MICROBIOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

1. INTRODUCCION

Existen referencias sobre el consumo de quesos y leches fermentadas que datan de hace mas de 10.000 años, pero los procesos fermentativos se empezaron a conocer hace sólo unos 100 años. A pesar de que el óptico alemán Leeuwenhoek observó por primera vez las bacterias en 1675, la ciencia de la bacteriología no comenzó su desarrollo hasta finales del siglo XIX. Las investigaciones realizadas por Pasteur (Paris) y posteriormente por Orla Jensen (Copenhague), fueron esenciales para estab1ecer una base sólida sobre la que comenzó el estudio de la microbiología de la leche y productos lácteos. El descubrimiento de que las bacterias ácido lácticas (lacti Acid Bacteria, LAB) contaminantes naturales de la leche cruda eran las responsables de las fermentaciones en la leche y productos lácteos, abrió el camino para su aislamiento, caracterización y cultivo. Así nació la industria de los fermentos lácticos que actualmente es una de las más sofisticadas y avanzadas tecnológicamente. Se calcula que para los 14-15 millones de toneladas de queso que actualmente se producen en el mundo, se necesitan unas 1021 bacterias lácticas como inóculo de la de fabricación. No obstante, en la microbiología de las leches fermentadas no lo se incluyen las bacterias lácticas. En los quesos madurados se produce el desarrollo de una flora secundaria inferior, o en la superficie en el caso de los quesos de maduración superficial. Algunas de las especies de esta microflora secundaria pueden tener un efecto negativo sobre la calidad del queso, pero la mayor parte son beneficiosas. El aroma y sabor característicos y la textura típica de cada variedad, están determinados por una compleja combinación entre su flora (y las enzimas que ésta produce), las bacterias lácticas y sus enzimas, las enzimas naturales de la leche, el proceso de fabricación del queso y las condiciones que se establecen en el interior y en el entorno del producto (pH, potencial redox, actividad de agua, concentración de sal, temperatura,

humedad relativa, etc.). La flora secundaria de los quesos, que incluye muchas especies distintas de levaduras, mohos y bacterias, ha sido objeto de numerosas investigaciones, especialmente en los últimos 20 años. Estos estudios se han centrado en el aislamiento, identificación y caracterización de la flora secundaria que tiene efectos deseables; sobre el conocimiento del papel que estos microorganismos desempeñan durante la maduración, y sobre las técnicas para prepararlos comercialmente y utilizarlos para lograr un mejor control del proceso madurativo del queso y así reducir los riesgos de contaminación por microorganismos alterantes.

2. Historia de las bacterias lácticas.

Para comprender mejor la situación actual de las bacterias lácticas que se utilizan industrialmente en fermentaciones lácteas, resulta conveniente repasar brevemente la historia de su desarrollo (tabla 2).

Tabla 2.1 las bacterias caído lácticas en la industria láctea: una revisión histórica.

Antes de 1900 Acidificación natural de la leche que se almacenaba durante toda una noche.La leche se sembraba con lactosuero procedente de la fabricacion anterior.

1857 Pasteur (Francia)- la fermentación acido láctica se debía a la acción de bacterias.Concepto de pasteurización.

1873 Lister aisló Bacterium lactis (ahora lactococos lactis)En torno a 1890 Fermentos en polvo – Chr. Hansen Laboratory (Dinamarca),

pruebas en el Brtitish Dairy Institute (Aylesbury, después Reading).Lloyds experimenta con los cultivos (Somerset Chesse School)

1906 Marshall (EEUU) fabrica cultivos iniciadores.1910 Metchnikoff (Rusia)- efectos positivos de la bacterias del

yogurt sobre la salud.1919 Tesis de Orla Jensen (Dinamamarca) sobre la naturaleza de

los cultivos fermentadores.1930/1940 Whitehead (Nueva Zelanda): conceptos del cultivo puro y de

bacteriófagos.En torno a 1950 Lewis (RU) diseña los sistemas protegidos para la

propagación industrial de los cultivos iniciadores.1960/1970 Cultivos concentrados congelados y liofilizados para la

obtención del fermento para la producción.1980/1990 Comercialización de los cultivos para inoculación directa en

la leche.Modificación genética de las bacterias lácticas.

Antes de que los cultivos estuvieran disponibles en los mercados, los procesos fermentativos dependían de las bacterias lácticas naturalmente presntes en la leche cruda. Quizás estas bacterias lácticas tuvieron su origen en las plantas, aunque esta teoría es discutible porque la fermentación que llevan los lactococos naturales que se3 conocen intervienen distintas enzimas hidrolizantes de la lactosa que de las cepas comerciales. Es posible que estas cepas hayan evolucionado al estar durante un periodo en contacto con la leche. Los primeros maestros queseros dejaban que se acidifique naturalmente, por ejemplo durante toda la noche o bien guardaban un poco de leche para inocular la leche con la que inoculaban la leche al día siguiente.

Los primeros fermentos comerciales fueron preparados por Chr. Hansen Laboratory (Dinamarca) a fines del siglo XIX. Se probaron en el British Dairy Institute (Aylesbury) y en la Somerset Cheese School. En esta última institución Lloyd llegó a la conclusión

de que los fermentos dificultaban la fabricación de un buen queso, probablemente al gran número de baterías lácticas que ya contenía la leche de forma natural.

La empresa Marshall (EEUU) también empezó a preparar fermentos a principios del siglo XX. Estos primeros cultivos comerciales estaban compuestos por una mezcla de cepas indefinidas, obtenías a partir de la leche cruda. Durante la primera mitad del siglo XX, las mezclas industriales se vendían a las queserías y a otras industrias lácteas en forma de fermentos deshidratados o de líquidos que debían ser subcultivados varias veces para su completa activación. Se plantearon dos cuestiones fundamentales que había que resolver para lograr la expansión de los fermentos comerciales: en primer lugar, era necesario definir a cada uno de los cultivos, su composición y características; en sgundo lugar, había que inventar una forma de presentación cómoda para la venta y empleo del cultivo en la industria.

Whitehead en 1930/40 en Nueva Zelanda, fue el primero en emplear los cultivos puros de cepas únicas (cepas lactococos) y también el primero en identificar los bacteriófagos (fagos) como una importante causa de la lenta acidificación en la elaboración de queso (Whitihead y Cox en 1935). El empleo de cepas puras (generalmente de 2-6 cepas del mismo microorganismo), se ha convertido actualmente en sistema de siembra mas utilizado en la leche de quesería.

Además de esos estudios iniciales se ha ido implementado medidas preventivas para evitar la contaminación por fagos tanto en el diseño de las industrias, como en la selección y preparación de los fermentos. Lewis (1956) diseñó un sistema para evitar la contaminación por bacteriófagos durante la propagación de los cultivos, e incluso para la obtención del cultivo final para la producción que se prepara en la propia quesería. Los cultivos «madre» se mantienen en el laboratorio en leche desnatada, esterilizada en botellas reutilizables de (de aproximadamente 100 ml de capacidad) la transferencia de los cultivos se realiza mediante una aguja estéril de doble punta, inyectando el inoculo a través de un cierre de goma desechable colocado en la boca de las botellas a 22°C durante una noche. A continuación el cultivo se inocula en los tanques o fermentadores donde se obtiene el fermento para la producción, utilizando el mismo sistema de la guja de dos puntas. Los fermentadores cerrados contienen leche en polvo desnatada reconstituida (12% de sólidos totales) tratada térmicamente durante 80ºC durante 30minutos; una vez que se in cuba durante 16-18 horas a una temperatura de 22 24°C con el fin de conseguir la actividad suficiente para sembrar la leche de la cuba de quesería.

Los sistemas de Lewis reduce notablemente los riesgos de contaminación por fagos mediante una protección física y sus buenos resultados lo convirtieron en el método de cultivo más utilizado en Gran Bretaña e e Irlanda entre los años 1950 y 1970; los fermentos así preparados eran principalmente mezclas comerciales indefinidas.

