06.06.2016
1
Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria
Bioingeniør Gunilla LøvgårdenSeksjon for utvikling, Ullevål
Avdeling for mikrobiologi
Oslo universitetssykehus
Leishmaniasis
• forårsakes av parasitten Leishmania• spredning via sandfluer• særlig utbredt i Sør‐Amerika, India, Midtøsten, enkelte land i Afrikaog rundt Middelhavet• ulike Leishmania‐arter kan gi ulike former av sykdom• behandling er kostbar og tilgjengelighet begrenset• ingen vaccine• insidens:
– 200.000 – 400.000 tilfeller av visceral Leishmaniasis / år– 700.000 – 1,2 mill. tilfeller av kutan Leishmaniasis / år– antall dødsfall: 20.000 – 40.000 / år
06.06.2016
2
Leishmaniasis
• kan gi livstruende systemisk infeksjon• benmarg, milt og lever
• vanligste form• sår i hud
1.
2.
3.
• slimhinner i nese, munn og svelg
21 arter gir infeksjon hos mennesker:
06.06.2016
3
CDC Centers for Disease Control and Prevention
Leishmania real‐time PCR
• for mer sensitiv påvisning av Leishmaniasis • for artsidentifikasjon
Dagens diagnostikk
Dyrkning Mikroskopi
kinetoplast
kjerne
Prøver
• Biopsi (10 – 20 mg) • Benmargsaspirat (200 µl med EDTA)• Fullblod (350 µl med EDTA)
Analyse
1. Påvisning av Leishmania genus (påvist/ikke påvist) (real‐time PCR)
2. Artsidentifikasjon (real‐time PCR og sekvensering)
EZ1 Biorobot (Qiagen)
06.06.2016
4
Prøvebehandling
Biopsi (10 – 20 mg):Prøven behandles med lysisbuffer tilsatt Proteinase K, 1‐3 timer ved 56 C. DNA ekstraheres med Qiagen EZ1 DNA Tissue‐kit
Benmargsaspirat (200 µl med EDTA):DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Tissue‐kit
Blod (350 µl med EDTA):DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Blood‐kit
Primere: Foulet et al. 2007 JCM (45) p. 2110‐2115
• produkt: 149 bp
• probe: hydrolyse‐probe (TaqMan) med fluorochrome
1. Påvisning av Leishmania genus
• real‐time PCR med 18S rDNA som target‐gen
• 50‐200 kopier/genom
06.06.2016
5
positiv prøve
positiv kontroll
negativ prøve/negativ kontroll
Tidsbruk: Biopsi: 3 timer + 15 min + 1 time 40 min = ca 5 timerBenmargsaspirat/blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer
Deteksjonsgrense • 10 fg DNA/PCR‐reaksjon (L.major DNA fra ATCC)
• < 1 parasitt/PCR‐reaksjon
• 3‐10 parasitter i prøve
Interferens• Ingen kryssreaksjon med følgende agens:
Streptococcus mitisStreptococcus pyogenesMycobacterium intracellulareMycobacterium avium complexMycobacterium tuberculosis complexStaphylococcus aureusPlasmodium falciparum
06.06.2016
6
2. Artsidentifikasjon
• real‐time PCR med Hsp70‐genet som target
• sekvensering
Primere: Van der Auwera et al. 2013 Euro Surveill. 18 (30)
• 203 referansesekvenser(www.itg.be/LeishmaniaHSP70)
• Genbank (NCBI)
Sekvensanalyse og typing
06.06.2016
7
Positive kliniske prøver
Prøve Smittested Materiale Ct 18S PCR Sekvensering Hsp701 Belize biopsi, hud 22,68 L.mexicana2 Belize biopsi, hud 24,25 L.braziliensis3 Belize biopsi, hud 26,4 L.naiffi (99%)4 Belize biopsi, hud 25,81 L.mexicana5 Israel biopsi, hud 30,5 L.major6 Spania benmargsaspirat 33,5 L.infantum7 Spania benmargsaspirat 35,18 L.infantum8 Peru biopsi, hud 20,99 L.braziliensis9 Sør-Amerika biopsi, gane 36,92 L.braziliensis10 Afghanistan biopsi, hud 36,58 L. tropica/L.aethiopica11 Syria biopsi, hud 29,93 L. tropica12 usikkert benmargsaspirat 22,61 L.infantum
Malaria
• Parasitten tilhører genus Plasmodium• overføres fra hunnmygg av arten Anopheles til menneske• >100 species av Plasmodium• kun 5 species gir sykdom hos menneske• Insidens: ca 200 mill. smittes årlig• dødsfall: ca 500.000 /år, 70% er barn < 5 år
