................................... 24

Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au ............................................ 25

Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine ............................................................... 25

Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP ................................................... 27

Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP ............................................. 28

Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử Nitơ của nguyên tử Oxy ................................. 29

Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx ................................................. 29

Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5-

carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid

succinimidyl ester .............................................................................................................. 30

Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen ........................................................... 31

Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) ........................ 31

Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt. ..................... 31

Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt. ..................... 32

Hình 1.4.6: Mô tả nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động ........................................... 34

Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng;

b) Một chíp với 9 thanh dao động .................................................................................... 35

Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer .............................................. 36

Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au. ........................................... 37

Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO). ...... 37

Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3 ......................................................... 37

Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au ....................................... 38

xi


Hình 2.1.6: Vai trò của BSA ............................................................................................. 39

Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2 ...................... 40

Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2 .......................................................... 40

Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES ............................................................. 41

Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane. R

là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) ..................................................................... 42

Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy .................................. 43

Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy. ...................................... 43

Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano ... 44

Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối

ưu hoá ................................................................................................................................ 45

Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận

DKK1 ................................................................................................................................. 46

Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt

SiNx của thanh dao động .................................................................................................. 47

Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT................................... 47

Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101 ................................................................ 48

Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT ................................................................................... 49

Hình 3.1.1: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang và thời gian ngâm GAD ................. 52

Hình 3.1.2: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD: a) 15 phút; b) 30

phút; c) 60 phút; d) 60 phút; e) 120 phút ........................................................................... 53

Hình 3.1.3: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào nồng độ GAD .......................... 54

Hình 3.1.4: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo nồng độ GAD: a) 1%; b) 1.5%; c) 2%;

d) 2.5%; e) 3%. .................................................................................................................. 55

Hình 3.1.5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ khác

nhau của AFP..................................................................................................................... 57

xii


Hình 3.2.1: Ảnh huỳnh quang của a) wafer SiNx được biến đổi với GOPTS và không

được xử lý plasma oxy và mẫu SiO2 ................................................................................. 58

Hình 3.2.2: Ảnh huỳnh quang của mẫu SiNx có xử lý plasma oxy .................................. 59

Hình 3.2.3: Đồ thị thể hiện sự thay đổi của độ sáng huỳnh quang theo thời gian xử lý

plasma oxy. ........................................................................................................................ 60

Hình 3.2.4: Ảnh huỳnh quang của 4 mẫu wafer ứng với thời gian xử lý plasma khác

nhau: a) 20 phút; b) 30 phút; c) 45 phút; d) 60 phút ......................................................... 61

Hình 3.2.5: Đồ thị sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào lưu lượng khí oxy ......... 62

Hình 3.2.6: Ảnh huỳnh quang của các mẫu ứng với lưu lượng khí oxy khác nhau: a) 20

sccm; b) 40 sccm; c) 80 sccm; d) 120 sccm; e) 160 sccm ................................................. 63

Hình 3.2.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào công suất xử lý

plasma ICP. ........................................................................................................................ 64

Hình 3.2.8: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo công suất plasma ICP: a) 200 W; b) 300

W; c) 400 W. ..................................................................................................................... 65

Hình 3.2.9: Ảnh huỳnh quang: a) mẫu không được xử lý plasma oxy; b) mẫu xử lý

plasma oxy với các thông số tối ưu ................................................................................... 66

Hình 3.2.10: Hình ảnh huỳnh quang của F-LCA trên thanh dao động được biến tính bề

mặt sử dụng các thông số tối ưu của quy trình APTES ..................................................... 67

Hình 3.2.11: Độ hấp thụ của dung dịch được đo bằng máy quang phổ UV-VIS với bước

sóng hấp thụ khoảng 540 nm ............................................................................................. 68

Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 khác

nhau ................................................................................................................................... 69

1


Mở đầu

1. Giới thiệu

Ung thư gan là 1 trong 9 bệnh ung thư hay gặp nhất trên toàn thế giới, chiếm 5,6%

trong tổng số các bệnh ung thư và là bệnh có tiên lượng xấu. Thời gian sống trung bình từ

khi phát hiện khoảng 6 tháng, chỉ có khoảng 4,7% có khả năng sống sót sau 5 năm [26].

Thật nguy hiểm hơn khi ngày càng ảnh hưởng mạnh từ mặt trái của sự phát triển như, ôi

nhiễm môi trường, lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm, uống rượu bia,… làm

tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư.

Để tăng khả năng điều trị bệnh ung thư thì yêu cầu cốt yếu là phát hiện bệnh sớm và

chính xác. Nhiều thập niên qua, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ra nhiều

phương pháp để chuẩn đoán sớm bệnh ung thư như, chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt

lớp đồng vị phóng xạ phát positron, chụp cắt lớp, nội soi,…[27].

Các phương pháp trên chủ yếu là chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã phát triển

thành khối u. Một phương pháp có khả năng phát hiện được bệnh sớm hơn, đơn giản, chi

phí thấp là phương pháp dùng chất chỉ thị thông qua cảm biến sinh học.

Các thanh dao động với kích thước micromet được ứng dụng làm cảm biến phát hiện

chất chỉ thị ung thư được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Với độ dày của

thanh dao động khoảng 1µm, dài khoảng 500-700µm, nhiều tính chất vật lý của thanh sẽ

thay đổi rõ rệt khi một lượng nhỏ chất chỉ thị (chất cần phân tích) bám lên bề mặt thanh.

Đo tín hiệu điện hoá, ứng suất bề mặt, độ lệch hoặc sự thay đổi của tần số dao động của

thanh thì ta thu được nhiều thông tin chính xác phục vụ cho quá trình phân tích và chẩn

đoán bệnh. Hình 1 mô tả sự thay đổi của thanh dao động trước và sau khi gắn kết chất chỉ

thị.

a) b)

2


Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động nhận

kháng nguyên.[1]

Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào khả năng cố định các phần tử sinh

học lên bề mặt của thanh dao động. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng khả năng

gắn kết các thụ thể sinh học lên bề mặt thanh dao động là rất cần thiết.

Các thanh dao động ứng dụng trong cảm biến sinh học thường làm từ vật liệu SiNx và

được phủ lên một lớp vàng và crom mỏng. Bản thân Au và SiNx không phản ứng trực

tiếp với các thụ thể nên để gắn kết các thụ thể này lên bề mặt thì chúng ta phải biến đổi

bề mặt của thanh dao động.

Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả

năng gắn kháng thể lên bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát

hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1.

2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài

2.1. Mục tiêu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động

được phủ lớp Au, SiNx hướng ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị AFP và

DKK1.

2.2. Ý nghĩa của đề tài

Sử dụng cảm biến thanh dao động để phát hiện các chất chỉ thị ung thư gan là

một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu, đơn giản, chi phí thấp và

đặc biệt là có thể phát hiện được bệnh ung thư gan ở giai đoạn đầu. Điều này sẽ giúp

tăng khả năng điều trị hiệu quả bệnh ung thư gan. Ở nước ta, đây là một đề tài khá

mới mẻ. Nghiên cứu này có thể mở ra những hướng nghiên cứu mới về xét nghiệm

miễn dịch nhằm chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan.

3


3. Tóm tắt nội dung của đề tài

Nội dung chính của đề tài bao gồm:

Khảo sát thí nghiệm biến đổi bề mặt Au của thanh dao động thông qua

cysteamine, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm AFP.

Khảo sát phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động thông qua

GOPTS, APTES, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm DKK1.

4


Chƣơng 1

TỔNG QUAN

1.1. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động

1.1.1. Cảm biến sinh học

1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học

Sự phát triển của cảm biến sinh học đầu tiên gắn liền với cái tên L. C. Clark, người

đầu tiên đề xuất đầu dò oxy (1956) cho việc xác định oxy trong máu và sau đó được coi

là “enzyme electrode” gồm có đầu dò enzim và hai màng lọc máu kèm theo một phần

nhỏ dung dịch glucose oxidase giữa chúng (hình 1.1.1).

Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên.

Enzim xúc tác sự oxi hoá chuyển đổi glucose thành axít gluconic. Vì vậy, lượng oxy

bị phân giải gần bề mặt điện cực tương ứng với nồng độ glucose. Sau này, một thiết bị

tương tự với glucose oxidase được giữ trong gel polyacrylamide đã được mô tả bởi

Updike và Hicks (1967). Tuy nhiên, ứng dụng phân tích đầu tiên của cố định enzim đã

được tạo ra vào năm 1962 (Guilbault et al. 1962). G. Guilbault đã đề xuất hệ thống cảnh

báo cho việc phát hiện sớm chất độc thần kinh. Nó bao gồm 2 điện cực lưới Pt với một

thanh xốp hấp thụ chứa các enzim cholinesterase cố định.

Năm 1969, cảm biến enzyme potentiometric đầu tiên dựa trên điện cực NH3 chọn lọc

và urease cho việc kiểm tra u-rê trong nước tiếu (Guilbault và Montalvo 1969).

Năm 1970, Bergveld đã phát minh transistor hiệu ứng trường chọn lọc ion (ISFET).

Năm 1972, cảm biến sinh học thương mại đầu tiên được sản xuất. Nó là thiết bị kiểm

tra đường huyết, có dạng cây bút sử dụng một điện cực.

5


Năm 1975, Janata phát minh ra cảm biến miễn dịch đầu tiên dự trên một bộ phân thế

(potentiometric transducer).

Năm 1976, ra đời cảm biến miễn dịch amperometric đầu tiên (Aizawa et al. 1976).

Cũng trong năm này, Karube phát mình ra cảm biến sinh học vi khuẩn (microbial

biosensor) dựa trên tốc độ hô hấp như là một tín hiệu đặc trưng trong tổng lượng vật chất

hữu cơ có thể oxi hoá trong nước.

Năm 1980, Peterson phát minh ra cảm biến pH sợi quang đầu tiên trong khí huyết cơ

thể.

Năm 1982, lần đầu tiên ra đời cảm biến sinh học glucose dựa trên cơ sở sợi quang.

Năm 1983, lần đầu ra đời cảm biên miễn dịch cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt

(surface plasmon reconance-SPR).

Năm 1984, ra đời cảm biến sinh học đo dòng gián tiếp đầu tiên. Ferrocene được sử

dụng với glucose oxidase cho việc thu nhận glucose.

Năm 1987, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết MediSense ExacTechTM

(mô hình

dải/bút và dùng một lần).

Năm 1990, ra mắt Pharmacia BIACore SPR dựa trên hệ thống cảm biến sinh học.

Năm 1992, i-STAT ra mắt thiết bị phân tích máu cầm tay.

Năm 1996, Glucocard được ra mắt.

Năm 1998, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết LifeScan FastTake.

Năm 2001, LifeScan đã mua hệ thống kinh doanh thiết bị kiểm tra glucose của

Inverness Medical’s với giá 1,3 tỷ đô.

Từ năm 1999-nay, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng một số kỹ thuật như BioNMES,

Quantum dots, nanopartivles, Nanocantilever, Nanowire và Nanotube vào cảm biến sinh

học [2], [3].

1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học

Cấu tạo cơ bản của một cảm biến sinh học được mô ta ở hình 1.1.2 [5]:

6


Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học.

Một cảm biến sinh học bao gồm 3 phần chính: (1) các thụ thể (kháng thể, bộ dò DNA,

cell receptor…) có thể bắt giữ các phần tử sinh học (như là kháng nguyên, DNA đích,

cell…); (2) bề mặt cảm biến, nơi gắn các thụ thể đồng thời cũng là nơi sinh ra các tín

hiệu vật lý (độ lệch, điện trở, chiết suất…) hoặc hóa học thay đổi khi các thụ thể bắt giữ

được các phần tử sinh học, (3) thiết bị điện tử có nhiệm vụ biến các tín hiệu vật lý, hóa

học từ cảm biến và chuyển thành tin hiệu chuyển về hệ thống máy tính để xử lý và hiển

thị kết quả.

Nguyên tắc hoạt động cơ bản của cảm biến sinh học: bề mặt cảm biến được biến đổi

và cố định các thụ thể lên đó, khi tiếp xúc với môi trường cần phân tích, các thụ thể này

sẽ bắt giữ các chất cần phân tích dẫn đến làm thay đổi một số tính chất hóa, lý của bề mặt

(độ lệch, điện trở, chiết suất…). Sau đó, thông qua bộ chuyển đổi, những thay đổi này

được chuyển sang các tín hiệu quang, điện, cơ,...và nhờ bộ phận xử lý tín hiệu (vi xử lý,

thiết bị điện tử) khuếch đại, đo lường các tín hiệu này và cho ta biết được thông tin về

chất phân tích.

1.1.1.3. Phân loại cảm biến sinh học

Việc phân loại cảm biến sinh học thông thường dựa vào nguồn gốc các bộ phận chính

của chúng (bảng 1.1.1.) [2].

Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học.

Thành phần sinh hoá Bộ phận truyền dẫn Thành phần phân tích

Enzim

Kháng thể

Axít nucleic

Chất cảm thụ

Mô

Điện hoá

Quang

Vi cơ điện

Mass sensitive

Enthalpiemetric

Thuốc và chất chuyển hoá của chúng

Chất chỉ thị sinh học

Vitamin và các chất chống oxi hoá

Các chất chuyển đổi

Chất ô nhiễm môi trường

7


Tế bào Công nghiệp hoá mỹ phẩm

Cảm biến sinh học enzim (còn gọi là cảm biến enzim, hay điện cực enzim) sử dụng

các enzim làm công cụ trên bề mặt của lớp chuyển đổi. Cảm biến miễn dịch

(immunosensors) sử dụng các thành phần tương tác miễn dịch, như là các kháng thể hay

kháng nguyên. Cảm biến DNA bao gồm đầu dò DNA và các aptamer. Một đầu dò DNA

là một chuỗi oligonucleotide ngắn sao chép lại một phần của gen. Những cảm biến sinh

học dựa trên chuỗi này và được mong đợi thu nhận những đoạn DNA đặc trưng cho

những gen thích hợp còn được gọi là genosensors (Yang và McGovern 1997). Các

aptamer cũng bao gồm các nucleotide nhưng không có cấu trúc tương tự như DNA tự

nhiên. Những aptamer được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp và được lựa chọn

bằng phép ghi sắc mô phỏng đối chiếu với một mục tiêu phân tích. Những aptamer có thể

dựa trên một thư viên RNA, trong khi đó các phần tử RNA tự nhiên vẫn chưa được sử

dụng trong cảm biến sinh học. Những cảm biến sinh học trên cơ sở aptamer được gọi là

aptasensor (Famulok và Mayer 2011).

Trong vài thập niên qua, người ta đã đề xuất việc sử dụng các mô sinh học trong cấu

trúc của cảm biến sinh học. Trong nhiều trường hợp, chúng được ứng dụng như một

nguồn hoạt tính của enzim riêng biệt. Theo đó, chúng được thay thế cho những enzim đắt

tiền hoặc không có. Bên cạnh đó, sự ổn định của những enzim trong các mô sinh học

thậm chí còn cao hơn so với ở trạng thái được tách riêng biệt bởi hiệu ứng bảo vệ của vi

môi. Sau này, việc sử dụng các mô sinh học giảm đi bởi việc tiếp cận các protein tinh

khiết và thậm chí còn cung cấp một số sản phẩm thực tế kết hợp các enzim và những chất

hỗ trợ (dẫn xuất cellulose, các hạt silica, và các hạt từ).

Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh

học và các chất phân tích riêng tương ứng.

