metabolómica in vivo y ex vivo en el control de la ... · esquema metabolómica y actividad...
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Metabolómica in vivo y ex vivo enel control de la Actividad
FarmacológicaB. Celda1,2,3, D. Monleón2,3,4, MC. Martínez1,2,3,V. Esteve1,2,3, B. Martínez1,3, E. Piñeiro1,R. Ferrer11Dept. Química Física-SCSIE, Universitat de Valencia,2Laboratorio Imagen Molecular (UCIM)3CIBER Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina, ISC III4Fundación de Investigación del Hospital ClínicoUniversitario de Valencia
(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
EsquemaEsquemaMetabolómicaMetabolómica y y ActividadActividad FarmacológicaFarmacológica
1.- Introducción1.- Introducción2.- Precisión diagnóstico 2.- Precisión diagnóstico Selección Terapia Selección Terapia
in vivo, ex vivo e in in vivo, ex vivo e in vitrovitro3.- Sistemas Modelo3.- Sistemas Modelo
in vivo, ex vivo e in in vivo, ex vivo e in vitrovitro4.- Desarrollo 4.- Desarrollo BioinformáticoBioinformático
BIONÓMICABIONÓMICA
ADNADN GenómicaGenómica 40.000 genes40.000 genes
ARNARN TranscriptómicaTranscriptómica 101055 transcripciones transcripciones
ProteínasProteínas ProteómicaProteómica 101099 proteínas proteínas
MetabolitosMetabolitos MetabolómicaMetabolómica 3000 metabolitos3000 metabolitos MetabonómicaMetabonómica estructura conocidaestructura conocida
ConocimientoConocimientoLimitadoLimitado
ConocimientoConocimientoAdecuadoAdecuado(RMN)(RMN)
Chips ADN Chips ADN SCSIE+UCIMSCSIE+UCIM
Chips ADNChips ADNSCSIE+UCIMSCSIE+UCIM
MALDI-MALDI-TofTofRMNRMN SCSIESCSIE
RMN Alto CampoRMN Alto CampoSCSIE+UCIMSCSIE+UCIM
B.Celda
Aplicaciones Moleculares al Aplicaciones Moleculares al Diagnóstico, Pronóstico y Selección TerapiaDiagnóstico, Pronóstico y Selección Terapia
Medicina Medicina TranslacionalTranslacional
MetabolómicaMetabolómica (in vivo y ex vivo)(in vivo y ex vivo)
GenómicaGenómica ((TranscriptómicaTranscriptómica y y GenotipadoGenotipado))
ProteómicaProteómica (Funcional y Estructural)(Funcional y Estructural)
B.Celda
INTRODUCCIONNMR ApplicationsNMR Applications
MRI +MRI + 9,6 - 100 9,6 - 100 0,25 - 3,0 0,25 - 3,0 < 100 < 100 5 5 human humanMRS MRS bodybody((clclíínicalnical))
MRI +MRI + 41 - 300 41 - 300 1,0 - 7,1 1,0 - 7,1 < 30 < 30 22 smallsmall animalsanimalsMRSMRS ( (rabitsrabits,, mousesmouses……))((biomedicinebiomedicine))
MiniimagingMiniimaging 300 - 400 300 - 400 7,1 - 9,4 7,1 - 9,4 < 12 < 12 0,005 0,005 mousesmouses
NMR NMR 200 - 600 200 - 600 4,7 - 14,1 < 2,5 4,7 - 14,1 < 2,5 0,00005 0,00005 insectsinsects,,MicroscopyMicroscopy materialsmaterials,,
embrionsembrions
NMRNMR 400 - 900 400 - 900 9,4 - 21 9,4 - 21 < 40 < 40 ÅÅ proteproteíínsns, DNA,, DNA,multidimensional multidimensional tissuestissues......
