METODY INSTRUMENTALNEMETODY INSTRUMENTALNE

W ANALIZIE CHEMICZNEJW ANALIZIE CHEMICZNEJ

ZakZakłład Chemii Medycznej PUMad Chemii Medycznej PUM

Promieniowanie elektromagnetyczne:

fala

strumień fotonów

Fala to rozchodzące się w przestrzeni i w czasie,

spójne drganie pól elektrycznego

i magnetycznego.

2

Fotony są pozbawione masy spoczynkowej, niosą ze

sobą ściśle określoną energię, którą wyraża zależność

Plancka:

gdzie:

E energia promieniowania

h stała Plancka 6,625 • 10-34 Js

liczba falowa cm-1

Zajmuje się oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego

z cząsteczkami.

W cząsteczce wieloatomowej można wyróżnić następujące rodzaje

energii:

translacji - swobodny ruch cząsteczki w przestrzeni

rotacji - związana z obrotem cząsteczki wokół osi środka masy

oscylacji - związana z drganiem atomów wokół położenia równowagi

elektronowa - energia kinetyczna (ruch) elektronów i potencjalna związana z przyciąganiem elektronów przez jądro i odpychaniem przez sąsiednie elektrony.

4

W wyniku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki

następuje wzbudzenie odpowiednich poziomów energii , czego mierzalnym

efektem jest widmo.

pod wpływem promieniowania z zakresu mikrofal i dalekiej podczerwieni

(energia 4x10-2 – 4x10-3 KJ/mol) następuje wzbudzenie rotacyjnych poziomów

energii a efektem jest widmo rotacyjne.

pod wpływem promieniowania IR (podczerwień 4 – 240 KJ/mol)

wzbudzeniu ulegają oscylacyjne poziomy energii – efekt widmo oscylacyjne.

wzbudzenie elektronów jest wywołane promieniowaniem

elektromagnetycznym (400 KJ/mol) z zakresu UV – Vis (ultrafiolet i

widzialne) - efektem jest elektronowe widmo absorpcyjne.

5

Elektronowe widmo absorpcyjne jest widmem ciągłym

6

Podstawowe założenia do praw absorpcji:

monochromatyczność wiązki promieniowania elektromagnetycznego

jednorodność ośrodka absorbującego

7

8

Intensywność początkowa

promieniowania (Io)

Intensywność promieniowania

(I1) po przejściu przez próbkę

o grubości l

c- stężenie roztworu

α- współczynnik absorpcji 0,4343K

I prawo absorpcji (prawo Lamberta)

Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez

jednorodny ośrodek absorpcyjny o grubości l ulega osłabieniu

wg równania:

I = Io e –Kl

A= log (I0 / I) = l

Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej jeśli wiązka promieniowania elektromagnetycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

9

A- absorbancja, gęstość optyczna,

zdolność pochłaniania

promieniowania

II prawo absorpcji (prawo Lamberta - Beera)

Absorbancja wiązki promieniowania

monochromatycznego przechodzącej przez

jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna

do stężenia roztworu c i do grubości warstwy

absorbującej l.

A = l c

10

III Prawo absorpcji (addytywności absorpcji)

Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się

sumie absorbancji poszczególnych składników.

A = A1 + A2 + A3 + ...... + An

11

Odchylenia od praw adsorpcji są wywołane przez:

1. Podstawowe ograniczenia praw

prawa absorpcji są spełniane dla roztworów rozcieńczonych

c 10 -2 mol/l

zakłada się, że jedynym oddziaływaniem promieniowania

elektromagnetycznego z substancją rozpuszczoną jest

absorpcja promieniowania (a nie np. fluorescencja)

12

2. Czynniki chemiczne

zmianie pH roztworu, także zmianie stężenia mogą towarzyszyć

reakcje takie jak: polimeryzacja, dysocjacja, asocjacja,

solwatacja, kompleksowanie - tym reakcjom towarzyszą zmiany

właściwości optycznych analizowanych roztworów.

3. Czynniki aparaturowe

brak monochromatyczności wiązki (główna przyczyna

odchylenia od praw)

promieniowanie rozproszone

Spektrometria w zakresie nadfioletu (ultrafiolet UV) i promieniowania

widzialnego (visible – Vis).

Absorpcja promieniowania w zakresie UV – Vis jest związana z

przejściami elektronów walencyjnych ( i π) oraz elektronów

wolnych par elektronowych (elektrony n).