8


Ngoài ra, cảm biến sinh học còn có thể được phân loại theo bộ phận chuyển đổi hay

nguyên tắc truyền dẫn tín hiệu [2].

- Cảm biến sinh học dựa trên tín hiệu điện hóa: Nguyên lý của việc thu nhận tín hiệu

điện hoá sử dụng trong cảm biến sinh học là dựa trên quá trình di chuyển của các điện

tích xảy ra trên mặt tiếp xúc của dung dịch phân tích-điện cực. Một số chất phản ứng (các

chất điều hoà, enzim nền, chất điện phân) được cho vào dung dịch, nhưng những thay đổi

các đặc trưng điện hoá (thế, dòng, độ dẫn) theo những chất thêm vào liên quan đến sự

thay đổi sự phân bổ năng lượng, cấu trúc và thành phần hoá học của mặt tiếp xúc.

- Những cảm biến sinh học quang dựa trên sự thay đổi pha và biên độ của ánh sáng

bị phân cực cung cấp thông tin độ dày và chiết suất của lớp phần tử sinh học bị hấp thụ

trên bề mặt. Sự thay đổi của chiết suất và độ dày của lớp màng mỏng này sẽ làm thay đổi

màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt của cảm biến [4].

Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ

dày màng thay đổi.

1.1.2. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động (cantilevers)

1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh

dao động

Trong những năm gần đây, các cantilever được ứng dụng rộng rãi trong cảm biến

sinh học bởi những ưu điểm nổi bật của nó như độ nhạy cao, kích thước nhỏ, thời gian xử

lý ngắn, và chi phí thấp. Chúng được ứng dụng: để phát hiện những thay đổi về nhiệt độ,

ứng suất bề mặt, và khối lượng với một lượng cỡ picogram của chất phân tích. Những

cantilever được sử sụng trong hệ thống cảm biến để có được một dạng bộ chuyển đổi nhỏ

hoàn toàn mới dựa trên các nguyên lý cơ ban của vật lý như là hiệu ứng lưỡng kim, ứng

suất bề mặt, hoặc dao động điều hoà.

Có 3 nguyên tắc truyền dẫn của cantilever chia làm ba phương pháp khác nhau. Thứ

nhất, là do sự thay đổi tần số cộng hưởng bởi sự tăng khối lượng hoặc sự thay đổi về

hằng số lực có thể đo được. Thứ hai, là do độ cong của một cantilever lưỡng kim bởi sự

9


thay đổi về nhiệt độ. Cuối cùng, là do cantilever thay đổi độ cong khi thành phần các chất

trên bề mặt thay đổi. Những nguyên tắc này được thể hiện trong hình 1.1.5 [6].

Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt độ

thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao động cộng

hưởng khi thay đổi khối lượng.

Sự thay đổi ứng suất bề mặt của cantilever có thể do sự thay đổi về khối lượng chất

hấp phụ, sự tương tác tĩnh điện của các chất trên bề mặt hoặc sự tương tác giữa các kháng

nguyên và kháng thể (hình 1.1.6).

Việc đo độ lệch của các cantilever hoặc độ dịch tần số dao động cộng hưởng sau khi

gắn các kháng nguyên cho phép ta định lượng được nồng độ của các chất cần phân tích.

Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất

bề mặt khác nhau. a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén.

Thanh dao động trong nghiên cứu này làm bằng vật liệu silicon nitride trên đế wafer

Si. Mặt trên của thanh có phủ một lớp màng mỏng Cr và Au nhằm tăng độ phản xạ (phục

vụ cho việc đo độ lệch của thanh, vì bản thân màng mỏng SiNx là trong suốt, không phản

xạ ánh sáng).

10


Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống

Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động

Để có thể ứng dụng thanh dao động làm cảm biến sinh học cần phải gắn lên bề mặt

thanh kháng thể tương ứng. Mục đích của luận văn này là dò tìm Alpha-fetoprotein

(AFP) và Dickkopt-1 (DKK1) là hai chất chỉ thị ung thư gan. Do đó cần phải gắn được

kháng thể của AFP và DKK1 lên bề mặt thanh dao động. Thanh có 2 mặt là Au (mặt

trên) và SiNx (mặt dưới). Hai mặt này không phản ứng với các phân tử sinh học như

protein, DNA v.v. do đó không gắn với kháng thể được, mà cần phải trải qua biến đổi

hóa học để trên bề mặt xuất hiện các nhóm chức có thể gắn với protein. Có hai hướng

biến đổi bề mặt để cố định các phần tử sinh học là: liên kết giữa vàng với các hợp chất

thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane.

1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng tới hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở

thanh dao động.

Dựa vào cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học thanh dao động, hiệu

quả của cảm biến được quyết định bởi hai yếu tố cơ bản nhất đó là hiệu quả bắt giữ chất

phân tích và hiệu quả truyền dẫn.

Si (380 µm)

Si (380 µm)

Cr

Au

SiNx (1 μm)

Phần thanh dao động

Phần thân chip

11


Hiệu quả bắt giữ chất phân tích được quyết định bởi quá trình biến đổi bề mặt của

thanh dao động. Nếu quá trình biến đổi bề mặt thanh dao động đạt hiệu quả cao thì khả

năng cố định các phần tử sinh học sẽ cao sẽ làm tăng độ nhạy của cảm biến. Do đó, vấn

đề biến đổi bề mặt thanh dao động có ý nghĩa rất quan trọng quyết định hiệu quả sử dụng

của cảm biến.

1.2. Ung thƣ gan

Ung thư gan là một bệnh ác tính của gan do sự tăng sinh ồ ạt tế bào gan hoặc tế

bào đường mật gây hoại tử và chèn ép trong gan.

Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư.

Ung thư gan được chia làm bốn giai đoạn phát triển chính:

Giai đoạn 1: khối u đơn lẻ chưa xâm lấn vào bất kỳ mạch máu nào. Nếu phát hiện ở

giai đoạn này thì sẽ có nhiều cơ hội kéo dài sự sống.

12


Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan.

Giai đoạn 2: khối u đơn lẻ đã xâm lấn vào mạch máu lân cận, hoặc có thể có nhiều

khối u nhỏ trong gan. Ở giai đoạn này, nguy cơ ung thư di căn thông qua các mạch

máu là rất cao.

13



Giai đoạn 3: nhiều khối u lớn, hoặc một khối u lớn đã xâm lấn tĩnh mạch chính của

gan hoặc xâm lấn các tổ chức lân cận, chẳng hạn như túi mật. Lúc này, sức khoẻ của

gan bị tổn thương nghiêm trọng.


Giai đoạn 4: ung thư đã lan ra ngoài gan đến các vùng khác của cơ thể. Ở giai đoạn

này, việc điều trị chỉ mang tính chất giúp giảm các triệu chứng của bệnh để người

bệnh cảm thấy dễ chịu hơn.

14



1.2.1. Thực trạng về bệnh ung thƣ gan trên thế giới

Trên thế giới, ung thư gan là bệnh ung thư phổ biến thứ 5 ở nam giới và thứ 9 đối với

nữ (hình 1.2.6). Vì việc chẩn đoán và điều trị trễ nên trong nhiều trường hợp, tỷ lệ tử

Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế

giới trung bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ. [26]

a) b)

15


vong gần như cao bằng tỷ lệ mắc bệnh (tỷ lệ tử vong/mắc là 0,93). Trên thế giới, ung thư

gan đứng thứ ba về tử vong liên quan đến ung thư. Trong năm 2008, đã có 748.300 ca

mắc mới và 695.900 trường hợp tử vong đã được thống kê. 85% tất cả các trường hợp

xảy ra ở các nước đang phát triển (hình 1.2.7) [26]. Các vùng có tỷ lệ mắc ung thư gan

cao là Đông và Đông Nam Á, Trung và Tây Phi.

Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng

trên thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới [26].

a)

b)

16


Hầu hết các bệnh nhân mắc bệnh ung thư gan đều thuộc loại ung thư biểu mô

gan (HCC). Hơn một nửa các trường hợp mắc HCC mới được chẩn đoán ở Trung Quốc,

với tỷ lệ 35,2/100.000 người. Trong khi ở Bắc Mỹ, Úc và Bắc Âu thuộc khu vực có tỷ lệ

mắc HCC thấp và thấp nhất là ở khu vực Nam châu Âu (tỷ lệ 10,5/100.000) (hình 1.2.7).

Tỷ lệ HCC tăng theo tuổi. Chỉ có những vùng có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B cao,

như ở Trung Quốc, bệnh nhân được chẩn đoán trẻ hơn, đa phần ở độ tuổi 55-59. Ngược

lại, ở Nhật Bản, nơi mà tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan C (HCV) mạn tính là yếu tố nguy cơ

nhất với HCC, tuổi mắc bệnh cao nhất trong khoảng 70 và 79. Tại châu Âu và Bắc Mỹ

hầu hết bệnh nhân được chẩn đoán ở độ tuổi giữa 60 và 65.

Trên thế giới, tỷ lệ mắc HCC ngày càng tăng. Tại châu Âu và Hoa kỳ, dự kiến sẽ đạt

đỉnh điểm vào năm 2020. Trong hai thập kỷ qua, tỷ lệ tử vong đã tăng lên ở một số nước

châu Âu (ví dụ nhứ Đức, Áo) và ở Mỹ, nơi mà tỷ lệ tử vong đã tăng lên 40% từ năm

1994 đến 2004. Mặt khác, ở một số quốc gia, như Pháp và Ý, đã cho thấy một sự tăng

mạnh mẽ về tỷ lệ tử vong trong giữa những năm 90 và giảm đi sau đó.

Xét toàn bộ dân số, nam giới bị bệnh ung thư gan nhiều hơn nữ giới. Tỷ lệ nam/nữ là

2:1 đến 4:1 ở những khu vực có nguy cơ cao. Một điều chắc chắn là nam giới thường tiếp

xúc nhiều hơn với các yếu tố nguy cơ gây bệnh[26].

1.2.2. Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thƣ gan

1.2.2.1. Phòng tránh bệnh ung thƣ gan

Ung thư gan là căn bệnh cực kỳ nguy hiểm, gây tử vong cao. Mặc dù các tiến bộ y

học hiện nay đã phát triển mạnh nhưng đối với bệnh ung thư gan, nhất là đã ở giai đoạn

cuối thì việc chữa trị vẫn gặp rất nhiều khó khăn và đạt hiệu quả điều trị thấp. Vì vậy, đối

với căn bệnh này, việc phòng bệnh vẫn được coi là biện pháp tối ưu nhất.

Ở thời kỳ đầu đa số bệnh nhân hoàn toàn không có triệu chứng gì, thường bệnh được

phát hiện qua siêu âm định kỳ hoặc xét nghiệm AFP tăng cao.

Khi khối u lớn dần, có thể thấy một hay nhiều triệu chứng dưới đây: mệt mỏi, sụt

cân, gầy sút nhanh; đau âm ỉ, cảm giác tức nặng khó chịu vùng hạ sườn phải; chán ăn, ăn

chậm tiêu; sốt; vàng da; cổ chướng; có thể bệnh nhân tự sờ thấy khối u ở vùng hạ sườn

phải…Lúc này phần lớn người bệnh đã ở giai đoạn cuối, việc chữa trị cũng gặp rất nhiều

khó khăn và hiệu quả điều trị thấp. Phần lớn các biện pháp điều trị lúc này chỉ là kéo dài

sự sống cho người bệnh chứ không thể chữa khỏi hoàn toàn cho người bệnh được[29].

17


Để phòng ngừa nguy cơ mắc bệnh ung thư gan, chúng ta nên giảm thiểu rủi ro bằng

cách giữ cho bản thân không bị lây các bệnh viêm gan B và C, bệnh chai gan và một số

bệnh gan khác.

Cách hữu hiệu nhất để phòng ngừa viêm gan B là tiêm phòng vacxin phòng ngừa.

Vacxin này có thể bảo vệ bạn trong nhiểu năm hoặc cũng có thể cả đời nếu việc tiêm

chủng thành công, cơ thể bạn có kháng thể chống lại sự xâm nhập của virus viêm gan B.

Chúng ta cần phải hiểu rõ về bệnh viêm gan do virus và các con đường lây truyền của nó

để có được các biện pháp phòng ngừa bệnh hiệu quả, tránh để bị lây nhiễm bệnh.

Không uống rụợu hoặc nên uống rươu có giới hạn cũng là biện pháp để phòng ngừa

nguy cơ mắc bệnh ung thư gan. Rượu tăng nhanh sự lan truyền của bất cứ căn bệnh gan

nào và là nguyên nhân chính của bệnh chai gan dẫn đến ung thư gan.

Tránh uống những thuốc có thể hại cho gan. Tốt nhất người bệnh nên hỏi trực tiếp

bác sĩ trước khi dùng một loại thuộc nào đó có thể gây độc cho gan. Ngoài ra cần tránh

trộn lẫn rượu với thuốc acetaminophen (tylenol…), vì sự phối hợp hai thứ này có thể gây

tổn thương gan. Gan phải lọc mọi chất mà bạn nuốt, hít vào hoặc bôi trên da, vì vậy,

đừng nên để gan chiu ảnh hưởng không cần thiết của các hoá chất [7],[8].

1.2.2.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ung thƣ gan

Kiểm tra sức khoẻ. Nếu một người có triệu chứng của HCC, các bác sĩ sẽ khám

bụng để kiểm tra gan, lá lách, và các cơ quan lân cận có cục u, sưng, hoặc thay đổi khác.

Bác sĩ cũng sẽ tìm kiếm một sự tích tụ bất thường của chất lỏng trong bụng và các dấu

hiệu của bệnh vàng da, bao gồm vàng da và lòng trắng của mắt.

Xét nghiệm máu. Đồng thời với việc kiểm tra sức khỏe, bác sĩ có thể làm xét

nghiệm máu để tìm một số chất chỉ thị ung thư gan như là GP73, DKK1, AFP-L3, AFP...

Bình thường, mức AFP là dưới 10ng/ml nhưng với những người mắc bệnh HCC thì hàm

lượng AFP có thể lên đến 400ng/ml. Tại Mỹ, hàm lượng AFP được tìm thấy trong máu

của những bệnh nhân HCC ở nồng độ cao hơn khoảng 50% đến 70% so với người không

mắc bệnh ung thư biểu mô gan. Tuy nhiên, các bệnh nhân với hàm lượng AFP tăng cao

nên được kiểm tra lại bằng phương pháp khác như siêu âm bụng, chụp cắt lớp hay chụp

cộng hưởng từ hạt nhân để cho kết luận chính xác cuối cùng. Bởi vì, thực tế thì các bệnh

nhân nhiễm vi rút viêm gan C cũng có hàm lượng AFP trong máu cao hơn bình thường

(10-100ng/ml).

Ngoài ra, các xét nghiệm khác cũng cần thiết để chẩn đoán HCC và tìm nơi khối u

nằm trong gan và ở các phần khác của cơ thể [29],[9]:

18


Siêu âm. Sử dụng sóng âm có tần số lớn hơn 20kHz để tạo ra một hình ảnh của các

cơ quan nội tạng. Các sóng âm phản xạ tại các mặt ranh giới của gan, các cơ quan khác,

và các khối u tạo ra một hình ảnh khác nhau trên một màn hình máy tính.

Phƣơng pháp chụp cắt lớp vi tính (CT- Computerized Tomography hay CAT-

Computerized Axial Tomography) cho phép chụp hàng loạt hình rất rõ và chính xác

theo lớp cắt ngang của cơ thể mô tả hình khối ba chiều của các cơ quan trong cơ thể.

