PHẦN 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thế giới vi sinh vật, bên cạnh vi khuẩn, nấm mốc thì nấm men

chiếm một tỉ lệ rất lớn, bao gồm cả những chủng có lợi và có hại. Đặc biệt

một số chủng nấm men có khả năng lên men một số loại thực phẩm, có thể sử

dụng để sản xuất các thực phẩm truyền thống.

Việc sử dụng nấm men với mục đích phục vụ cho con người đã được

nhà bác học người Pháp Louis Pasteur và nhà bác học người Đan Mạch E.C

Hansen tiên phong nghiên cứu từ giữa những năm 1800 và cũng từ thời điểm

này, những công trình nghiên cứu về tính đa dạng của những sản phẩm thực

phẩm được sản xuất hoặc có tác động của nấm men đã cho thấy được vai trò

to lớn của nó.

Ban đầu, để sản xuất cồn từ tinh bột, ở Châu Á, người ta thường dùng

các loại bánh men truyền thống; ở Châu Âu và Châu Mỹ, người ta dùng chế

phẩm enzyme thu nhận được từ malt để đường hóa. Theo thời gian, công nghệ

sản xuất cồn rượu ngày càng được hoàn thiện. Từ bánh men thuốc bắc, thuốc

nam của người Châu Á, các nhà khoa học đã phân lập được các giống vi sinh

vật thuần khiết có khả năng đường hóa cao và ứng dụng thành công trong

công nghiệp như: nấm Rhizopus và Mucor (trong phương pháp amylose) hay

loài nấm sợi Aspergillus trong phương pháp mycomalt. Ngày nay, thay vì

công đoạn nuôi cấy mốc, người ta sử dụng trực tiếp chế phẩm enzyme công

nghiệp trong công đoạn đường hóa, làm tăng hiệu suất đường hóa cũng như

hiệu suất lên men rất nhiều.

Các phương pháp sản xuất rượu theo quy mô công nghiệp có một

nhược điểm là yêu cầu điểu kiện vô trùng nghiêm ngặt. Trong khi đó, việc sản

xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống bằng chế phẩm bánh men rượu

không đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về vi sinh, lại thu được rượu có hương vị

thơm ngon. Do đó, những nghiên cứu gần đây có xu hướng quay lại công

nghệ lên men rượu truyền thống. Hầu hết các nghiên cứu đều nhằm nâng cao

và ổn định hiệu suất của lên men truyền thống: nghiên cứu phân lập, ứng

dụng những chủng giống đặc biệt vào lên men rượu truyền thống ở Nhật Bản,

Philipines, Trung Quốc… Trong nước, hiện đã có nhiều nghiên cứu về những

đặc tính của những chủng giống nấm men, nấm mốc phân lập từ bánh men

rượu; nghiên cứu ứng dụng loại bánh men có bổ sung hỗn hợp nấm men và

nấm mốc trong lên men rượu gạo có kiểm soát: nghiên cứu ảnh hưởng của các

vị thuốc lên hệ vi sinh vật trong bánh men...[16]

Do đó cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng nấm

men phân lập từ các nguồn tự nhiên để tìm cách tối ưu hóa, ứng dụng vào

việc sản xuất bánh men rượu là rất cần thiết. Xuất phát từ những yêu cầu đó,

chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân

lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu”.

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm men

2.1.1. Định nghĩa, hình thái và cấu tạo của nấm men

2.1.1.1. Định nghĩa [3], [12], [17]

Nấm men (Yeast, levure) là loại nấm đơn bào sinh sản bằng hình thức

nẩy chồi hoặc phân đôi tế bào, có cấu tạo khá hoàn chỉnh gần giống tế bào cơ

thể bậc cao. Chúng cư trú ở nhiều nơi, đặc biệt là trên lá, hoa quả và trong đất,

nước, trên lương thực, thực phẩm có hàm lượng đường cao.

Nấm men là vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon

và đường khác nhau. Loài nấm men Saccharomyces cerevisae có khả năng

hấp thụ rất nhiều loại đường như: glucoza, fructoza, mannoza, galactoza,

sacaroza, maltoza, maltotrioza và một phần rafinoza. Ngoài ra 2 loài có ích

nhất là: Saccharomyces cerevisae và Saccharomyces uvarum (carlsbergensis)

có khả năng sử dụng các dextrin và melibioza tương ứng. Tuy nhiên, loài

Saccharomyces và các loài có quan hệ gần gũi với nó không có khả năng

chuyển hóa tất cả các loại đường như pentoza (riboza, xyloza, và arabinoza),

xenlobioza (sản phẩm thủy phân của hemixenluloza, xenluloza), lactoza,

insulin và xenluloza [2], [10].

2.1.1.2. Hình thái của tế bào nấm men [3], [11], [12]

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tùy loài nấm

men mà tế bào có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan,

hình elip... và thường không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi, loài và điều kiện

nuôi cấy. So với các vi sinh vật khác tế bào nấm men có kích thước tương đối

lớn: đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm.Và kích thước này thay đổi tùy

theo loài, lứa tuổi, và điều kiện nuôi cấy.

2.1.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men [4], [11]

Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp gần giống như tế bào thực

vật. Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân,

không bào và các hạt dự trữ.

Thành tế bào được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất

glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin. Glucan là hợp chất

cao phân tử của D- Glucozamin, mannan là hợp chất cao phân tử của D -

Mannoza. Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu

và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra. Màng tế bào có chiều

dày không quá 1nm và dính chặt vào tế bào chất. Tế bào chất có cấu trúc không

đồng nhất và ở thể keo. Độ nhớt của tế bào chất cao hơn của nước 800 lần.

Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là

chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân của tế bào nấm men ngoài ADN còn

có protein và nhiều loại men.

Ty thể là cơ quan năng lượng của tế bào. Ty thể nấm men có hình bầu

dục, được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng

lược hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên.

Cấu trúc của 2 lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất.

Trên bề mặt của màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu. Các hạt này

có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể. Trong ty

thể còn có các thành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như riboxom,

các loại ARN và các loại enzym cần thiết cho sự tổng hợp protein.

Riboxom của tế bào nấm men có 2 loại: loại 80S ( gồm 2 tiểu thể 60S

và 40S) nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với tế bào chất; loại 70S( gồm

2 tiểu thể 40S và 30S). Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và

các hạt dự trữ như hạt volutin, hạt glycogen và hạt lipit.

2.1.2. Các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào nấm men

2.1.2.1. Dinh dưỡng nấm men [4], [12].

Chất dinh dưỡng được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi

trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào ở trạng thái môi trường nghèo hoặc cạn

các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregaloza,

lipit, các hợp chất chứa nitơ sẽ được sử dụng: dinh dưỡng nội bào.

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng hoặc là đi vào thành phần tế bào

để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời

sống của tế bào.

* Dinh dưỡng cacbon

Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các

rượu, axit hữu cơ, axit amin... có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm

men. Hầu hết các loại nấm men đều không có enzym polyhdrolaza trong đó

có amylaza và xenlulaza. Vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh

bột cũng như xenluloza và hemixenluloza.

Hầu hết các loài nấm men đều sử dụng được đường glucoza. Tỷ số các

đường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài. Các loài

sacharomyces lên men rượu vang sử dụng glucoza, fructoza, maltoza,

saccaroza, galactoza, với rafinoza chỉ sử dụng được một phần, còn lactoza,

melibioza, dextrin, pentoza và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.

Các axit hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm

men. Chúng có khả năng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men.

Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất. Các

axit béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng chủng loài

nấm men, vào nồng độ axit, vào chiều dài của mạch cacbon trong phân tử axit

và mức độ điện ly.

* Dinh dưỡng Nitơ [4], [12]

Nguồn N cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitơ có thể là các hợp

chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chứa

nitơ của tế bào là các axit amin, các nucleotit burin, pyrimidin, protein và một

số vitamin.

Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat. Nguồn nitơ vô cơ được

nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ. Đó

là amoni sunphat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat.

Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, các peptit, các

nucleotic... Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy

phân protein tự nhiên ( đậu tương, khô lạc...) làm nguồn nitơ hữu cơ.

Nấm men tiêu hóa rất tốt các axit amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn

không sử dụng được protein. Nấm men chỉ sử dụng được các axit amin ở

dạng tự nhiên (L - axit amin). Trong quá trình nuôi cấy nấm men các axit

amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng.

* Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ khác [4], [12]

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm

men thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh...

+ Phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào như các

nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit...các hợp chất phospho

đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong

trao đổi chất hydratcacbon và vận chuyển năng lượng. Trong điều kiện kỵ khí

nấm men tiêu hóa phospho chủ yếu ở giai đoạn đầu, có thể dùng tới 80 - 90%

tổng nhu cầu nguyên tố này.

