Laporan Praktikum Biokimia

Percobaan ke 7

Induksi Beta-Galaktosidase

Nama : Widya Wigati

NIM : 10511035

Kelompok : V

Asisten : Riski (20512045)

Tanggal Praktikum : Kamis, 3 April 2014

Tanggal Pengumpulan : Kamis, 10 April 2014

Laboratorium Biokimia

Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Bandung

2014

Percobaan ke 7

Induksi Beta Galaktosidase

I. Tujuan Percobaan

Menginduksi dan menentukan aktivitas beta-galaktosidase dari E.Coli

menggunakan teknik spektrofotometri

II. Teori Dasar

Laktosa adalah gula bisakarida yang tersusun atas glukosa dan galaktosa.

Laktosa dapat diuraikan menjadi glukosa dan galaktosa dengan bantuan enzim   -βgalaktosidase. Bakteri E. coli dalam hidupnya dapat memanfaatkan baik laktosa

maupun glukosa tergantung gula mana yang tersedia dilingkungan. Bakteri E. coli

mempunyai kemampuan mensintesis   -galaktosidase sehingga bila laktosa yangβ

dimanfaatkan sebagai sumber karbon maka bakteri tersebut akan mampu

mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa.

Operon, adalah. sekelompok gen yang diapit secara bersamaan oleh sepasang

promotor dan terminator. Gen-gen pada satu operon akan diekspresikan secara

bersamaan melalui inisiasi transkripsi pada promotor yang sama dan berakhir

pada terminator yang sama.  Gen-gen yang berada pada satu operon mempunyai

hubungan fungsi dalam metabolisme.

Lac operon adalah operon yang berfungsi dalam proses metabolisme laktosa di

bakteri E.coli ataupun bakteri lainya. Pada operon laktosa terdapat tiga gen

struktural yaitu sebagai berikut :

lacZ : gen yang berfungsi untuk memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa.

mengubah laktosa menjadi allolaktosa yang mengatur Lac operon (mengkode

enzim beta-galaktosidase)

Lac Y : berperan dalam transport laktosa dalam membran sitoplasma (mengkode

enzim permease)

Lac A : berperan dalam mengkode enzim transasetilase.

Dalam kasus operon laktosa terdapat dua gen regulator yaitu gen lac-i dan

gen crp. Gen Lac i berhubungan dengan kehadiran laktosa, sedangkan

gen crp berhubungan dengan kehadiran glukosa. Gen regulator berperan

mengatur ekspresi gen struktural.

Skema lac operon di dalam sel E.coli :

Operator : urutan basa di DNA yang berdekatan dengan promotor Lac mRNA dan

merupakan tempat terikatnya represor.

Represor : protein/chemical yang menempel pada operator dan mengalangi

proses transkripsi.

Inducer : chemical yang menginisiasi proses transkripsi dengan cara melepaskan

represor dari operator.

Promotor : tempat menempel nya RNA polimerase yang juga berfungsi untuk

memperkenalkan / mem-promote kan proses transkripsi.

Pada percobaan ini, kultur bakteri ditumbuhkan dulu dalam media yang berisi

berbagai gula yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut dijadikan sumber energi

bakteri selama inkubasi semalaman. Sebagai substrat, tidak digunakan laktosa,

melainkan ONPG (orthonitrophenyl galactosides), yaitu suatu senyawa -βgalaktosida. Setelah ONPG dipotong oleh enzim -galactosidase, akan dihasilkanβ

ONP (orthonitrophenol) yang berwarna kuning ( maks = 420 nm). Denganλ

demikian, penentuan efek induksi gula pada sintesis -galaktosidase dapatβ

ditentukan dengan metode spektrofotometri.

Berikut merupakan struktur ONPG menjadi ONP dengan adanya bantuan dari enzim beta galaktosidase :

III. .Data Pengamatan

a. Data OD

Medium NB 0.542

Medium NB + Laktosa 0.503

Medium NB + Lak + glu 0.364

Tabungwaktu inkubasi (menit)

0 10 20 30 40medium NB 0.03 1.952 1.987 1.988 1.998medium NB + laktosa 0.013 2.003 2.001 1.992 1.984medium NB + laktosa + glukosa 0.053 0.054 0.103 0.152 0.211

IV. Perhitungan dan Pengolahan Data

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

Absorban Vs Waktu

NBNB+LacNB+Lac+Glu

waktu (menit)

Abso

rban

Menentukan Aktivitas Enzim

Aktivitas enzim=A420

t inkubasi×V kultur×OD600

Aktivitas enzim= 1.95210×1.5×10−3 L×0.542

= 240.098

Denganmenggunakan perhitungan yang sama,maka didapatkanhasil sebagai

berikut :