Phương pháp chụp cắt lớp có khả năng phát hiện các khối u đường kính xấp xỉ 1cm trong

nhiều cơ quan, kể cả các cơ quan nằm sâu trong cơ thể như: não, gan, thận và tuỵ tạng.

Chụp cộng hƣởng từ (MRI-Magnetic Resonance Imaging). Cộng hưởng từ hạt

nhân phụ thuộc vào từ học của tế bào, nhất là ở độ tập trung của ion hydrô cho phép phân

biệt được một số tổn thương tuỳ theo mức độ cộng hưởng từ trường của hạt nhân. Đây là

"tiếng nói phân tử" vì diễn đạt cấu trúc hoá học của tổn thương ung thư. Kỹ thuật này mở

ra khả năng hoàn toàn mới để nghiên cứu về sinh học của khối u và giám sát về phương

diện hoá sinh hiệu quả của điều trị ung thư.

Chụp mạch (Angiogram). Là phương pháp chụp hình X-quang các mạch máu. Một

loại thuốc nhuộm được tiêm vào mạch máu để mạch máu của gan hiển thị trên X quang.

Nội soi chẩn đoán (Laparoscopy). Phương pháp này cho phép bác sĩ nhìn thấy bên

trong cơ thể với một ống dẻo, phát sáng và mỏng gọi là thiết bị nội soi.

Chẩn đoán mô bệnh học ung thƣ. Đây là phương pháp tối quan trọng. Sau khi chẩn

đoán bệnh nhân có khả năng mắc bệnh ung thư, bác sỹ phải xác định được loại ung thư

(típ vi thể hay típ mô học), vì việc điều trị, nhất là hoá trị và xạ trị hoàn toàn phụ thuộc

vào kết quả này. Chẩn đoán mô bệnh học cho phép bác sỹ xác định chính xác loại ung

thư. Việc sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã mở rộng việc

đánh giá các tổn thương vi thể bao gồm các đặc điểm về sinh hóa và siêu cấu trúc của tế

bào góp phần cho chẩn đoán mô bệnh học chính xác hơn.

1.2.2.3. Một số phƣơng pháp điều trị ung thƣ gan

Sau khi chẩn đoán bệnh nhân mắc ung thư gan thì các phác đồ điều trị được đưa ra

phù hợp với từng giai đoạn cụ thể của bệnh. Có một số phương pháp điều trị bệnh ung

thư gan hiện đang được áp dụng trên thế giới [29], [27].

Điều trị phẫu thuật. Đây là phương pháp phẫu thuật cắt rộng, lấy toàn bộ khối ung

thư và một phần tổ chức lành bao quanh u. Nếu có hạch vùng khả nghi di căn, cần vét

toàn bộ hạch vùng với mục đích không còn để sót lại tế bào ung thư. U, hạch và phần tổ

chức lành xung quanh được lấy gọn thành một khối. Phương pháp này có khả năng chữa

19


khỏi nhiều loại ung thư khi còn ở giai đoạn sớm với khối u nhỏ (nhỏ hơn 5cm). Trường

hợp khối u đã lan ra ngoài, hoặc nếu bệnh nhân có các bệnh nghiêm trọng khác thì phẫu

thuật có thể không phải là một lựa chọn tốt.

Điều trị bằng tia xạ. Xạ trị là dùng tia phóng xạ để tiêu diệt các tế bào ung thư.

Cùng với phẫu thuật, xạ trị là một trong hai phương pháp điều trị ung thư phổ biến nhất

và hiệu quả nhất. Chỉ dùng phương pháp xạ trị đơn thuần có thể chữa khỏi nhiều loại ung

thư khi còn ở giai đoạn cư trú tại chỗ, nhất là đối với các bệnh ung thư hạch bạch huyết,

ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, một số ung thư vùng đầu cổ… Điều

trị bằng tia xạ phối hợp với phẫu thuật thường được áp dụng trong nhiều trường hợp khi

ung thư đã phát triển tương đối lớn hơn. Có khi xạ trị trước mổ nhằm giảm bớt thể tích u

để dễ mổ, hạn chế di căn xa trong lúc mổ. Có khi dùng phương pháp này sau mổ nhằm

diệt nốt những tế bào ung thư còn sót lại. Có khi xạ trị cả trước mổ và sau mổ hoặc xạ trị

phối hợp với hoá trị để tăng khả năng diệt tế bào ung thư tại một khu vực mà hoá trị

không đủ khả năng diệt hết. Tuy vậy, tia phóng xạ không chỉ diệt tế bào ung thư mà còn

diệt luôn tế bào lành ở vùng bị chiếu gây ra các biến chứng phụ.

Có 3 phương pháp điều trị bằng tia xạ:

- Chiếu xạ từ ngoài vào (máy Cobalt, tia X, máy gia tốc), là phương pháp áp dụng

rộng rãi nhất. Tia X có năng lượng tương đương kilovôn dung để xạ trị các bệnh

về da hoặc nằm ở vùng nông gần bề mặt da. Tia X có năng lượng tương đương

megavôn được dung để chiếu sâu vào các cơ quan trong cơ thể người như phổi,

ruột, não bộ…

- Chiếu xạ từ bên trong cơ thể: nguồn phát bức xạ đặt trong ống, kim radium, kim

Cobalt60, Cesium, Yridium, sợi Yridium…) đặt vào các hốc tự nhiên của cơ thể

hoặc cắm vào các bộ phận mang ung thư.

- Sử dụng thuốc có gắn đồng vị phóng xạ: Uống hoặc tiêm các thuốc có đồng vị

phóng xạ (ví dụ 131

I) hoặc kháng thể đặc hiệu có gắn đồng vị phóng xạ để diệt tế

bào ung thư trong quá trình chuyển hoá và kết hợp chọn lọc.

Iod có cả thảy 37 đồng vị, nhưng chỉ có đồng vị 127

I là bền (chu kì bán rã 15,7 triệu

năm). Đồng vị 125

I có thời gian sống ngắn đứng thứ hai trong số các đồng vị của iod (chu

kì bán rã 59 ngày, phân rã gamma-phát ra tia gamma), được ứng dụng nhiều trong chẩn

đoán phóng xạ (radioimmunoassay) (các chất sinh học được gắn với 125

I, và sử dung máy

dò phóng xạ để phát hiện). Đồng vị 131

I có ứng dụng trong xạ trị, thường được dùng với

liều cao. Nó có chu kì bán rã 8 ngày, thuộc dạng phân rã beta - và gamma (bước đầu tiên

nó phân rã nhanh thành Xe*, electron và phản nơtrino, sau đó Xe* phân rã thành Xe và tia

gamma). Trong đó, hạt beta – (electron) sinh ra từ bước đầu tiên có năng lượng cao và có

thể xuyên qua mô từ 0,6 -2 mm.

20


Điều trị hoá chất (hoá trị). Là phương pháp dùng thuốc để tiêu diệt các tế bào ung

thư. Hoá trị còn được sử dụng để hỗ trợ cho phẫu thuật và tia xạ. Điều trị hoá chất không

chỉ đắt mà còn có nhiều tác dụng độc hại đối với các tế bào lành trong cơ thể nhưng có

tính tăng sinh nhanh như tế bào tủy xương, tế bào ở hệ tiêu hóa, nang tóc dẫn đến suy

tủy, viêm niêm mạc và rụng tóc... Hoá trị thường kèm theo nhiều tác dụng phụ như buồn

nôn và ói mửa, rụng tóc, chán ăn, tiêu chảy, mệt mỏi, tê và ngứa ran ở tay hoặc chân, đau

đầu,... Hiện nay, hoá trị ít được sử dụng để điều trị ung thư gan.

Điều trị miễn dịch. Trong khoảng 20 năm gần đây, những hiểu biết về hệ thống

miễn dịch ở người ngày càng tiến bộ. Đã sử dụng các cytokin và kháng thể đơn dòng điều

hòa hoạt động của hệ miễn dịch trong điều trị ung thư và một số bệnh lý khác. Các chất

miễn dịch không đặc hiệu có nguồn gốc sinh học như: BCG và Carynebacterium barvum

đã được sử dụng trên thực nghiệm và trên người. Các chất kích thích miễn dịch không

đặc hiệu có nguồn gốc hoá học như LH1… cũng đang được nghiên cứu.

1.2.3. Hệ kháng thể - kháng nguyên

Kháng nguyên là yếu tố lạ đối với cơ thể có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Không

phải tất cả các vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể đều là kháng nguyên, chúng phải có kích

cỡ ít nhất bằng kích cỡ của một Epitope (nhóm quyết định kháng nguyên) mới có thể gây

ra đáp ứng miễn dịch.

Kháng nguyên có 3 đặc tính cơ bản là tính sinh kháng thể, tính đặc hiệu và tính đa trị

kháng nguyên.

Người ta phân loại kháng nguyên thành 2 loại: kháng nguyên hoàn toàn (antigen) là

loại kháng nguyên có đầy đủ tính sinh kháng thể, tính đặc hiệu và kháng nguyên không

hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên, là những kháng nguyên chỉ có tính đặc

hiệu.

Kháng thể còn được gọi là các globulin miễn dịch hay immunoglobulin, kí hiệu là Ig.

Ig được sinh ra khi cơ thể bị kháng nguyên kích thích, chúng có khả năng kết hợp đặc

hiệu với kháng nguyên kích thích sinh ra chúng. Cấu trúc của một kháng thể được thể

hiện trong hình 1.2.8.

21


Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể.

Phân tử kháng thể được cấu tạo từ bốn chuỗi polypeptide, liên kết với nhau bằng cầu

nối dissulfur (-s-s), trong đó có hai chuỗi nặng H giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ L cũng

giống hệt nhau. Kháng thể được chia thành nhiều lớp khác nhau: IgG, IgM, IgA, IgE,

IgD. Trong các lớp globulin miễn dịch có IgG chiếm khoảng 75-85% tổng số globulin

miễn dịch của cơ thể. Chúng có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và nhẹ, cấu trúc

chuỗi nhẹ của các loại kháng thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ có khác nhau ở

chuỗi nặng. Bề mặt của kháng thể IgG được mô tả như trong hình 1.2.9.

Hình 1.2.9: Bề mặt của kháng thể IgG.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/vi/e/e4/Khang_The.jpg

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:IgG_molecular_surface.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/vi/e/e4/Khang_The.jpg

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADp_tin:IgG_molecular_surface.jpg

22


Một trong những vai trò của kháng thể là liên kết với kháng nguyên. Các

immunoglobulin có khả năng nhận diên và gắn một cách đặc hiệu với một kháng nguyên

tương ứng nhờ các vùng biến đổi. Khi kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể do kháng

nguyên đã kích thích sinh ra thì phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể xảy ra một

cách đặc hiệu.(hình 1.2.10).

Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể.

Phản ứng kháng nguyên - kháng thể là cơ sở để xây dựng những phương pháp, kỹ

thuật miễn dịch học thường sử dụng trong mục đích y học như chẩn đoán các bệnh ung

thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh kí sinh trùng, kỹ thuật xét nghiệm y học, thú y học, sinh

học...

1.2.4. Chất chỉ thị ung thƣ gan AFP và DKK1

1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP

Alpha-fetoprotein (AFP) là một chất chỉ thị được các nhà khoa học nghiên cứu, căn

cứ để chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư biểu mô gan từ lâu. Hàm lượng AFP

trong máu của những người khoẻ mạnh bình thường nằm trong khoảng từ 0 đến 10

ng/ml. Hàm lượng này tăng lên bất thường (vượt quá 400ng/ml)[5] ở những bệnh nhân

mắc bệnh HCC, lúc này bác sỹ có thể kết luận bệnh nhân bị ung thư gan. Theo dõi hàm

lượng AFP trong máu cũng giúp bác sỹ kiểm tra hiệu quả chữa trị bệnh nhân ung thư biểu

mô gan. Nếu tình trạng bệnh nhân thuyên giảm thì hàm lường AFP cũng giảm dần và

ngược lại. Tuy nhiên, ở người bị nhiễm virút viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C thì

hàm lượng AFP luôn cao hơn mức bình thường (10-100ng/ml). Trong trường hợp này,

cần thực hiện thêm một số phương pháp kiểm tra khác nữa để có kết luận có mắc ung thư

gan hay không.

23


AFP là một glycoprotein với cấu trúc gồm 590 amino acid và một phân tử

carbohydrate, với khối lượng phân tử cỡ 70 kDa. AFP là một protein quan trọng của

huyết tương và do túi phôi của phôi thai hay theo một số tài liệu thì do gan của phôi sản

sinh ra. Protein này được cho là bản sao của albumin huyết thanh. Gen mã hóa AFP và

albumin cùng có mặt ở vị trí đối diện trên nhiễm sắc thể số 4. AFP được tìm thấy ở các

dạng cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3 và gắn kết với nguyên tố đồng (Cu), niken (Ni), acid

béo và bilirubin [10],[11].

Trong giai đoạn phôi thai, AFP gắn với hormone estradiol và được định lượng thông

qua máu của người mẹ hoặc dịch màng ối. Trường hợp hàm lượng AFP tăng cao bất

thường thì nhiều khả năng là phôi thai có vấn đề liên quan đến sự phát triển của hệ thần

kinh hay thoát vị rốn hoặc hội chứng Down. Sau khi được sinh ra, hàm lượng AFP của bé

mới sinh giảm dần cho tới khi đạt mức chuẩn của người lớn bình thường trong khoảng từ

8-12 tháng tuổi.

1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1

Mặc dù chỉ thị AFP được nghiên cứu từ rất lâu trong chẩn đoán ung thư gan nhưng

trong một số trường hợp giá trị của nó không cho ta kết luận chính xác. Gần đây, một số

nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm đến chất chỉ thị Dickkopf-1 (DKK1) trong chẩn đoán

ung thư biểu mô gan.

DKK1 là một thành viên trong gia đình protein DKK bao gồm DKK1, DKK2, DKK3

và DKK4. Protein DKK1 là một glycoprotein có khối lượng phân tử 35-40 kDa bao gồm

235 amino axít [28].

Hàm lượng DKK1 cao là tiên lượng xấu cho khả năng mắc bệnh HCC, hàm lượng

DKK1 tăng cao với những người mắc HCC giai đoạn đầu, ngay cả khi hàm lượng AFP

đang ở mức bình thường [12]. Theo công trình nghiên cứu [12], hàm lượng DKK1 được

tìm thấy ở mức độ cao trong dòng tế bào di căn của HCC là MHCC97-L và HCCLM3.

24


Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẫu thuật liên

hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC [12].

1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong

việc phát hiện ung thƣ gan

Như đã mô tả về cấu trúc thanh dao động nghiên cứu trong luận văn này, thanh dao

động là vật liệu SiNx được phủ một lớp màng mỏng Au. Để bắt giữ được các chất chỉ thị

sinh học phải tiến hành biến đổi bề mặt của thanh dao động theo hai hướng: liên kết giữa

vàng với các hợp chất thiol hoặc liên kết giữa bề mặt SiNx với với các hợp chất silane.

1.3.1. Biến đổi bề mặt Au

Đối với bề mặt Au, trong luận văn này sử dụng các hợp chất thiol và các chất kết nối

để biến đổi bề mặt sau:

- Trước tiên cho cysteamine (SHCH2CH2NH2) phản ứng với bề mặt Au.

Cysteamine sẽ gắn với Au thông qua nhóm thiol (-SH).