TypeType 11H(H(MHzMHz)) MagneticMagnetic SizeSize SpatialSpatial ApplicationApplicationresonanceresonance FieldField ( (cmcm) ) resolutionresolution SystemSystem
frequencyfrequency IntensityIntensity (T) (T) (mm (mm33))
B.Celda
Laboratorio Imagen MolecularUCIM (UVEG)
Espacio Espacio IntraIntra y extracelular, y extracelular, Fluidos corporales Fluidos corporales
Fluidos CorporalesFluidos Corporales
MetabolomaMetaboloma MetabonomaMetabonoma
MetabolómicaMetabolómica Plantas PlantasMetabolómicaMetabolómica Mamíferos Mamíferos
MetabolómicaMetabolómica humanos: humanos: Cerebro Cerebro
Corazón Corazón Hígado: Hígado:
HepatocitoHepatocito Riñón Riñón Próstata Próstata Cáncer Mama Cáncer MamaTejido Tejido parenquimalparenquimalTejido MédulaTejido Médula
Líquido Líquido CefalorráquideoCefalorráquideo
Sangre:Sangre: Plasma Plasma Suero SueroBilisBilis
Fluido SeminalFluido Seminal
OrinaOrina
PERFIL BIOQUÍMICOPERFIL BIOQUÍMICO
Exposición por enfermedad, cambio micro-flora, fármacos, tóxicos ...Exposición por enfermedad, cambio micro-flora, fármacos, tóxicos ...
RMNRMN
B.Celda
In vivo + ex vivo In vivo + ex vivo MetabolismMetabolism
GeneticGenetic profileprofile ( (transcriptomicstranscriptomics))
ProteinProtein expressionexpression ( (ProteomicsProteomics))
MetabolismMetabolism ( (MetabolomicMetabolomic))
PrecedsPreceds toto tissuetissue physiologicalphysiological changeschanges
B.Celda
NAANAA
CrCrCoComImI
NAANAACrCr
CrCr
AlzheimerAlzheimerTE = 31 TE = 31 msms
TE = 136 TE = 136 msms
NAANAA ; mI ; mINAA/mINAA/mI
NAA/NAA/CrCr
NAA/mI 2,32
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 11 - Espe cificidad (fals os positivos)
Sens
ibili
dad
RMI
ERMGlobal
Europ.J.Neurology2004: 11; 89-98
B.Celda
Brain tumour Diagnosis MRSI + SV
http:// www.etumour.net, M.C. Martínez-Bisbal et al. ESMRMB (2005); # 114 and Rev.Neurol. (2002), 34(4); 309C. Majós et al. AJNR (2004), 25; 1696; http://www.carbon.uab.es/INTERPRET,
SV location of AIIaccording Cho High levelprevious 2D TSITE 272 msTR 2s 1.5 T
2
34
Grade
MMB/Cr
MMA/Cr
Gliomas grading by twoTE (31 + 136 ms) SVquantitative analysisprevious SV locationby 2D TSI high levelCholine image(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
B.Celda
Brain primary tumour vs metastasis MRSI2D TSI at 272 ms 1.5 T
Brain secondary lesionmetastasis (MT)
Brain brimary tumour(GBM)
(Cho/Cr)MT<(Cho/Cr)GBM
http:// www.etumour.net, (FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
B.Celda
Brain tumour patient outcome and follow-up by Perfusion MRI and MRS
M. Law et al. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 13 (2005); 330
Kaplan-Meier survival curves
Cerebral Blood Volume (CBV) predicts more accurately the Low Grade Gliomas (LGG) progression than initial histopathology grading Longer survival CBV<1.75 Shorter survival CBV>1.75
Follow-up of AII by 1H MRS SV at 1.5 T
NAACho Cr
TE 136 ms
MRS study number
B.Celda
Normal tissue
Necrosis
Tumour tissue Infiltration
A B
Guided Therapy; Guided Therapy; Radiotherapy, Radiotherapy, QuimioQuimio
T. Laudatio, MC. Martínez-Bisbal et al., NMR Biomedicine, in press (2006)
B.Celda
Brain tumour radionecrosis vs. recurrence MRSI
Co
Radiation injury (RI)
Tumour Recurrence (TR)
(Cho/NAA)TR >(Cho/NAA)RI
http:// www.etumour.net, (FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
Cho
Saggital2D TSI 1.5 T TE 272 ms TR 2 s
Transverse2D MRSI 1.5 TTE 31 ms TR 2 s
B.Celda
Breast cancer diagnosis (MRS/CSI)
J. Hu et al. Proc.Intl.Soc.Mag.Reson.Med. 13 (2005); 134
High Cho levels active tumour by histology
Gd-enhanced areasabsence of viable tumour
2D PRESS MRSI (CSI) with k-space sampling1.5 T TE = 270 ms 16 x 16 11:40 min8 averagesTwo independent CHESS optimized pulsesfor water and lipid suppression
2D 1H MRSI study after 5 days no Cho
Liver treatment response by 19F MRSI at 3 Tof Capacitabine colorectal cancer drug
D.W. Klomp.et al. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 13 (2005); 128
19F CSI of liver of a patient treated with oral Capecitabine FABL imaging
Capecitabine
Capecitabine 5’ deoxy-5’ fluorocytidine 5’ deoxy-5’ fluorouridine -fluor- -alanineOral drug 5’ DFUR 5’ DFCR FBAL
Ex Vivo 1H MRSEx Vivo 1H MRS
Germinoma
GBMlip
Tau????