+ Lưu huỳnh: là thành phần của một số axit amin trong phân tử protein

và là nhóm phụ (- SH) của một số enzym. Trong môi trường với hàm lượng

nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men nhưng ở nồng độ 1mg/l thì lưu huỳnh

đã kìm hãm quá trình này.

+ Các ion kali, canxi cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên

men. Thông thường ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc

sunfat, còn Ca2+ và Mg2+ thường có đủ trong nước sinh hoạt.

+ Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết để quá trình sinh lý trong tế

bào nấm men được xảy ra bình thường.

+ Các nguyên tố vi lượng là mangan, đồng, sắt, kẽm, molipden, bo, liti,

rubidi, coban... Các nguyên tố này chỉ cần một lượng rất nhỏ.

2.1.2.2. Quá trình trao đổi chất cuả nấm men [12]

Dị hóa và đồng hóa ở tế bào nấm men

* Sự dị hóa

Sự dị hóa là quá trình phân giải các hợp chất dinh dưỡng có phân tử

lớn để có thể qua màng làm nội bào, sau đó tiếp tục phân giải các chất hữu cơ

có phân tử nhỏ thành các hợp chất trung gian và thu nhận năng lượng. Nấm

men phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ (kể cả sản phẩm trung gian) thành

sản phẩm cuối CO2 và H2O và phần lớn năng lượng ở dạng ATP. Phần lớn các

sản phẩm của quá trình dị hóa là vật liệu tế bào dùng cho sinh tổng hợp các

hợp chất cấu trúc tế bào mới, còn một số sản phẩm tế bào không sử dụng thải

ra ngoài môi trường như: rượu etylic, CO2, glycerin...

Các cơ chất dinh dưỡng của nấm men thường dùng là các loại đường

như: các monosaccharit (glucoza, fructoza, galactoza...), các disaccharit

( lactoza, maltoza, sacchroza...) các trisaccharit (xenlobioza...)

* Sự đồng hóa

Đồng hóa là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dị

hóa tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinh

tổng hợp ra các cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccharit,

protein, axit nucleic, lipit... tạo ra các tế bào mới từ các tiền chất đơn giản

(axit amin, các bazơ purin và pyrimidin, axit hữu cơ).

Các quá trình đồng hóa và dị hóa thường xảy ra ở các vùng khác nhau

trong tế bào, song chúng lại xảy ra đồng thời do các enzym đặc hiệu. Các quá

trình lên men và hô hấp hoặc là phản ứng hiếu khí hay kị khí đóng vai trò cơ

bản trong trao đổi chất của tế bào nấm men. Các phản ứng trao đổi chất trong

tế bào nhờ chất xúc tác sinh học là các enzym. Trong tế bào vi sinh vật có

hàng ngàn enzym được chuyển hóa xúc tác những phản ứng đặc trưng. Những

enzym và hệ enzym khác nhau được khu trú trong các cơ quan của tế bào

hoặc đơn giản là chúng được hòa tan trong tế bào chất. Các enzym invertaza,

permeaza đảm nhận việc đồng hóa các loại đường và vận chuyển các chất qua

màng tế bào.

Trao đổi năng lượng

Nấm men cần nguồn năng lượng trong quá trình phân giải (hay oxy hóa

hoặc đốt cháy) các hợp chất dinh dưỡng từ ngoài vào tế bào. Nguồn cung cấp

năng lượng chủ yếu cho nấm men là gluxit, thực chất là một số loại đường

đơn và đường đôi. Các loại đường trước hết được biến thành glucoza và

fructoza. Hai loại đường bị biến đổi qua một số phản ứng tới axit pyruvic và

giải phóng ra hợp chất năng lượng giàu ATP. Tiếp theo giai đoạn đường phân

là sự phân giải triệt để các hợp chất trung gian thành sản phẩm cuối cùng là

CO2 và H2O.

Hô hấp

Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy tiện. Chúng có thể sống ở điều kiện

hiếu khí cũng như kỵ khí. Chính vì vậy chúng có 2 kiểu hô hấp khác nhau, tùy

thuộc vào lượng oxy cung cấp cho quá trình trao đổi chất.

Hô hấp hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H20 + 674 cal

Hô hấp kỵ khí:

C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal

2.1.2.3. Sinh trưởng của nấm men [12]

Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh

dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết trong môi

trường giảm tới mức thấp nhất. Khi đó sinh trưởng phát triển của chậm dần và

ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự phân tăng

sinh khối không đáng kể. Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không bổ

sung và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trong

không gian sống có giới hạn.

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó

có nấm men được chia làm 4 pha:

- Pha lag (pha tiềm phát hay pha làm quen):

Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh

sản. Vận tốc sinh trưởng xem như bằng không. Đây là pha tiềm phát, nấm

men còn thích nghi với môi trường mới, trong đó một tế bào bị ức chế, thậm

chí có thể chết. Số lượng tế bào nấm men lúc này là không tăng hoặc tăng

không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng xảy ra mạnh mẽ. Tế bào có

kích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất đều tăng lên. Trong môi

trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng non, khỏe thì

pha lag càng ngắn.

- Pha logarit (pha phát triển chỉ số hay pha phát triển theo cấp số nhân).

Trong pha này nấm men sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhân

với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh

lý sinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy cảm với các nhân tố không thuận

lợi hơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định.

Trong pha chỉ số tế bào phát triển ồ ạt, trong khi đó các chất dinh

dưỡng trong môi trường không phải là vô tận mà ngược lại ngày một giảm đi,

hơn nữa trong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chất

không cần thiết đối với giống nuôi cấy. Như vậy trong quá trình chất dinh

dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận

lợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định.

- Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật thể quần

thể là tối đa.

- Pha suy vong: Trong pha này tế bào sống giảm dần và tế bào chất

tăng dần, một số tế bào chất bị tự phân do các enzym proteaza nội bào. Các tế

bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện

dạng hạt. Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt

chất béo nhỏ.

2.1.2.4. Sinh sản của nấm men [3], [4], [12], [13]

Nấm men có 3 hình thức sinh sản: sinh dưỡng (bằng nảy chồi hoặc

phân cắt tế bào), hữu tính ( bằng bào tử) và vô tính (bằng bào tử). Tùy thuộc

vào điều kiện nuôi cấy tế bào nấm men sẽ sinh sản theo cách sinh sản vô tính

hay cách sinh sản hữu tính.

* Sinh sản sinh dưỡng

Là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men. Có 2 hình thức sinh

sản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức phân đôi tế bào. Ở hình thức nảy chồi,

từ một cực của tế bào mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thành

vách ngăn ngang giữa 2 tế bào. Tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc có

thể dính với tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống như

hình dạng cây xương rồng tai nhỏ.

* Sinh sản vô tính: bằng 2 hình thức bào tử túi và bào tử bắn.

Bào tử túi là những bào tử đã được hình thành trong một túi nhỏ gọi là

nang. Trong nang thường chứa từ 1 đến 8 bào tử, đôi khi đến 12 bào tử.

Bào tử bắn là những bào tử sau khi hình thành nhờ năng lượng của tế

bào bắn mạnh về phía đối diện. Đó là một hình thức phát tán của tế bào.

* Sinh sản hữu tính: do 2 tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành

hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử

được phát tán ra ngoài. Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thước giống

nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm

men khác nhau thì được gọi là tiếp hợp dị giao.

2.1.3. Một số ứng dụng của nấm men

2.1.3.1. Vai trò và ứng dụng của nấm men trong công nghiệp thực phẩm

[12], [13], [17]

Các sản phẩm từ nấm men khi nuôi cấy hiếu khí ta thu được một lượng

lớn sinh khối và sản phẩm chủ yếu là sinh khối của nấm men được dùng làm

men bánh mỳ, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cân đối protein và vitamin

trong khẩu phần dinh dưỡng, khi nuôi cấy kị khí ta thu được là rượu etylic là

sản phẩm chủ yếu, ngoài ra còn có một loạt sản phẩm phụ, trong đó CO2 là

sản phẩm kinh tế, còn lại là các hợp chất có mùi vị hương thơm hoặc làm cải

thiện hoặc làm giảm chất lượng cho rượu thành phẩm.