25


- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với cysteamine thông

qua nhóm chức aldehyde của GAD và -NH2 của cysteamine. Kết quả thu được, bề

mặt Au gắn GAD chứa nhóm chức aldehyde sẵn sàng để gắn các phần tử sinh

học.

Thông thường, người ta sử dụng các hợp chất thiol để cổ định trên bề mặt vàng thông

qua phản ứng Au-thiol. Cơ chế của phản ứng được thể hiện trong hình 1.3.1:

Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm -SH

Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.[21]

Một chất thường dùng trong biến đổi bề mặt Au của thanh dao động là cysteamine,

có công thức phân tử là C2H7NS, công thức cấu tạo như thể hiện trong hình 1.3.2:

Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng cysteamine cùng với một chất tạo kết nối là GAD

để biến đổi bề mặt Au của thanh dao động.

1.3.2. Biến đổi bề mặt SiNx

1.3.2.1. Phƣơng pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx

Tương tự với bề mặt Au, SiNx cũng là một hợp chất khá trơ và không phản ứng với

các hợp chất sinh học. Để cố định các phần tử sinh học trên bề mặt SiNx thì phải biến đổi

nó.

Đối với bề mặt SiNx, trong luận văn này sử dụng các hợp chất silane và các chất kết

nối để biến đổi bề mặt sau:

26


- Trước tiên cho APTES (3-Aminopropyl triethoxysilane) phản ứng với bề mặt SiNx

thông qua nhóm triethoxysilane.

- Tiếp theo cho chất glutaraldehyde (CHO(CH2)3CHO) gắn với APTES thông qua

nhóm chức aldehyde của GAD và –NH2 của APTES. Kết quả là thu được bề mặt

SiNx gắn GAD chứa nhóm chức (-CHO) sẵn sàng để gắn các phần tử sinh học.

Mục đính của việc biến đổi bề mặt SiNx là tạo ra các nhóm silanol (SiOH) trên bề

mặt, từ đó có thể phản ứng với các hợp chất silane (Si(OR)3) (như là GOPTS hay

APTES...). Đối với SiO2 thì việc tạo ra các nhóm chức silanol có thể thực hiện đơn giản

bằng cách ngâm trong dung dịch piranha. Tuy nhiên, với SiNx lại không tạo ra được

nhóm silanol bằng cách này.

Có một số phương pháp biến tính bề mặt SiNx để gắn các phần tử sinh học đã được

nghiên cứu và báo cáo như phương pháp sử dụng bức xạ tử ngoại ở nhiệt độ phòng [13],

sử dụng hoá chất như dung dịch NaOH, HF, phương pháp xử lý bằng plasma oxy [13],

[14], [15]... Trong đề tài này, bề mặt thanh dao động của chíp có phủ một lớp vàng nên

cần hạn chế sử dụng hoá chất ăn mòn mạnh như HF. Hơn nữa, với những điều kiện về

trang thiết bị hiện có chúng tôi chọn phương pháp xử lý plasma oxy để biến tính bề mặt

SiNx trong đề tài này.

1.3.2.2. Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2

1.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2

Plasma O2 là một hỗn hợp gồm các hạt phân tử oxy trung hoà, các điện tử, các iôn

âm, và các iôn dương oxy. Chúng được tạo ra do quá trình iôn hoá các phân tử oxy dưới

tác dụng của điện trường, từ trường hay những tia lửa điện. Các phân tử oxy trong môi

trường plasma tồn tại ở các mức năng lượng khác nhau, do nhận thêm năng lượng nên

một số phân tử oxy ở trạng thái kích thích. Những phân tử này trở nên hoạt hoá hơn bình

thường, dó đó có thể xảy ra một số phản ứng hoá học mà ở trạng thái không kích thích

không thể xảy ra.

1.3.2.2.2. Một số kỹ thuật tạo plasma

Có nhiều kỹ thuật khác nhau để tạo plasma. Tuy nhiên, tất cả chúng đều có chung

một nguyên tắc đó là phải cung cấp một năng lượng đủ lớn để tạo ra và duy trì plasma.

27


Điểm khác biệt giữa các kỹ thuật này là phương pháp tạo ra plasma. Dưới đây là một số

kỹ thuật tạo plasma phố biến hiện nay.

Plasma GDP, một hiệu điện thế một chiều được áp vào giữa 2 bản kim loại, gọi là

anod và cathode. Ban đầu, trong khối khí trung hòa có tồn tại một ít các hạt bị ion hóa tự

phát và một ít electron. Các hạt mang điện này sẽ bị gia tốc bởi điện trường và va chạm

với các hạt trung hòa khác, làm ion hóa, sinh ra các ion và electron mới. Quá trình sẽ tái

diễn và cuối cùng trong khối khí giữa cathode và anod sẽ chứa rất nhiều hạt mang điện và

ở trang thái kích thích, tức là đã trở thành plasma. Thiết bị plasma phóng điện khí yêu cầu

phải có hiệu thế giữa 2 bản cực rất cao. Một nhược điểm khác là điện thế gia tốc sẽ làm

cho các electron và ion va đập bề mặt của 2 bản cực theo phương thẳng đứng với năng

lượng lớn, làm mòn dần bản cực và các chi tiết cần làm sạch/ăn mòn của thiết bị đặt trên

bản cực cũng bị bắn phá.

Capacitively coupled plasma (CCP) là kỹ thuật tạo plasma sử dụng phố biến nhất

trong công nghiệp hiện nay. Cấu tạo gồm hai điện cực kim loại, đặt gần nhau trong một

buồng phản ứng. Một trong hai điện cực này nối với cực dương của nguồn RF có tần số

hoạt động bằng 13,56MHz, điện cực còn lại nối mát. Sóng RF có tác dụng iôn hoá chất

khí nằm giữa 2 điện cực này tạo thành plasma. Vì cấu tạo của buồng phản ứng này giống

như một tụ điện nên nó được gọi là kỹ thuật plasma CCP.

Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP.

Inductively Coupled Plasma (ICP), trong thiết bị này, ngoài một điện thế áp vào

giữa 2 cực, còn có một điện áp xoay chiều áp vào 2 đầu cuộn dây quấn dọc theo buồng.

Khi cấp một dòng điện xoay chiều chạy qua cuộn dây sẽ sinh ra từ trường biến thiên

28


trong buồng plasma. Từ trường biến thiên theo thời gian sẽ sinh ra một điện trường biến

thiên, và điện trường biến thiên này lại sinh ra một từ trường biến thiên làm xuất hiện

sóng điện từ làn truyền trong buồng plasma. Sóng này làm các electron và ion tự phát dao

động và ion hóa các hạt trung hòa khác, làm cho buồng phản ứng trở thành plasma.

Ưu điểm của thiết bị plasma ICP là có thể điều khiển một cách độc lập điện từ trường

gia tốc theo phương thẳng đứng (tức là hiệu thế áp vào giữa 2 bản cực) và điện từ trường

theo phương ngang (tức là điều khiển dòng điện chạy trong cuộn cảm). Do đó, có thể

dùng cuộn cảm để tạo plasma trong buồng chứa rất nhiều hạt ở trang thái kích thích, có

hoạt hóa cao sử dụng làm sạch hoặc phản ứng tốt với lớp vật chất mỏng trên bề mặt mẫu

(thường là chip, wafer), trong khi lại hầu như không bắn phá bề mặt mẫu theo phương

thẳng đứng, giữ các chi tiết trên bề mặt mẫu không bị thay đổi. Buồng phản ứng của thiết

bị tạo plasma ICP có dạng như hình 1.3.4:

Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP

Phương pháp làm sạch bề mặt bằng plasma oxy với hệ plasma ICP có ưu điểm là

plasma chỉ tác động lên các chất bẩn nằm trên bề mặt của thiết bị muốn làm sạch, và hầu

như không ảnh hưởng để các vi cấu trúc của thiết bị. Do đó, các chức năng, chất lượng

của thiết bị được bảo toàn. Plasma oxy trong thiết bị ICP, có thể làm thay đổi tính chất

29


hóa học của lớp mỏng vật chất trên bề mặt mẫu mà không làm tổn hại sâu bên trong mẫu.

Do đó, plasma oxy đã được chọn để xử lý bề mặt silicon nitride trong luận văn này.

1.3.2.2.3. Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx

Plasma oxy có vai trò rất quan trọng đối với bề mặt SiNx trong việc hình thành một

màng mỏng Si2N2O, là cơ sở để tạo ra nhóm silanol trên bề mặt. Cơ chế hình thành màng

Si2N2O thông qua 4 bước: (i) đầu tiên oxy được tiêm vào mặt tiếp giáp giữa oxít-plasma;

(ii) tiếp đến, oxy được vận chuyển qua lớp oxít đang phát triển; (iii) sau đó, xảy ra sự

biến đổi ở mặt tiếp giáp giữa oxít-nitride; (iv) cuối cùng, xảy ra sự vận chuyển N2 tới mặt

tiếp giáp oxít-plasma [16],[17].

Khi trong buồng có O2 và năng lượng điện từ được cấp vào buồng, thì khí O2 bị ion

hoá và kích thích, sẽ tạo nên các hạt như sau:

O2 O2*, O, O2+, O

+, O

-, e

Các mẫu oxy có hoạt tính hóa học cao sẽ phản ứng với Si trong SiNx, tạo thành SiOx.

Ví dụ, mẫu O- sẽ phản ứng như sau [18]:

Si +2O- SiO2 +2e

Trong thực tế, các mẫu oxy sẽ phản ứng với Si và thế chỗ cho N:

Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử N của nguyên tử O [19]

Quá trình xảy ra dần dần và một lớp mỏng màng silicon nitride trên bề mặt sẽ chuyển

thành silicon oxynitride Si2N2O:

Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx [20]

Chính các nhóm SixOy sẽ chuyển thành SiOH trong bước biến đổi bề mặt và tham gia

phảm ứng với các hợp chất silane sau này.

1.4. Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở

thanh dao động

30


1.4.1. Đánh giá các bƣớc biến đổi bề mặt

1.4.1.1. Phƣơng pháp chụp ảnh huỳnh quang

Sử dụng một chất phát huỳnh quang (fluorescent probe) gắn với những nhóm chức

của các phần tử sinh học như là protein, axít nucleic... Những protein, axít nucleic không

có tính chất huỳnh quang thì không phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang và không

thể quan sát được, nhưng khi chúng được gắn với các chất huỳnh quang thì sẽ quan sát

dưới hính hiển vi huỳnh quang. Ví dụ, những kháng thể được đánh dấu huỳnh quang có

thể được sử dụng để phát hiện các tế bào và các mô có sự hiện diện của các kháng

nguyên đặc biệt và chúng được ghi nhận thông qua thiết bị kính hiển vi huỳnh quang.

Một số chất huỳnh quang được thể hiện trong hình 1.4.1 [21].

Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5-

carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid

succinimidyl ester

Bản chất của hiện tượng là khi điện tử hấp thụ năng lượng sẽ chuyển lên các mức

năng lượng cao hơn. Năng lượng này sau đó có thể được giải phóng dưới dạng phonon

hoặc phát xạ photon ánh sáng. Trong luận văn này, protein LCA (lens culinaris

agglutinin) được gắn với chất huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocyanate). Khi quan

sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có đèn phát ra bước sóng kích thích khoảng 488nm -

495nm thì FITC sẽ bị kích thíchvà sau đó chuyển trở về mức cơ bản thì sẽ phát ra photon

có bước sóng khoảng 520 nm.

1.4.1.2. Phƣơng pháp đo góc tiếp xúc

Phương pháp này khảo sát tính chất của bề mặt thông qua tương tác giữa bề mặt

đó với các chất lỏng. Cụ thể trong luận văn này, là đo độ lệch dính ướt giữa bề mặt của

31


mẫu và nước được khảo sát. Một giọt nước trên bề mặt thủy tinh có khuynh hướng lan

rộng ra, và trở nên dẹt đi. Còn trên bề mặt lá sen có xu thể gom lại thành những hạt gần

như hình tròn.

Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen.

Trường hợp thứ nhất, giữa nước và thủy tinh, được gọi là hiện tượng thấm ướt,

trong đó bề mặt chung giữa 2 chất rắn và chất lỏng càng lúc càng được mở rộng. Trường

hợp thứ hai là không thấm ướt, trong nó chất rắn và chất lỏng có sự “kỵ nhau”, chúng có

khuynh hướng giảm thiểu sự tiếp xúc nhau bằng việc giảm tối đa diện tích tiếp xúc giữa

nước và lá sen.

Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) [30].

Hiện tướng thấm ướt và không thấm ướt có thể được đo đạc định lượng thông qua

việc đo góc tiếp xúc θ:

32


Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt.

Góc tiếp xúc phụ thuộc vào tương tác bề mặt xảy ra trên 3 bề mặt: mặt phân giới

giữa chất lỏng và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài lỏng-khí γlg), mặt phân

giới giữa chất rắn và chất khí (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-khí γsg) và mặt

phân giới giữa chất rắn và chất lỏng (được đặc trưng bởi sức căng mặt ngoài rắn-lỏng γsl).

Tuy nhiên, trong luận văn này tất cả các lần đo đều thực hiện với chất lỏng là nước và

thực hiện trong không khí, cho nên góc tiếp xúc đo được chỉ phụ thuộc vào trạng thái bề

mặt của mẫu rắn.

Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt.

Khi giọt lỏng nhỏ lên bề mắt rắn, tất cả chất rắn, lỏng, khí đều có khuynh hướng

thu nhỏ diện tích tiếp xúc của các mặt phân giới, nhằm giảm năng lượng bề mặt rắn-lỏng,

lỏng-khí, rắn-khí nhỏ nhất. Phương trình Young mô tả liên hệ giữa góc tiếp xúc và tương

tác giữa 3 chất rắn-lỏng-khí:

γlgcosθ=γsg−γsl

Trong dó: γlv, γsv, γsl lần lượt là sức căng mặt ngoài của các bề mặt lỏng-khí, rắn –

khí và rắn-lỏng, θ là góc tiếp. Khi bề mặt rắn được biến đổi hóa học, có thêm các nhóm

chức trên bề mặt thì trang thái phân cực của bề mặt rắn thay đổi. Từ đó có thể làm thay

đổi tính ái nước hoặc kỵ nước của bề mặt, tức là thay đổi góc tiếp xúc với nước. Ví dụ,

33


khi bề mặt vàng (Au) gắn kết các hợp chất cysteamine, glutaraldehyde, protein, … thì

tính phân cực của các phần đuôi (nhóm chức tự do) sẽ quyết định góc tiếp xúc. Sau khi

gắn cysteamine lên bề mặt Au, đầu SH sẽ quay vào bề mặt Au, còn đầu NH2 sẽ là đầu tự

do quay ra ngoài và tương tác với nước khi đo góc tiếp xúc. Do trong nhóm NH2 thì N có

độ âm điện mạnh và thu hút điện tử của 2 nguyên tử H về phía nó, nên nhóm này có tính

phân cực, về phía N có nhiều điện tích âm hơn, còn 2 nguyên tử H có ít điện tích âm hơn.

Do đó, NH2 có khuynh hưởng tương tác mạnh với nước cũng là phân tử phân cực, vì O

có độ âm điện mạnh hút các điện tử của H. Khi đó góc tiếp xúc giữa bề mặt Au với nước

sẽ giảm đi [25]. Đối với bề mặt Au sau khi gắn glutaraldehyde và protein, cũng xảy ra

hiện tượng tương tự.