Durante las décadas de los años 60 y 70, se desarrollaron los cultivos iniciadores concentrados, que son fermentos cuya actividad permite eliminar los pasos previos y que se pueden inocular directamente en los tanques o contenedores para la obtención del fermento para la producción. Esto cultivos suelen presentarse congelados o liofilizados y se preparan en un medio enriquecido en nutrientes a pH controlados; después el medio se centrifuga para obtener el cultivo concentrado.

Aproximadamente al mismo tiempo, aparecieron en el mercado los medios de cultivo específicamente formulados para inhibir la propagación de los bacteriófagos, que se utilizaban reemplazando total o parcialmente la leche desnatada. Se comprobó que la adición de fosfatos al medio de cultivo inhibe la proliferación de los fagos porque actúan quelando el calcio, que es un elemento imprescindible para que se produzca el ataque fágico. Estos medios de cultivo, elaborados a partir de leche o lactosuero en polvo, con los factores de crecimiento necesarios para las bacterias lácticas y con fosfatos, se utilizaron profusamente en EE UU, a partir de 1970, pero en Europa no se emplearon hasta los años 80.

Durante las dos últimas décadas, se han producido avances de gran importancia en diversos aspectos de la tecnología de los elementos o cultivos lácticos y han mejorado notablemente las técnicas de selección de microorganismos, aumentando su resistencia a los fagos. Los avances en los métodos de fermentación, concentración y conservación de los cultivos iniciadores, han permitido incrementar la producción de ácido láctico hasta unos niveles que posibilitan la inoculación directa del cultivo en la cuba de fabricación - sistema conocido como siembra directa en cuba - eliminando todos los pasos previos de preparación del fermento que se llevaban a cabo en las queserías. Este tipo de cultivos se ha extendido rápidamente desde 1990 y en el Reino Unido, se utilizaban para la elaboración de aproximadamente el 40% de la producción quesera en el año 1995.

El descubrimiento de que el material genético (DNA) de los cultivos iniciadores de quesería (lactococos) contiene DNA extra-cromosómico en forma de plásmidos (Cords el al., 1974) y de que algunos de estos plásmidos codifican importantes funciones tecnológicas (como la producción de acido láctico, la captación de citrato, la actividad proteasa, o la resistencia a los fagos), ha desencadenado el inicio de muchos experimentos y estudios dirigidos a ampliar los conocimientos sobre el mapa genético de las bacterias lácticas. Actualmente, los científicos están modificando los cultivos mediante técnicas de transferencia plásmido/gen con el fin de mejorar y modificar el comportamiento de los fermentos que se utilizan en las queserías y en las industrias de leches fermentadas

3. Microbiología de los cultivos lácticos

En las clasificaciones generales, las bacterias lácticas se dividen en dos grandes grupos: mesófilas y termófilas. Las primeras tienen una temperatura óptima de crecimiento de 30-33°C y son principalmente especies de los géneros Lactococcus (Lc) y Leuconostoc (L). Se utilizan en los procesos tecnológicos cuyas fermentaciones se realizan a temperaturas de 20-40°C. Las bacterias lácticas termófilas presentan una temperatura óptima de crecimiento de 40-45ºC y se emplean cuando los procesos fermentativos se llevan a cabo a temperaturas entre 30-50°C. Las bacterias Lacticastermófilas más importantes son Streptococcus sa1ivarius. Subespecie thermophilus( (llamado simplemente S. Thermophilus) y las especies de lactobacilos lactobacillus del brueckii su especie bulgaricus (al que nos referimos como Lb. Bulgaricus),Lb. El veticus y Lb del Brueckii subespecie lactis (Lb. lactis). Esta clasificación según la utilización, es muy flexible y en muchos casos se emplean cultivos termófilos en fermentaciones a temperaturas menores a la óptima de crecimiento para estas bacterias lácticas (por ejemplo en la producción de quesos brie y Cheddar se siembra thermoplilus). Hay también otras bacterias lácticas asociadas a los

productos lácticos fermentados, como los lactobacilos mesófilos (Lb. Casei, Lb. plantarun) y especies pediococos que se encuentran en los quesos madurados de pasta dura y semidura, que no se consideran bacterias lácticas iniciadoras. Además, hay otras bacterias lácticas que pueden tener efectos beneficiosos para la salud, como Lb. acidophilus, Lb reuteri y las especies de bifidon bacterium. En la Tabla 2.2 se resumen algunas de las características de las bacterias lácticas utilizadas como cultivos iniciadores. Cords et al., en 1974, descubrieron que el material genético de los lactococos contenían DNA cromosómico y DNA en forma de plásmidos - pequeñas moléculas de DNA independientes. El tipo de plásmidos varía según las cepas y se ha comprabado que algunos plasmidos codifican funciones de gran importancia industrial,como las encimas proteolíticas, en el metabolismo de la lactosa, la captación de citrato, la resistencia a loa fagos y al aproduccion de bacterias. Las funciones que dependen de los plásmidos se consideran bastante inestables, durante la replicación celular se puede perder el plásmido, y parece que ésta puede ser la explicación de la aparición de variantes de crecimiento lento en una población bacteriana. En cualquier caso, dado que existen que Existen técnicas muy sencillas para transferir plásmidos de una cepa de lactococos a otra (por ej. La conjugación ), se están llevando a cabo numerosas investigaciones para aplicar las técnicas de ingeniería genética sobre el DNA de los plásmidos y modificar funciones tecnológicamente importantes, en especial, la resistencia a los fagos.

Tabla2.2 algunas características diferenciales de las bacterias lácticas que componen los cultivos.

TipoEspecie F

orm

a

Crecimiento a

Isóm

ero

del

láct

ico

Met

abol

ism

o d

e ci

trat

o

Met

abol

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o d

e la

ga

lact

osa

Pro

du

cció

n d

e am

onia

co a

par

tir

Inhibición

% sal

Productos metabólico

s importante

s10ºC

40ºC

45ºC

MESÓFILOSLactococcus lactisSubsps. lactis

coco + + - L(+) - + + 4.6-6.5 Lactato

Lactococcus lactis.Subsps lactis(-cit+)

coco + + - L(+) + + + 4.6-6.5Lactato

DiacetiloCO2

Lactococcus LactisSubsps. crémoris

coco + - - L(+) - + - 2.0-4.0 lactato

Leuconostoc mesenteroidesSubsps. crémoris

coco + - - D(-) + + - 2.0-4.0Lactato

DiacetiloCO2

Leuconostoc lactis

coco + - - D(-) + + - 2.0-4.0Lactato,diaceti

lo,CO2

TERMÓFILOS Streptococcus thermophilus

coco- + + L(+) - - - < 2.0

Lactato, acetaldehído

Lactobacillus bulgaricus

bast

onci

to

- + + D(-) - - - < 2.0Lactato,

acetaldehído

Lactobacillus helveticus

bast

onci

to

- + + DL - + - < 2.0 Lactato

Lactobacillus lactis

bast

onci

to

- + + D(-) - - +/- 2.0-4.0 lactato

3.1 Bacterias láctica mesófilas

Los taxonomistas clasifican como una única especie los lactococos que se utilizan en la industria láctea: lactococcus lactis. Esta especie se divide en dos subespecies (sbsps): lactis y cremoris, que corresponden a las bacterias lácticas que antes se denominaban Streptococcus lactis y Streptococcuss cremoris (Schleifer et al., 1985).