Nấm men là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, nó

tham gia vào các quá trình chuyển hóa vật chất, phân hủy chất hữu cơ trong

đất. Hoạt tính sinh lý của nhiều loại nấm men được ứng dụng trong công

nghiệp thực phẩm, nông nghiệp và các ngành khác. Đặc biệt trong quá trình

sản xuất các lọai rượu, cồn, nước giải khát lên men, làm thức ăn gia súc; trong

y học như sản xuất chất kháng sinh penixilin, trong việc tổng hợp các loại axit

hữu cơ, các loại enzym, các nhân tố sinh trưởng, trong công nghệ enzym nấm

men là nhân tố tích cực nhất.

Ngoài hoạt tính sinh lý, bản thân tế bào nấm men có rất nhiều loại

vitamin và các axit amin, đặc biệt là các axit amin không thay thế. Đặc tính

này được dùng để chế tạo thức ăn gia súc từ nấm men.

2.1.3.2. Ứng dụng của nấm men trong sản xuất rượu [12], [14]

Bản chất của quá trình lên men

Về bản chất, lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được thực hiện

do hoạt động sống của vi sinh vật dưới xúc tác của enzym nhằm cung cấp

năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng.

Cũng như quá trình oxy hóa khử sinh học ở mọi cơ thể khác, các mạch

phản ứng của sự đường phân, chu trình Krebs, chu trình pentosophosphat là

những phanr ứng hóa sinh cơ bản nhất của quá trình lên men ở tế bào vi sinh

vật. Khác với cả quá trình hô hấp, trong quá trình lên men, hydro (gồm e- và

H+) tách khỏi cơ chất được chuyển tới chất nhận cuối cùng là các chất hữu cơ

khác nhau tạo thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường. Đó là các sản

phẩm mà người ta nhận được trong sản xuất lên men.

Năng lượng giải phóng ra từ sự phân giải các hợp chất hữu cơ trong

quá trình sản xuất lên men tuy không nhiều, song do chính là nguồn cung cấp

năng lượng đáp ứng nhu cầu về năng lượng cần cho hoạt động sống của vi

sinh vật trong các quá trình lên men tương ứng.

*Điều kiện của quá trình lên men

Thành phần của môi trường

- Glucid : Glucid là nguồn dinh dưỡng quan trọng của vi sinh vật, đóng

vai trò chủ chốt trong sự tạo năng lượng cho tế bào vi sinh vật. Ngoài ra nó

còn là nguồn cung cấp vật liệu tạo nên các thành viên của tế bào. Trong môi

trường lên men, glucid thường được sử dụng dưới dạng chiết có đường, mật rỉ

hoặc các nguyên liệu và bã thải chứa đường, tinh bột. Các vật liệu chứa tinh

bột thường cũng được thủy phân thành đường trước khi lên men.

- Phosphat vô cơ :

Phosphat vô cơ đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng.

Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphat

amon, phosphat kali.

- Nitơ :

Nitơ tham gia quá trình tạo protein và nhiều chất có đặc tính sinh học

khác của tế bào vi sinh vật. Trong môi trường lên men, nitơ thường được sử

dụng dưới dạng muối nitrat và các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn

gốc vi sinh vật.

- Vitamin và nguyên tố vi lượng :

Vitamin là nguyên tố vi lượng là các chất sinh trưởng cần thiết cho hoạt

động sống của vi sinh vật. Chúng thường được sử dụng với lượng rất ít nhưng tác

dụng của chúng rất lớn và đa dạng đối với sự sống bình thường của vi sinh vật.

Tác nhân gây lên men

Điển hình của tác nhân gây lên men là nấm men. Trong số các giống

nấm men, Saccharomyces là giống được sử dụng rộng rãi. Nấm men đặc điểm

là trong môi trường yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành rượu

etylic và CO2 và không có khả năng chuyển hóa tiếp etanol tạo thành, có

nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu etylic.

Tế bào nấm men còn có đặc điểm là khả năng tạo ra các nội enzym, nghĩa là

những enzym xúc tác ở bên trong tế bào. Như vậy sự phân ly đường sẽ xãy ra

ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành thì đi ra

khỏi tế bào và tích tụ ở trong môi trường.

Các chủng nấm men có ứng dụng nhiều trong công nghiệp bia, rượu,

nước uống thuộc họ Saccharomyceteae bao gồm các giống Pichia,

Saccharomyces, Torulaspora, Debaryomyces, Schizosaccharomyces.

Nguyên liệu và các điều kiện lên men

Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất rượu là tinh bột. Trước khi thực hiện

quá trình lên men, tinh bột cần được thủy phân thành đường. Sự thủy phân có

thể thực hiện nhờ enzym amylaza từ nguồn khác như enzym vi sinh vật hoặc

malt. Trong các nguồn cung cấp enzym này, ngoài amylaza còn chứa các

enzym khác. Vì vậy, cùng với sự thủy phân tinh bột cũng đồng thời xảy ra sự

thủy phân các chất khác chứa trong nguyên liệu lên men như: protein, hợp

chất phospho, chất béo... Nhiều sản phẩm thủy phân của các chất này chất

dinh dưỡng cần thiết cho nấm men và cũng là những chất tạo hương vị cho

sản phẩm cho quá trình lên men rượu, hoa quả, bánh mỳ...

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như nồng độ đường,

độ axit của môi trường, nhiệt độ. Nồng độ đường thích hợp cho đa số nấm

men là 12 - 16%. Khi nồng độ đường quá cao hoặc quá thấp thì hiệu lực lên

men đều bị giảm thấp. Độ axit của môi trường cũng giữ vai trò quan trọng.

Quá trình lên men xảy ra bình thường khi pH = 4 - 4.5. Trong môi trường

kiềm, sự lên men tiến triển theo đường hướng đặc biệt tạo thành sản phẩm

chính là glycerin. Nhiệt độ có ảnh hưởng tới vận tốc lên men. Thường vận tốc

lên men lớn nhất vào khoảng 29 - 320C. Trong thực tế tùy yêu cầu quá trình

lên men tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24 - 280C. Sự tích tụ rượu trong

môi trường có tác dụng độc hại đối với nấm men. Đa số trường hợp sự lên

men đường bị đình chỉ khi nồng độ rượu trong môi trường đạt từ 12 - 14% thể

tích. Khí CO2 ức chế sự lên men, nhưng sự thoát khí CO2 có tác dụng khuấy

động dịch lên men do đó làm tăng tốc độ lên men.

Diễn biến sinh lý quá trình lên men rượu

Đường và các chất dinh dưỡng khác của quá trình lên men trước tiên

được hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua bề mặt

bán thấm vào bên trong tế bào. Trong tế bào, đường bị chuyển hóa qua chuỗi

phản ứng enzym để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là rượu và

CO2. Rượu etylic và CO2 được tạo thành thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tán

vào môi trường xung quanh. Vì rượu hòa tan được với nước theo bất kỳ tỷ lệ

nào nên nó có thể khuyếch tán vào môi trường một cách nhanh chóng và tạo

ra một đậm độ lớn ở xung quanh tế bào nấm men. Khí CO2 cũng hào tan được

trong dịch thể, song độ hòa tan của nó trong nước không lớn lắm. Do vậy mà

môi trường lên men nhanh chóng bão hòa bởi khí CO2. CO2 bám vào tế bào

nấm men thành những cái bột. Khi các bọt đạt đến độ lớn nào đó thì lực nâng

của nó vượt quá trọng lượng của tế bào và cả tế bào bọt được nâng lên nổi

trên bề mặt, bọt vỡ, tế bào nấm men bị chìm xuống. Như vậy tế bào nấm men

vốn dĩ không di động trở thành di động ở trong môi trường lên men khiến cho

sự trao đổi chất trong tế bào trở nên mạnh mẽ hơn sự lên men cũng được tăng

lên một cách tương tự.

Cơ chế sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men rượu

Lên men rượu là phân giải yếm khí đường dưới tác dụng của enzym vi

sinh vật đặc hiệu. Trong sự lên men rượu, axit pyruvic được tạo thành và bị

decacboxyl hóa tạo thành acetaldehyl và CO2 nhờ sự xúc tác của pyruvat

decacboxylaza. CH3 - C - COOH CH3CHO +CO2 (1) Pyruvat decacbonxylaza O Axit pyruvic Acetaldehyd

Sau đó, acetaldehyde bị khử thành rượu etylic dưới tác dụng xúc tác

của ancoldehydrogenaza của nấm men.

CH3CHO + NADH+ + H+ CH3CH2OH +NAD+ (2) Acoldehydrogenaza

Ở đây NADH2 tạo thành trong phản ứng oxy hóa glyceradehyd 3P của

quá trình đường phân đóng vai trò chất cho hydro, còn acetaldehyd là chất

nhận. Trong điều kiện thoáng khí quá trình lên men bị ức chế, khi đó hydro

tách ra được chuyển qua chuỗi hô hấp tới oxy và axit pyruvic, sản phẩm của

quá trình đường phân sẽ tiếp tục bị oxy hóa qua nhiều bước trong chu trình

Krebs. Các cặp hydro tách ra được chuyển tới oxy. Quá trình này liên hợp với

quá trình tạo ATP.