1.4.1.3. Phƣơng pháp phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP

Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng

phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) trong dung dịch O-

dianisidine và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt của enzim

xúc tác là horseradish peroxidase. Như vậy, phản ứng càng mạnh khi làm lượng HRP

được gắn lên GAD trên bề mặt càng lớn, chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt càng lớn.

Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM

(đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4

được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước

khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2

phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì

o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau:

Sau khi thực hiện xong phản ứng ELISA, những chip đã gắn được HRP sẽ tạo dung

dịch có màu hồng do o-dianisidine mất 2 proton H+ để chuyển từ dạng khử sang dạng

oxy hoá. Dung dich chuyển từ không màu sang màu hồng có khả năng hấp thụ bước sóng

540nm được đo bằng máy quang phổ.

1.4.2. Phƣơng pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học

o-dianisidine

(dạng khử,

không màu)

Peroxidase

se

o-dianisidine

(dạng oxi

hóa, nâu) H2O2 +

34


Đây là phương pháp đặc trưng đối với cảm biến sinh học thanh dao động để xác định

lượng kháng nguyên cần phân tích được bắt giữ trên các thanh dao động. Sơ đồ mô tả

nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động được như hình 1.4.6.

Hình 1.4.6: Mô tả nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động [6].

Việc đo độ lệch của thanh dao động đạt được bằng việc sử dụng phương pháp độ lệch

chùm quang (hình 1.4.6). Một chùm laze được chiếu vào điểm cuối của thanh dao động

và chùm phản xạ sẽ được thu nhận bởi bộ phận thu nhận quang (photodetector). Khi

thanh dao động bị uốn cong thì chùm laze phản xạ sẽ bị lệch so với ban đầu. Độ lệch của

thanh dao động tương ứng với độ dịch chuyển của chùm phản xạ này trên detector.

Thông thường một hệ đo độ lệch được thiết kế để đo cùng một lúc nhiều chíp, các

chíp này được đặt trên một giá đỡ. Hình 1.4.7 mô tả một hệ đo độ lệch các thanh dao

động của một mảng các chíp.

35


Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng;

b) Một chíp với 9 thanh dao động [22].

Sự thay đổi độ lệch của các thanh dao động trước và sau khi bắt giữ kháng nguyên tỉ

lệ với ứng suất do lớp các kháng nguyên trên bề mặt cảm biến gây ra. Độ lệch của thanh

dao động được xác định thông qua công thức dưới đây [23]:

. 3(1 )

4rect

W tz

k l

Trong đó:

- top bottom : độ chênh lệch ứng suất mặt trên và mặt dưới của

thanh dao động.

- rectk : hằng số đàn hồi của thanh dao động dạng hình chữ nhật.

- : tỉ số Poisson của thanh dao động.

- W, l, t: tương ứng là độ rộng, độ dài và độ dày của thanh dao động.

36


Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động

2.1.1. Quy trình biến đổi bề mặt phủ Au

Trong phần này, chúng tôi tiến hành biến tính bề mặt phủ vàng của các mẫu wafer và

các thanh dao động trên chíp.

2.1.1.1. Khảo sát mẫu wafer

Quy trình biến đổi bề mặt wafer phủ vàng như sơ đồ dưới đây:

Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer.

Cysteamine với nhóm chức thiol (-SH) sẽ phản ứng với Au trên bề mặt wafer như

hình 2.1.2:

Làm sạch mẫu

• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 30s-> DI->N2

• Ngâm trong piranha 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô bằng N2.

Gắn Cysteamine

• Ngâm mẫu trong dd cysteamine 5mM (pha với ethanol), trong 24h, top.

• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.

• Đem mẫu đi đo góc tiếp xúc.

Gắn GAD

• Ngâm mẫu trong dd GAD 2,5%, thời gian 15, 30, 60, 90, 120, 180 phút, to

p.

• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.

• Đo góc tiếp xúc.

Gắn F-LCA

• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH 7.4), 18h, to

p.

• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô với N2.

• Đo góc tiếp xúc nước và chụp huỳnh quang.

37


Au Hợp chất thiol Liên kết cho nhận giữa Au và nhóm SH

Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au.

Cơ chế gắn GAD trên cysteamine được thể hiện thông qua hình 1.2.3:

Amine Hợp chất aldehyde Base Schiff

Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO).

Theo đó, nhóm amine (-NH2) của cysteamine sẽ phản ứng với nhóm aldehyde (-

CHO) của glutaraldehyde.

Sản phẩm tạo ra là base Schiff là một chất amine bậc 3 có nối đôi kém bền. Để tạo

amine bền hơn người ta sử dụng thêm chất khử NaCNBH3 để chuyển amine bậc 3 về

amine bậc 2 không có liên kết đôi:

Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3.

Tuy nhiên, NaCNBH3 là một chất rất độc nên trong đề tài đã được thay thể bằng

vitamin C, là một chất khử an toàn. Vitamin C xúc tác phản ứng giữa nhóm amine (-NH2)

với nhóm aldehyde (-CHO) và làm tăng hiệu suất tạo thành amine bền hơn.

2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP

Quy trình gắn cysteamine và GAD tối ưu nhất được lựa chọn và tiến hành trên chip,

và được đánh giá bằng phương pháp đo độ lệch thanh dao động.

Quy trình thực nghiệm được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1.5.

38


Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au

Trong quy trình này, BSA là một protein huyết tương bò. Chip sau khi gắn anti-AFP

được xử lý tiếp với dung dịch BSA. Các phân tử BSA có kích thước nhỏ sẽ len lỏi vào

các khe hở trên bề mặt chip, phản ứng với các nhóm -CHO tự do và ngăn không cho các

protein lạ phản ứng với các nhóm -CHO này. Nếu không có BSA thì các protein lạ sẽ len

lỏi vào các khe hở và phản ứng với các nhóm -CHO tự do trên bề mặt chip. Từ đó làm

thanh dao động bị lệch không phải vì AFP, dẫn đến chẩn đoán không chính xác. Hình

Làm sạch chíp

• Quy trình làm sạch được thực hiện như trong phần 2.1.1.1.

Gắn Cysteamine

• Ngâm chíp trong dd cysteamine 5mM (pha với ethanol), trong 24h, top.


Gắn GAD

• Ngâm chíp trong dd GAD 2,5% + Vitamin C 50mM + PBS pH 7.4, 2h, top.

• Rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.

Gắn kháng thể anti-

AFP

• Ngâm chíp trong dd anti-AFP 5ug/ml, 18h, 4oC .

• Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.

Ngâm trong dd

BSA

• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, top

.

• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2. • Đo độ lệch.

Gắn kháng nguyên

AFP

• Ngâm chíp trong dung dịch AFP có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to

p.

• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, DI, N2.

• Đo độ lệch.

39


2.1.6 mô tả vai trò của BSA trong quy trình dó tìm kháng nguyên bằng chíp thanh dao

động.

Hình 2.1.6: Vai trò của BSA.

2.1.2. Qui trình biến đổi bề mặt SiNx/SiO2

2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx

Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện với hợp chất silane là

GOPTS và hiệu quả của quá trình được đánh giá thông qua phương pháp chụp ảnh huỳnh

quang F-LCA gắn trên silane. Quy trình silane hoá bề mặt SiNx và SiO2 được thực hiện

theo sơ đồ hình 2.1.7.

Y Y Y Y Au

Cysteamine

GAD

Anti-AFP

Protein lạ

BSA

AFP

40


Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2

Để hình thành nhóm chức silanol trên bề mặt, các mẫu wafer được ngâm trong dung

piranha, trong 5 phút.

Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2.

Quá trình silane bề mặt được thực hiện với các chất có nhóm silane như 3-

glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPTS) (hoặc với 3-Aminopropyltriethoxysilane

(APTES)).

Làm sạch mẫu

• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô bằng khí N2

Tạo nhóm silanol trên

bề mặt

• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, thời gian 5 phút.


Silanization bề mặt

• Ngâm mẫu trong dd GOPTS 2% (pha loãng từ nồng độ 100% trong Toluene), thời gian qua đêm, to

p.

• Rửa 2 lần trong dd Toluene, mỗi lần 5 phút, rửa lại bằng nước DI, xịt khô N2.

Gắn F-LCA

• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH7.4).

• Rửa trong dd đệm PBS pH7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô với N2.

Chụp ảnh huỳnh quang

• Mẫu sau khi rửa sạch được mang đi chụp ảnh huỳnh quang và đánh giá kết quả.

41


Phân tử GOPTS gồm 1 nhóm epoxy và 3 nhóm silane, còn phân tử APTES gồm một

nhóm chức NH2 và 3 nhóm silane như trong hình 2.1.9:

Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES [21].

Sơ đồ phản ứng của quá trình silane được thể hiện trong hình 2.1.10:

42


Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm

silane. R là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) [21].

Trong đề tài này, quá trình silane hoá được thực hiện với GOPTS nồng độ 2% trong

dung dịch toluene, ngâm mẫu qua đêm, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, các mẫu được rửa lại

trong dung dịch toluene trong 5 phút, rửa 2 lần để loại bỏ các phần tử GOPTS và APTES

hấp phụ vật lý trên bề mặt.

43


5. Quá trình gắn F-LCA 6. Chụp ảnh huỳnh quang

F-LCA là protein lens culinaris agglutinin (LCA) gắn chất phát huỳnh quang

fluorescein isothiocyanate (FITC). Cơ chế gắn F-LCA lên bề mặt là một nhóm amine

của LCA sẽ phản ứng với nhóm epoxy của GOPTS như trong hình 2.1.11 dưới đây:

F-LCA GOPTS Amine bậc 2

Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy [21]

Như nhận định ban đầu, những mẫu SiO2 cho kết quả huỳnh quang tốt còn những

mẫu SiNx hầu như không có huỳnh quang khi thực hiện silane theo quy trình này. Do đó,

đã tiến hành xử lý plasma oxy bề mặt SiNx.

2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma oxy

Quy trình xử lý bề mặt SiNx bằng plasma oxy và khảo sát hiệu quả của plasma được

thực hiện như sơ đồ hình 2.1.12.

Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy.

Quá trình xử lý plasma oxy (2) được thực hiện với các thông số thời gian, lưu lượng

khí oxy, công suất plasma ICP, áp suất hoạt động buồng phản ứng dựa trên công trình

nghiên cứu [15] thông qua thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, Nhật Bản, tại Phòng Thí

1. Quá trình làm sạch

2. Quá trình xử lý plasma

oxy

3. Tạo silanol trên

bề mặt

4. Silanization

bề mặt

44


nghiệm Công nghê Nano-Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh.

Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano.

Các quá trình (1, 3, 4, 5, 6) được thực hiện tương tự như trong mục 2.1.2.1 ở trên.

2.1.2.3. Tối ƣu hóa quy trình xử lý plasma oxy

Đã tiến hành tối ưu quá trình xử lý plasma oxy để xác định các thông số tối ưu của

quá trình xử lý bằng cách lần lượt thay đổi các thông số thời gian xử lý, lưu lượng khí

oxy, công suất plasma ICP. Các quá trình còn lại được thực hiện như trong mục 2.1.2.2.

Kết quả thu được, được áp dụng vào quy trình biến đổi bề mặt SiNx.

2.1.2.4. Áp dụng quy trình plasma tối ƣu để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS

Thực hiện quy trình biến đổi bề mặt SiNx như trong sơ đồ mục 2.1.2.2 với các thông

số tối ưu của quá trình xử lý plasma.

2.1.2.5. Thử nghiệm APTES+GAD

APTES + GAD thường được dùng trong quá trình silane bề mặt SiO2/SiNx nên đã

tiến hành thử nghiệm biến đổi bề mặt với các chất này và so sánh kết quả với GOPTS.

Sau khi xử lý bề mặt SiNx bằng quy trình plasma oxy tối ưu, đã tiến hành xử lý cho

APTES và sau đó là GAD phản ứng với mẫu. Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp

APTES+GAD sẽ cố định đươc nhiều protein hơn là sử dụng GOPTS.

Quy trình thực hiện được thể hiện như trong sơ đồ hình 2.1.14.

45


Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình

tối ưu hoá.

Kết quả thu được cho thấy hiệu quả biến đổi bề mặt SiNx của APTES+GAD tốt hơn

GOPTS nên nó được sử dụng để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động nhằm dò tìm

DKK1.

2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1

Các thanh dao động trên chíp với mặt trên phủ Au, mặt dưới là SiNx, được xử lý nhờ

quy trình plasma+APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động. Kết

quả được đánh giá bằng việc đo độ lệch của các thanh dao động trước và sau khi gắn

kháng nguyên.

Quy trình thực hiện được trình bày như trong sơ đồ hình 2.1.15 dưới đây:

Làm sạch mẫu

• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 30s-> DI->N2

• Ngâm trong piranha 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô N2.

Xử lý plasma

oxy

• Sau khi làm sạch, mẫu được mang đi xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu: thời gian là 60 phút, lưu lượng khí oxy là 40 sccm, công suất plasma ICP là 300W.

Tạo nhóm silanol

• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, 5 phút để tạo nhóm silanol trên bề mặt.


Gắn APTES

• Ngâm mẫu trong dd APTES nồng độ 1%, thời gian 60 phút, top.

• Rửa bằng ethanol trong 15 phút, DI, N2.

Gắn GAD

• Ngâm mẫu trong dd GAD 2,5% trong đệm PBS pH7.4, thời gian 60 phút, top.

• Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.

Gắn F-LCA

• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH 7.4), 18h, 4oC.

• Rửa sạch bằng PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.

• Chụp huỳnh quang và đánh giá bằng phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP.

46


Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận

DKK1.

Trong quy trình này, vai trò của BSA cũng tương tự như trong mục 2.1.1.3. Cụ thể

được mô tả như trong hình 2.1.16.

Làm sạch chíp

• Quy trình làm sạch được thực hiện như trong phần 2.1.1.1. • Sau đó mang chíp đi xử lý plasma.

Tạo nhóm silanol bề mặt

• Xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu.

• Rửa lại chíp bằng nước DI, xịt khô N2.

Gắn APTES

• Ngâm chíp trong dd APTES 1%, trong 60 phút, top.

• Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.

Gắn GAD

• Ngâm chíp trong dd GAD 2% trong đệm PBS pH 7.4, 60 phút, top.

• Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.

Gắn kháng

thể anti-DKK1

• Ngâm chíp trong dd anti-DKK1 5ug/ml, 18h, 4oC .

• Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.

Ngâm trong dd

BSA

• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, top

.

• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. • Đo độ lệch.

Gắn kháng nguyên DKK1

• Ngâm chíp trong dung dịch DKK1 có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to

p.

• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.

• Đo độ lệch.

47


Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt

SiNx của thanh dao động.

2.2. Các phƣơng pháp và thiết bị khảo sát

2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang

Ảnh huỳnh quang có được thông qua kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) sử

dụng bước sóng kích thích 490nm, tại LNT. F-LCA phát xạ ánh sáng huỳnh quang mạnh

nhất ở bước sóng 520 nm (màu xanh lục). Thiết bị BX41 tại LNT như hình 2.2.1:

Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT.

SiNx

Anti - DKK1

DKK1

BSA

GAD

APTES

48


2.2.2. Máy đo góc tiếp xuc

Góc tiếp xúc được đo bằng thiết bị: máy đo góc tiếp xúc CAM 101, hãng KVS

Instrument, Phần Lan, tại LNT. Một máy đo góc tiếp xúc có các bộ phận sau: một ống

nhỏ giọt chất lỏng, một đèn để chiếu qua giọt nước, một máy chụp ảnh.