14

Ilościowe oznaczanie metodą spektrofotometryczną UV – Vis należy

do metod porównawczych (porównanie z wzorcami, stosowanie

krzywych kalibracyjnych)

1. Metoda porównania z pojedynczym wzorcem

Ax – absorbancja roztworu badanego cx

Aw – absorbancja roztworu wzorcowego cw (pomiar w kuwetach o tej

samej grubości l i przy tej samej długości fali )

Ax = cx l Aw = cwl

15

2. Metoda porównania z kilkoma wzorcami czyli metoda

krzywej wzorcowej – metoda uniwersalna

16

A

C

Ax

Cx

Analiza jakościowa

Elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną

związku chemicznego i określa jednoznacznie związek jednorodny.

W przypadku związku organicznego widma UV – Vis w zakresie

180 –800 nm są użyteczne do ustalania pewnych zależności

strukturalnych i identyfikacji grup funkcyjnych.

Użytecznym pojęciem jest wprowadzone przed wieloma laty określenia:

chromofor i auksochrom

17

Chromofory są to grupy absorbujące promieniowanie

elektromagnetyczne w zakresie 180 – 800 nm

grupy: karboksylowa, nitrozowa, alkenowa, azowa, tiolowa, benzenowa

Auksochromy są to grupy przesuwające absorpcję ( max i Emax) w

kierunku fal dłuższych (przesunięcie batochromowe)

grupy: aminowa, hydroksylowa, sulfhydrylowa

18

Cząstki w stanie wzbudzonym mogą emitować promieniowanie

przechodząc do stanu podstawowego - zjawisko to nazywamy

luminescencją - emisja światła przez ciała zimne.

W zależności od czynników które wywołały luminescencję rozróżniamy:

fotoluminescencja – substancja jest wzbudzona promieniowaniem elektromagnetycznym UV – Vis

chemiluminescencja – wzbudzenie jest wynikiem reakcji chemicznej

bioluminescencja - wzbudzenie jest wynikiem procesów biochemicznych

elektroluminescencja – wzbudzenie następuje w polu elektrycznym.

19

Proces fotoluminescencji cząstki można przedstawić

schematycznie: X + h X* X + ciepło + h

h ´- energia oddana na sposób

promienisty

W zależności od mechanizmu

przejść elektronowych:

fluorescencja

fosforescencja

20

Zastosowanie analityczne fluorescencyjnej analizy

ilościowej:

witaminy (tiamina)

hormony (adrenalina)

aminokwasy (tryptofan)

alkaloidy (chinina)

leki (antybiotyki, barbiturany)

środki spożywcze

substancje toksyczne w środowisku

tiamina

tiochrom

Absorpcja promieniowania IR wpływa na zmianę

energii oscylacyjnej cząsteczki

Zakresy długości fal odpowiadające podczerwieni:

0,8 – 2,5 m NIR bliska podczerwień

2,5 – 25 m MIR podstawowa

25 – 500 m FIR daleka podczerwień

22

Widmo IR jest właściwością charakterystyczną dla danego związku chemicznego.

Wykorzystuje się je do:

identyfikacji związków (ustala się grupy funkcyjne i strukturę badanego związku).

w analizie ilościowej (obowiązuje tu także prawo Lamberta-Beera).

w biologii, biochemii, medycynie do badania tkanek-mięśni, włókien i krwi.

23

Jądra atomowe niektórych izotopów umieszczone w jednorodnym polu

magnetycznym mogą absorbować promieniowanie elektromagnetyczne

o częstotliwości radiowej.

Z warunku rezonansu wynika, że można:

przy ustalonej częstotliwości radiowej zmieniać natężenie pola magnetycznego tak długo aż wystąpi rezonans

przy stałym natężeniu pola można zmieniać częstotliwość promieniowania radiowego aż do wystąpienia rezonansu

Promieniowanie o częstotliwości radiowej uzyskuje się z krystalicznego

oscylatora o dużej stabilności

Najczęściej bada się izotopy: 1H, 13C, 19F, 31P, 14N, 11Bi, 29Si

24

25

Tomografia MRI (magnetic resonance imaging)

Pierwszy raz wykorzystany w 1973r przez

Lauterbur’a,

Obecnie to istotna metoda stosowana w

diagnostyce klinicznej.

Magnes horyzontalny, do którego wsuwany

jest na leżąco pacjent utrzymuje stałe i

jednorodne pole magnetyczne.

Za pomocą dodatkowych cewek uzyskuje się

warunki rezonansowe jąder tylko w wybranej

warstwie, w przekroju.