Sự lên men rượu trong điều kiện bình thường: Xảy ra khi pH = 4 –

5 và có thể chia làm hai thời kỳ:

Thời kỳ cảm ứng

Trong thời kỳ nay lượng acetaldehyd tạo thành theo phản ứng (1) còn ít,

khi đó hydro được chuyển từ NADH2 tới glyceradehyd 3P tạo thành glycerin

3P. Chất này bị khử gốc P nhờ enzyme photphataza tạo thành glycerin CH2OP NADH2 NAD CH2OP CH2OH

C6H12O6… CHO CHOH CHOH P CHO CH2OH CH2OH Glyceradehyd 3P glycerin 3P glycerin

Vậy glycerin là sản phẩm phụ của lên men rượu trong môi trường axit.

Thời kỳ tĩnh

Khi lượng acetadehyd đã đạt tới mức nào đó thì chất tiếp tục nhận

hydro từ để chuyển thành rượu etylic theo phản ứng (2).

C6H12O6 CH3CHO + NADH2 + CH3CH2OH + NADH+

Sự ức chế lên men rượu khi có mặt oxy

Sự lên men rượu xảy ra mạnh mẽ trong điều kiện yếm khí, hiệu suất

dự trữ năng lượng cho tế bào vi sinh vật trong trường hợp này rất thấp. Do

vậy để duy trì sự sống vi sinh vật phải sử dụng một lượng lớn glucoza nhờ

quá trình lên men.

Khi có oxy, quá trình lên men bị ức chế và chuyển sang cơ chế hô hấp.

Sự ức chế lên men khi có mặt oxy gọi là hiệu ứng Pasteur. Trong quá trình

này ATP được tổng hợp mạnh mẽ nhờ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa liên

hợp với quá trình vận chuyển proton và electron qua dãy hô hấp tới oxy. Kết

quả là trạng thái tích lũy năng lượng glucoza không nhiều cũng đủ duy trì sự

sống và phát triển của chúng. Bởi vậy khi có hiệu ứng Pasteur thì không

những tạo thành etanol và CO2 giảm mà cả tiêu thụ đường cũng giảm.

2.2. Tổng quan về bánh men

Ở các nước Châu Á, theo truyền thống người ta hay dùng các loại bánh

men để sản xuất rượu, cồn từ tinh bột. Lúc đầu, bánh men cũng được tạo ra từ

những mẻ ủ tốt nhất bằng cách tạo hình, đem sấy khô, rồi bảo quản để dùng

dần. Bằng cách này, người ta hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất và

đảm bảo cả chất lượng sản phẩm. Từ đó phương pháp sản xuất bánh men phát

triển khá hoàn thiện và tạo ra được nhiều loại bánh men khác nhau, tùy từng

dân tộc và thị hiếu người tiêu dùng. Các loại bánh men đươc sản xuất theo

phương pháp truyền thống về nguyên tắc là giống nhau. Nhưng tùy theo đặc

điểm khí hậu, nguyên liệu và sở thích từng địa phương mà người ta bổ sung

vào nấm men một số thành phần khác.

2.2.1. Bánh men thường

Thành phần chính là bột gạo sống và giống vi sinh vật. Một trong

những cách làm bánh men thường được thực hiện như sau:

Gạo ngâm nước (3h) để ráo xay thành bột nhào với men

giống + nước định hình bánh men ủ men ở 29 - 30 0C,

trong 48h sấy khô ở 400C hay phơi nắng bánh men thành phẩm.

2.2.2. Bánh men rượu lá

Bánh men lá thường được người dân tộc thiểu số sản xuất và tiêu thụ.

Đồng bào thiểu dân tộc thiểu số sử dụng bánh men lá để sản xuất rượu cần. Ở

đây thay cho các vị thuốc bắc là các loại lá khác nhau. Chất lượng rượu phụ

thuộc rất lớn vào số lượng và thành phần các loại lá. Bánh men lá có 3 loại:

loại một lá, loại hai lá, loại ba lá.

2.2.3. Bánh men thuốc bắc

Ngoài thành phần bột gạo, vi sinh vật còn có các vị thuốc bắc. Trong

bánh men thuốc bắc ở Mai Đông - Vân Hà (Hà Bắc) có 10 đến vị thuốc bắc

như bạch truật, nhục đậy khấu, nhục quấy .

Việc cho thuốc bắc vào có thể là để kích thích sinh trưởng cho hệ vi

sinh vật trong bánh men, để sát trùng hoặc có thể tạo mùi thơm đặc trưng của

sản phẩm.

2.3. Quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống Giới thiệu bánh men và quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp

truyền thống [16].Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam.

Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có một phương pháp sản xuất riêng. Trong chế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn, nấm men và nấm mốc (nấm sợi). Thực chất, men thuốc bắc là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp hệ enzyme đường hóa và lên men rượu.

Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men là: bột gạo, men giống. Quy trình sản xuất theo phương pháp truyền thống như sau:

Quy trình sản xuất bánh men rượu theo phương pháp truyền thống

Nước

Tạo hình

Gạo

Làm sạch

Làm ẩm

Ngâm nước

Để ráo

Trộn men

Xay thành bột

Nghiền mịn

Men mốc giống

Nước

Ủ

Bánh men rượu

Hong khô

Thuyết minh quy trình:

Nguyên liệu làm bánh men: Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu

truyền thống là bột gạo ẩm trộn lẫn với bánh men giống giả nhỏ.

Làm bánh men

Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với men giống đã được

nghiền nhuyễn theo tỉ lệ nhất định. Sau đó định hình thành dạng viên, đặt vào

các khay có lót trấu và ủ trong thời gian thích hợp để hệ vi sinh vật trong bánh

men phát triển và nở xốp. Khi bánh men nở xốp, nấm mốc mọc đều và có mùi

rượu thì tiến hành hong khô. Bánh men thành phẩm được bảo quản để sử

dụng dần.

Lưu ý có hỗn hợp bột trước khi tạo hình nên có độ ẩm vừa phải, không

khô quá cũng không nhão quá, thích hợp nhất là khoảng 50 - 55%. Nhiệt độ ủ

khoảng 30 - 350C là tốt, nhiệt độ hong không quá 350C.

Việc sản xuất bánh men theo phương pháp cổ truyền có những ưu và

nhược điểm nhất định. Ưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần khiết,

không đòi hỏi kỹ thuật cao và không cần nhiều vốn đầu tư. Tuy nhiên chất

lượng bánh men kém vì có nhiều tạp khuẩn dẫn đến chất lượng bánh men

cũng không ổn định và hiệu suất lên men không cao.

Ngày nay cùng với những tiến bộ trong phân lập, nhân giống, kỹ thuật

sản xuất bánh men rượu có thay đổi : thay vì sử dụng bánh men gốc để sản xuất

bánh men, người ta dùng trực tiếp chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất

bánh men, hoặc vẫn dùng bánh men gốc nhưng bổ sung thêm những giống

thuần khiết, có hoạt lực cao để tăng chất lượng của bánh men thành phẩm.

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Nấm men được phân lập từ các nguồn : dứa, nho có trong tự nhiên.

- Gạo tẻ được mua tại các chợ ở thành phố Huế.

- Nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng từ Nhật Bản.

Môi trường nuôi cấy

Các môi trường và thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu

(phụ lục):

- Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm men: môi

trường Hansen. (MT1)

- Môi trường nhân giống nấm men: môi trường Hansen – Cao nấm

men. (MT2)

- Nghiên cứu khả năng lên men của các loại đường: môi trường nước

chiết giá đậu có bổ sung 2% các loại đường. (MT3)

- Môi trường nghiên cứu khả năng lên men: môi trường Hansen bổ

sung 20% glucose. (MT4)

3.2. Nội dung nghiên cứu [1], [6], [7], [9]

- Phân lập các chủng nấm men thuần chủng từ các nguồn nho và dứa.

- Xác định được một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm men

phân lập được:

+ Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và của tế bào nấm men.

+ Khả năng lên men của một số loại đường: glucoza, sacchroza,

maltoza, lactoza của nấm men.

+ Khảo sát khả năng lên men rượu của các chủng nấm men phân lập được.

+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của các

chủng nấm men như: thời gian, nhiệt độ.

+ Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men.

- Phương pháp sản xuất bánh men rượu.