Chùm sáng từ đèn khi chiếu qua giọt nước và được thu lại bởi máy ảnh sẽ cho ảnh

có một vùng màu đen, đây chính là giọt nước.

Từ ảnh chụp đó, máy tính sẽ xử lý ảnh và tính toán ra góc tiếp xúc.

Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101.

2.2.3. Khảo sát bằng enzim HRP

Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng

phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) của dung dịch O-dianisidine

và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt enzim horseradish

peroxidase. Phản ứng càng mạnh khi hàm lượng HRP được gắn lên GAD trên bề mặt

càng lớn, càng chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt.

Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM

(đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4

được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh. Cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước

khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2

phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì

o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau:

49


Sau khi thực hiện xong phản ứng ELISA, những chip đã gắn được HRP sẽ tạo dung

dịch có màu hồng do o-dianisidine mất 2 proton H+ để chuyển từ dạng khử sang dạng

oxy hoá. Dung dịch chuyển từ không màu sang màu hồng có khả năng hấp thụ bước sóng

540nm được đo bằng máy quang phổ hấp thụ khả kiến.

2.2.4. Đo độ lệch

Độ lệch của thanh dao động được đo bằng thiết bị Scala, hãng sản xuất MecWin, Tây

Ban Nha tại LNT.

Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT

2.2.5. Các hoá chất sử dụng trong đề tài

Đề tài có sử dụng một số hoá chất được thể hiện trong bảng 2.2.1 dưới đây:

Bảng 2.2.1. Danh mục các hóa chất.

Stt Hóa chất Công thức hóa

học Xuất xứ

Trọng lƣợng

phân tử

1 Acetone CH3COCH3 Merck, Đức M=58,08 g/mol

2 Ethanol C2H5OH Merck, Đức M=46,07 g/mol

o-dianisidine

(dạng khử,

không màu)

Peroxidase

se

o-dianisidine

(dạng oxi

hóa, nâu) H2O2 +

50


3

3-Glycidyloxypropul

trimethoxysilance

(GOPTS)

C9H2OO5Si Aldrich, Sigma

M=234 g/mol

4 Cysteamine 95%wt C2H7NS Aldrich, Sigma M=77 g/mol

5 Glutaraldehyde

(GAD) 25%wt C5H8O2 Aldrich, Sigma M=100,12 g/mol

6 BSA Aldrich, Sigma ~66 kDa

7 F-LCA Vector

Laboratory, USA

8 anti-AFP Insight

Genomics, USA

9 AFP Insight

Genomics, USA 70 kDa

10 Anti-DKK1 Aldrich, Sigma ~29kDa

11 DKK1 Aldrich, Sigma 35-40 kDa

12 Ascorbic acid

(vitamin C) C6H8O6 Aldrich, Sigma M=176,12 g/mol

13 Hydrogen peroxide

30%wt H2O2 Merck, Đức M=34,01 g/mol

14 Toluene C6H5CH3 Merck, Đức M=92,14 g/mol

15 Acid sulfuric 98%wt H2SO4 Merck, Đức M=98 g/mol

Ngoài ra, một số hóa chất được chuẩn bị tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano

như: dung dịch đệm PBS, nước DI.

51


Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát qui trình biến đổi bề mặt Au

Đã tiến hành khảo sát quy trình gắn glutaraldehyde để xác định thời gian ngâm và

nồng độ GAD tối ưu thông qua ảnh huỳnh quang của F-LCA được gắn trên GAD. Các thí

nghiệm khảo sát được thực hiện trên các mẫu wafer có bề mặt phủ vàng. Sau quy trình

làm sạch, các mẫu wafer được ngâm trong dung dịch cysteamine 5mM, trong 24h, ở nhiệt

độ phòng.

3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD

Để khảo sát thời gian ngâm GAD, nồng độ GAD được giữ nguyên là 2,5%, chỉ thay

đổi thời gian ngâm GAD. Số liệu cụ thể như trong bảng 3.1.1.

Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD.

Thời gian (phút) 15 30 60 90 120

Đơn vị huỳnh quang tương đối 2,54 5,72 8,30 6,92 5,71

Kết quả cho thấy, thời gian ngâm GAD tối ưu là 60 phút. Nếu thời gian ngâm giảm đi

thì GAD chưa phản ứng hết với các phân tử cysteamine trên bề mặt. Mặt khác, thời gian

ngâm lâu hơn 60 phút thì tín hiệu huỳnh quang cũng giảm. Tuy nhiên, nguyên nhân của

hiện tượng tín hiệu huỳnh quang giảm khi ngâm GAD lâu hơn 60 phút như đã quan sát

được trong khảo sát này thì vẫn chưa rõ. Sự ảnh hưởng của thời gian ngâm GAD lên hiệu

quả phản ứng giữa nhóm amine và nhóm aldehyde được thể hiện rõ hơn thông qua đồ thị

hình 3.1.1.

52


Hình 3.1.1: Sự phụ thuộc của tính hiệu huỳnh quang và thời gian ngâm GAD.

Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD được thể hiện như trong

hình 3.1.2.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60 80 100 120 140

Đơ

n v

ị h

uỳn

h q

uan

g t

ƣơ

ng đ

ối

Thời gian ngâm GAD (phút)

53


Hình 3.1.2: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD: a) 15 phút; b)

30 phút; c) 60 phút; d) 60 phút; e) 120 phút.

a) b)

c) d)

e)

54


3.1.2. Khảo sát nồng độ GAD

Tiếp theo, thay đổi nồng độ GAD và chọn thời gian ngâm là 60 phút để xác định

nồng độ GAD tối ưu. Giá trị nồng độ và kết quả độ sáng huỳnh quang được trình bày

trong bảng 3.1.2.

Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD.

Nồng độ GAD (%) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0


Kết quả cho thấy, độ sáng huỳnh quang tăng khi nồng độ GAD từ 1,0 % đến 2,5 %

và giảm khi nồng độ lớn hơn 2,5%.

Hình 3.1.3: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào nồng độ GAD.

Kết quả này có thể là do nồng độ GAD nhỏ hơn 2,5% không đủ để phản ứng giữa

cyteamine và GAD đạt tốc độ lớn nhất, nồng độ càng nhỏ thì tốc độ phản ứng càng nhỏ

dẫn đến mật độ các phân tử F-LCA gắn trên bề mặt mẫu cũng giảm nên cường độ huỳnh

quang giảm theo. Tuy nhiên, khi nồng độ GAD cao hơn 2,5% thì tín hiệu huỳnh quang lại

giảm đi. Nguyên nhân của hiện tượng này cũng chưa được rõ. Như vậy, nồng độ GAD

2,5% được chọn là tối ưu.

Hình ảnh huỳnh quang các mẫu wafer theo nồng độ GAD được thể hiện như trong

hình 3.1.4.

0

2

4

6

8

10

12

14

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Đơ

n v

ị h

uỳn

h q

uan

g t

ƣơ

ng đ

ối

Nồng độ GAD (%)

55


Hình 3.1.4: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo nồng độ GAD: a) 1%; b) 1,5%; c)

2%; d) 2,5%; e) 3%.

3.1.3. Đánh giá hiệu quả biến đổi bề mặt thông qua góc tiếp xúc

Áp dụng quy trình cysteamine tối ưu trên 3 mẫu wafer SiNx phủ Au ở mặt trên, kích

thước 10x10 mm. Tiến hành đo góc tiếp xúc của nước trên 3 mẫu, mỗi mẫu đo ba lần và

lấy giá trị trung bình, đã thu được bảng số liệu dưới đây:

a) b)

c) d)

e)

56


Bảng 3.1.3: Kết quả đo góc tiếp xúc nước.

Mẫu M1 M2 M3

Giá trị

Sau khi rửa Piranha 74,6 0,6 75,7 0,4 74,9 0,5

Sau khi gắn cysteamine 61,1 1,0 -13,6 60,9 1,4 -14,8 62,1 0,3 -12,8

Sau khi gắn GAD 68,1 1,2 7,0 67,1 1,9 6,2 66,9 1,9 4,8

Sau khi gắn F-LCA 57,7 0,7 -10,4 57,6 1,0 -9,5 55,1 2,2 -11,9

Chú thích:

- Đơn vị đo góc tiếp xúc là độ (o).

- : góc tiếp xúc trung bình của 3 lần đo trên một mẫu.

- : sai số của kết quả đo.

- : hiệu giữa 2 góc tiếp xúc đo sau và trước khi thực hiện bước biến đổi bề

mặt tương ứng.

Từ bảng số liệu, có thể rút ra một số nhận xét như sau:

- Trước khi ngâm cysteamine, bề mặt Au ở tất cả các mẫu đều không ái nước

lắm (góc tiếp xúc cao, chừng 75o).

- Sau khi ngâm cysteamine, góc tiếp xúc giảm xấp xỉ 13 độ. Nguyên nhân có

thể là do sự hiện diện của nhóm amine (-NH2), có tính phân cực nên làm tăng

tính ái nước trên bề mặt mẫu wafer lên nên góc tiếp xúc giảm. Từ kết quả này

có thể dự đoán sự tồn tại của lớp cysteamine trên mẫu wafer.

- Sau khi ngâm GAD, góc tiếp xúc lại tăng lên vài độ nhưng vẫn thấp hơn nhiều

so với bề mặt Au thuần túy. Trong GAD có chứa nhóm aldehyde (-CHO), mà

CHO cũng có tính phân cực nhưng có thể yếu hơn nhóm amine (-NH2), đây có

thể là nguyên nhân khiến góc tiếp xúc tăng lên lại một chút.

- Sau khi ngâm F-LCA thì góc tiếp xúc lại giảm khoảng 10o. Có thể F-LCA làm

tăng tính ái nước của bề mặt so với GAD. Nguyên nhân còn chưa thể biết rõ,

nhưng qua kết quả cho thấy có sự khác biệt rõ về tính dính ướt nước bề mặt

trước và sau khi ngâm F-LCA.

Kết quả đo góc tiếp xúc cho thấy bề mặt Au qua mỗi lần biến đổi bề mặt đều có sự

thay đổi tính dính ướt. Điều này chứng minh rằng các phương pháp biến đổi bề mặt đã

thành công.

3.1.4. Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP

Sử dụng các thông số tối ưu của quy trình cysteamine để biến đổi bề mặt Au của

thanh dao động, thực hiện quy trình dò tìm AFP ứng với các nồng độ khác nhau từ 0

ng/ml đến 500 ng/ml. Đo độ lệch của thanh dao động đã thu được kết quả thể hiện trong

đồ thị hình 3.1.5:

57


Hình 3.1.5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ

khác nhau của AFP

Đồ thị trên cho thấy, độ lệch của thanh dao động tăng lên khi tăng nồng độ AFP. Mặc

dù, không phải là sự tăng tuyến tính nhưng kết quả này cũng chứng tỏ rằng độ cong tăng

theo nồng độ AFP. Với phương pháp biến đổi bề mặt Au ở trên, đã phát hiện được AFP

từ nồng độ 200 ng/ml.

Kết quả này cho thấy, với quy trình xử lý cysteamine tối ưu, chíp thanh dao động có

thể thu nhận được AFP ở nồng độ khá thấp (200ng/ml). Kết quả này sẽ là cơ sở khoa học

trong mục tiêu hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị ung thư gan

AFP.

3.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2

3.2.1 Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chƣa qua xử lý plasma O2 và SiO2

Thực hiện quy trình biến đổi bề mặt SiNx và SiO2 với GOPTS theo mục 2.1.2.1

chúng tôi thu được kết quả huỳnh quang thể hiện trong hình 3.2.1:

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300 400 500

Độ

lệc

h (

nm

)

Nồng độ AFP (ng/ml)

58


a) b)

Hình 3.2.1: Ảnh huỳnh quang của a) wafer SiNx được biến đổi với GOPTS và không

được xử lý plasma oxy và mẫu SiO2.

Hình ảnh huỳnh quang thu được với độ sáng trung bình của mẫu SiNx là 1,08 cho

thấy gần như không có hoặc có rất ít phân tử F-LCA được cố định trên bề mặt. Điều này

chứng tỏ là GOPTS gần như không được cố định trên bề mặt SiNx khi không được xử lý

plasma oxy.

Những mẫu SiO2 cho kết quả huỳnh quang rất tốt với độ sáng trung bình là 27,83.

Kết quả này một lần nữa khắng định, với bề mặt SiO2 quá trình silane bề mặt rất tốt.

Để tăng hiệu quả biến đổi bề mặt SiNx, đã tiến hành xử lý bề mặt bằng plasma oxy.

3.2.2. Cải tiến quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng phƣơng pháp xử lý plasma oxy

Quy trình được thực hiện như trong sơ đồ ở mục 2.1.2.2. Các thông số của quá trình

xử lý plasma dựa theo công trình nghiên cứu [15] và được trình bày như trong bảng 3.2.1:

Bảng 3.2.1: Các thông số của quá trình xử lý plasma oxy

Công suất ICP PICP 300 (W)

Công suất Bias PBias 50 (W)

Lưu lượng khí oxy FO2 80 (sccm)

Áp suất hoạt động Press 10 (Pa)

Thời gian xử lý t 60 (phút)

Kết quả huỳnh quang thu được thể hiện trong hình 3.2.2:

59


Hình 3.2.2: Ảnh huỳnh quang của mẫu SiNx có xử lý plasma oxy.

Kết quả thu được cho thấy cường độ huỳnh quang được cải thiện đáng kể (với độ

sáng trung bình 16,58) so với trường hợp không xử lý plasma oxy, tức là tín hiệu huỳnh

quang tăng đến 15 lần. Như vậy, hiệu quả của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma oxy là rất

lớn. Tuy vậy, độ sáng huỳnh quang chưa thực sự cao nên cần khảo sát quá trình xử lý

plasma oxy để tìm ra các thông số tối ưu nhằm đạt hiệu quả biến đổi bề mặt SiNx cao

nhất.

3.2.3. Tối ƣu hóa quy trình xử lý plasma oxy

Để tối ưu quy trình xử lý plasma oxy, đã thay đổi các thông số của quá trình xử lý

plasma như thời gian, lưu lượng khí oxy và công suất ICP trên các mẫu wafer với bề mặt

là lớp SiNx.

Để đánh giá hiệu quả của quy trình, đã sử dụng phương pháp chụp ảnh huỳnh quang,

sử dụng phần mềm ImageJ để tính độ sáng trung bình của mẫu. Từ đó, tìm ra các thông

số tối ưu.

3.2.3.1. Thời gian xử lý plasma

Để xác định thời gian xử lý plasma tối ưu, đã thay đổi thời gian xử lý (t) từ 20 phút

đến 60 phút. Các thông số còn lại như công suất ICP (PICP), công suất bias (PBias), lưu

lượng khí oxy (FO2), áp suất làm việc (Press) và giá trị đơn vị huỳnh quang tương đối của

các mẫu wafer được thể hiện như bảng 3.2.2:

60


Bảng 3.2.2: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy.

Độ sáng của mẫu thu được tương ứng với lượng F-LCA được gắn trên bề mặt. Hàm

lượng F-LCA càng lớn thì chứng tỏ mật độ GOPTS được gắn trên bề mặt càng lớn nghĩa

là hiệu quả xử lý plasma oxy bề mặt càng cao.

Hình 3.2.3: Đồ thị thể hiện sự thay đổi của độ sáng huỳnh quang theo thời gian xử lý

plasma oxy.