Impuls pola zmiennego wzbudzającego rezonans trwa ułamek sekundy

Obraz żywego organizmu przedstawia mapę gęstości protonów wody w

tkankach danej części ciała.

Najczęściej obrazuje się nieruchome części ciała tj. mózg, rdzeń kręgowy,

kończyny.

Obraz mózgu otrzymany metodą tomografii zmienia się w zależności od tego ile świeżej utlenowanej krwi jest dostarczone do niego w trakcie myślenia, zapamiętywania czy reakcji na bodźce.

Uzyskuje się mapę funkcji mózgu

Do obrazowania narządów wewnętrznych konieczne jest dodatkowe sterowanie gradientem pola w rytm oddechów tzw. nawigator oddechowy

W badaniu serca sekwencje obrazujące są sterowane sygnałem EKG

26

PROTEin complement of the genOME

(składnik białkowy kodowany przez genom)

Proteomika zmierza do poznania wszystkich białek pojawiających się w danym organizmie w ciągu całego życia.

Wykorzystuje kilka technik służących do jednoczesnej analizy setek lub tysięcy białek.

Białka są trudnym obiektem badań ze względu na ich przestrzenną strukturę

i występowanie w wielkocząsteczkowych kompleksach.

Dynamiczny obraz proteomu zawiera:

zmiany w pojedynczej komórce związane z jej cyklem życiowym

rozmieszczenie białek w obrębie struktur komórki

wzajemne oddziaływanie komórek tworzących tkanki

Liczba białek proteomu jest znacznie

większa niż liczba kodujących ją genów.

Ludzki genom ma w przybliżeniu 30-50 tysięcy genów kodujących białka.

Do tej pory rozpoznano około 500 tysięcy białek, co oznacza, że na 1 gen przypada prawie 10 różnych wariantów białek

Na taki stan mają wpływ:

procesy molekularnego składania w trakcie translacji i powstawania informacyjnego kwasu rybonukleinowego

procesy potranslacyjne: fosforylacja czy glikozylacja, które mają wpływ na ostateczną strukturę białka

Pełna analiza białek- markerów białkowych zawartych w materiale biologicznym może być źródłem wielu informacji o zdrowiu pacjenta oraz wspomóc kliniczną diagnozę w monitorowaniu choroby czy prowadzeniu terapii.

Ludzka surowica zawiera wiele tysięcy białek/peptydów o stężeniu w zakresie 35-50 ∙ 10⁹ pg/ml do 0-5 pg/ml

Poznano 22 białka stanowiące 99% surowiczego proteomu, pozostały 1%

białek/peptydów nazwano peptydomem, zawierającym białka o masie cząsteczkowej

mniejszej niż 10 000 Da.

Małe białka są trudne do identyfikacji i wykonania analizy ilościowej z powodu ich małej

ilości w surowicy oraz tendencji przyłączania się do białek transportujących, takich jak

albumina.

W wykrywaniu markerów biologicznych stosuje się techniki pozwalające na

porównywanie złożonych mieszanin białkowych i ilościową ocenę ich

poszczególnych składników.

ETAP 1

Białka są rozdzielane w gradiencie pH w

zależności od punktu izoelektrycznego pI,

czyli wartości pH, przy której ładunek

wypadkowy białka jest równy zero

Stosuje się kapilary z żelem

poliakrylamidowym lub paski żeli z

immobilizowanym gradientem pH,

dającym wysoką rozdzielczość i

powtarzalność wyników Ogniskowanie izoelektryczne IEF

Analiza proteomiczna wykorzystuje głównie elektroforezę dwukierunkową 2D i

spektrometrię mas.

ETAP 2

Białka są rozdzielane zgodnie z ich masą

cząsteczkową metodą SDS-PAGE

Uzyskuje się rozdziały białek o

podobnych masach cząsteczkowych

Barwniki fluorescencyjne

Technika analityczna, której

podstawą jest pomiar stosunku

masy do ładunku elektrycznego

danego jonu.

Metoda oparta na jonizacji

cząsteczek lub atomów, a

następnie detekcji liczby jonów w

funkcji ich stosunku masy do

ładunku (m/z).

Wyniki działania spektrometru

mas są przedstawiane w postaci

tzw. widma masowego.

GC-MS - chromatografia gazowa w połączeniu ze spektrometrią mas;

metoda skojarzona, łącząca technikę separacji z detekcją MS; służy do ilościowego

oznaczania składników złożonych próbek.