Algunas cepas de Lc. lactis son capaces de metabolizar el citrato que contiene la produciendo diacetilo que es uno de los principales compuestos responsables del aroma y generando dióxido de carbono (CO2) en la misma reacción. Estas características presentan un gran interés tecnológico en algunas fermentaciones lácticas, pero como todas las cepas se clasifican taxonómicamente como Lc. Lactis (la función de metabolización del citrato está codificada por plásmidos), no se especifican ni se clasifican como especies o subespecies diferentes. Estos lactococos se suelen llamar citrato positivo (Cit+) o cepas biovariantes diacetylact,s de Lc. Lactis. Estas bacterias lácticas fueron descritas por primera vez por Matuszewski et al. (1936), cuando se les denominó Streptococcus diacetylactis, pero no obtuvieron más que el nivel de subespecies en la 8ª edición del Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Buchanan y Gibbons, 1974). Lc. lactis es homofermentativo y metaboliza la lactosa produciendo ácido L(+) láctico vía la ruta glicolítica (Fig.2.1).Resulta interesante destacar que la inmensa mayoría de los

cultivos iniciadores mesófilos utilizados para la producción de queso en todo el mundo, están constituidos por una sola especie; pero no hay que olvidar que el número de cepas de cada una de las especies es infinito y cada cepa presenta unas características diferentes en su velocidad de crecimiento, intensidad metabólica, sensibilidad a los fagos, actividades proteolíticas, formación de aromas, cte., y es el control y dirección de estas diferencias junto con el empleo de as distintas técnicas de fabricación quesera, lo que hace que una determinada especie tenga muchas aplicaciones industriales distintas. Tradicionalmente, Lc. lactis sbsps. cremoris se considera el fermento de quesería más importante, mientras que Lc. lactis sbsps. lactis se utiliza menos porque se asoció al origen de aromas y sabores extraños (Law y Sharpe, 1978). Durante la pasada década, Lc. lactis sbsps. lactis se ha empezado a aplicar con más frecuencia porque presenta una gran capacidad de resistencia a las condiciones adversas a las que se ven sometidos los microorganismos durante la producción de los cultivos industriales concentrados y además, porque con el perfeccionamiento de las técnicas de selección de cepas, prácticamente ha quedado resuelto el problema de los aromas extraños.

El otro grupo de bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores mesófilos pertenece al género Leuconostoc (antes conocido como betacocos). La principal diferencia que presentan con respecto a los lactococos es que producen una cantidad de ácido láctico notablemente menor. Leuconostoc fermenta la lactosa por la ruta hetefermentativa de la fosfoketolasa, en la que además de ácido láctico se produce CO2 y etanol; estas bacterias también uti1zan el citrato y, como resultado de la metabolización conjunta de la lactosa y del nitrato, se produce un cambio en los productos metabólicos finales, pasando el etanol a acetato. Dado su escaso poder acidificante, los microorganismos del género Leuconostoc se siembran con los lactococos para potenciar la formación del aroma, especialmente en los quesos frescos y en variedades de maduración muy corta. Leuconostoc mesenteroides sbsps. mesenteroides, produce una gran cantidad de CO2 y se añade en la fabricación de algunos quesos de pasta azul (como el Roquefort y el Stilton) para conseguir una pasta de textura más abierta que facilite la distribución del moho Penicillium roqueforti en el interior de la masa del queso.

3.2 Bacterias lácticas termófilas

Sin ninguna duda, las bacterias lácticas termófilas más utilizadas son S. termophilus y L. Bulgaris, que se siembran conjuntamente para obtener toda la gama de yogures disponible en el mercado. No existe un acuerdo general sobre su clasificación exacta; Farrow y Collins (1984), demostraron que S. termophilus y S. salivarius son espacies muy próximas que presentan una gran homología entre las secuencias de sus DNA y propusieron la clasificación de S. thermophilus como una subespecie de S. salivarius. Scheifer y Kilpper-Bolz (1987) encontraron suficientes diferencias fenotípicas como para justificar que son dos especies distintas. En la industria láctea solamente tienen interés dos especies de lactobacilos termófilos: Lb. helveticus y Lb. Delbrueckii. Antes, Lb. Bulgaricus y Lb. lactis se clasificaban como dos especies distintas, pero actualmente se consideran, subespecies de Lb. delbrueckii. También en este caso denominaremos a estas bacterias 1ácticas Lb. lactis y Lb. bulgaricus. Las bacterias lácticas termófilas son más ácidotolerantes que las mesófilas y hacen descender el pH de la leche fermentada hasta valores

Lactosa de la leche

Lactosa - P

Captación de lactosa a través de PEP y PTS

Galactosa 6-P

Tagatos 6 -PRuta (de la tagatosa 6-P)

Tagatosa -1,6- diP

P –β-Gal (Glicólisis o ruta de Embden Meyerhof )

Glucosa

Glucosa 6-P

Fructosa 6-P

Fructosa 1,6 - diP

Gliceraldehído 3-P Dihidroxiacetona-P

3-fosfoglicerato

1,3 – difosfo glicerato

*Piruvato

Fosfoglicerato

2-fosfoglicerato

L (+) lactato

Lactato deshidrogenasa

Nota: a partir de una molécula de lactosa se forman cuatro de lactato

*Paso en el que se forma energía (ATP)

Figura 2.1 metabolismo homofermentativo de la lactosa Lc. Lactis

muchas veces inferiores a 4.0; de todas ellas, la que presenta mayor poder acidificante es Lb. helveticus (consultar la tabla 2.2 para ver las principales características). Otra diferencia muy importante entre las bacterias lácticas termófilas desde punto de vista taxonómico, pero sobre luto económico, es su capacidad para metabolizar la galactosa, que constituye la mitad de la molécula de lactosa. Solamente metaboliza la galactosa Lb. helveticus (y posiblemente algunas cepas de Lb. lactis), mientras que el resto, excretan la galactosa al medio. Turner y Martley (1983) sugirieron que las cepas Gal+ de Lb. Lactis están incorrectamente clasificadas y propusieron su inclusión como Lb. helveticus. La acumulación de galactosa en el medio puede causar problemas en determinados productos lácteos. Por ejemplo, este azúcar puede ser utilizado como fuente de energía por las bacterias lácticas que no forman parte de los cultivos iniciadores en las variedades de queso Suizo produciendo aromas extraños. En los quesos Pizza y Mozzarella, la presencia de galactosa origina pardeamientos (reacción (le Maillard) durante el horneado de las pizzas (Johnson y Olson, 1 985).

4. Microbiología de la flora secundaria

Hay un gran número de microorganismos que pueden desarrollarse en la superficie y en el interior de la pasta de los quesos madurados. Esta microflora es muy dependiente del tipo de queso y de las técnicas de elaboración y, en muchos casos, está constituida por una compleja mezcla de distintos microorganismos. A pesar de que la relación existente entre la presencia de microorganismos, la producción de enzimas y el desarrollo de la textura y flavor del queso, resulta muy difícil de establecer, en los últimos veinte años se ha hecho un gran esfuerzo para aislar las especies industrialmente importantes, caracterizarlas y conocer el papel que desempeñan en el queso. El estudio de estos microorganismos tiene mucho interés con el fin de controlar y regular el desarrollo de la textura y del flavor, pero también es fundamental para «copiar» el aroma y sabor que imparte la leche cruda y tratar de reproducirlo en los quesos elaborados con leche pasterizada. En la Tabla 2.3 se relacionan los principales microorganismos de la flora secundaria.

Tabla 2.3: flora secundaria de los productos lácteos fermentados

Tipo microorganismo Tipos de queso

Mohos

Penicillium camemberti

Geotrichum candicum

Penicillium roquefortePenicillium nalgiovensisVerticillium lecanii

Quesos blandos madurados por mohos (Brie, Camembert, Coulommier).Quesos blandos madurados por mohos (Brie, Camembert, Coulommier).Quesos de pasta azul (Azul Danés, Roquefort, Stilton ).TommeTomme

levaduras Kluyderomyces lactis

Saccharomyces cerevisiae

Candida utilis

Debaryomyces hansensii

Azules, blandos madurados por mohos y fermentos del rojo, de corteza lavada.Azules, blandos madurados por mohos y fermentos del rojo, de corteza lavada.Azules, blandos madurados por mohos y fermentos del rojo, de corteza lavada.Azules, blandos madurados por mohos y fermentos del

Rhodoporidium infirmominiatum

Candida kefir

rojo, de corteza lavada.Azules, blandos madurados por mohos y fermentos del rojo, de corteza lavada.Kéfir.

Bacterias

Cornybacteria

Micrococcus sps.