+ Sản xuất bánh men rượu từ chủng nấm men phân lập được.

+ Ảnh hưởng của độ ẩm đến chất lượng bánh men và khả năng lên

men rượu của bánh men.

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Nấm men

3.3.1.1. Phân lập nấm men [6[, [7]

Chuẩn bị một dãy ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã được

khử trùng. Đồng nhất và lấy 1g mẫu cho vào ống nghiệm, tiến hành pha loãng

thành các nồng độ liên tiếp. Lấy 1ml dung dịch ở một độ pha loãng được chọn

cho vào hộp peptri đã được khử trùng, đổ môi trường Hansen đã được khử

trùng và làm nguội đến 50oC vào, xoay nhẹ và đều tay hộp peptri để môi

trường phân bố đều trong đĩa. Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 35oC ± 2oC. Sau 24 -

36h lấy ra quan sát khuẩn lạc.

Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, dùng que cấy phân lập tiếp trên môi

trường đặc. Tiếp tục phân lập đến khi nào được các khuẩn lạc thuần chủng.

3.3.1.2. Cấy chuyền và giữ giống [2], [8]

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ống

nghiệm chứa dung dịch Hansen. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 35oC ± 2oC. Sau

24h lấy que cấy nhúng vào dịch rồi cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trường

Hansen. Nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ

cấy vào ống thạch nghiêng. Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở

3 - 4oC trong vòng 1 tháng.

3.3.1.3. Nhân giống [9]

Môi trường nhân giống là môi trường lỏng được chuẩn bị và thanh

trùng trong ống nghiệm và bình tam giác. Chủng nấm men được lấy trong ống

giống. Sau 24h phát triển thì cấy tiếp sang bình tam giác (tỉ lệ 1% về thể tích).

Tùy thuộc quy mô phòng thí nghiệm mà các cấp nhân giống thích hợp.

3.3.1.4. Nhuộm, soi tế bào nấm men [1], [2], [6].

Nguyên tắc: vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp

phụ. Trong đa số trường hợp thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật rất bền

vững khó bị phá hủy hoặc bị nước làm phai đi.

Cách tiến hành: cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc

nhuộm lên phiến kính, trộn đều, đậy lá kính lại để yên 2 - 3 phút rồi đem quan sát.

3.3.1.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập được

Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo

thời gian nuôi cấy

Theo một số tài liệu thì đa số nấm men phát triển bình thường trong

khoảng nhiệt độ 280C - 320C [6], [12]. Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ là 300C

để khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo thời gian là

12h, 24h, 36h, 48h và 72h.

Nấm men được lấy từ ống giống sau khi đã nhân giống được bổ sung

vào các ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng.Tiến hành nuôi cấy ở nhiệ

độ 300C theo các khoảng thời gian trên. Định kỳ lấy ra và đo mật độ tế bào

bước sóng 620nm.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của

các chủng nấm men

Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng phát triển của

các chủng nấm men phân lập được, chúng tôi chọn các mốc nhiệt độ 25 0C,

300C, 350C, 400C để khảo sát nhiệt độ tối thích cho từng chủng nấm men.

Nấm men được lấy từ ống giống, sau khi đã nhân giống được bổ sung vào

các ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng. Sau khoảng thời gian tối thích

nhất cho từng chủng nấm men thì lấy ra đo mật độ tế bào ở bước sóng 620nm.

Khảo sát khả năng lên men các nguồn đường của các chủng

nấm men [1]

Môi trường sử dụng để nghiên cứu là môi trường nước chiết giá đậu.

Cách tiến hành:

Phân 10ml môi trường nước chiết giá đậu có chứa từng nguồn đường

khác nhau (chiếm 2%) vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Ống đối chứng

không có một nguồn đường nào. Các ống nghiệm được khử trùng sau đó cấy

vào 0.1ml dịch huyền phù nấm men để ở nhiệt độ là 35oC. Sau 24h lấy ra

quan sát hiện tượng.

Quan sát việc tạo thành CO2 và đẩy ống Durham để biết nấm men có

hay không có khả năng lên men từng nguồn đường.

Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men

phân lập được [1]

Cho môi trường Hansen đã được thay glucoza bằng tinh bột vào các đĩa

peptri, sau đó cấy các chủng nấm men theo phương pháp chấm điểm và nuôi

cấy ở nhiệt độ 35oC trong 24h. Nhuộm màu bằng dung dịch thuốc nhuộm

Lugol. Sau đó quan sát đường kính vùng thủy phân tinh bột xung quanh

khuẩn lạc nấm men. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy thì

chứng tỏ là nấm men có khả năng phân giải tinh bột.

Khảo sát khả năng lên men rượu [5], [6], [9]

Xác định hoạt lực lên men bằng cách xác định lượng CO2 sinh ra trong

quá trình lên men. Phương pháp này dựa trên sự sai khác trọng lượng trước và

sau khi lên men.

Cách tiến hành :

Cho 200ml dung dịch lên men vào bình tam giác dung tích 250ml rồi

bổ sung 3% dịch nấm men thuần chủng đã được phân lập ở trên, đậy kín

miệng bình. Sau khi gieo cấy nấm men rồi, nút chặt bằng ống cao su có ống

hồi lưu, có kẹp giấy ở đầu ống hồi lưu, cân toàn bộ trên cân kỹ thuật. Nuôi

cấy trong tủ ấm ở 350C và qua từng thời gian nhất định (12h, 24h, 36h, 48h).

Trong quá trình lên men, CO2 thoát ra cho phản ứng với Ba(OH)2. Thông ống,

dẫn khí từ bình lên men vào trong bình chứa Ba(OH)2 10%. Sau một thời gian

ta sẽ thấy có kết tủa trắng. Điều đó chứng tỏ rằng có CO2 trong dịch lên men.

Sau đó cân lại để xem xét sự giảm khối lượng, cân toàn bộ bình lại cho đến

lúc trọng lượng không đổi (lên men kết thúc) thường là 2 - 3 ngày.

CO2 + Ba(OH)2 BaCO3 + H2O

Sự sai khác trọng lượng trước và sau khi lên men,từ đó biết được lượng

CO2 bay ra. Chủng nấm men nào có khả năng sinh CO2 lớn nhất thì chủng đó

có khả năng lên men rượu tốt nhất.

Xác định sự có mặt của rượu [6]

Cách thực hiện: cho phản ứng với K2Cr2O7 và H2SO4 đậm đặc.

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lên men, thêm vào 1ml dung dịch H2SO4

đậm đặc và nhỏ thêm từng giọt cho đến khi màu da cam của thuốc thử này

chuyển sang màu xanh lam nhờ tác dụng với rượu theo phương trình:

2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH 4KCr(SO4)2+ 3CH3COOH +11H2O

Da cam Xanh lam

3.3.2. Phương pháp sản xuất bánh men rượu

3.3.2.1. Quá trình nhân giống nấm men, nấm mốc [16]

Sau khi xác định khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập

được, lựa chọn chủng nấm men nào có khả năng lên men tốt nhất đem đi nhân

giống trên môi trường Hansen – Cao nấm men (MT2) ở nhiệt độ 350C, thời gian

nhân giống 24h, tiến hành bổ sung vào quy trình sản xuất bánh men rượu.

Ngoài việc ứng dụng chủng nấm men phân lập ở các nguồn nho và dứa,

chúng tôi còn bổ sung chủng nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng dùng

để sản xuất koji ở Nhật Bản vào quy trình sản xuất bánh men rượu. Chủng

nấm mốc Aspergillus oryzae được nhân giống trong môi trường Czapeck ở

nhiệt độ 350C, thời gian nhân giống 24h, tiến hành bổ sung vào quy trình sản

xuất bánh men rượu.

3.3.2.2. Quy trình sản xuất bánh men rượu [16]

Sau khi phân lập, nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa cũng như khả

năng lên men rượu của các chủng nấm men. Tiến hành lựa chọn chủng thích

hợp để ứng dụng vào quy trình sản xuất bánh men rượu.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tham khảo một số tài liệu và sử dụng

quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống (ở mục 2.3 của phần TQTL)

[16] để tiến hành sản xuất bánh men rượu.

3.3.2.3. Xác định độ ẩm của bột gạo [16]

Gạo được ngâm 2h, để ráo rồi đem nghiền lấy bột khô để nhào bánh.

Cân chính xác 5g bột để xác định độ ẩm theo phương pháp sấy tới khối lượng

không đổi.

Phương pháp xác định hàm lượng nước bằng cách sấy ở nhiệt độ 1050C

đến khối lượng không đổi.