Đồ thị cho thấy thời gian xử lý plasma càng tăng thì độ sáng huỳnh quang càng tăng.

Những mẫu có thời gian xử lý nhỏ hơn 30 phút hầu như không có huỳnh quang và mẫu

được xử lý trong ở 60 phút cho giá trị độ sáng huỳnh quang mạnh nhất. Kết quả này có

thể là do trong 30 phút đầu, plasma oxy chỉ có mới có tác dụng làm sạch các tạp chất bám

trên bề mặt và chưa tạo ra được lớp oxít. Chỉ sau 30 phút bề mặt đã sạch và plasma oxy

bắt đầu giúp hình thành lớp oxynitride Si2N2O.

Hình ảnh huỳnh quang của các mẫu được thể hiện trong hình 3.2.4.

0

15

30

45

60

75

90

15 25 35 45 55 65

Đơ

n v

ị đ

ộ s

án

g h

uỳn

h q

uan

g

Thời gian xử lý plasma t (phút)

PICP=300 W; PBias= 50 W; FO2 = 40 sccm

P = 10 Pa

t (phút) 20 30 45 60

Đơn vị huỳnh quang tương đối 0,15 0,36 15,16 75,50

61


Hình 3.2.4: Ảnh huỳnh quang của 4 mẫu wafer ứng với thời gian xử lý plasma khác

nhau: a) 20 phút; b) 30 phút; c) 45 phút; d) 60 phút.

3.2.3.2. Ảnh hƣởng của lƣu lƣợng khí oxy

Sau khi tìm ra được thời gian xử lý plasma tối ưu là 60 phút, đã tiến hành khảo sát

ảnh hưởng của lưu lượng khí O2 bằng cách thay đổi giá trị lưu lượng O2 từ 20 đến 160

sccm, các thông số còn lại và kết quả đơn vị huỳnh quang tương đối được thể hiện trong

bảng 3.2.3.


PICP= 300 W; PBias= 50 W

t = 60 phút

Press= 10 Pa

a) b)

c) d)

62


Kết quả trên cho thấy, lưu lượng khí O2 có ảnh hướng lớn đến hiệu quả xử lý plasma

từ đó ảnh hưởng đến mật độ nhóm silanol trên bề mặt của mẫu. Hiệu quả biến đổi bề mặt

không cao nếu lưu lượng khí O2 quá lớn hoặc quá nhỏ. Kết quả thu được cũng cho thấy

lưu lượng khí O2 tối ưu là 40 sccm.

Hình 3.2.5: Đồ thị sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào lưu lượng khí oxy.

Kết quả này có thể là do:

Với lưu lượng khí oxy nhỏ thì ít có oxy trong buồng và nhận năng lượng plasma để

hoạt hoá và phản ứng với các phân tử Si ở bề mặt mẫu.

Với lượng khí oxy quá lớn thì plasma không cung cấp đủ năng lượng cho tất cả oxy

để hoạt hoá nên cản trở quá trình phản ứng của các oxy có hoạt tính hóa học cao với bề

mặt mẫu. Vì vậy, lớp oxít hình thành trên bề mặt không đủ để tạo ra mật độ nhóm silanol

lớn.

Ảnh huỳnh quang của các mẫu được thể hiện trong hình 3.2.6:

0

15

30

45

60

75

90

15 35 55 75 95 115 135 155

Đơ

n v

ị h

uỳn

h q

ua

ng t

ƣơ

ng đ

ối

Lƣu lƣợng khí oxy FO2(sccm)

FO2 (sccm) 20 40 80 120 160


63


Hình 3.2.6: Ảnh huỳnh quang của các mẫu ứng với lưu lượng khí oxy khác nhau: a)

20 sccm; b) 40 sccm; c) 80 sccm; d) 120 sccm; e) 160 sccm.

b) a)

c) d)

e)

64


3.2.3.3. Ảnh hƣởng của công suất plasma

Sử dụng hai thông số tối ưu thời gian và lưu lượng khí oxy, thay đổi công suất

plasma ICP với mục đích tìm giá trị tối ưu của công suất trong quá trình xử lý plasma.

Bảng 3.2.4 trình bày các thông số của quá trình xử lý:


Kết quả này cho thấy công suất plasma ICP tối ưu ứng với 300 W, nhỏ hơn hay lớn

hơn giá trị này đều cho hiệu quả xử lý không cao.

Hình 3.2.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào công suất xử

lý plasma ICP.

Với công suất ICP thấp, plasma không cung cấp đủ năng lượng để kích hoạt các phân

tử oxy trong buồng phản ứng. Tuy nhiên lí do vì sao ở chế độ công suất cao thì hiệu quả

xử lý bề mặt lại giảm là vấn đề cần nghiên cứu tìm hiểu thêm.

0

20

40

60

80

150 250 350 450

Đơ

n v

ị h

uỳn

h q

uan

g t

ƣơ

ng đ

ối

Công suất ICP PICP (w)

PBias= 50 W; Press = 10 Pa

FO2 = 40 sccm

T = 60 phút

PICP (W) 200 300 400

Đơn vị huỳnh quang tương đối 2,66 75,50 16,04

65


Hình ảnh huỳnh quang của các mẫu được thể hiện trong hình 3.2.8.

Hình 3.2.8: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo công suất plasma ICP: a) 200 W; b)

300 W; c) 400 W.

3.2.3.4. Các thông số xử lý plasma tối ƣu

Từ các kết quả khảo sát trên, đã tìm ra các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma

oxy ghi nhận trong bảng 2.3.5.

Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma oxy

PICP 300 (W)

PBias 50 (W)

a) b)

c)

66


FO2 40 (sccm)

Press 10 (Pa)

t 60 (phút)

Ứng dụng vào quy trình xử lý plasma, kết quả huỳnh quang thu được so sánh với

huỳnh quang của mẫu không được xử lý plasma oxy mô tả trong hình 3.2.9.

a) b)

Hình 3.2.9: Ảnh huỳnh quang: a) mẫu không được xử lý plasma oxy; b) mẫu xử lý

plasma oxy với các thông số tối ưu.

Hình 3.2.9 cho thấy được sự khác biệt rất rõ về độ sáng huỳnh quang của mẫu không

được xử lý và được xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu. Có thể kết luận rằng, việc

xử lý plasma oxy đã làm tăng đáng kể mật độ nhóm silanol trên bề mặt, vì vậy làm tăng

mật độ GOPTS được gắn và cuối cùng tăng mật độ F-LCA cố định trên bề mặt mẫu. Từ

đó có thể khẳng định rằng, đã thành công trong việc biến đổi bề mặt wafer có phủ lớp

SiNx. Những kết quả này sẽ được áp dụng để biến đổi bề mặt thanh dao động có phủ lớp

SiNx hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị ung thư gan DKK1.

3.2.4. Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ƣu

Đã áp dụng các giá trị tối ưu của quá trình xử lý plasma vào quy trình APTES tối ưu

(nồng độ 1%, thời gian ngâm 60 phút) để biến đổi bề mặt thanh dao động.

Đánh giá hiệu quả được thực hiện bằng phương pháp chụp ảnh huỳnh quang F-LCA

gắn trên bề mặt thanh dao động thông qua liên kết giữa nhóm amine (-NH2) của F-LCA

và nhóm aldehyde (-CHO) của glutaraldehyde. Kết quả thể hiện ở hình 3.2.10.

67


Hình 3.2.10: Hình ảnh huỳnh quang của F-LCA trên thanh dao động được biến tính

bề mặt sử dụng các thông số tối ưu của quy trình APTES.

Kết quả ảnh huỳnh quang thu được cho thấy phân bổ của F-LCA trên bề mặt khá đều

với mật độ lớn. Điều này chứng tỏ hiệu quả biến đổi tốt, là kết quả khả quan để hướng

đến ứng dụng trong cảm biến sinh học phát hiện chỉ thị ung thư gan.

Hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt thanh dao động còn được khắng định thông

qua phản ứng đổi màu xúc tác bởi enzim HRP.

Thanh dao động SiNx được gắn APTES, GAD và sau đó cho phản ứng HRP

(horseradish peroxidase) trong PBS pH 7.4, qua đêm. Kiểm tra sự tồn tại của HRP lên bề

mặt chip bằng cách ngâm chip vào dung dịch và quan sát sự đổi màu dung dịch.

68


Hình 3.2.11: Độ hấp thụ của dung dịch được đo bằng máy quang phổ UV-VIS với

bước sóng hấp thụ khoảng 540 nm.

Trong thí nghiệm này, sau khi chip được gắn enzim HRP và ngâm vào dung dịch

H2O2 và o-dianisidine. Tất cả các dung dịch ngâm đều chuyển thành màu hồng, riêng

dung dịch H2O2 và O-dianisidine ngâm chip SiNx chưa qua các bước biến đổi bề mặt thì

vẫn không thay đổi (ứng với đường cong baseline). Điều này cho thấy, qui trình biến đổi

bề mặt đã xảy ra và được chứng minh nhờ enzim HRP. Để kiểm chứng kỹ hơn, các dung

dịch được đem đi đo phổ hấp thụ bằng máy UV-Vis, Cary100. Qua phổ UV-Vis, có thể

thấy các mẫu có gắn HRP đều có sự hấp thụ tăng lên ở bước sóng 540 nm, đây là đỉnh

hấp thụ đặc trưng của o-dianisidine ở dạng bị oxi hóa. Riêng dung dịch của mẫu SiNx

không được gắn HRP thì phổ UV-Vis không có đỉnh hấp thụ, đây là đặc trưng của o-

dianisidine ở dạng khử.

3.2.5. Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ƣu để biến đổi bề mặt

SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1

Kết quả mà phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động đã được áp dụng

vào biến đổi bề mặt của thanh dao động có phủ SiNx nhằm dò tìm DKK1. Kết quả được

đánh giá bằng cách xác định độ lệch của thanh dao động, từ đó xây dựng đường chuẩn.

Đã xây dựng được đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 thay

đổi từ 0 (ng/ml) đến 500 (ng/ml) như đồ thị hình 3.2.12:

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

400 500 600 700 800

Độ

hấp

thụ

Bước sóng (nm)

Wafer SiN Thanh SiN

Baseline

69


Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 khác

nhau.

Mặc dù sự thay đổi độ lệch của thanh dao động chưa thực sự tuyến tính nhưng về cơ

bản ta nhận thấy độ lệch giảm khi tăng nồng độ DKK1. Đồ thị cho thấy, ứng với nồng độ

DKK1 là 200 ng/ml, độ lệch của thanh dao động thay đổi gần 300 nm. Sự thay đổi này là

đủ lớn để ta có thể khắng định được khả năng phát hiện DKK1 của chíp thanh dao động

thông qua phương pháp biến đổi bề mặt của chúng tôi.

-1,400

-1,200

-1,000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

0 100 200 300 400 500 600

Độ l

ệch

(n

m)

Nồng độ DKK1 (ng/ml)

Độ lệch thực nghiệm (nm)

Fit

70


Chƣơng 4

KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI

4.1. Kết luận

Đề tài đã thu được một số kết quả sau:

Xây dựng được quy trình biến đổi bề mặt Au của thanh dao động bằng

cysteamine và sử dụng các phương pháp đánh giá hiệu quả của quy trình như

phương pháp chụp ảnh huỳnh quang, phương pháp đo góc tiếp xúc nước.

Xác định được thời gian ngâm và nồng độ GAD tối ưu cho quy trình cải biến bề

mặt Au của thanh dao động.

Bước đầu áp dụng thanh dao động trong dò tìm AFP đạt nồng độ khá thấp từ

~200ng/ml.

Đã xác định được thông số tối ưu của quy trình xử lý plasma oxy, áp dụng vào

xử lý bề mặt SiNx của thanh dao động. Cải biến bề mặt SiNx thanh dao động

bằng APTES, dùng chụp ảnh huỳnh quang, phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP để

đánh giá.

Bước đầu thu được kết quả dò tìm DKK1 ở khoảng nồng độ từ ~200 ng/ml bằng

thanh dao động trên.

4.2. Hƣớng phát triển của đề tài

Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện thông số trong quá trình biến đổi bề mặt để

nâng cao hiệu quả và tăng độ nhạy của cảm biến thanh dao động.

Nghiên cứu các phương pháp khác để nâng cao độ nhạy của cảm biến và giảm

thời gian của quy trình xuống thấp hơn.

71


Tài liệu tham khảo

[1]. Nardo Ramírez Frómeta, “Cantilever Biosensors”, Ave. 25 esq. 158, Cubanacán,

Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.

[2]. Gennady Evtugyn, “Biosensors: Essentials”, Department of Analytical Chemistry,

Kazan Federal University, Kazan, Russia.

[3]. Dr. Javed H. Niazi KM, “Overview, history & types of biosensors”, Faculty of

Engineering & Natural Sciences, Sabanci University.

[4]. Janos, Tomaso, “Optical Biosensors”, Laboratory of Biosensors and Bioelectronics,

Institute for Biomedical Engineering.

[5]. K. Kivirand, M. Kagan, T. Rinken, “Calibrating Biosensors in Flow-Through Set-

Ups: Studies with Glucose Optrodes”, Intech, DOI: 10.5772/54127.

[6]. D. Then, C. Ziegler, “Cantilever – based sensors”, University of Kaiserslautern,

Kaiserslautern, Germany.

[7]. Josep M. Llovet, Michel Beaugrand, “Hepatocellular carcinoma: present status and

future prospects”, Journal of Hepatology 38 (2003) S136–S149.

[8]. Helen Reeves, Derek M. Manas and Rajiv Lochan, “Liver Tumors - Epidemiology,

Diagnosis, Prevention and Treatment", April 10, 2013 under CC BY 3.0 license,

Intech.

[9]. Ahmet Gurakar, James P. Hamilton, Ayman Koteish, Zhiping Li, Esteban Mezey,

“Hepatocellular Carcinoma”, 600 North Wolfe Street, Baltimore, Maryland.

[10]. Thomas B. Tomasi, “STRUCTURE AND FUNCTION OF ALPHA-

FETOPROTEIN”, Ann. Rev. Med. 1977. 28:453-65.

[11]. Pietro Pucci, Rosa Siciliano, Antonio Malorni, Gennaro Marino, Mario F. Tecce,

Costante Ceccarini, Benedetto Terraria, “Human a-Fetoprotein Primary Structure: A

Mass Spectrometric Study”, Biochemistry 1991, 30, 5061-5066.

[12]. Bin Yu, Xinrong Yang, Yang Xu, Genfu Yao, Huiqun Shu, Biaoyang Lin, Leroy

Hood, Hongyang Wang, Shengli Yang, Jianren Gu, Jia Fan, Wenxin Qin, “Elevated

expression of DKK1 is associated with cytoplasmic/nuclear b-catenin accumulation

and poor prognosis in hepatocellular carcinomas”, Elsevier, Journal of Hepatology

50 (2009) 948–957.

72


[13]. Michel Rosso, “Modification of Silicon Nitride and Silicon Carbide Surfaces for

Food and Biosensor Applications”, PhD thesis, Wageningen University, Dutch.

[14]. Míriam Gironès i Nogué, “Inorganic and Polymeric Microsieves ”, PhD Thesis,

University of Twente, The Netherlands.