Lactobacillus sps.Pediococcus sps.Propionibacteria

Quesos madurados por fermentos del rojo, de corteza lavada.Quesos madurados por fermentos del rojo, de corteza lavada.Pastas duras y semidurasPastas duras y semidurasQuesos de tipo Suizo.

4.1 Mohos

a. La especie más importante en los quesos madurados superficialmente por mohos es Penicillium camemberti. Hasta hace muy poco tiempo se distinguía dos especies: P. camemberti (algunas veces P. album), cuyo micelio imparte a la superficie del queso un color blanco-grisáceo y P. candidum (llamado también E. caseicolum), que produce un micelio totalmente blanco. Actualmente, se considera que ambas son variantes de la misma especie, llamada P. camemberti. Se han identificado muchas cepas distintas de P. camemberti y hasta se ha recomendado la utilización de unas u otras según las distintas técnicas de fabricación de estos quesos de pasta blanda . Moreau (1979), propuso la clasificación de las cepas en cuatro grupos basados en el crecimiento del micelio:

1 Forma Neufchatel (crecimiento rápido con producción de un micelio grueso y de color amarillento).

2 Micelio corto y liso (crecimiento rápido, hifas juntas y lisas).3 Micelio extendido y largo (crecimiento lento, hifas largas y sueltas).4 Micelio algodonoso y hueco (hifas blancas que con el tiempo adquieren un

color gris forma original de P. camemberti (P. album)).

b. Geotrichum candidum se suele utilizar en combinaciones con P. camemberti y produce un micelio fino y corto en la superficie de quesos maduros por mohos como Camemberti, Brie y Pont L'Eveque. También forma una característica corteza grisácea en la superficie del queso St. Nectaire. Algunas cepas imparten a la superficie del queso un aspecto parecido al de la levadura, que se conoce como piel de sapo. S un moho aerobio que crece muy rápidamente en la superficie del queso en donde ejerce un efecto sinérgico sobre el desarrollo de P. camemberti y Brevibacterium linens.

c. Penicillium Roqueforti es el moho azul de quesos como roquefort, Stilton, Blue D'Auvergne, Gorgonzola, Azul Danés… Se caracteriza por sus conidióforos (cuerpos carnosos) con típicas paredes rugosas; sus hifas son lisas y generalmente de color azul – verdoso. Las diferentes cepas presentas actividades lipolíticas y proteolíticas de distinta intensidad y colores característicos que van desde azul oscuro hasta el verde claro; también se han encontradas mutaciones de color blanco. P. Roqueforti puede crecer a temperaturas de refrigeración (4-10ºC) y con altas concentraciones de sal. Es un moho microaerófilo que se desarrolla bien cuando la concentración de oxígeno es baja.

4.2 Levaduras

Las levaduras representan una parte importante de la microflora de muchos quesos de maduración superficial por mohos, especialmente en los quesos azules, quesos de pasta blanda, St Nectaire, St. Paulin, Cantal. Los géneros mas frecuentes son Kluyveromyces, Candinda, Debaryomyces y Saccharomyces. Estas levaduras colonizan la superficie del queso desde el comienzo de la maduración, pueden crecer en concentraciones salinas del 4% y tienen uros intensa actividad neutralizante en virtud de su capacidad para metabolizar el lactato. Además son proteolíticas y lipolíticas y originan la formación de numerosos compuestos volátiles, así como de péptidos y aminoácidos sápidos. También se han encontrado levaduras en quesos de pasta dura y semidura, en los que generalmente se consideran microorganismos contaminantes, a pesar de que pueden potenciar el desarrollo del flavor(Forss, 1969). Otros productos fermentados como el como el kéfir, el laban y el koumiss, contienen levaduras que crecen en asociación con las bacterias lácticas (por ej., en los granos de kéfir). Entre las levaduras aisladas en productos de este tipo pueden citarse Saccharomyces (especies Delbrueckii, cerevisiae, exiguus), Kluyveromyces fragilis, candida kefir y candida pseudotropicalis (Marshall, 1984).

4.3 Bacterias

Los grupos de bacterias más importantes como componentes de la flora secunda de Tos quesos, son: micrococos, lactobacilos, pediococos, corynebacterias (bacterias rojas) y bacterias propiónicas.

a. Corynebacteria. Entre estas bacterias, la especie que más interesa a la industria láctea es Brevibacterium linens (B. linens). Esta bacteria es la responsable del color anaranjado y del olor característico (originado a partir de los aminoácidos sulfurados) de los quesos de superficie lavada como el Munster, Maroilles, Pont L'Eveque, St. Paulin, Gruyére, Beaufort y los quesos Camembert y Limburger de elaboración tradicional (con leche cruda). El color que produce B. linens varía según las cepas desde naranja fuerte, amarillo, hasta marfil-crema. Estas bacterias son Gram+, aerobias y necesitan condiciones de pH neutro para crecer rápidamente. Su temperatura óptima de crecimiento es de 20º a 30º C, aunque algunas cepas se desarrollan bien a 10°C en general son bastante halotolerantes.

La microbiología de la superficie de los quesos de corteza lavada es una compleja mezcla de , micrococos, mohos y levaduras. El crecimiento de B. linens comienza una vez que el pH se eleva como consecuencia de la degradación del lactato que llevan a cabo las levaduras y los mohos Las corynebacterias metabolizan triglicéridos, péptidos y aminoácidos y son microorganismos que presentan una gran actividad proteásica, aminopeptidásica y lipolítica.

b. Micrococci Los micrococos son bacterias aerobias, halotolerantes y capaces de crecer a 10-20°C. Representan una parte importante de la flora de los quesos de

corteza lavada, pero también se encuentran en el interior de los quesos de pasta dura, semidura y quesos blandos madurados por mohos. Investigaciones recientes indican que pueden desempeñar un importante papel en el proceso madurativo de los quesos, ya que se han aislado cepas con gran poder proteolítico y lipolítico (Bhowmik y Marth, 1990). Las especies que con mas frecuencia se encuentran en el queso son Micrococus Caseolíticos, M. Freudenreichii y M. varians.

c. Lactobacilli y Pediococci. Los microorganismos dominantes en la flora secundaria de muchos quesos de pasta dura y semidura (como Cheddar, tipos suizos, variedades italianas, Gouda, Edam), son lactobaci1os mesófilos como las especies homofermentativas Lb. casei subsps. Lb. casei subsps. Pseudoplantarum, Lb. plantarum, Lb. curvatus , y el heterofermentativo Lb. brevis. En el queso Cheddar también se han aislado pediococos, aunque en una proporción muy inferior (Bhowmik y Marth, 1990; Bhowmik et al., 1990; Dacre, 1958; Thomas y Crow, 1983). Los lactobacilos son bacterias Gram+, catalasa-, no esporuladas, inmóviles, con forma de bastoncito y anaerobios facultativos. En la leche crecen muy lentamente, pero aunque se encuentran en pequeño número en la leche de quesería, pueden llegar a alcanzar poblaciones de 107 – 108 células/gramo en un queso de 2-3 meses.

d. Propionibacteria. Las bacterias propiónicas (principalmente la especie propionibacterium freudenreichii) se utilizan elaboración de los quesos de tipo suizo (Emmental, Gruyére, Appenzell). Pueden convertir el lactato producido por las bacterias lácticas en compuestos aromáticos como propionato, acetato y CO2, que es e1 gas responsable de la formación de ojos en estos quesos:

3 CH3 CHOHCOO- 2CH3 CH2 COO- + CH3 COO- + H20 + CO2

LACTATO PROPIONATO ACETATO

El número de bacterias propiónicas en un queso de pasta cocida a los 20-30 días de su fabricación es del orden de 108-109 células/gramo (Steffen et al., 1993).

5. Funciones de los fermentos lácticos.

Las principales funciones de las bacterias lácticas; que componen los cultivos iniciadores son: la acidificación, la mejora de la textura y el desarrollo del flavor. Las bacterias lácticas parecen tener algunos efectos beneficiosos para la salud, pero este aspecto no se tratará en este capítulo.