Dụng cụ: Cốc thuỷ tinh đường kính 50mm, cao 30mm, tủ sấy, bình hút

ẩm, cân phân tích

Cách tiến hành:

- Cân 5g bột gạo đã được trộn đều vào cốc thuỷ tinh đã sấy khô và biết

khối lượng. Đem sấy cốc có chứa mẫu ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không

đổi. Lần cân đầu được cân sau khi sấy 40 phút, lần cân tiếp theo sau 20 phút.

Tính kết quả:

Hàm lượng nước được tính bằng % theo công thức

X = ; (%)

Trong đó:

G : khối lượng của bột gạo, tính bằng g

G1 : khối lượng của cốc thuỷ tinh và bột gạo trước khi sấy, tính bằng g

G2 :khối lượng của cốc thủy tinh và bột gạo sau khi sấy, tính bằng g

3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được sẽ tiến hành xử lý bằng phần mềm SAS.

PHẦN 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập các chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng nấm men

trên môi trường Hansen (MT1) từ các nguồn nguyên liệu là nho và dứa. Quá

trình phân lập được thao tác nhiều lần cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện đồng

nhất trên bề mặt thạch đĩa. Kết quả từ các khuẩn lạc mọc được, sơ bộ chúng

tôi chọn được 4 chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau và có ký hiệu là: K2,

Y1, Y2 và Y3.

Kết quả quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc kết hợp với nhuộm và

soi tế bào nấm men bằng kính hiển vi điện tử của 4 chủng được trình bày ở

bảng 4.1:

Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các

chủng nấm men phân lập được

Nguồn

phân lập

Kí hiệu

khuẩn lạcĐặc điểm khuẩn lạc

DứaK2 Có nhân to, màu trắng sữa, viến nhẵn mỏng.

Nho

Y1 Có nhân, màu trắng sữa, có nhân, nhẵn bóng.

Y2Có nhân, màu trắng sữa, viến răng cưa,

hình cầu

Y3Không có nhân, màu trắng sữa,

viến nhẵn bóng.

Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy, đa số các chủng Y1, Y2, Y3, K2 có tế

bào hình cầu hay hình oval. Khuẩn lạc có kích thước lớn (từ 5 - 8 mm), màu

sắc chủ yếu là màu trắng sữa, viền răng cưa (Y2) hoặc viền nhẵn bóng (K2,

Y1, Y3), có nhân (K2, Y1, Y2) hoặc không nhân (Y3).

Nấm men là đối tượng vi sinh vật chiếm tỷ lệ rất lớn trong tự nhiên, đặc

biệt là ở các nguồn nguyên liệu giàu gluxit như các loại hoa quả chín, rau quả

chứa hàm lượng tinh bột cao. Ngoài ra, theo G. Chandrasena và cộng sự

(2006) khi tiến hành phân lập từ các nguồn hoa quả như dứa, nho, cà chua,

cam ... đã thu được rất nhiều chủng nấm men khác nhau như: Saccharomyces

ovifirmis, S. fructuum, S. acidifaciens, S. bayanus.[18].

4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men phân

lập được

4.2.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men

Để khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men, chúng tôi

tiến hành nuôi cấy trên môi trường Hansen lỏng (MT2). Khả năng sinh trưởng

của các chủng được thể hiện bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị

OD ở bước sóng 620nm. Giá trị này được đo 12h một lần trong suốt quá trình

nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.1.

Bảng 4.2. Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men

theo thời gian nuôi cấy

Thời gian

(h)

OD620nm

Y1 Y2 Y3 K2

0 0.260d 0.164f 0.080f 0.158e

12 0.597c 0.869d 0.420e 0.744d

24 0.994a 1.126a 0.723a 1.021a

36 0.905ab 1.060ab 0.641b 0.915ab

48 0.775abc 0.992bc 0.540c 0.867cb

60 0.741bc 0.929cd 0.517cd 0.787cd

72 0.660c 0.550e 0.484d 0.750e

Ghi chú: - Số liệu được trình bày ở các bảng trên là giá trị trung bình với n (n=3).

- Số liệu cùng cột có mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ( = 0.05)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h

Thời gian(h)

OD

62

0n

m Y1

Y2

Y3

K2

Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn khả năng sinh trưởng của các chủng

nấm men theo thời gian nuôi cấy

Từ bảng 4.2 chúng tôi nhận thấy, từ 0 - 12h các chủng nấm men sinh

trưởng chậm, đây là thời kỳ các chủng nấm men sinh tổng hợp các chất như là

protein, axitnucleotit, enzym...và là thời gian chúng với thích nghi môi

trường. Sau 12h tất cả các chủng nấm men đều có sinh khối tăng lên rõ rệt và

đạt mức cực đại ở 24h (giá trị OD đo được từ 0.723 - 1.126). Điển hình là

chủng Y1, ở 12h mật độ quang đo được chỉ là 0.579, sau 24h mật độ quang đo

được là 0.994 (gần gấp 2 lần). Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy càng dài thì

lượng sinh khối giảm dần ở cả 4 chủng nấm men và sau 72h mật độ quang đo

được là 0.484 - 0.750. Điều này có thể giải thích như sau: ở giai đoạn đầu của

quá trình sinh trưởng và phát triển (pha lag và pha log) vi sinh vật sẽ sinh tổng

hợp mạnh mẽ các hợp chất để tăng kích thước và số lượng tế bào dẫn đến kết

quả là sinh khối của nấm men sẽ tăng mạnh (ở 24h), tuy nhiên đến pha cân

bằng và pha tử vong thì các chất dinh dưỡng giảm đi rất nhanh do chúng đồng

hóa mạnh và do môi trường trường tích lũy các chất độc là nguyên nhân dẫn

đến các tế bào chết hàng loạt [12]. Từ kết quả ở trên có thể kết luận rằng thời

gian tối thích để sinh khối đạt giá trị cực đại của 4 chủng nấm men là 24h. Do

đó chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy thích hợp nhất là 24h để nghiên cứu các

tính chất tiếp theo.

4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của các

chủng nấm men

Để đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men phân lập

được, chúng tôi tiến hành lên men trong trong môi trường Hansen lỏng (MT2)

ở các nhiệt độ khác nhau: 25oC , 30oC, 35oC, 40oC. Khả năng sinh trưởng của

các chủng được thể hiện bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị OD

ở bước sóng 620nm trong suốt chu kỳ lên men.

Kết quả được trình bày ở bảng 4.3 và hình 4.2 - 4.5.

Từ bảng 4.3 chúng tôi nhận thấy rằng: tất cả 4 chủng nấm men đều có xu

hướng phát triển theo nhiệt độ là tương đương nhau, cụ thể khi tăng nhiệt độ

càng cao thì các chủng nấm men đều phát triển càng mạnh (giá trị OD thu được

từ 0.620 - 1.188), trong đó chủng Y2 có khả năng thích ứng với các khoảng nhiệt

độ là mạnh nhất (OD đo được đều đạt ở mức cao và khi xử lý thống kê thì không

thấy có sự sai khác giữa các khoảng nhiệt độ (1.115 - 1.188)

Trong khoảng nhiệt độ từ 250C - 300C hầu hết các chủng nấm men có

khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh (giá trị OD tăng mạnh 0.620 -

1.126), sau khoảng thời gian 300C thì sự sinh trưởng và phát triển của các

chủng nấm men đi vào mức ổn định và có xu hướng giảm đi ở 400C. Như vậy,

khoảng nhiệt độ thích hợp đến khả năng phát triển của các chủng nấm men ở

nghiên cứu này là 30 - 350C. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số tác

giả [6], [12] cho rằng đa số nấm men tốt trong khoảng nhiệt độ từ 28 - 320C.

Đồng thời, Qureshi S. K. và cộng sự (2007) khi nghiên cứu một số đặc tính

sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập từ mốt số nước trái cây

thuộc họ cam, quýt và nước mía đã chỉ ra rằng hầu hết các chủng phân lập

được đều phát triển tốt ở nhiệt độ 300C [19].

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển

của các chủng nấm men

Nhiệt độ

(0C)

OD620nm

Y1 Y2 Y3 K2

25 0.620b 1.115 0.723b 0.724b

30 1.012a 1.126 1.072a 1.073a

35 1.121a 1.188 1.107a 1.170a

40 1.102a 1.187 0.917ab 0.915ab

Ghi chú: - Số liệu được trình bày ở các bảng trên là giá trị trung bình với n (n=3).

