Mechanismen der

Membranfusion

Capsid (Protein)

Genom (Nukleinsäure)

Envelope (Hülle)

Nukleokapsid

Virion

VirionNukleokapsid

Penetration

Rezeptorvermittelte Endozytose:

die meisten „nackten“ Viren (z.B. Picornaviren, Adenoviren)

einige umhüllte Viren (z.B. Influenzavirus, Flaviviren, Rhabdov.)

Virusstrukturprotein mit fusionsaktiver Sequenz

(meist durch absinkendem pH im Endosom aktiviert)

Fusion mit der Plasmamembran:

umhüllte Viren (z.B. Paramyxoviren, Herpesviren)

Verschmelzen der viralen und zellulären M direkt nach

Adsorption

Virales Fusionsproteine bei neutralem pH aktiv

Rezeptorvermittelte EndozytoseBeispiel: Semliki Forest Virus

Clathrin-abhängige rezeptorvermittelte

Endozytose

Ansäuerung im frühen Endosom

Fusion der Virusmembran mit der

Endosomenmembran

Freisetzung des Nukleokapsids in das

Zytoplasma (bleibt mit Endosomen

assoziiert)

Disassembly des Nukleokapsids

Genexpression und Genomreplikation

Phospholipid-Bilayer

Membranassoziierte Proteine

aussen: Sphinogmyelin

Phosphatidylcholin

Glykolipide

Cholesterin

innen: Phospatidylethanolamin

Phosphatidylserin

Phosphatidylinositol

Cholesterin

Integrale Membranproteine

(Transmembranproteine, meist

glykosyliert)

Periphere Membranproteine

Lipid-verankerte Proteine

Kohlenhydrate (Zucker)

Physik der Membranfusion

Annäherung der Membranen

Destabilisierung der Hydrophoben-/Hydrophilen Grenzen

Virushülle

Zellmembran

Physik der Membranfusion

Membranporen

- Entstehen auch bei proteinfreien Liposomen

- Flackern von Poren : Dauer von nur wenigen

Millisekunden bis hin zu Sekunden

- Proteine können dem Auslösen sowie dem

Stabilisieren der Fusionsporen dienen

Membranfusion

• zwei separate Lipiddoppelschichten verschmelzen

miteinander zu einer

zusammenhängenden

Lipiddoppelschicht

• Essentieller Prozess im Lebenszyklus von Zellen

– zB involviert in die regulierte Interaktion zwischen

intracellulären Membrankompartimenten, wie beim

Vesikeltransport oder der Exozytose

– Auch extrazelluläre Fusionsvorgänge wie während der

Spermium-Ei-Fusion oder Myoblastendifferenzierung sind

bekannt

Zell-Zell Membranfusion

• Bei Befruchtung sowie Bildung der

Immunabwehr und Immunabwehr an sich

• Spermium-Oocyte-Fusion:

- nur wenig bekannt

- IZUMO mit Ig-like Domäne (Spermium)

- CD9 (cluster of differentiation) (Oocyte)

bewirken extremere Krümmungen

Intrazelluläre Membranfusion

•Fusion wird von Protein-Maschinerie durchgeführt

•Außer SNAREs (membranverankert) alles aus dem

Cytoplasma rekrutiert

•Zwei Protein-Protein-Interaktionszyklen notwendig

Intrazelluläre Membranfusion

• Membrananlagerung über Rab-GTPasen

• SNARE-Assemblierung durch Rab soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor

•Fusion durch SNARE und SM-Proteine

SNARE-Zyklus

Rab-Proteine

Rab-Proteine ->GTPasen (GDP-löslich; GTP-gebunden)

Vermittelt die Membrananlagerung (meistens)

Für jedes Kompartiment spezielle Rabs (+Kofaktoren)

Keine Transmembrandomäne (Geranylgeranylreste)

Jedes Rab besitzt einen eigenen Effektor

Rab-Zyklus

Rab-GTP (membranst.)

-> Attachment

Nach/während Fusion

-> GTP zu GDP

-> Rab wird löslich

Rab-Zyklus

SNAREs und SM-Proteine

Freie SNARE-Motive sind unstrukturiert

Gebundene bilden 4-Helix-Bündel

Müssen auf beiden Membranen vorhanden sein

Bedeutender Kofaktor SM-Proteine

Einziger Fakt: SNAREs bringen die Membranen näher

aneinander, alles andere unbekannt

v-SNARE = vesicle synaptosome-associated protein receptor

t-SNARE = target synaptosome-associated protein receptor

SNARE-Zyklus

b) Assemblierung der

SNARE-/SM Proteine

SNARE-Motive

noch unstrukturiert

SNARE-Zyklus

c) trans-SNARE

Bndg.