??
NAA
Leu
Val
Lac
Ala
Leu
IleNAAGlx
AspNAACr
PCr
PCho
Cho
mI
GlyIleLeu
BiopsyBiopsystudystudy by byHR-MASHR-MAS((ex vivoex vivo))
PCA
HR-MAS
PCA
HR-MAS129
T=0 C (4 C inner)4500 Hzca. 20 mg of tissueCylindrical rotor(50 l)(PCA ca. 2g)D2O field homogeneityand mobility
NMR in NMR in BiomedicineBiomedicine, Martínez-, Martínez-BisbalBisbal et al. 2004;17:191-205 et al. 2004;17:191-205B.Celda
Brain tumour characterization ex vivo (HR-MAS)
http:// www.etumour.net; D. Monleón et al., ESMRMB (2005) #325(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
M.C. Martínez-Bisbal et al. NMR Biomed.(2005), 17; 1
Met
Men
GBM
Ast
B.Celda
Brain tumour biopsies ex vivo metabolic profile
NMR NMR BiomedBiomed. 2004;17:191-205. 2004;17:191-205
Brain tumour characterization ex vivo (HR-MAS)
http:// www.etumour.net; D. Monleón et al., ESMRMB (2005) #325(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)(FP6-2002-LIFESCIHEALTH 503094)
M.C. Martínez-Bisbal et al. NMR Biomed.(2005), 17; 1
B.Celda
Fle 158Metastasis
In vivo ERM 30 ms a 1,5 T
in vivo ERM 30 ms a 1,5 T
ex vivo HR-MAS a 11,5 T
ex vivo HR-MAS a 11,5 T
Fle 153Ganglioglioma
Perfil Metabólico ex vivo Biopsias Hígado
NMR NMR BiomedBiomed. 2006;19:90-100. 2006;19:90-100
Glucosa /LipI
p = 0,01 p = 0,026
Lip I/LipII Alanina/Lisina
p < 0,001
Breast cancer diagnosis and invasion High-Resolution 1H NMR
C.E. Mountford et al. Chem. Rev. (2004), 104; 3677C.E. Mountford et al. Br. J. Surg. (2001), 88; 1234C. Lean et al., J. Women´s Imaging (2000), 2; 19
1H NMR spectra at 8.5 T, 37 C ofbreast fine needle aspiration biopsy
benign vs malignantAccuracy 96% (Cho/Cr) lymph node vascular invasionAccuracy 95% 94%
malignant bening
1H NMR spectra at 8.5 T, 37 C ofbreast ductal carcinoma in situ (DCIS)fine needle biopsy
Breast cancer grading and lymph node status (HR-MAS)
B. Sitter et al. NMR in Biomedicine 2002; 15: 327T.F. Bathen et al., Proc. Intl. Soc. Reson. Med., 13 (2005), 130L.R. Jensen et al., Proc. Intl. Soc. Reson. Med., 13 (2005), 131
1H HR-MAS CPMGPRaliphatic region of a breasttumour tissue at 14 T
• Breast cancer grading for invasive ductal carcinoma IDC
IDC I IDC II IDC IIISensitivity 100% 84% 81%Specificity 100% 83% 86%
B) Breast cancer lymph node status prediction by HR-MAS
Actual negative Actual PositiveSensitivity 92% 97%Specifity 97% 92%
Cervical cancer diagnosis in vivo MRS + ex vivo (HR-MAS)
M.M. Mahon et al. NMR Biomed. (2004), 17; 1
normal control
normal control
10 cm3 squamouscell carcinoma
Invasive cervicalcarcinomasagittal T2 TSEendovaginal coil 1.5 TTR 2 s TE 80 ms
1H MRS SV 3.4 cm3 PRESS spectraTR 1600 msTE 135 ms
normal uterine tissue
squamous cell carcinomauterine cervix
ChoCr
TriglycerideCH2
1H presat HR-MAS alipahtic region at 11.7 T 25Clipid and Choline levels markedly increased insquamous cell carcinoma biopsy
biomarker ofinvasive cervicaltumour (74% oftumours NOT incontrol p<0.001)
-CH2
GBM
MEN
MET
OLIGO
A II
Not supervised analysisHierarchical cluster
GBM, OA, AII, MET, MEN.