5.1 Acidificación

La principal función de las bacterias lácticas es la acidificación de la leche.Transforman la lactosa en ácido láctico, bajando el pH del medio hasta valores que inhiben el crecimiento de microorganismos patógenos y alterantes. Además, la acidificación favorece la expulsión de suero de la cuajada durante el proceso de elaboración del queso, reduciendo el contenido en humedad y

ejerciendo así un mayor efecto conservante. A este respecto, la adición de sal al queso recién obtenido, bien por salado en seco o por inmercion en salmuera, también tiene un efecto conservante; la concentración final de sal en el queso generalmente está comprendida entre el 1% y el 2,5% y con un contenido medio en humedad del 40%, la disolución salinaalcanza concentraciones del 2,50-6,25%. Conviene recordar que para un cultivo iniciador que está creciendo en la leche, el ácido láctico es simplemente un producto residual del metabolismo de la lactosa, ruta que las bacterias utilizan para producir energía en forma de adenosín-tri-fosfato (ATP).

No todas las bacterias lácticas metabolizan lactosa de la misma forma. En Lc. Lactis, la lactosa es transportada activamente a través de la membrana de la pared como lactosa-fosfato (lactosa-P) por un sistema fosfo-enol-piruvato-fosfo-transferasa (PEP-PTS). La lactosa-P es hidrolizada en glucosa y galactosa-6-P por 1aenzima fosfo-β-galactosidasa (Pβgal). La glucosa se metaboliza siguiendo la ruta glicolítica hasta L(+) lactato (ver Fig. 2.1). El ácido láctico es el único producto final; sin embargo en determinadas circunstancias como una baja concentración de glucosa, altos niveles de galactosa, o en presencia de maltosa, se pueden producir además otros matabolitos corno formato, etanol, y acetato (Thomas et al., 1980).

Las bacterias lácticas termófilas también fermentan la lactosa por la ruta glicolítica, pero con algunas diferencias respecto al Lc. lactis: la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa está catalizada por una β-galactosidasa (β-gal). El mecanismo de transporte de la lactosa todavía no está totalmente aclarado; para S. thermophilus se ha propuesto un sistema en el que interviene un protón (Poolman, 1990; Hutkins y Ponne, 1991). Solamente Lb. helveticus (y probablemente algunas cepas de Lb. Lactis) son capaces de metabolizar la galactosa por la ruta de Leloir (la galactosa se fosforila a galactosa-1-P, que se convierte en glucosa-1-p y después en glucosa-6-P. forma en la que ingresa a la ruta glicolítica). Las bacterias lácticas termófilas originan diferentes isómeros del ácido láctico (ver Tabla 2.2 y Fig. 2.2): S. termophilus produce L(+) lactato; Lb. bulgaricus y Lb. lactis producen ácido láctico D(—) y Lb. Helveticus una mezcla de ambas formas.

Las bacterias del género Leuconostoc hidrolizan la lactosa mediante la enzima β-gal; a continuación, la glucosa es metabolizada por la ruta de la fosfoketolasa (PK) con producción de D(—) lactato, etanol y CO2. En este aspecto, las bacterias Leuconostoc son heterofermentativas estrictas.

La cantidad de ácido láctico que contiene un queso recién elaborado varía en función de las técnicas de fabricación. Se han señalado valores del 1%, 1,4%, 1,5% y 1.7% para los quesos Camembert, de tipo Suizo, Cheddar y Romano respectivamente.

Forma L (+) Forma L(-)

Figura 2.2

(Cogan e. Hill 1993), siendo el L (+) láctico el isómero dominante. No obstante, en los quesos el lactato sufre posteriormente diversas modificaciones: la flora delos quesos madurados por mohos/bacterias degrada el lactato en CO2

y H2O, produciendo un aumento del pH superficial que favorece el crecimiento microbiano y la rápida proteólisis en las variedades del tipo suizo, las bacterias propiónicas transforman el lactato en propionato, acato y CO2 ;en el queso cheddar y similares las bacterias lácticas que no forman parte de los cultivos iniciadores, racemizan el lactato L(+)a la forma D(-), que es menos soluble y a partir se pueden formar cristales de lactato cálcico que imparten al queso una indeseable textura granulosa y un aspecto superficial de color blanquesino.

5.2 Desarrollo de la textura.

la textura de los quesos obtenidos por coagulación enzimática es el resultado de una serie de complejas interacciones entre los componentes de la leche (grasa, proteínas , etc.), las enzimas coagulantes, las actividades del cultivo iniciador de la flora secundaria (acidificación, proteólisis, lipólisis), el proceso de fabricación del queso y los factores ambientales que lo rodean (Tº, Hº). Durante la elaboración la acidez intensifica la retracción del coágulo acelerando la expulsión del suero y se obtiene una cuajada menos húmeda cuya sinéresis aumenta posteriormente con el calentamiento o escaldado y con el prensado. La acidez final o los valores de pH de la cuajada determinan en gran parte la textura final del queso. Los quesos con un ph elevado alrededor de 5.2-5.5 (por ejemplo las variedades holandesas), presentan una textura elástica o plástica porque los agregados proteicos se encuentran en u8na forma globular parecieran a la presentan en la leche (de 10 a 15 nm. de diámetro). En los quesos de pH bajo (pH 4.8) como los ingleses Cheshire y Lancashire, los agregados proteicos son más pequeños (de 3 a 4 nm.) y la textura se define como de pasta corta no cohesiva o demenuzable. El cheddar presenta una textura intermedia entre estos dos extremos. Durante la maduración la textura del queso se modifica por efecto de la acciones conjuntas de la bacterias lácticas la flora secundaria, las enzimas excretadas (especialmente las proteolíticas) y en las condiciones en las que se mantiene el queso durante ese periodo. Por ejemplo en los quesos de pasta blanda madurada por mohos, la textura es inicialmente firme y yesosa, pero evoluciona hasta convertirse en

COOH

C HHO

CH3

COOH

C OHH

CH3

una textura blanda, casi “fluida” por acción de la flora secundaria (P. camemberti y levaduras) que neutraliza el acido láctico y va hidrolizando la casina por acción de sus enzimas proteolíticas.

La textura de las leches fermentadas depende esencialmente del acido láctico producido por la bacterias lácticas. En la fabricación de estos productos no se añaden enzimas coagulantes y la coagulación se produce como consecuencia del progresivo descenso del pH hasta el punto isoeléctrico de las caseínas, momento en el que se estabilizan y precipitan. A continuación algunos se productos se escurren, centrifugan por ultrafiltración con la finalidad de aumentar el contenido de sólidos totales y lograr una textura mas consistente (por ejem. Algunos quesos frescos y el quark).

Algunas leches fermentadas (como el lactosuero acidificado y los yogures, con acepción del yogur griego) son productos no concentrados y por lo tanto su textura final depende exclusivamente de los componentes de la leche (contenido graso, sólidos lácteos añadidos), los estabilizantes, el tratamiento térmico (grado de desnaturalización proteica), y las condicione de incubación.

El empleo de bacterias lácticas productoras de exopolisacáridos (EPS) puede mejorar notablemente la textura y/o viscosidad del producto. Con esta finalidad las mas utilizadas son cepas de S. thermophilus y Lb. Bulagaricus, aunque también hay alguna s cepas de Lc. Lactis.