5 10 15 20 25 30 35 40 450

50

100

150

200

250

300

kurva aktivitas VS Waktu

NBNB+LakNB+Glu+Lak

Waktu (menit)

Aktiv

itas

t (menit)Tabung

0 10 20 30 40

A (NB) 0 240,0984

122,2017

81,50882

61,43911B (NB + laktosa) 0 265,47

38132,60

4488,005

365,738

9C (NB + glukosa + laktosa) 0 9,89011

9,432234

9,279609

9,661172

V. Pembahasan

Pada percobaan ini, akan ditentukan aktivitas enzim beta galaktisidase pada

berbagai medium dan pada berbagai waktu inkubasi. Induksi beta galaktosidase

yang dilakukan berasal dari kultur suspensi bakteri E.Coli yang telah ditumbuhkan

pada 3 media yaitu media NB, media NB+laktosa dan media NB+glukosa+laktosa.

penggunaan kultur suspensi e.coli sebagai prekursor enzim beta galaktosidase

disebabkan karena bakteri e.coli tidak dapat menyerap laktosa, sehingga bakteri

tersebut akan mengsintesis enzim beta galaktosidase untuk merombak laktosa

menjadi suatu yang glukosa yang dapat diserap.

Pada tahap awal, kultur bakteri disentrifugasi dengan tujuan untuk

mengendapkan bakteri dan memisahkan dari media. Penambahan buffer Z

bertujuan untuk mencuci sisa-sisa media yang masih ada. Sentrifugasi dan

pencucian dengan buffer Z dilakukan berkali-kali supaya pemisahan bakteri dari

media berlangsung dengan baik.

Setelah ditambahkan buffer Z, maka akan ditambahkan kloroform dan SDS.

Kloroform berfungsi sebagai pelarut organik yang ditambahkan untuk

mengekstrak komponen-komponen sel yang sudah tidak dibutuhkan. Sedangkan

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ditambahkan sebagai molekul yang akan melakukan

proses lisis terhadap sel bakteri, sehingga SDS akan mengikat dan merusak

membran sel bakteri dan akhirnya sel akan pecah dan enzim beta galaktosidase

nya dapat terekstrak.

Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 37°C. Suhu 37°C merupakan suhu yang

sama dengan suhu tubuh sehingga suhu tersebut merupakan suhu optimum bagi

kerja enzim -galaktosidase. Dengan inkubasi terlebih dahuluβ pada suhu 37°C

akan membuat enzim menjadi efektif untuk bekerja.

Setelah diinkubasi, ditambahkan ONPG (orthonitrophenyl-galactosides) yang

berfungsi sebagai substrat. ONPG ini merupakan pengganti dari laktosa. Alasan

penggunaan ONPG adalah karena saat adanya aktivitas enzim beta galaktosidase,

ONPG ini akan berubah menjadi ONP yang berwarna kuning dan menyerap cahaya

UV pada panjang gelombang 420 nm. Sehingga penentuan aktivitas enzim beta

galaktosidasenya dapat menggunakan metode spektrofotokimia. ONPG dapat

bertindak sebagai pengganti laktosa dikarenakan strukturnya yang serupa dan

sama-sama akan terhidrolisis menjadi galaktosa ketika terdapat aktivitas enzim

beta galaktosidase.

Setelah penambahan ONPG. Maka tabung tersebut diinkubasi pada berbagai

waktu. Ada juga tabung yang tidak diinkubasi. Setelah tahap inkubasi selesai,

maka larutan di dalam tabung akan ditambahkan Na2CO3 yang bersifat basa, dan

akan mengubah pH larutan. Kondisi pH menjadi tidak optimum lagi bagi kerja

enzim, dan aktivitas enzim akan menurun. Sehingga Na2CO3 juga dapat bertindak

sebagai penghenti kerja enzim beta gaaktosidase yang ada di dalam tabung.

Setelah ditambahkan Na2CO3, tabung tersebut dimasukan kedalam penangas es

untuk memastikan bahwa aktivitas enzim beta galaktosidase tersebut benar-benar berhenti.

Pada percobaan ini, seharunya tabung-tabung yang tidak melalui tahap inkubasi tidak

menunjukan aktivitas enzim beta galaktosidase (absroban larutan harus sama dengan nol)

akibat dari kerja enzim yang langsung dihentikan sesaat penambahan substrat. Namun yang

terjadi pada percobaan ini adalah terdapatnya aktivitas enzim beta galaktosidase pada ke 2

tabung yang ditandai dengan nilai absorban yang tidak sama dengan nol. Hal tersebut

dikarenakan saat ditambahkan ONPG, tidak langsung ditambahkan Na2CO3 (terdapat jeda

walaupun hanya beberapa detik) sehingga aktivitas enzim beta galaktosidase

tetap ada walaupun hanya sedikit.