Supervised LDA analysis
PangenomicPangenomic DNA DNA microarraysmicroarrays eTUMOUReTUMOUR protocols protocols
CPMG
GBM high lipids content vs GBM lower lipid amount
GBM with high lipidscontent
GBM with lower lipidcontent and higherintensity for mobilemetabolites
PCA
Perfil metabólico Plasma
Lipoprotein diameter (nm)
Rel
ativ
e N
MR fre
quen
cy (
Hz)
LIPOPROTEIN PANEL
Des irableOptimal B orderline-High High Risk
1100 - 1399 great er than 18001400 - 1799les s t han 1100
Coronary Heart Disease (CHD) Risk Categories
Posit ive Ris k Factor
less than 21
Negative R isk Fac tor
greater than 40
Intermedi ate
40 - 21
Higher-R iskgreatert han 27
Intermedi ate7 - 27
Lower-Ris kless than 7
*
LipoMe d, Inc. 0 4/99
LipoMed, Inc.3009 New Bern Avenue
Raleigh, NC 27610www. lipoprof ile.com
Prod uced und er pa tent licensesto U. S. Paten t Nos. 4,933 ,844an d 5,34 3,389
Page 1 of 2Pat ient Name
Specimen ID
Dat eCo llect ed
Pa tien t ID
Sex Age
Date Received Dat eReported
Bir th Dat e
PhysicianN ame& Address
Phone: ( )FA X: ( )
M
7-29-36
8-24-99 8-25-99 8-26-99
LM018820
63
Comments
Pat tern A (large LDL)
Lower-Risk22.0 - 20.6
Pat tern B (small LDL)
Higher-Ri sk20.5 - 19.0
LDL Particles 1654nmol/L
16mg/dL
Large HDL
35mg/dL
Large VLDL
19.1nm
LDL Size
RISK ASSESSMENT PANEL
ElevatedLDL Particles
>1400 nmol/L
AtherogenicDyslipidemia
2 traitsSmal l LD LPattern B
( 20.5 n m)
Ele vatedLarge VLDL
(> 27 mg/dL)
Re duce dLarge HDL
(< 21 mg/dL)
Diagnostic Traits of Atherogenic Dyslipidemia
NMR LipoProfile NMR LipoProfile
(mg/ dL Tr igly cer ide) (mg/dLC holestero l)
(mg/dL Choles terol)
-
(35)
(0)(5)
(16)
(21)
(107)
(18)
(H1+H2)(L1 )(L2)( L3)(V1+V2)(V3+ V4)(V5+ V6 ) (H3+H4 +H5)
Lar geVLDL
MediumVLDL
Smal lVLDL
LargeLDL
MediumLDL
SmallLDL
LargeHDL
Smal lHDL
SUBCLASS LEVELS
IDL
VLDL Subclasses LDL Subclasses HDL Subclasses
LipoM ed, Inc. 0 4/99
LipoMed, Inc.3009 New Bern Avenue
Raleigh, NC 27610www. lipoprof ile.com
Prod uced un der p atent license sto U.S. Paten t Nos. 4,93 3,844a nd 5,34 3,389
Pag e 2 of 2
D es ira b le Bo r de r line -H igh H ig h
le ss th an 2 00 20 0 - 2 3 9 2 40 o r g r ea te r18 5m g/d L
18 1
3 7
112m g/d L
m g/d L
m g/d L
Ne ga tiv e R isk Fac to r I nt er m ed ia te P osi tive Ri sk Fa ct or
6 0 or g re at er 5 9 - 35 les s t ha n 35
De sir a ble Bo rd e rlin e- Hig h H igh
le ss tha n 2 00 20 0 - 4 0 0 4 00 - 1 ,0 00
Current NCEP Risk CategoriesNMR LIPID PANEL
De sir a bleO pt im al Bo rd e rlin e- Hig h H igh R isk
1 00 - 1 29 g re at er th a n 1 6 01 30 - 15 9le ss th an 1 00
Total Cholesterol
Triglycerides
LDL Cholesterol
HDL Cholesterol
*
Pat ien t Na m e
LM018820 08-26-99
Spe cim en ID Da te Rep or te d
(0 )
Rat urines afterRat urines afterdosage ofdosage ofliver- andliver- andkidney-toxinskidney-toxins
600 MHz-1H600 MHz-1Hnoesypr1dnoesypr1d64scans64scans