[15]. Manoj Joshi, Sunil Singh, BibhuSwain, Samadhan Patil, Rajiv Dusane, Ramgopal

Rao, Soumyo Mukheji, “Anhydrous Silanization and Antibody Immobilization on

Hotwire CVD Deposited. Silicon Oxynitride Films”, IEEE India Annual conference

2004. Indicon 2004.

[16]. Shun'ko, Evgeny V, Stevenson, David E, Belkin, Veniamin S, "Inductively

Coupling PlasmaReactor With Plasma Electron Energy Controllable in the Range

From ~6 to ~100 eV". IEEE Transactions on Plasma Science 42 (3): 774–785.

[17]. Octmvien Buiu, Gray PKennedy et.al, “Structural Analysis of Silicon Dioxide and

Silicon Oxynitride Films Produced using an Oxygen Plasma”, IEEE Transactions

on Plasma Science,VOL.26, N0.6, Dec.1998.

[18]. Buiu, Gartner, Mariuca, Taylor, “Structural analysis of silicon dioxide and silicon

oxynitride films produced using an oxygen plasma”, Plasma Science, IEEE

Transactions on (Volume:26 , Issue: 6 ).

[19]. C. Jime´nez, J. Perrie`re, I. Vickridge, J.P. Enard, J.M. Albella, “Transformation of

silicon nitride in oxygen plasma”, Surface and Coatings Technology, Volume 45,

Issues 1–3, 15 May 1991, Pages 147–154.

[20]. S Weichela, R de Reusa, S Bouaidata, P.A Rasmussena, O Hansena, K Birkelundb,

H Dirac, “Low-temperature anodic bonding to silicon nitride”, Sensors and

Actuators A: Physical, Volume 82, Issues 1–3, 15 May 2000, Pages 249–253.

[21]. Greg T. Hermanson, “BIOCONJUGATE TECHNIQUES ”, 525 B Street, Suite

1800, San Diego, CA 92101-4495, USA, Third edition 2013, chapter 10.

[22]. N. F. Martínez, P. M. Kosaka, J. Tamayo, J. Ramírez, O. Ahumada, J. Mertens, T.

D. Hien, C. V. Rijn, and M. Calleja, “High throughput optical readout of dense

arrays of nanomechanical systems for sensing applications ”, Review of Scientific

Instruments 81, 125109 (2010).

[23]. Michel Godin, Vincent Tabard-Cossa, Peter Gru¨tter and Peter Williams,

“Quantitative surface stress measurements using a microcantilever”, Applied

Physics Letters, Volome 79, Number 4, 2001.

73


[24]. Yuehua Yuan, “Surface Science Techniques”, Springer Berlin Heidelberg (2013),

chapter 1 trang 5.

[25]. Sung-Hoon Kim, Sun-Kyung Han, Jae-Ho Kim, Myung-Bock Lee, Kwang-Nak

Kohd, Shin-Won Kang, “A self-assembled squarylium dye monolayer for the

detection of metal ions by surface plasmon resonances”, Elsevier, Dyes and

Pigments 44 (2000) 55-61.

[26]. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx.

[27].http://benhvienk.com/pcut/tim-hieu-benh-ung-thu/1059-cac-phuong-phap-chan-

doan-ung-thu.

[28]. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3258?lang=en&region=VN

[29]. http://www.cancer.net.

[30]. http://en.wikipedia.org/wiki/Contact_angle.

http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx

http://benhvienk.com/pcut/tim-hieu-benh-ung-thu/1059-cac-phuong-phap-chan-doan-ung-thu

http://benhvienk.com/pcut/tim-hieu-benh-ung-thu/1059-cac-phuong-phap-chan-doan-ung-thu

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3258?lang=en&region=VN

http://www.cancer.net/

http://en.wikipedia.org/wiki/Contact_angle

74


PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

stt Tên bài báo Tên tác giả Nơi công bố Thời gian

công bố

01

Investigation of the

surface conditioning of

silicon-based substrate

to improve silanization

efficiency of biosensor

Thanh Trung Nguyen,

Tho Van Pham,

Tuyen Thi Thanh Le,

Hien Duy Tong,

Khoa Thanh Nhat Phan

The 7th

International

Workshop on

Advanced Materials

Science and

Nanotechnology,

Halog city, Vietnam

06/11/2014

Investigation of the surface conditioning of silicon-based substrate to improve silanization efficiency of biosensor

Thanh Trung Nguyen, Tho Van Pham, Tuyen Thi Thanh Le, Hien Duy Tong, Khoa Thanh Nhat Phan

Laboratory for Nanotechnology, Vietnam National University-Ho Chi Minh City, Community 6, Linh Trung Ward, Thu Duc District, Ho Chi Minh City,Vietnam

Email: [email protected] ; [email protected]

Abstract: In order to increase sensitivity of an immunoassay biosensor, it is mandatory to improve the efficiency of binding antibody on the biosensor surface. For silicon substrate or silicon nitride substrate, the best method to modify these surfaces is silanization, in which a silane coupling reagent is used to convert silicon or silicon nitride surface into a functional surface which can react with amine group on antibody. Our research showed that the silanol groups on the surface play an essential role in this method. We suggested the method of oxygen plasma treatment to increase the silanol group. Plasma parameters such as oxygen flow, power and time were investigated. The result showed that the efficiency of binding antibody increased significantly. This result is of high value to be applied into biosensor modification.

Keywords: Silicon nitride, biosensor, oxygen plasma, immunoassay biosensor.

Classification numbers: 6.09

1. Introduction

Si and SixNy materials have been widely used in semiconductor industry. SixNy is often used as an insulating thin film as a surface passivating layer in the semiconductor industry. The Young modulus and stress of SixNy thin film can be tuned during deposition process. In order to be able to resist HF etching and have low internal stress, SixNy can be deposited with high ratio of Si (silicon–rich SixNy). SixNy can also act as a barrier layer against the diffusion of ions with high mobility (such as Na+, K+ ions in biological environment), thus is is used widely in bio MEMS [1]. Other electrical and mechanical properties of SixNy can be changed to suit the application requirements by selecting the parameters of deposition process

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

75


accordingly. SixNy also can be used in biological sensors to collect the biological element if its surface is properly modified. A method called silanization is often used to modify Si and SixNy surfaces, in which a silane compound reacts with silanol groups on the surfaces and converts the surface to be reactive toward aldehyde or amine groups, which is abundant in protein. Silanol group is abundant on silica or glass surface, but few are found on the native oxide layer formed on the surface of Si and SixNy [2]. Therefore, another step is used, either chemically [3] or physically, to increase the silanol on Si and SixNy. Chemical methods use liquid chemicals with strong oxidation or strong acidic properties. This leads to the corrosion or total damage of metal patterns on the biosensors, which is essential to output signal.

In this paper, we present the physical method, treatment with oxygen plasma, which does no such harm. The Si and SixNy samples were treated with oxygen plasma in ICP (inductive-coupled plasma) system to increase the density of silanol groups without altering the mechanical properties of the thin film. We investigated the effects of plasma parameters including oxygen flow, treatment time and plasma power to find an optimized recipe.

2. Experiment

The following protocol was used to modify the Si and SixNy samples:

Figure 1: Cleaning process to remove inorganic and organic contaminants on samples’ surface

2.1. Cleaning process

Si and SixNy with dimension 5x5 mm2 were cleaned as below:

Figure 1: Cleaning process to remove inorganic and organic contaminants on samples’ surface

2.2. Oxygen plasma treatment

Soak in acetone

Soak in ethanol

Rinse with DI water

Soak in piranha solution (5 mins)

Rinse with DI water

Dry under a stream of N2 gas

76


After cleaned, the samples were treated in oxygen plasma. The treatment was performed in the system ICP-200iPB (SAMCO, Japan) at the Laboratory for Nanotechnology, Vietnam National University, Ho Chi Minh city.

Figure 2: ICP-200iPB system at the Laboratory for Nanotechnology.

The treatment created a thin SiO2 film on the Si and silicon oxynitride film on SixNy surface of the samples. This was done when reactive oxygen species substituted nitrogen on the surface, which happened through 4 steps: (i) oxygen injection at the oxide-plasma interface; (ii) transport of the oxygen species through the growing oxide; (iii) transformation (oxidation reaction) at the oxide-nitride interface; (iv) transportation of nitrogen species back to the oxide-plasma interface [4].

After treated in oxygen plasma, the samples were soaked in H2O2 30% solution at 150oC for 15 minutes to form silanol groups on Si and SixNy surfaces. Then the samples were rinsed with deionized water and dried with nitrogen gas.

2.3. Silanization with GOPTS

Figure 3: Depiction of inductive-coupled plasma system.

77


Figure 4: GOPTS molecule

3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPTS) is a useful silanization agent. The molecule contains three silane groups to bond with silanol group on the sample surface, and an epoxy group. The reaction between the silane groups of GOPTS and the silanol groups on the sample surface happens through four stages: (i) hydrolysis of silane groups, (ii) adjacent silane groups bond with each other via hydrogen bond, (iii) condensation, (iv) forming hydrogen bond with silanol groups on sample surface and (v) condensation to form silane layer on the sample surface. The epoxy ring can be opened and engage in reaction with thiol (-SH), amine or hydroxyl-containing ligands, depending on the pH of the environment.

In our study, we used 2% GOPTS (Aldrich) solution in toluene. The samples were soaked overnight at room temperature.

78


Figure 5: Mechanism of silanization [5]

2.4. Protein immobilization

The efficiency of oxygen plasma treatment is proportionate to the density of protein reacting with epoxy group of GOPTS attached to the surface. In our study, we used the protein lens culinaris agglutinin conjugated with fluorescein isothiocyanate (F-LCA, from Vector Laboratory, USA) to react with epoxy groups. The concentration of F-LCA was 2.5μg/mL. The samples were soaked in F-LCA solution in 5 hours at 4oC. After that the samples were washed in PBS to remove F-LCA physically absorbed on sample and then rinsed with DI water and dried with nitrogen gas.

The efficiency of oxygen plasma treatment was evaluated by taking fluorescence imaging with the fluorescence microscope BX41, Olympus.

3. Results and discussion

79


We investigated the following parameters of plasma: treatment time, O2 flow and plasma power. These parameters affect the density of reactive oxygen species created by plasma and their lifetime.

3.1. Effect of treatment time

In this investigation, the inductive-coupling of plasma power was set at 300W, the bias power was set at 50W, the oxygen flow was set at 40 sccm and the pressure in process chamber was set at 10 Pa. The treatment time was varied between 20 and 60 minutes.

Table 1: Process parameters for oxygen plasma treatment

The fluorescence images were processed with the software ImageJ to calculate the averaged brightness. We assumed that the brightness of the images was directly proportionate to the fluorescence intensity of F-LCA attached (which was in turn proportionate to the density of epoxy groups and the efficiency of oxygen plasma treatment). Therefore, we considered the averaged brightness of the image as the relative fluorescence unit (RFU) and used it to compare the efficiency of experiments.

Figure 6: Dependence of RFU on plasma treatment time

The graph shows that the longer the treatment happened, the brighter the fluorescence intensity became. The samples treated in less than 30 minutes had negligible fluorescence. Sample treated in 45 minutes gave some fluorescence, and sample treated in 60 minutes gave very strong fluorescence. Perhaps in the first 30 minutes, the oxygen plasma just removed contaminant on the sample and did not start creating oxide. Only after some period longer than 30 minutes then the formation of oxide started to happen and thus more silanol groups were created. This led to the increase of GOPTS number attached to the surface and subsequently more F-LCA immobilized on the surface.

3.2. Effect of oxygen flow

PICP=300w; PBias= 50w

Oxygen flow = 40sccm

Pressure = 10Pa

Treatment time (mins) 20 30 45 60

RFU 0.1 0.3 15.1 75.5

80


In this investigation, the oxygen flow was varied from 20 to 160 sccm. The other parametes were fixed at values stated in Table 2.

The results show that oxygen flow strongly affected the density of silanol group created on samples. Either too high or too low flow had bad effect. The investigation shown that the optimized oxygen flow was about 40 sccm. At the regime of low oxygen flow, there might be not enough oxygen flowing into the chamber and received energy from plasma to become excited and react with sample surface.

Table 2: Process parameters for oxygen plasma treatment

At the regime of too high oxygen flow, there might be too much oxygen flowing into the chamber, and the plasma was not able to make all of them reactive. There might be two kinds of oxygen in the chamber: reactive oxygen (which received energy from plasma, this species was at excited level and was chemically active) and normal oxygen (which did not receive energy from plasma, this species was at ground energy level and thus less chemically active). The oxygen species at ground energy level could have collide and take some energy from the excited oxygen, thus there were fewer oxygen excited enough to react with sample surface. Therefore, there would be less silanol group created.

Figure 7: Dependence of RFU on oxygen flow

3.3. Effect of plasma power

Table 3: Parameters for oxygen plasma treatment

PICP= 300w; PBias= 50w

Treatment time: 60 minutes

Pressure= 10Pa

Oxygen flow (sccm) 20 40 80 120 160

RFU 2.8 75.5 16.5 4.4 3.7

81


In this investigation the ICP power was set at various value, while other parameters were fixed. The results shows that at 300 W of ICP power the efficiency of plasma treatment is the greatest. We haven’t been able to understand this kind of behavior yet and more tests will be conducted in the future about this parameter.

Figure 8: Dependence of RFU on ICP power

3.4. Optimized recipe and application

The following table lists the optimized recipe for oxygen plasma treatment in the conditions of our

experiments:

Table 4: Optimized parameters for oxygen plasma treatment

ICP power 300 (W)

Bias power 50 (W)

Oxygen flow 40 (sccm)

Pressure 10 (Pa)

Treatment time 60 (minutes)

PBias= 50w; Pressure = 10Pa

Oxygen flow = 40sccm

Treatment time: 60 minutes

ICP Power (W) 200 300 400

RFU 2.6 75.5 16.0

82


(a)

(b)

Figure 8: Fluorescence image of samples (a) without oxygen treatment and (b) with oxygen treatment

The green color from the sample treated with oxygen plasma under fluorescence microscope proved that F-LCA was immobilized and hence the sample was efficiently modified with GOPTS. We can conclude that the treatment helped increase significantly the density of silanol groups on the surface, thus increased the density of GOPTS attached and finally the density of F-LCA immobilized. This optimized recipe can be used in immunosensor, in which F-LCA can be replaced with other antibody to detect antigen. The optimized recipe can help increase the sensitivity of the immunosensor, because the higher the density of antibody on the sensor is, the more antigens the sensor can capture.

Acknowledgments

The authors highly appreciate the financial support of Vietnam National University - Ho Chi Minh City. This work was funded by Vietnam National University - Ho Chi Minh City through the scientific project 2014 with the code of C2014-32-01.

References

[1] Nardim M and Kirt W 2003 An Introduction to Microelectromechanical Systems Engineering (London: Artech House)

[2] Williams R A and Blanch H W 1994 Covalent immobilization of protein monolayers for biosensor application Biosensors & BioeIectronics 9 159

[3] Lee S H, Lee C S, Shin D S, Kim B G, Lee Y S and Kim Y K 2004 Microprotein patterning using a lift-off process with fluorocarbon thin film Sensors and Actuators B 99 623

[4] Buiu O, Kennedy G P, Gartner M and Taylor S 1998 Structural Analysis of Silicon Dioxide and Silicon Oxynitride Films Produced using an Oxygen Plasma IEEE Transactions on Plasma Science 26 1700

[5] Greg T H 2013 Bioconjugate Techniques 3rd edition chapter 13 (London, Academic Press) p 536

nguyỄn trung thÀnh nghiÊn cỨu phƯƠng phÁp biẾn...

Documents