5.3 Contribución al flavor.

En los quesos madurados de pasta dura o semidura corno el Cheddar, el aroma y el flavor son consecuencia de una serie de complejas reacciones interconexionadas que todavía no están completamente dilucidadas. Entre los factores que afectan al flavor se pueden señalar la composición de la leche, los tratamientos térmicos a los que se ha sometido las bacterias lácticas, la flora secundaria, el pH, la relación sal/humedad, las enzimas naturales de la leche (por ejm. la plasmina), las enzimas coagulantes, el proceso de maduración del queso y las condiciones de maduración. El papel exacto que desempeñan las bacterias lácticas en el desarrollo del flavor no se conoce, pero la importancia de su acción se ha demostrado comparando quesos obtenidos por acidificación directa con quesos acidificados por las bacterias lácticas elaborados en condiciones asépticas. Las bacterias lácticas pueden contribuir al flavor de tres formas: en primer lugar modificando las condiciones del medio para que tengan lugar las reacciones enzimáticas y no enzimáticas. Por ejemplo por acidificación y cambios del potencial redox en el queso; en segundo lugar, produciendo metabolitos que contribuyen al flavor directamente a partir de lactosa y del citrarto; y por ultimo hidrolizando las proteínas de la leche (y la grasa) liberando Péptidos, aminoácidos y compuestos volátiles.La adicion de determinadas enzimas proteolíticas para acelerar el desarrollo del sabor y aromna del queso o para potenciarlo a sido un tema muy estudiado en los últimos 15 años. Law y wigmore (1983) utilizaron extractos muy ricos en peptidadasas, obtenidos de Lc. Lactis, junto con una proteasa neutra extraida de Bacllus subtilis para potenciar el flavor del cheddar.

Un método desarrollado posteriormente consiste en añadir a la leche de quesería un gran número de lactocos seleccionados que aunque presentan una alta actividad peptidásica, son metabolicamente inactivos (para evitar una acidificación excesiva).

La contribución de las bacterias lácticas al flavor de las leches fermentadas se conoce meior que en los quesos madurados. En los productos obtenidos con cultivos mesófilos (nata fermenteda, queso fresco, queso blanco, queso cottage, mantequilla), el principal componente del aroma es el diacetilo, que se produce a partir del citrato de la leche por la acción de Lc. lactis biovar. Diacetylactis y L. mesenteroides sbsps. cremoris.

En los productos fermentados por bacterias lácticas termófilas (esencialmente Lb. Bulagaricus y el S. termophilus), el principal componente del aroma es el acetaldehído, que en cantidades de 20-40 ppm imparte el óptimo flavor; otros componentes del aroma como el diacetilo y la acetona, se encuentran proporciones muy inferiores. No resulta fácil determinar cuál es la contribución individua1 de Lb. bulgaricus y de S. termophilus en la producción total de acetaldehido a partir del piruvato, pero se cree que Lb. bulgaricus sólo es capaz de generar cantidades muy pequeñas por esta vía. Se ha sugerido que la principal ruta de producción de acetaldehido es a partir de la treonina, por esta via el principal productor de acetaldehido es Lb. bulgaricus aunque también el S. thermophilus puede seguirla cuando esta en cultivo puro.

6. función de la flora secundaria

En general, la flora secundaria modifica la textura y el flavor como resultado de su crecimiento, su actividad metabólica y la producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas. En los quesos de pasta blanda madurados por mohos, la flora inicial esta constituida esencialmente por las bacterias lácticas utilizadas como cultivo iniciador. Aproximadamente a los tres días de haberse fabricado el queso, el crecimiento de las levaduras forma una capa superficial de unas 200 µm de espesor y comienza también el desarrollo de Geotrichum candidum. Al cabo de una semana el crecimiento del micelio de P. camemberti forma una pelucilla blanca (las hifas) en la superficie. Tanto las levaduras como los mohos metaolizan el lactato, reduciendo así la acidez la parte externa del queso y permitiendo el crecimiento de la flora secundaria menos acido-tolerante como corinebacterias (especialmente B. linens).

El P. camemberti participa en la hidrólisis de las caseínas porque presenta actividad proteinasa y actividad peptidásica, rindiendo péptidos y aminoácidos; después estos aminoácidos se degradan y dan lugar a la formación de distintos compuestos aromáticos como amoniaco, aldehídos, aminas y metanotiol. Los mohos también ejercen una intensa actividad lipolítica sobre la grasa de la leche, degradando el 5-20% de los triglicéridos hasta ácidos grasos libres y otros compuestos madurados por mohos como las metilcetonas. La lipólisis es mucho más intensa en los quesos madurados por mohos que en el resto de los quesos. La actividad neutralizante de los mohos junto con su poder proteolítico, produce una importante modificación de

la textura de los quesos de pasta blanda que pasa de ser firme y yesosa a la típica textura blanda, untuosa, casi fluida que presentan los quesos de pasta blanda madurados por mohos. En el desarrollo del aroma, desempeñan un papel fundamental los compuestos sulfurados, producidos por B. linens y por los mohos B. linens posee activos equipos enzimáticos de proteínas y peptidasas que proteolizan intensamente las caseínas liberando una gran cantidad de aminoácidos a partir de los cuales se generan los compuestos volátiles sulfurados típicos de los quesos madurados superficialmente por bacterias. Además, B. linens es también muy lipolítico produciendo enzimas liasas, carboxilesterasa y glicerol-ester hidrolasas.

En los quesos de pasta azul, P. roqueforti es el microorganismo determinante de la textura y del aroma. Tiene una gran actividad proteolítica y actúa sobre la caseína α y β mediante la acción de muchas proteinasas y peptidasas distintas (metaloproteinasa, aspartato proteinasa, proteinasa alcalina).

En los quesos de pasta dura y semidura, la flora secundaria dominante esta constituida por bacterias lácticas, fundamentalmente por 1actobacilos mesófilos. No se han determinado cuales son los substratos que utilizan las bacterias lácticas como fuente de energía en el interior de la masa del queso. Después de la elaboración, solo queda en la pasta una pequeña cantidad de lactosa residual, que no parece suficiente para el crecimiento de los lactobacilos; por lo tanto, deben utilizarse otras energías como la galactosa, citrato, lactato, material de la autolisis de las bacterias del fermento, aminoácidos libres, péptidos, azucares liberados en la proteólisis de las caseínas y glicerol procedente de la lipólisis.

7. Selección producción y utilización de las bacterias lácticas.

7.1 Selección de las bacterias lácticas.

Dado que la industria quesera utiliza cada vez mas cultivos iniciadores concentrados que únicamente contienen Lc. lactis, como cepas únicas o mezclas de cepas definidas. Las posibles fuentes para obtener nuevos fermentos son la vegetación verde, la leche cruda , los productos lácteos fermentados y las colecciones de microorganismos. En la practica esras tres últimas fuentes son las más importantes, pero además actualmente existe un gran interés en la mejora de la característica de los cultivos existentes, especialmente a lo que se refiere a su resistencia a los fagos. Las cepas únicas se aíslan y se purifican en un medio de cultivo adecuado, como el agar M17 para lactococus y S. thermophilus o en medio RS para lactobacilos. Cuando se aísla una cepa se procede a su clasificación y se comprueba su posible utilidad como cultivo iniciador (tabla 2.4).

Tabla 2.4 pruebas para la selección de las bacterias lácticas para los cultivos iniciadores

Objeto Pruebas que se realizanFermentación de la leche

Efectos sobre el aroma/texturaVelocidad de acidificación (a diferentes temperaturas)Insensibilidad a los fagos(en relación con otras cepas)Compatibilidad con otras cepas (ausencia de producción de bacteriocinas).Resistencia a las temperaturas de cocción Actividad proteolíticaHalotolerancia.Características especiales (ejemplo producción de mucopolisacaridos)Estabilidad de sus características.Resistencia a la aglutinación.

Producción de cultivos Rendimiento en la fermentación industrial.Concentrados.Mantenimiento de la viabilidad/actividad durante el proceso de fabricación.Estabilidad en forma liofilizada/congelada.Actividad en forma de cultivos para inoculación directa.

Una vez seleccionada la cepa es posible modificar algunas de sus características con la finalidad de mejorar su comportamiento en las aplicaciones industriales. Se sabe desde hace un tiempo que al poner en contacto una cepa sensible a un fago con un fago virulento, sobreviven las cepas mutantes insensibles a ese fago (BIMs). Con estas cepas es posible obtener nuevos cultivos para utilizarlos en las queserías en las que las cepas originales serian rápidamente inactivadas por los fagos contaminantes. Sin embargo las cepas BIM requieren unas pruebas de comportamiento muy rigurosas, porque es posible que ni sean aptas para la fabricación de queso debido a su lenta velocidad de acidificación.