Sprague Sprague DawleyDawley + +Han-Han-WistarWistarare standardisedare standardisedlaboratory rat strainslaboratory rat strains
HexachloroHexachloro-- butadiene butadiene
ThioThio--acetamidacetamid
HydrazinHydrazin
SpragueSprague DawleyDawley control control
HanHan WistarWistar control control
Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))
CoomansCoomansPlotPlotshowingshowing95%95%confidenceconfidencelevellevelofofclassificlassifi--cationcation
normal ratnormal raturinesurinesversusversustoxin treatedtoxin treatedurinesurines
Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))
Classification of hydrazine induced Classification of hydrazine induced hepatotoxicityhepatotoxicity against againstrenal corticalrenal corticaltoxicity andtoxicity andcontrolscontrolsbased onbased onrat urinerat urine1D-NMR1D-NMRspectraspectra
Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))
Time course Time course in rat urines in rat urines after dosage after dosage ofofa-a-naphtylisonaphtyliso--thiocyanatthiocyanat(ANIT,(ANIT,liver toxin)liver toxin)
96-120h96-120h
lactatelactate72-96 h72-96 h
acetateacetate48-72 h48-72 h
32-48 h32-48 h
bile acidsbile acids24-32 h24-32 h
glucoseglucose8-24 h8-24 h
0-8 h0-8 h
controlcontrol
Determination of drug-toxicity (Determination of drug-toxicity (metabonomicsmetabonomics))
Metabolomic of gene alterations from DNAreparation
1D 1H spectracomparison ofbreast cellcultures withBRCA geneblocked and notblocked
The mostsignificantchanges in themetabolite profileare marked
ColaborationColaboration withwithDra. Dra. ArmengodArmengodFVIBFVIB
Cell Culture differences CONTROL/AICAR
Sample 124
Lactate
Lípids Lípids
Choline
Alanine
Creatine?Lysina?Asparagine?
Lípidos
Lactate
Glucose,amino acidsbetaine
Glucose,amino acids
ColaboraciónProf. JM. EspluguesF. Medicina
Visualización Apoptosis RMNa) Evolución temporal de 1H-ERMde un glioma transfectado HSV-tktratado in vivo con glanciclovirb) RMI convencional de un glioma notratado.c) Imagen de microscopía electrónica detransmisión (x5000) de célulastumorales no tratadasd) Gotas de lípidos flechas vacías;cuerpos de apoptosis triángulos negrosen células tumorales no tratadas
e) En tumores tratados (4 días) gotasricas en ácidos grasos poliinsaturadosseñaladas mediante flechas abiertas.
Hakumäki y Brindle, Trends in Pharmac. Sci. ,24,3 (2003)
Visualización Apoptosis RMN
Hakumäki y Brindle, Trends in Pharmac. Sci. ,24,3 (2003
Imágenes de 1H RMI de un tumor de ratón tratado con glanciclovir posteriores a lainyección del agente de contraste C2-SPIO. (a) imagen previa a contraste; (b), (c), (d),(e) a 11, 47, 77 y 107 min después. Las áreas de apoptósis, captan contraste, áreas depérdida de intensidad (flecha blanca). Imágenes inferiores sustracciones.