- Số liệu cùng cột có mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ( = 0.05)

0,62

1,0121,121 1,102

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

25 30 35 40

Nhiệt độ

OD

620n

m

25

30

35

40

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

sinh trưởng của chủng Y1

1,1151,126

1,188 1,187

1,06

1,08

1,1

1,12

1,14

1,16

1,18

1,2

25 30 35 40

Nhiệt độ

OD6

20nm 25

30

35

40

Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

phát triển của chủng Y2

0,723

1,072 1,107

0,917

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

25 30 35 40

Nhiệt độ

OD

620n

m

25

30

35

40

Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

phát triển của chủng Y3

0,724

1,0731,17

0,915

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

25 30 35 40

Nhiệt độ

OD

620n

m

25

30

35

40

Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

phát triển của chủng K2

4.2.3. Khảo sát khả năng lên men các nguồn đường của các chủng nấm men

Ở thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường lên men là môi trường

nước chiết giá đậu có bổ sung 2% các loại đường như glucoza, saccharoza,

maltoza và lactoza (MT3). Tiến hành lên men ở nhiệt độ 300C trong thời gian

24h. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4

Bảng 4.4. Khả năng lên men các nguồn đường

của các chủng nấm men

Kí hiệu

khuẩn lạc

Hiện tượng

Glucoza Saccharoza Maltoza LactozaĐối

chứng

K2 + + + - -

Y1 + + + - -

Y2 + + + - -

Y3 + + + - -

Ghi chú: (-) : không có khả năng lên men.

(+) : có khả năng lên men

Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy rằng: tất cả 4 chủng nấm men K2, Y1, Y2, Y3 đều có khả năng lên men 3 loại đường là: glucoza, saccharoza và maltoza nhưng không có khả năng lên men đường lactoza.

Sở dĩ có kết quả thu được như trên vì glucoza là nguồn cacbon hầu hết vi sinh vật dễ sử dụng nhất. Đường sacharoza, dưới tác dụng của enzyme invertaza nó bị thủy phân tạo thành đường glucoza và fructoza và được nấm men sử dụng [14]. Đường maltoza sẽ được thủy phân bởi enzym maltoaza tạo thành 2 phân tử đường glucoza. Ngoài ra, nấm men không sử dụng được đường lactoza. [3], [12],[13]

Kết quả này phù hợp với nguyên lý Kluyver và Dekker: “Những loài nấm men không lên men được đường glucoza thì không lên men được các loại đường khác” và không có nấm men nào đồng thời lên men được maltoza và lactoza ” [12]. Tương tự, Qureshi S. K. và cộng sự (2007) khi khảo sát khả năng lên men các nguồn đường glucoza, saccharoza, maltoza và lactoza của các chủng nấm men S. cerevecise, S. kluyeri, S. ludwigii, S. exigus, S. octosporus... cũng thu được kết quả là tất cả các chủng đều không lên men đường lactoza [19].

Từ các kết quả thu được ở trên và dựa vào các phương pháp xác định nấm men của Nguyễn Lân Dũng [1] chúng tôi khẳng định 4 chủng: K2, Y1, Y2, Y3 được phân lập từ nho và dứa đều là nấm men. 4.2.4. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột cả các chủng nấm men

Từ 4 chủng nấm men có khả năng lên men đường ở trên chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng thủy phân tinh bột. Sau 24h nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vòng phân giải tinh bột, kết quả được trình bày ở bảng 4.5.

Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men

Kí hiệu khuẩn lạc Khả năng thủy phân tinh bột

K2 -

Y1 -

Y2 -

Y3 -

Ghi chú: (+) : Có khả năng thủy phân tinh bột

(-) : Không có khả năng thủy phân tinh bột

Qua bảng 4.5 chúng tôi thu được kết quả: tất cả các chủng nấm men

được khảo sát không có chủng nào có khả năng thủy phân tinh bột (môi

trường bắt màu xanh với dung dịch Lugol). Điều đó có thể giải thích rằng: cả

4 chủng nấm men trên đều không có enzyme amylaza nên chúng không thể

thủy phân được tinh bột và khi nhuộm bằng dung dịch Lugol thì nó tạo màu

với Iod. Từ kết quả thu được, có thể kết luận rằng cả 4 chủng nấm men phân

lập được từ nguồn nho và dứa đều không có khả năng thủy phân tinh bột.

4.2.5. Khảo sát khả năng lên men rượu của các chủng nấm men

Từ 4 chủng trên chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng lên men rượu bằng

cách sử dụng các bình tam giác có chứa 200ml dịch lên men (MT4), bổ sung 3%

dịch nấm men thuần chủng sau khi đã tiến hành nhân giống sau 24h. Lên men

trong thời gian 24 – 48h, tiến hành quan sát hiện tượng và định tính, định lượng

sự tạo thành CO2 ở các bình lên men. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5

Bảng 4.6. Kết quả khảo sát khả năng lên men rượu

của các chủng nấm men

Kí hiệu

khuẩn lạc

Kết quả

Hiện tượngPhản ứng với

Ba(OH)2

Phản ứng

với K2Cr2O7

Y1Sủi bọt khí thành lớp dày

ở bề mặt

+ +

Y3 Sinh bọt khí không nhiều+ +

K2

Sinh bọt khí ít, sủi bọt khí từ

dưới lên, bọt nhỏ,

không bền.

+ +

Y2Khả năng sinh bọt khí mạnh,

thành lớp dày trên bề mặt.

+ +

Ghi chú: Phản ứng với Ba(OH)2

(+): Tạo kết tủa trắng (- ): không có hiện tượng Phản ứng với K2Cr2O7

(+): tạo dung dịch màu xanh lam (-) : màu nâu đậm.

Kết quả nghiên cứu cho thấy: sau 48h quan sát, tất cả các chủng nấm men đều có phản ứng dương tính với (BaOH)2 và K2Cr2O7, H2SO4 đậm đặc. Điều này chứng tỏ: các chủng nấm men phân lập được đều có khả năng lên men đường tạo rượu và CO2. Đồng thời quan sát hiện tượng trong suốt quá trình lên men, chúng tôi nhận thấy rằng:

Trong 12 giờ đầu chủng Y1, Y2, Y3, K2 chủ yếu ở giai đoạn thích nghi với môi trường và tiến hành sinh sản để tăng số lượng tế bào nên hàm lượng CO2 tạo ra trong giai đoạn này không đáng kể. Sau đó, các chủng nấm men sẽ tiến hành quá trình hô hấp yếm khí, sử dụng nguồn cơ chất là glucoza để lên men sinh ra rượu và CO2. Lúc này môi trường bắt đầu có bọt trên bề mặt và sủi bọt khí, số lượng tế bào nấm men đạt cực đại trong thời gian từ 12 – 24h (đã khảo sát ở các thi nghiệm trên) đã làm cho quá trình lên men cũng bắt đầu tăng nhanh ở các thời điểm này. Nhưng lượng rượu tạo ra trong quá trình lên men tăng dần đã ức chế các hoạt động của nấm men làm cho quá trình lên men bị giảm sau 48h. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trần Xuân Nghạch cùng các cộng sự [10] và nghiên cứu của Vụ công nghiệp “ lên men các sản phẩm cồn nhẹ”[21].4.2.6. Khảo sát khả năng lên men của các chủng nấm men bằng cách định lượng CO2 sinh ra

Để đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập được, chúng tôi tiến hành định lượng CO2 thông qua việc xác định hàm lượng CO2

sinh ra bằng phương pháp cân trọng lượng bình lên men [5].Kết quả được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.6

Bảng 4.7. Hàm lượng CO2 sinh ra của các chủng nấm men

Thời gian (h)

Chủng

Hàm lượng CO2 ( gCO2/100ml )

12 24 36 48

Y1 1.085m 3.948j 5.408gh 7.796d

Y2 9.620c 11.614b 12.596a 13.101a

Y3 2.240l 5.485fg 6.061ef 6.260e

K2 1.840l 3.276k 4.167ij 4.773ih

Ghi chú: - Số liệu được trình bày ở các bảng trên là giá trị trung bình với n (n=3).

- Số liệu trong bảng có mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ( = 0.05)

1.085

9.62

2.241.848

3.948

11.614

5.485

3.276

5.408

12.596

6.061

4.167

7.796

13.101

6.26

4.773

0

2

4

6

8

10

12

14

Y1 Y2 Y3 K2

Chủng nấm men

CO

2(g

CO

2/10

0ml) 12h

24h

36h

48h

Hình 4.6. Đồ thị thể hiện khả năng sinh CO2 của các chủng nấm men

Qua kết quả ở bảng 4.6 cho thấy: tất cả các chủng nấm men đều có

lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men tăng dần theo thời gian. Trong

đó chủng Y2 có hàm lượng CO2 sinh ra cao nhất trong tất cả các chủng ở

các thời điểm khảo sát, hàm lượng CO2 đạt cực đại ở 48h lên men

(13.101g CO2/100ml dịch lên men). Điều này có thể kết luận rằng: chủng

Y2 có khả năng lên men tốt nhất.