En los laboratorios de investigación se realiza actualmente la transferencia de material genético entre cepas de lactococos. El DNA puede ser de origen cromosómico o plasmídico y la transferencia se puede llevar a cabo por distintas técnicas cono la de conjugación entre células, se consideran sistemas naturales y en general están admitidas como seguras e inocuas.

Una vez que se ha comprobado que una determinada cepa puede utilizarse en los fermentos hay que mantenerla sin que s produzca mutaciones o modificaciones con el fin de obtener exactamente los mismos resultados en cada fabricación industrial. Generalmente las cepas se cultivan en leche desnatada en polvo reconstituida esterilizada y se conservan en ampollas en

forma congelada o liofilizada. En algunos casos con los cultivos liquidos se impregnan unas perlas de vidrio que luego se conservan en congelación. Normalmente se aconseja mantener los cultivos entre -70 y -196, los fermentos liofilizados pueden conservarse en refrigeración.

7.2 Producción de las bacterias lácticas.

Lo cultivos se presentan en distintas formas dependiendo de su utilización en la industria láctea. Los cultivos comerciales pueden clasificarse en tre grupos: cultivos de inoculación directa, cultivos para preparar fermento para la producción; y cultivos que requieren una activación previa (fermentos tradicionales). Para comprender el proceso industrial de preparación de cultivos, resulta imprescindible conocer los parámetros de crecimiento de las bacterias lácticas. El desarrollo de las bacterias lácticas en la leche sigue las curvas típicas en las fases de latencia, multiplicación logarítmica y estacionaria. Cuando crecimiento llega a la fase estacionaria se ha alcanzado un numero de células de 108 -109 ml-1 y a partir de ese momento, las divisiones celulares son inhibidas por el acido láctico producido (pH4.5 – 4.5). Si durante la multiplicación del cultivo la acidez se neutraliza mediante un sistema tampón o controlando el pH, la fase logarítmica de crecimiento se prolonga y antes de llegar a la fase estacionaria, es posible alcanzar poblaciones de 109- 1010 células/ml. La eliminación de lactato por ultrafiltración permite que continúe la fase de crecimiento hasta 1010- 1011 células/ml. Estas técnicas se utilizan para la producción industrial de cultivos iniciadores concentrados y para ello se dispone de muchos medios de cultivo distintos.

7.3 Utilización de los cultivos iniciadores

a. La obtención del fermento para la producción. La mayor parte de los cultivos iniciadores que se encuentran en el comercio son d siembra semidirecta y sirven para preparar el fermento para la producción; es decir un cultivo con el suficiente volumen, numero de microorganismos y actividad acidificante como que para cuando se inocule en la cuba de quesería o en el tanque d fermentación, se produzca la acidificación de la leche a la velocidad necesaria para la técnica d fabricación determinada.

b. Cultivos de siembra directa. En los últimos 5 años se ha producido un espectacular aumento de la utilización de los cultivos de siembra directa, especialmente en los países europeos. Se calcula que en 1995, el 40% del queso producido en Gran Bretaña se fabricó con este tipo de cultivos (ver tabla 2.5), empleándose por igual en forma congelada (gránulos) y liofilizada. En Francia, el 20% se elabora con fermentos de siembra directa, mientras que en EEUU la proporción no llega al 10%. Una de las principales razones que explica la amplia utilización de los cultivos de siembra directa en gran Bretaña es la expansión del empleo de mezclas de Lc. Lactis y S. thermophilus para la fabricación de queso tipo cheddar. Estos cultivos son mas eficaces que los fermentos mesófilos puros

(debido e que el crecimiento del S. thermophilus se estimula durante la etapa de escaldado de la cuajada) y presentan una buena resistencia a los fagos debido al crecimiento bifásico de los m.o. durante las etapas del proceso de fabricación que se realizan a temperaturas menores (mesífilos) más altas (termófilos). En las primeras fases de la fabricación, la acidez desarrollada es menor con los cultivos de siembra directa y en consecuencia, para compensar este efecto, hay que realizar unas pequeñas modificaciones en el proceso de elaboración. Los cultivos de siembra directa deben aportar a la leche una población de aproximada de 107

bacterias lácticas/ml.

Tabla 2.5 evolución del mercado de los cultivo de siembra directa para la elaboración de queso en el Reino Unido

Año % de queso elaborado con cultivos de siembra directa1980198519901995

<1%5%20%40%

7.4 Selección del cultivo de quesería. En cada planta de fabricación de quesos, la selección del cultivo a utilizar se realiza en función de una serie d criterios entre los que se pueden citar:

La técnica para fermentar la leche. El flavor, textura y acidez que se desean en el producto final. Las necesidades de rotación de cultivos (riesgo de fagos). El tipo de cultivos (fermento para la producción o para siembra directa).

La selección de los cultivos para la elaboración de yogurt a empezado a empezado a realizarse en los últimos años 5-10 años a raíz del desarrollo y el éxito de nuevos yogures (estilo griego con bajo contenido graso, de fantasía, cermosos, bio, etc.).Los cultivos tradicionales del yogurt, compuestos por unja cepa de S. thermophilus y una cepa de Lb. Bulgaricus que dan lugar a un producto más acido (pH 3.8) se utilizan casa vez menos y están siendo sustituidos por una nueva generación de cultivos para yogurt.

a. Introducción de los cultivos bio (principalmente Lb. Acidofilus, Lb. Casei y especies de bifidobacterias) junto a S. thermophilus y Lbm bulgaricus, con el fin de obtener productos con posibles efectos beneficiosos para la salud de los consumidores.

b. Empleo de cepas de Lb. bulgaricus menos acido – resistentes, para reducir el descenso de pH.

c. Utilización únicamente de cultivos S. thermophilus (es decir, eliminado Lb. bulgaricus) para la elaboración de productos muy suaves – en nuchas ocasiones se emplean conjuntamente con los cultivos bio – (en algunos paíse por ejm en Francia y en España, la legislación prohíbe que el producto se llame yogurt cuando no contiene Lb. bulgaricus)

d. Selección de cepas de Lb. Bulgaricus y S. thermophilus productoras de exopolisacaridos, que imparten untuosidad a los yogures con bajo contenido graso, mejoran la textura (más cuerpo), disminuyen la granosidad y permiten reducir la cantidad de sólidos lácteos y estabilizantes.

e. Siembra de leche con cultivos compuestos por mezclas de diferentes sepas, cada una de las cuales desempeñan una función específica (aroma, textura, acidificación, etc.).

8. Defectos y problemas de calidad relacionados con los microorganismos.

8.1 Defectos de acidificación.La inactivación total o parcial de las bacterias lácticas durante la fermentación de la leche se traduce en una acidificación insuficiente, obteniéndose un queso de elevado pH y alto contenido de humedad, que no se conserva bien y en el que fácilmente proliferan los microorganismos alterantes (y los microorganismos patógenos si no sean eliminados con unas buenas prácticas de fabricación). La causa más frecuente de la falta de desarrollo de la acides es la contaminación del cultivo por fagos, aunque también puede deberse a otros motivos como la incorrecta preparación del fermento, variaciones en la composición de la leche, modificaciones en el procedimiento de elaboración del queso, residuos de antibióticos (como resultado del tratamiento de las vacas con mastitis), aglutininas, restos de desinfectaste e inhibidores naturales de la leche (lactoperóxido). Los problemas originados por los fagos y las aglutininas se tratan seguidamente con más detalle

a. Fagos. Los bacteriófagos se encuentran en el ambiente y utillaje de las queserías. Pueden proceder de la leche cruda y en algunos casos están en forma lisogénica en los cultivos iniciadores. Los fagos de las bacterias lácticas miden unos 200 nm, presentan una cabeza proteica generalmente hexagonal que contiene su material genético, una cola proteica (contráctil) y una estructura basal de anclaje mediante la que el fago se une a un receptor especifico (sistema llave-cerradura) en la pared de la célula hospedadora. El ciclo lítico de los bacteriófagos (fig.2.3).