ProteinsProteins vsvs MetabolitesMetabolites(0.1-3KDa)(0.1-3KDa)
MetabonomicMetabonomic ofof Folicular Fluid Folicular Fluid
Contribución Clínica y Biomédica RMN Alto CampoContribución Clínica y Biomédica RMN Alto Campo
•• Diagnóstico Clínico BiofluidosDiagnóstico Clínico Biofluidos•• Diagnóstico Clínico TejidosDiagnóstico Clínico Tejidos•• Estudios Biomédicos Líneas CelularesEstudios Biomédicos Líneas Celulares•• Estudios Estudios FarmacocinéticosFarmacocinéticos:: TejidosTejidos BiofluidosBiofluidos•• Desarrollo Desarrollo BiomarcadoresBiomarcadores:: DiagnósticoDiagnóstico Diseño FármacosDiseño Fármacos•• Mejora Compresión Bioquímica PatologíasMejora Compresión Bioquímica Patologías
NMR ApplicationsNMR Applications
MRI +MRI + 9,6 - 100 9,6 - 100 0,25 - 3,0 0,25 - 3,0 < 100 < 100 5 5 human humanMRS MRS bodybody((clclíínicalnical))
MRI +MRI + 41 - 300 41 - 300 1,0 - 7,1 1,0 - 7,1 < 30 < 30 22 smallsmall animalsanimalsMRSMRS ( (rabitsrabits,, mousesmouses……))((biomedicinebiomedicine))
MiniimagingMiniimaging 300 - 400 300 - 400 7,1 - 9,4 7,1 - 9,4 < 12 < 12 0,005 0,005 mousesmouses
NMR NMR 200 - 600 200 - 600 4,7 - 14,1 < 2,5 4,7 - 14,1 < 2,5 0,00005 0,00005 insectsinsects,,MicroscopyMicroscopy materialsmaterials,,
embrionsembrions
NMRNMR 400 - 900 400 - 900 9,4 - 21 9,4 - 21 < 40 < 40 ÅÅ proteproteíínsns, DNA,, DNA,multidimensional multidimensional tissuestissues......
TypeType 11H(H(MHzMHz)) MagneticMagnetic SizeSize SpatialSpatial ApplicationApplicationresonanceresonance FieldField ( (cmcm) ) resolutionresolution SystemSystem
frequencyfrequency IntensityIntensity (T) (T) (mm (mm33))
B.Celda FIHCV-06
AknowledgmentsHospital La Ribera-AlziraDr. J. PiquerDr. E. MolláDr. A. RevertDr. P. FerrerIVO- ValenciaDr. J. CerveraDr. A. MarhuendaDr. A MenendezF. Medicina (UVEG)-ValenciaProf. F. PallardóProf. J.M. RodrigoProf. M. CerdáDr. M. MataHospital Clínico-ValenciaDr. J. Del OlmoDr. J. TalamantesFundación Investigación H.ClínicoClínica QuirónDr. L. Martí-BonmatíBruker Biospin Lab of ApplicationsDr. M. PiottoDr. O. Assemat
eTUMOUR Consortium Prof. C. Arús (UAB-Barcelona)Dr.F. Howe (SGHMS-London)Prof. A. Heerschap (UMCN-Nijmengen)Prof. L. Buydens (KUN-Nijmengen)Dr. C. Segerbart (INSERM-Grenoble)Mr. M Lluch (Microart-Barcelona)Dr. A. Capdevilla (HSJD-Barcelona)Dr. G. D’Incerti (PQE-Milan)Dr. L. Visani (PQE-Milan)Prof. S. Van Huffel (KUL-Leuven)Dr. P. Kreisler (Siemens-Etlinger)Dr. A. Klaasen (SCITO-Paris)Dr. M. Robles (UPVLC-Valencia)Dr. S. Wolfhard (DKFZ-Heidelberg)Dr. C. Brevard (Bruker-Biospin-Wissembourg)Dr. R. Grundy (BU-Birmimghan)Dr. F. Berger (INSERM-Grenoble)Dr. J. Calvar (FLENI-Buenos Aires)Dr. W. Gajewicz (MUL-Lodz)
UVEG-ValenciaDr. V. Esteve; MB Martínez-GranadosE. Piñero; R. Ferre
B.Celda IIIGERMN