Zastosowanie:

identyfikacja cukrów, amin, alkoholi, narkotyków, substancji dopingujących, pestycydów i dioksyn.

identyfikacja metabolizmu leków (farmakokinetyka)

badanie wpływu leków na funkcjonowanie organizmu (farmakologia)

odkrywanie nowych, bioaktywnych metabolitów

LC-MS - chromatografia cieczowa w połączeniu ze spektrometrią mas;

stosuje się chromatografię wysokosprawną (HPLC) i ultra wysokosprawną (UPLC).

Zalety:

jednoznaczna identyfikacja składników próbki

bardzo wysoka czułość układu analitycznego

możliwość identyfikacji wszystkich składników próbki

wysoka powtarzalność pomiarów

analiza ilościowa

Chromatografia (gr. chromatos = barwa + graphos = pisze)

technika służąca do rozdziału lub badania składu mieszanin

związków chemicznych.

Chromatografię stosuje się do :

wyodrębniania związków z mieszanin oczyszczania identyfikacji ilościowej i jakościowej preparacji związków

Wybór metody zależy od :

ilości mieszaniny identyfikacyjnej rodzaju związków stopnia skomplikowania podziału

36

Rozdział chromatograficzny polega na umieszczeniu badanej mieszaniny na ciekłej lub stałej fazie nieruchomej (stacjonarnej), a następnie na przepuszczeniu ciekłej bądź gazowej fazy ruchomej (mobilnej) przez nią lub też nad nią, czyli elucji mieszaniny z fazy nieruchomej.

Składniki mieszaniny o różnych stosunkach podziału są eluowane (migrują) z różnymi szybkościami. Te różnice w szybkości migracji prowadzą do rozdziału składników w czasie i przestrzeni.

37

Kryteria podziału metod chromatograficznych

38

I. Zastosowanie eluentu

1. chromatografia cieczowa

2. chromatografia gazowa

3. chromatografia fluidalna

IV. Stan skupienia faz

1. chromatografia gazowo-cieczowa (GLC)

2. chromatografia cieczowo-cieczowa (LLC)

3. chromatografia gazowo-stała (GSC)

4. chromatografia cieczowo-stała (LSC)

II. Natura sił fizyko-chemicznych procesu

1. chromatografia adsorpcyjna

2. chromatografia jonowymienna

3. chromatografia podziałowa

a. klasyczna

b. z odwróconymi fazami

c. par jonowych

4. chromatografia sitowo-żelowa (sączenie

molekularne)

5. chromatografia powinowactwa

6. elektroforeza kapilarna (CE)/ wysokosprawna

elektroforeza kapilarna (HPCE)

III. Geometria układu

1. chromatografia kolumnowa

2. chromatografia planarna

a. bibułowa

b. cienkowarstwowa (TLC)

V. Parametry procesu

1. wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

2. szybka, białkowa chromatografia cieczowa (FPLC)

Klasyfikacja adsorbentów: 1. pod względem aktywności adsorpcyjnej

- słabe (skrobia, sacharoza)

- średnie (węglan wapnia)

- silne (aktywowany kwas krzemowy, tlenek glinu)

2. ze względu na polarność

- silnie polarne (tlenek glinu, tlenek krzemu)

- słabo polarne (węglan wapnia)

- niepolarne (węgiel aktywowany)

3. ze względu na właściwości chemiczne:

- kwaśne ( SiO2)

- zasadowe ( CaO)

- obojętne ( węgiel aktywowany)

- amfoteryczne ( Al2O3)

4. ze względu na naturę chemiczną:

- organiczne

- nieorganiczne

- mieszane

- specyficzne

39

Rozpuszczalniki (solwenty) - ułożone są w szereg eluotropowy, w zależności

od zdolności adsorpcyjnych w stosunku do substancji w nich rozpuszczonych

oraz elucyjnych.

Stosowane są do rozwinięcia chromatogramu jak i do elucji (wymywania

rozdzielonych substancji).