Pada percobaan ini, dapat dilihat juga pengaruh dari ketiga medium pada

aktivitas enzim beta galaktosidase. Dapat dilihat bawa medium NB+laktosa meiliki

aktivitas enzim rata-rata yang lebih besar dibandingkan dengan ke-2 medium

lainya. Sementara medium NB+laktosa+glukosa memiliki aktivitas terkecil

dibandingkan dengan ke-2 medium lainya. Hal tersebut terjadi karena Kehadiran

laktosa pada media tumbuh akan mendorong terjadinya ekspresi operon laktosa

atau terjadi sintesis beta galaktosidase. Berarti kehadiran laktosa harus mampu

melepaskan protein regulator dari promotor agar terjadi ekspresi gen lac-Z, untuk

menghasilkan beta galaktosidase. Dalam sistem regulasi ini laktosa yang diambil

oleh bakteri dapat berinteraksi dengan protein regulator dan asosiasi yang akan

mengubah konfigurasi molekul protein regulator. Perubahan konfigurasi pada

protein represor menyebabkan protein tersebut menjadi tidak mampu berasosiasi

dengan operator. Dengan tidak adanya inhibitor pada promotor maka

transkriptase menjadi tidak terhalang untuk melakukan inisiasi transkripsi dan

terjadi ekspresi gen-gen pada operon laktosa.

Selain oleh laktosa, yang akan mendorong terjadinya ekspresi operon lac juga

diatur oleh keberadaan glukosa. Ketika kadar glukosa dalan darah sudah banyak,

maka tubuh secara otomatis akan lebih memilih untuk menggunakan glukosa

daripada laktosa. Sehingga proses eskpresi enzim beta galaktosidase pun

dihentikan. Regulasi oleh glukosa ini disebut represi katabolit atau represi

glukosa. Proses regulasi ini melibatkan tiga komponen yaitu glukosa, cAMP (cyclic

AMP), dan CAP (protein aktivator/ represor). CAP merupakan protein yang

berperan mengaktifkan enzim transkriptase, protein ini disandikan oleh gen

regulatorcrp Asosisasi antara CAP dengan transkriptase menyebabkan

transkriptase menjadi aktif dan mampu mengkatalisis proses transkripsi; tanpa

CAP transkriptase menjadi tidak aktif. Glukosa mengatur aktivitas CAP melalui

pengaturan cAMP. Antara CAP dan cAMP dapat terbentuk asosiasi, dan asosiasi ini

akan menyebabkan CAP aktifberperan sebagai aktivator; CAP yang terbebas dari

cAMP tidak dapat berperan sebagai aktivator. Kuantitas cAMP berbanding terbalik

dengan kuantitas glukosa. Saat glukosa di dalam sel berjumlah kecil cAMP

ditemukan berada dalam jumlah yang besar, dan bila kuantitas glukosa dalam sel

meningkat maka cAMP akan menurun. Dalam keadaan kuantitas rendah cAMP

tidak dapat berasosiasi dengan CAP, akibatnya CAP tidak dapat menjadi aktivator.

Jadi pada saat glukosa rendah cAMP berada dalam jumlah besar dan membentuk

asosiasi cAMP-CAP yang berperan menjadi aktivator enzim transkriptase,

sehingga terjadi transkripsi operon laktosa. Ketika glukosa meningkat sampai

jumlah tertentu cAMP menurun sehingga tidak terbentuk asosiasi cAMP-CAP, dan

CAP tidak dapat berperan sebagai aktivator dan transkripsi operon laktosa tidak

berlangsung.

Sehingga, sudah jelas bahwa medium pertumbuhan yang mengandung glukosa

memiliki aktivitas enzim beta galaktosidase terendah, sementara medium

pertumbuhan yang mengandung laktosa memiliki aktivitas enzim beta

galaktosidase tertinggi.

VI. Kesimpulan

Medium NB + Laktosa menunjukan aktivitas rata-rata paling tinggi

Medium NB menunjukan aktivitas rata-rata menengah

Medium NB + glukosa + laktosa menunjukan aktivitas rata-rata paling rendah

VII. Daftar Pustaka

Lehninger, A.L. (2008),”principle of Biochemistry”,5th Ed., Worth Publisher, Inc.,

New York.

Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. “Biochemistry”, 6th ed. 2006.

W. H. Freeman and Company. (page 892-901)

http://oksyt3tra.wordpress.com/2008/09/26/apa-itu-operon/ - diunduh pada

5 April 2014 pukul 06.10

http://umi.staff.fkip.uns.ac.id/tag/lac-operon/ - diunduh pada 5 April 2014

pukul 06.10