En las condiciones optimas para el desarrollo de las bacterias lácticas, este ciclo lítico suele durar unos 45 minutos y en él se liberan hasta 100 nuevos fagos, mientras que en el mismo tiempo las células hospedadoras solamente sean multiplicadas una vez. El rápido incremento en el número e bacteriófagos y su acción destructivas sobre las bacterias lácticas, inactiva el cultivo impidiendo la fermentación de la leche. Los fagos de los lactococos se han clasificado ene l grupo B de Bradley y son principal mente de tres tipos en cuanto a la estructura de su cabeza: ovoides, isoméricos, pequeños e isoméricos grandes. Muchas de las cepas de lactococos contienen un fago en estado lisogénico, que pueden activarse en determinadas circunstancias (exposición en el laboratorio a los rayos UV y al antibiótico Mitomicina C); sin embargo la relación entre los estados líticos y lisógeno en el interior y entre las cepas de bacterias lácticas y las causas que hacen que un fago pase de forma latente a virulenta durante la

fabricación del queso todavía no están bien establecidas. Para reducir los riesgos de proliferación de los fagos, se utilizan diversos procedimientos (ver tabla 2.6) como la selección y rotación de los cultivos, la preparación de un fermento para la producción (o la utilización de un cultivo de siembra directa) que no contenga ningún fago, y el correcto diseño y funcionamiento de la planta de fabricación.

Tabla 2.6 Medidas para el control de los fagos

Punto a controlar Posibles medidas Selección del cultivo Cultivos insensibles a los fagos

Pruebas de resistencia del LawrenceMezcla de mesófilos y termófilosRotación de los cultivos

Preparación del cultivo para la producción

Inoculación aséptica.Medios inhibidores de los fagos.Aislamiento de la sala de cultivos.Condiciones del aire (aire filtrado, presión positiva).Nebolizaciones de agentes esterilizantes adecuados.Como alternativa: cultivos de siembra directa.

Planta diseño/funcionamiento

Control de las condiciones ambientales.Nebulizaciones.Sistema CIP.Esterilización de las cubas antes de su llenado.Buenas practicas en la manipulación del lactosuero (evitar salpicaduras, retirar rápidamente el suero del área de producción, aislar los tanques de almacenamiento del lactosuero)Cubas de queserías cerradas.

b. Aglutinación. Los quesos de coagulación ácida (cuya cuajada se obtiene por el descenso de pH debido al ácido láctico producido por los cultivos de lactococos y no por la adición de enzimas coagulantes a la leche) y, en especial el queso Cottage, puede presentar problemas de fabricación debidos a la aglutinación de los lactococos sensibles a los anticuerpo (aglutininas) que contiene la leche. La reacción antígeno-anticuerpo causa la precipitación de las células del cultivo iniciador, con la correspondiente disminución del número de células del cultivo iniciador y de la producción del ácido láctico en la cuba quesera, excepto en la zona donde se encuentran las bacterias lácticas precipitadas que se acumulan en la parte inferior de la cuba. Como consecuencia, se forma como una alfombra o un fango, constituido por una capa de leche coagulada en el fondo de la cuba.

Las distintas cepas de lactococos presentan notables diferencias respecto a su sensibilidad frente a la acción de las aglutininas por lo que la acertada elección de los cultivos es esencial para evitar el problema. La homogeneización de la leche reduce la actividad de las aglutininas.

8.2 Contaminación microbiana.

a. Patógenos. Los microorganismos patógenos se destruyen en la pasteurización y en teoría, no deberían suponer ningún problema en los quesos elaborados con leche pasteurizada. Sin embargo en los productos fermentados se pueden encontrar microorganismos patógenos procedentes de una contaminación post-pasteurización, como resultado de un tratamiento térmico in correcto y como consecuencia de la utilización de leche cruda. Si las bacterias lácticas acidifican rápidamente la leche, los microorganismos patógenos no se desarrollan, pero cuando la acidificación es lenta (porque la técnica de fabricación así lo requiere o porque hay inhibición de los fermentos), o cuando los quesos se desacidifican por la acción neutralizante de la flora secundaria, pueden presentarse problemas de intoxicaciones alimentarias.

b. Bacterias lácticas que no forman parte de los cultivos iniciadores. En generan, la flora secundaria de los quesos de pasta dura y semidura no suele originar problemas de calidad, al contrario, se considera muy beneficiosa para el desarrollo del aroma y del sabor de estos quesos. No obstante si las bacterias lácticas que no forman parte de los cultivos iniciadores se encuentran en una cantidad excesiva (≥ 108 células /ml), probablemente como consecuencia de una baja concentración de sal en la fase acuosa del queso (< 4.5% para el cheddar), pueden dar lugar a la aparición de algunos defectos. Entre los más frecuente se pueden citar la producción de gas, la aparición de manchas verdes, la excesiva formación de cristales de lactato cálcico, el enmascaramiento del aroma y la alteración de la textura y el flavor por una acidificación excesiva.

c. Bacterias coliformes. Para poder desarrollarse en la leche. Los coliformes necesitan lactosa y generalmente su crecimiento se inhibe en condiciones ácidas (aunque algunos son ácido-tolerantes). Cuando hay bacterias coliformes y si las condiciones del medio favorecen su desarrollo (acidificación lenta), alteran el producto por formación de aromas extrañas y producción de CO2.

d. Clostridios. la contaminación por Clostridium tyrobutyricum ha sido muy estudiada en los quesos tipo Gouda y Edam y suele estar relacionada con la alimentación del ganado a base de ensilados. Los esporos bacterianos resisten el tratamiento de pasteurización y su desarrollo en el queso origina la producción del CO2, H2 y ácido butírico (a partir del ácido láctico). Entre las medidas que resultan efectivas para evitar este problema se incluyen la bactofugación de la leche, la adición de nitratos, de peróxido de hidrógeno, de lisozima o de nisina (cuando está permitida), o la utilización de cultivos iniciadores productores de nisina.

e. Levaduras. Estos microorganismos están ampliamente distribuidos en la leche y productos lácteos y constituyen una parte importante de la flora secundaria en muchos quesos. Pueden suponer un problema en el queso y

en las leches fermentadas cuando se desarrollan incontroladamente y se encuentran en gran número. Las alteraciones más frecuentes se producen en las leches fermentadas (yogurt) cuyo elevado contenido en humedad favorece el crecimiento de las levaduras que producen gas. Las levaduras no resultan inhibidas por las condiciones de acidez que se dan en los productos lácteos fermentados.

8.3 Defectos del flavor relacionados con las bacterias lácticas.Algunas cepas de Lc. Lactis sean asociado con la producción de aramos extraños específicos en los productos lácteos, en particular con la aparición de aromas afrutados (etil-butirato, etil-hexanoato) y aromas a malta (3-metil-butanol). Los sabores amargos suelen aparecer en los quesos maduros y se deben a la proteólisis de las caseínas, concretamente de la caseína αs-1, que da lugar a la formación de péptidos que contiene una gran proporción de leucina, fenilalanina y prolinam todos a ellos aminoácidos libro fóbicos. El amargor sea relacionado con capas de Lc. Lácteos en cheddar y el gouda; Lc. Lactis y P. candidum en los quesos blandos madurados por mohos superficiales y P. roqueforti en los quesos de pasta azul. Las cepas de Lc. Lactis de acidificación rápida son las que origina los mayores problemas de amargor, que parecen de verse aun crecimiento excesivo (especialmente de las cepas que resisten la temperatura de escaldado de la cuajada del queso cheddar) que conlleva la producción de un complemento con gran actividad proteínasa. La eliminación o la diminución del número de este tipo de cepas puede resolver el problema y también se reduce la aparición de sabores amargos añadiendo una determinada flora secundaria que produzca péptidasas capaces de hidrolizar los péptidos sápidos (por ejemplo Lb.casei sbsps. Casei en los quesos duros; geotrichium candidum en los quesos de pasta blanda maduradas por mohos). En algunos quesos de maduración superficial por bacterias como maroilles, libarot y pont y L'`Eveque, la aparición de sabores amargos se ha asociado a la degradación de triptófano a indol.

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