06.06.2016

1

Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria

Bioingeniør Gunilla LøvgårdenSeksjon for utvikling, Ullevål

Avdeling for mikrobiologi

Oslo universitetssykehus

Leishmaniasis

• forårsakes av parasitten Leishmania• spredning via sandfluer• særlig utbredt i Sør‐Amerika, India, Midtøsten, enkelte land i Afrikaog rundt Middelhavet• ulike Leishmania‐arter kan gi ulike former av sykdom• behandling er kostbar og tilgjengelighet begrenset• ingen vaccine• insidens:

– 200.000 – 400.000 tilfeller av visceral Leishmaniasis / år– 700.000 – 1,2 mill. tilfeller av kutan Leishmaniasis / år– antall dødsfall: 20.000 – 40.000 / år

06.06.2016

2

Leishmaniasis

• kan gi livstruende  systemisk infeksjon• benmarg, milt og  lever

• vanligste form• sår i hud

1.

2.

3.

• slimhinner i  nese, munn og svelg

21 arter gir infeksjon hos mennesker:

06.06.2016

3

CDC Centers for Disease Control and Prevention

Leishmania real‐time PCR

• for mer sensitiv påvisning av Leishmaniasis • for artsidentifikasjon

Dagens diagnostikk

Dyrkning  Mikroskopi

kinetoplast

kjerne

Prøver

• Biopsi (10 – 20 mg) • Benmargsaspirat (200 µl med EDTA)• Fullblod (350 µl med EDTA)

Analyse

1. Påvisning av Leishmania genus (påvist/ikke påvist) (real‐time PCR)

2. Artsidentifikasjon (real‐time PCR og sekvensering)

EZ1 Biorobot (Qiagen)

06.06.2016

4

Prøvebehandling

Biopsi (10 – 20 mg):Prøven behandles med lysisbuffer tilsatt Proteinase K, 1‐3 timer ved 56 C. DNA ekstraheres med Qiagen EZ1 DNA Tissue‐kit

Benmargsaspirat (200 µl med EDTA):DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Tissue‐kit

Blod (350 µl med EDTA):DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Blood‐kit 

Primere: Foulet et al. 2007 JCM (45) p. 2110‐2115

• produkt: 149 bp

• probe: hydrolyse‐probe (TaqMan) med fluorochrome

1. Påvisning av Leishmania genus

• real‐time PCR med 18S rDNA som target‐gen

• 50‐200 kopier/genom

06.06.2016

5

positiv prøve

positiv kontroll

negativ prøve/negativ kontroll

Tidsbruk: Biopsi: 3 timer + 15 min + 1 time 40 min = ca 5 timerBenmargsaspirat/blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer

Deteksjonsgrense • 10 fg DNA/PCR‐reaksjon (L.major DNA fra ATCC)

• < 1 parasitt/PCR‐reaksjon

• 3‐10 parasitter i prøve

Interferens• Ingen kryssreaksjon med følgende agens:

Streptococcus mitisStreptococcus pyogenesMycobacterium intracellulareMycobacterium avium complexMycobacterium tuberculosis complexStaphylococcus aureusPlasmodium falciparum

06.06.2016

6

2. Artsidentifikasjon

• real‐time PCR med Hsp70‐genet som target

• sekvensering

Primere: Van der Auwera et al. 2013 Euro Surveill. 18 (30)

• 203 referansesekvenser(www.itg.be/LeishmaniaHSP70)

• Genbank (NCBI)

Sekvensanalyse og typing

06.06.2016

7

Positive kliniske prøver

Prøve Smittested Materiale Ct 18S PCR Sekvensering Hsp701 Belize biopsi, hud 22,68 L.mexicana2 Belize biopsi, hud 24,25 L.braziliensis3 Belize biopsi, hud 26,4 L.naiffi (99%)4 Belize biopsi, hud 25,81 L.mexicana5 Israel biopsi, hud 30,5 L.major6 Spania benmargsaspirat 33,5 L.infantum7 Spania benmargsaspirat 35,18 L.infantum8 Peru biopsi, hud 20,99 L.braziliensis9 Sør-Amerika biopsi, gane 36,92 L.braziliensis10 Afghanistan biopsi, hud 36,58 L. tropica/L.aethiopica11 Syria biopsi, hud 29,93 L. tropica12 usikkert benmargsaspirat 22,61 L.infantum

Malaria

• Parasitten tilhører genus Plasmodium• overføres fra hunnmygg av arten Anopheles til menneske• >100 species av Plasmodium• kun 5 species gir sykdom hos menneske• Insidens: ca 200 mill. smittes årlig• dødsfall: ca 500.000 /år, 70% er barn < 5 år