W chromatografii rozpuszczalniki uszeregowane są wraz ze wzrostem zdolności

wymywania zaadsorbowanych związków polarnych:

heksan ( najmniej polarny)

tetrachlorek węgla

benzen

eter dietylowy

aceton

chloroform

octan etylu

etanol

metanol

woda

Zdolności adsorpcyjne cząsteczek zależą od :

wielkości i budowy przestrzennej

liczby i położenia wiązań podwójnych

liczby podstawników polarnych i niepolarnych

liczby i rodzaju grup funkcyjnych

Stopień adsorpcji cząsteczek adsorbatu wzrasta wraz z:

ilością wiązań podwójnych

grup funkcyjnych

liczbą podstawników tego samego rodzaju

42

Rozpuszczone w fazie ruchomej składniki mieszaniny ulegają podziałowi między

dwie fazy. O rozdziale decyduje:

Prawo podziału solutu- prawo Nernsta

K - współczynnik w stanie równowagi zależy jedynie od temperatury i właściwości

substancji tworzących roztwory, a nie zależy od ilości substancji rozpuszczonej

C1 - stężenie solutu (substancji rozpuszczonej) w fazie stacjonarnej

C2 - stężenie solutu w fazie ruchomej

Ekstrakcja- metoda rozdziału składników mieszaniny lub oczyszczania

określonego składnika z towarzyszących zanieczyszczeń wykorzystująca

prawo podziału solutu.

43

Rozdział mieszaniny jest oparty na różnicy we współczynnikach podziału

składników mieszaniny (odmienną rozpuszczalnością) między dwie nie

mieszające się ze sobą fazy, z których jedna jest cieczą osadzoną na nośniku

(faza stacjonarna), a druga fazą ruchomą (ciecz, gaz). 44

Szybka metoda wstępnej orientacji w ilości i względnym

udziale składników mieszaniny związków organicznych.

Podstawę podziału stanowią reakcje wymiany jonowej między jonami z roztworu, a

jonami związanymi z fazą stacjonarną, którą stanowią jonity (kationity i anionity).

Rozdział składników mieszaniny wynika z różnic w ładunku elektrycznym jonów.

Jonity (wymieniacze jonowe) są to substancje, które mają właściwości pobierania

jonów z roztworów w zamian za oddawanie do roztworów równoważnych ilości innych

jonów tego samego znaku.

Żywica jonowymienna składa się ze szkieletu (matrycy) polimeru łańcuchów

węglowodorowych w postaci sieci przestrzennej. Z matrycą są trwale powiązane jony

(grupy) aktywne, które noszą nazwę jonów utrwalonych. Jony te mogą być wymieniane

na inne znajdujące się w roztworze.

Zastosowanie chromatografii jonowymiennej:

rozdział związków jonowych, kwasów karboksylowych, zasad (aminy),

aminokwasów, peptydów, białek, pochodnych kwasów nukleinowych,

cukrów

zmiękczanie wody – usuwanie jonów wapnia i magnezu

demineralizacja wody

Podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek – rozdział

zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków.

Wypełnienie kolumn - żele o zdefiniowanych rozmiarach porów, zbliżonych

do rozmiarów cząsteczek analizowanych substancji;

sita molekularne

Faza nieruchoma - rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu.

Faza ruchoma - rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu.

Substancje o dużych rozmiarach cząsteczek (większych od średnicy porów)

przesuwają się wzdłuż kolumny szybciej i przechodzą do wycieku. Cząsteczki

o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną

głębokość - im mniejsze rozmiary tym głębiej penetrują ziarna żelu – wolniej

migrują wzdłuż kolumny.

47

Przykładowe wypełnienia

1. Sephadex - na bazie dekstranu (wielkocząsteczkowy glikan)

2. Sepharose - granulowana forma agaru (glikan obojętny (D-galaktoza +

3,6-anhydro-L-galaktoza)

3. Sephacryl – całkowicie syntetyczne sito molekularne-kopolimer

allilodekstranu i N,N’- metylenobisakrylamidu

Zastosowanie chromatografii sitowej:

określanie rozkładu mas cząsteczkowych polimerów

rozdział substancji wielkocząsteczkowych takich jak: białka, kwasy

nukleinowe, peptydy, cukry, glikole, silikony.

Wada – nie nadaje się do rozdziału związków o zbliżonych masach

48

49

Szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się

wzajemne powinowactwo dwóch substancji:

chemicznie związany z nierozpuszczalnym nośnikiem – ligand (efektor)

substancja w fazie ruchomej specyficznie adsorbowana przez ligand

Substancja rozpuszczona w fazie ruchomej może oddziaływać z

unieruchomionym ligandem jak:

hormon z receptorem,

enzym z substratem,

enzym z inhibitorem,

przeciwciało z antygenem,

kwasy nukleinowe z białkami,

dopełniacz z przeciwciałami

50

Etapy chromatografii powinowactwa

1. Chemiczne związanie ligandu ze złożem (immobilizacja ligandu) –

złoża stosowane w filtracji żelowej

2. Specyficzne wiązanie substratu do unieruchomionego ligandu i

„odmycie” niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek

białkowych

3. Elucja specyficznie związanego substratu – za pomocą eluentów:

specyficznych – np. inhibitorów enzymów

niespecyficznych – np. buforów o niskim/wysokim pH,

roztworów o dużej sile jonowej, związków rozrywających

wiązania wodorowe

51

52

Podstawą rozdziałów elektroforetycznych jest różnica w

prędkościach migracji cząstek obdarzonych ładunkiem w stałym

polu elektrycznym.