So sánh với các kết quả nghiên cứu khác như Qureshi S. K. và cộng sự

(2007) [19] khi khảo sát khả năng sinh khí của các chủng nấm men S.

cerevecise, S. kluyeri, S. ludwigii, S. exigus, S. octosporus... đều nhận thấy tất

cả các chủng này đều sinh khí mạnh sau 1 ngày lên men (24h). Teramoto và

cộng sự (2005) [20] khảo sát lượng CO2 sinh ra của các chủng S. cerevisiae W4,

S. cerevisiae ET99, S. cerevisiae K7 ở 300 C là 11.5 – 13.2 (gCO2/100ml), kết

quả này tương tự với kết quả chúng tôi thu được hàm lượng CO2 sinh ra đối

với chủng Y2 sau 24h lên men (11.614 - 13.101 gCO2/100ml).

Vì vậy chúng tôi chọn chủng Y2 để sản xuất bánh men rượu.

4.3. Quy trình sản xuất bánh men rượu

4.3.1. Phương pháp tạo bánh men:

Theo kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của 4 chủng nấm men

phân lập được là K2, Y1, Y2 và Y3 ở bảng 4.5 cho kết luận rằng cả 4 chủng trên

đều không có khả năng thủy phân tinh bột. Vì vậy, trong quy trình sản xuất bánh

men ở nghiên cứu này chúng tôi bổ sung kết hợp chủng nấm men và nấm môc

Aspergillus oryzae thuần chủng có khả năng thủy phân tinh bột mạnh.

Phương pháp tạo bánh men rượu: Gạo tẻ sau khi ngâm nước, vớt để ráo

nước rồi xay thành bột mịn, sau đó được đem trộn đều với nước và nấm men, nấm

mốc giống theo tỷ lệ 5% nấm men và 2% nấm mốc. Tạo hình bánh men, rải ra

khay đã được phủ bằng một lớp trấu, ủ bánh men ở 300C, thời gian khoảng 24 -

30h. Sau đó đem sấy ở nhiệt độ 350C trong thời gian 10 – 15h.

4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm của bột gạo sau khi nghiền đến chất lượng

của bánh men

Độ ẩm bột nhào là yếu tố vô cùng quan trọng trong quá trình sản xuất

bánh men, với độ ẩm thích hợp các chủng nấm men, nấm mốc phát triển

mạnh, quá trình tạo bánh men dễ dàng. Độ ẩm bột nhào quá cao hay quá thấp

cũng ảnh hưởng xấu đến chất lượng nấm men cũng như sự phát triển của nấm

men và sự xâm nhập của các đối tượng vi sinh vật lạ. Do đó, cần khống chế

độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm men, nấm mốc một cách thuận

tiện. Tham khảo tài liệu của Nguyễn Mạnh Tuấn và cộng sự khi nghiên cứu tỷ

lệ nấm men và nấm mốc trong quá trình sản xuất bánh men rượu [16] chúng

tôi bổ sung 5% nấm men chủng Y2 và 2% nấm mốc Aspergillus oryzae.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm của bột gạo đến chất

lượng bánh men rượu được trình bày ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của độ ẩm bột gạo đến chất lượng của bánh men

Độ ẩm (%) Chất lượng của bánh men

40 Màu trắng sáng, khô, cứng

45 Màu trắng tối hơn, khô, cứng

50 Màu hơi vàng, khô, cứng

55 Màu vàng đậm hơn, khô, cứng

Kết quả trên cho thấy, độ ẩm càng thấp thì bánh men tạo thành càng

khô, bề mặt sần sùi, màu sáng hơn (40 – 45%). Độ ẩm 50 – 55% bánh men

tạo thành có bề mặt bóng nhẵn hơn , bánh men có màu vàng nhạt.

4.3.3. Khảo sát khả năng lên men của bánh men rượu theo độ ẩm khác nhau

Bánh men sau khi được tạo thành với các độ ẩm của bột gạo khác nhau

(40, 45, 50 và 55%), tiến hành lên men ở môi trường lên men (MT4) ở nhiệt

độ 300C trong 48h.

Để đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập được,

chúng tôi tiến hành định lượng CO2 thông qua việc xác định hàm lượng CO2

sinh ra bằng phương pháp cân trọng lượng bình lên men.

Kết quả trình bày ở bảng 4.9 và hình 4.7.

Bảng 4.9. Khả năng lên men của bánh men rượu ở những độ ẩm

khác nhau

Thời gian (h)

Độ ẩm

Hàm lượng CO2 ( gCO2/100ml)

12 24 36 48

40 2.782k 6.412h 8.319f 8.740ed

45 2.103l 3.352j 6.537h 9.311bc

50 4.390i 7.033g 9.035cd 9.893a

55 3.352J 6.480h 8.701e 9.416b

Ghi chú: - Số liệu được trình bày ở các bảng trên là giá trị trung bình với n (n=3).

- Số liệu trong bảng có mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ( = 0.05)

Hình 4.7 : Đồ thị thể hiện khả năng sinh CO2 của các bánh men rượu theo

độ ẩm khác nhau

2,7822,103

4,3903,352

6,412

3,352

7,0036,480

8,319

6,537

9,035 8,7018,7409,314

9,8939,416

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

40 45 50 55

Độ ẩm

gCO

2/10

0ml 12h

24h

36h

48h

Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy: tất cả các loại bánh men rượu đều có

lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men tăng dần theo thời gian (hàm lượng

CO2 thu được từ 2.10 - 9.893 gCO2/100ml), trong đó hàm lượng đạt CO2 sinh ra

đạt cực đại sau 48h lên men (8.740 - 9.893gCO2/100ml). So sánh khả năng lên

men của bánh men rượu ở các độ ẩm khác nhau, dễ dàng nhận ra rằng: hàm lượng

CO2 sinh ra của bánh men độ ẩm 50% là cao nhất so với các loại bánh men cùng

thời điểm khảo sát (9.893 gCO2/100ml).

So sánh với các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Tuấn và cộng sự

[16] khi khảo sát khả năng sinh khí của bánh men ở những độ ẩm khác nhau

nhận thấy bánh men ở độ ẩm từ 55- 50% sinh khí CO2 mạnh, kết quả này

tương tự với kết quả chúng tôi thu được hàm lượng CO2 sinh ra của bánh men

ở độ ẩm sau 48h lên men (9.416 – 9.893 gCO2/100ml).

PHẦN 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

- Từ 2 nguồn nho và dứa chúng tôi phân lập được 4 chủng nấm men đó

là: K2, Y1, Y2 và Y3

- Đã xác định được một số đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men như:

+ Thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng

nấm men từ 12 - 24h và đạt giá trị cực đại ở 24h.

+ Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men trong khoảng 30 -

350C, trong đó nhiêt độ tối thích nhất cho sự phát triển của 4 chủng nấm men

trên là 300C.

+ Không có chủng nấm men nào có khả năng thủy phân tinh bột.

+ Cả 4 chủng đều có khả năng lên men đường glucose, maltose,

saccharose. Không có chủng nấm men nào có khả năng lên men đường lactose.

+ Cả 4 chủng đều có khả năng lên men sinh CO2 trong quá trình lên

men rượu, trong đó chủng Y2 có khả năng sinh CO2 mạnh nhất.

Vì vậy chúng tôi chọn chủng Y2 để sản xuất bánh men rượu.

- Xác định được phương pháp sản xuất bánh men rượu

+ Chất lượng bánh men rượu được đánh giá tốt nhất khi độ ẩm của bột

gạo từ 50 - 55%.

+ Độ ẩm thích hợp nhất cho bánh men rượu lên men đạt hàm lượng

CO2 mạnh nhất là 50%.

5.2. Kiến nghị

- Thử nghiệm nhân giống và làm các chế phẩm của nấm men trên môi

trường cải biến để thay thế môi trường Hansen đắt tiền.

- Định danh các chủng nấm men đã phân lập được.

- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống bổ sung vào đến chất lượng bánh men

- Nghiên cứu khả năng ứng dụng của nấm men vào thực tế như sản xuất

lên men sản phẩm truyền thống, sản xuất các chế phẩm vi sinh vật.

- Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bánh men rượu.

- Khảo sát các thông số công nghệ của quy trình sản xuất bánh men

rượu (độ thông khí, nồng độ cồn, nhiệt độ, thời gian…)

- Đánh giá tính chất cảm quan, phương pháp bảo quản của bánh men

rượu thu được.