06.06.2016

8

CDC Centers for Disease Control and Prevention

P.falciparum

P.vivax

P.ovale

P.malariae

P.knowlesi

Plasmodium falciparum• finnes over hele verden, ca 500.000 mennesker dør hvert år av P. falciparum (WHO 2015) • forårsaker alvorlig anemia, kan tette små blodårer som i hjernen kan gi cerebral malaria

Plasmodium vivax• mest i Asia, Latin America, og deler av Afrika. • har hvilende leverstadier ("hypnozoites") som kan aktiveres flere måneder eller år etter infeksjon  

Plasmodium ovale• mest i Afrika (vest Afrika) og stillehavsøyene. • svært lik P.vivax og har også hvilende leverstadier 

Plasmodium malariae• finnes over hele verden• kan gi langvarig, kronisk infeksjon og nyresvikt hvis ubehandlet

Plasmodium knowlesi• finnes i sørøst Asia, og infiserer aper og også mennesker, spesielt i Malaysia  • kan gi alvorlig infeksjon, dødelige tilfeller er rapportert

CDC Centers for Disease Control and Prevention

06.06.2016

9

Malaria real‐time PCR

• forbedre sensitivitet og spesifisitet av malariadiagnostikk

• verifisere mistenkte og påviste tilfeller av malaria

• usikker artsbestemmelse ved mikroskopi og hurtigtest

• klinisk mistanke tross negativ mikroskopi og hurtigtest

Dagens diagnostikk

• Mikroskopi• Hurtigtest

Prøver

• Fullblod (350 µl)

EZ1 Biorobot (Qiagen)

PCR‐oppsett

1. for verifisering av påvist Malaria

Mix 1: P.falciparumMix 2: P.vivax + P.knowlesiMix 3: P.ovale + P.malariae

2. for påvisning av mistenkt Malaria

Mix 1‐3Mix 4: P.genusMix 5: ACTB

Stratagene Mx3005P

06.06.2016

10

Interferens: 

• Ingen kryssreaksjon med 

Toxoplasmose gondii, E.coli, S.aureus, L.infantum, L.donovani

Deteksjonsgrense• Mikroskopi: 100 parasitter/µl blod (5‐50 parasitter/µl blod)

• CareStart Malaria HRP‐2/pLDH (Pf/pan) Combo Test:Sensitivity: P.falciparum 88,8%, P.vivax 77,6%, P.ovale 18,4%, P.malariae 30,4%(Maltha et al. 2010 Malaria J) 

• Real‐time PCR: P.fal: 0,06 parasitter/µl blod (20 parasitter/350 µl blod)P.vivax: < 5 parasitter/µl blod

Tidsbruk: Blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer

06.06.2016

11

Resultat validering

• 8 positive prøver fra Canada (PCR) 

• 39 positive prøver fra infeksjonsmedisin Ullevål (mikroskopi+hurtigtest)

P.fal P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi benign SumMikroskopi 18 17 0 3 0 1 39vår PCR 19 18 2 0 0 0 39

Resultat Resultat Prøve Mikroskopi P.fal P.viv P.ova P.mal P.kno sekvensering

1 P.malariae ? No Ct No Ct 35 No Ct No Ct P.ovale

3 P.malariae ? No Ct 25,08 No Ct No Ct No Ct P.vivax

6 benign 21,2 No Ct No Ct No Ct No Ct P.fal

9 P.malariae ? No Ct 25,87 No Ct No Ct No Ct P.vivax

11 P.fal 18,46 No Ct 36,19 No Ct No Ct P.fal

25 P.vivax No Ct No Ct 26,93 No Ct No Ct P.ovale

Resultat PCR (Ct)

• Sekvensering av 18 prøver viser samme resultat som PCR

Positive kliniske prøver

Prøve Ct Art Kommentar

1 20,51 P.falciparum

2 19,95 P.falciparum

3 39,88 P.vivax

4 25,62/40,07 P.fal / P.viv

5 31,45 P.vivax

6 22,93/28,33 P.fal / P.ovale Hurtigtest: +, <1% parasitemi

7 20,65 P.falciparum Hurtigtest: non‐P.fal.

8 27,73 P.vivax

06.06.2016

12

Avdeling for mikrobiologi, UllevålDr.scient Cathrine Fladeby Spesialbioingeniør Hilde KlevenOverlege Lumnije DediOverlege Fredrik Müller

Samarbeidspartnere

Infeksjonsmedisinsk avdeling, UllevålFagbioingeniør Mette SannesOverlege Frank Olav PettersenOverlege Mogens Jensenius