06.06.2016
8
CDC Centers for Disease Control and Prevention
P.falciparum
P.vivax
P.ovale
P.malariae
P.knowlesi
Plasmodium falciparum• finnes over hele verden, ca 500.000 mennesker dør hvert år av P. falciparum (WHO 2015) • forårsaker alvorlig anemia, kan tette små blodårer som i hjernen kan gi cerebral malaria
Plasmodium vivax• mest i Asia, Latin America, og deler av Afrika. • har hvilende leverstadier ("hypnozoites") som kan aktiveres flere måneder eller år etter infeksjon
Plasmodium ovale• mest i Afrika (vest Afrika) og stillehavsøyene. • svært lik P.vivax og har også hvilende leverstadier
Plasmodium malariae• finnes over hele verden• kan gi langvarig, kronisk infeksjon og nyresvikt hvis ubehandlet
Plasmodium knowlesi• finnes i sørøst Asia, og infiserer aper og også mennesker, spesielt i Malaysia • kan gi alvorlig infeksjon, dødelige tilfeller er rapportert
CDC Centers for Disease Control and Prevention
06.06.2016
9
Malaria real‐time PCR
• forbedre sensitivitet og spesifisitet av malariadiagnostikk
• verifisere mistenkte og påviste tilfeller av malaria
• usikker artsbestemmelse ved mikroskopi og hurtigtest
• klinisk mistanke tross negativ mikroskopi og hurtigtest
Dagens diagnostikk
• Mikroskopi• Hurtigtest
Prøver
• Fullblod (350 µl)
EZ1 Biorobot (Qiagen)
PCR‐oppsett
1. for verifisering av påvist Malaria
Mix 1: P.falciparumMix 2: P.vivax + P.knowlesiMix 3: P.ovale + P.malariae
2. for påvisning av mistenkt Malaria
Mix 1‐3Mix 4: P.genusMix 5: ACTB
Stratagene Mx3005P
06.06.2016
10
Interferens:
• Ingen kryssreaksjon med
Toxoplasmose gondii, E.coli, S.aureus, L.infantum, L.donovani
Deteksjonsgrense• Mikroskopi: 100 parasitter/µl blod (5‐50 parasitter/µl blod)
• CareStart Malaria HRP‐2/pLDH (Pf/pan) Combo Test:Sensitivity: P.falciparum 88,8%, P.vivax 77,6%, P.ovale 18,4%, P.malariae 30,4%(Maltha et al. 2010 Malaria J)
• Real‐time PCR: P.fal: 0,06 parasitter/µl blod (20 parasitter/350 µl blod)P.vivax: < 5 parasitter/µl blod
Tidsbruk: Blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer
06.06.2016
11
Resultat validering
• 8 positive prøver fra Canada (PCR)
• 39 positive prøver fra infeksjonsmedisin Ullevål (mikroskopi+hurtigtest)
P.fal P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi benign SumMikroskopi 18 17 0 3 0 1 39vår PCR 19 18 2 0 0 0 39
Resultat Resultat Prøve Mikroskopi P.fal P.viv P.ova P.mal P.kno sekvensering
1 P.malariae ? No Ct No Ct 35 No Ct No Ct P.ovale
3 P.malariae ? No Ct 25,08 No Ct No Ct No Ct P.vivax
6 benign 21,2 No Ct No Ct No Ct No Ct P.fal
9 P.malariae ? No Ct 25,87 No Ct No Ct No Ct P.vivax
11 P.fal 18,46 No Ct 36,19 No Ct No Ct P.fal
25 P.vivax No Ct No Ct 26,93 No Ct No Ct P.ovale
Resultat PCR (Ct)
• Sekvensering av 18 prøver viser samme resultat som PCR
Positive kliniske prøver
Prøve Ct Art Kommentar
1 20,51 P.falciparum
2 19,95 P.falciparum
3 39,88 P.vivax
4 25,62/40,07 P.fal / P.viv
5 31,45 P.vivax
6 22,93/28,33 P.fal / P.ovale Hurtigtest: +, <1% parasitemi
7 20,65 P.falciparum Hurtigtest: non‐P.fal.
8 27,73 P.vivax
06.06.2016
12
Avdeling for mikrobiologi, UllevålDr.scient Cathrine Fladeby Spesialbioingeniør Hilde KlevenOverlege Lumnije DediOverlege Fredrik Müller
Samarbeidspartnere
Infeksjonsmedisinsk avdeling, UllevålFagbioingeniør Mette SannesOverlege Frank Olav PettersenOverlege Mogens Jensenius