Kationy przyciągane są przez katodę (-), a aniony przez anodę (+).

Prędkość migracji w kierunku elektrod jest różna dla różnych

cząsteczek i zależy od:

natężenia pola elektrycznego

ładunku cząsteczki

rozmiaru cząsteczki

lepkości środowiska

Rozdział przeprowadza się w kapilarach ze stopionej krzemionki

(kwarcu) SiO2 wypełnionych roztworem elektrolitu nośnego;

kapilary o Фwewn. 25–75 µm i l ok. 50 cm.

53

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej:

analiza biopolimerów (białka, polipeptydy, kwasy nukleinowe)

analiza związków biologicznie czynnych (aminokwasy, nukleozydy, nukleotydy)

analiza leków – kontrola jakości leków

analiza mieszanin racemicznych i ich rozdział na optycznie czynne enancjomery

54

Obejmuje metody chromatograficzne, w których fazą nośną jest gaz.

Analizowana próbka (analit) jest przenoszona za pomocą gazu nośnego poprzez

kolumnę wypełnioną fazą nieruchomą, gdzie następuje rozdział mieszaniny na

poszczególne związki chemiczne.

Rozdzielone substancje mierzy się i rejestruje u wylotu kolumny za pomocą

odpowiedniego układu detektorowego.

W zależności od rodzaju fazy nieruchomej rozróżnia się:

chromatografię gazową podziałową (faza nieruchoma - ciecz naniesiona na stałym

nośniku)

chromatografię gazową adsorpcyjną (faza nieruchoma - adsorbent)

chromatografię gazową kapilarną - średnica kolumny 0,2-0,6 mm, (faza nieruchoma –

ciecz naniesiona bezpośrednio na ścianki kolumny)

Szybka i skuteczna metoda rozdzielania mieszanin związków lotnych.

Zastosowanie

Analiza jakościowa:

identyfikacja związków na podstawie parametrów retencji - w tych samych

warunkach rozdziału takie same charakterystyki retencyjne

identyfikacja substancji poprzez porównanie ze wzorcem

Analiza ilościowa:

wysokość h i powierzchnia A piku są proporcjonalne do ilości oznaczanego

składnika: h = f(c) i A = f(c)

metoda krzywej kalibracyjnej

metoda wzorca wewnętrznego

metoda dodawania wzorca

56

Schemat chromatografu gazowego

58

Wysokociśnieniowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa -

HPLC – High Pressure/Performance Liquid Chromatography

Faza ruchoma - ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem (20MPa-40MPa)

Faza stacjonarna - gęsto i jednorodnie upakowane złoże w kolumnie z metalu,

dobrze odpowietrzone

Wariant analityczny - węższe kolumny (4-8 mm); długość 5 – 25 cm

Wariant preparatywny - szersze kolumny (20 – 500 mm); długość 25 –100 cm

Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe

stosowanie gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie

związków (pole powierzchni pod pikiem)

Detekcja: spektroskopowa (UV-vis), elektrochemiczna, spektrofluorymetryczna

Wada: rozdział małych ilości związków

Schemat chromatografu cieczowego

Zastosowanie HPLC

Analiza związków:

biologicznie czynnych (białka, aminokwasy, witaminy,

kwasy nukleinowe, sterydy, polipeptydy, polisacharydy)

preparatów farmaceutycznych

środków ochrony roślin, pestycydów

węglowodorów policyklicznych (benzopiren w środowisku)

związków metaloorganicznych i kompleksowych

skomplikowanych mieszanin kationów np. rozdzielanie

pierwiastków ziem rzadkich 61

62 min 0 2 4 6 8 10

mAU

-2

0

2

4

6

8

10

VWD1 A, Wavelength=254 nm (US\16PUR051.D)

GTP GDP

UA

GMP

IMP

ATP

ADP

Hyp

AD

PR

Xan

AMP

Urd

NADP

NAD

In

o

Guo