-> 4x SNARE

trans

Komplex

SNARE-Zyklus

d) Hemifusion nach

Tubulibildung

-> weitere Schritte

noch unklar

SNARE-Zyklus

d) vollständige

Fusion

-> trans-Komplexe

werden zu cis

-> von NSF/SNAP

abgebaut

Synaptische Vesikelfusion

Virale Membranfusion

Übersicht

• Membranfusion allgemein

• Klasse I-III – Fusionsproteine

• FAST-Proteine

Membranfusion

• Zell-Zell-Fusion -> Synzytienbildung

– möglich durch zelluläre Proteine, wie zB. FF-Proteine oder

SNARE-Proteine

– bei umhüllten Viren durch Glykoproteine vermittelt

– bei nicht-umhüllten Viren: FAST-Proteine

– bedeutsam für cell-to-cell-spread, Virulenz und Persistenz

• Virus-Zell-Fusion

– durch Klasse I- III - Fusionsproteine bei umhüllten Viren

• KEINE Fusion durch bloßen Zell-Zell-Kontakt! Zelluläre oder virale Fusionsproteine nötig

Klasse I, II und III –

Fusionsproteine bei umhüllten

Viren

Fusionsproteine• Glykoproteine bestehen aus:

– eine große Ektodomäne

– Transmembrandomäne

– kurze cytoplasmatische Domäne

• Besonderheit: Fusionspeptid (kurze Sequenz hydrophober AS)

• Präfusionsformen sind metastabil

• whl. kinetische Barrieren vorhanden:

• Fusion durch Konformationsänderungen

zu niedrigeren Energiezustand ermöglichtHemifusion

Fusionspore

Allgemeiner Werdegang der

Fusionsproteine:

1. Änderung in eine verlängerte Konformation, wobei das Fusionspeptid freigelegt wird

2. Insertion und Verankerung des Fusionspeptids in die gegenüberliegende Membran -> „Prehairpin“-Struktur

3. Rückfaltung -> „Hairpin“- Struktur

Diversität von viralen Fusionsproteinen

und den Auslösern für die Fusion

(A) Influenza HA

(B) Paramyxovirus F und die meisten retroviralen Env Proteine

(C) α-retrovirale Env Proteine

(D) Ebola GP

(E) TBEV E

(F) VSV G

(G) HSV gB

Klasse I

Beispiele Influenza -> HA

Paramyxovirus -> F

HIV -> gp41

Integraler Membrantyp Typ I

Lage der

Fusionspeptide

In der Nähe des N-

Terminus

proteolytische

Prozessierung

benötigt

Ja

Oligomerer Status der

nativen Form

Trimer

Oligomerer Status der

fusionsaktiven Form

Trimer

Sekundärstruktur der

fusogenen UE

α - Helix

Struktur der post-

Fusionsform

„hairpin“-Struktur

(„coiled-coil“,

6Helixbündel aus TM

+ Fusionspeptiden)

Klasse I -Fusionsprotein

FP Fusionspeptid – lokalisiert am oder in der Nähe des N-Terminus

N-HR N-heptad repeat

C-HR C-heptad repeat

TMD Transmembrandomäne

Wellenlinie: Cytoplasmatischer Schwanz

// Linker mit variabler Länge

immer als Vorläuferproteine synthetisiert und später in zwei Polypeptide

gespalten

N-Terminus C-Terminus

Influenzavirus Paramyxovirus

• Familie: Orthomyxoviridae

• - ssRNA, segmentiert

• umhüllt, 80-120 nm Durchmesser

• Fusionsprotein HA

• Trigger für Fusion: pH-Wert

• Ordnung: Mononegavirales

• Familie: Paramyxoviridae

• - ssRNA, linear

• umhüllt, 150 nm Durchmesser

• Fusionsprotein F

• Trigger für Fusion: Rezeptor

Influenza HA

• HA0 (Vorläuferprotein) wird gespalten:

• HA1-Untereinheit

bindet an Sialinsäure auf der Zelloberfläche

internalisiert Endosomalen Weg

• HA2-Untereinheit

– für Fusion

• Fusion durch niedrigen pH im Endosom

HA0 HA1-UEHA2-UE

• N-terminales Fusionspeptid

• bei pH - ↓:

– Bewegung der Rezeptor-

bindenden Kopfdomäne (HA1,

nicht in der Abb) wobei HA2

freigelegt wird

• Fusion durch:

– Verlängerung des

Fusionspeptids

Prehairpin-Intermediat

und C-terminale Umkehrung

Transmembrandomäne

(Dreiecke) in die Nähe des

Fusionspeptids

• finales Stadium: Hairpin-Struktur

Trimer Monomer Hairpin-Struktur

zentrale coiled-coilStruktur

unstruktur. Linker

unstruktur. Linker

Influenza HA

Influenza HA

rb = Rezeptor-bindende Untereinheit

F = Fusionsuntereinheit

6HB = 6 Helixbündel

Zielmembran

virale Membran

10

-20

nm

Rezeptorvermittelte Endozytose

Influenza: Ansäuerung des Kapsids durch viruskodierte

Ionenkanal (M1) führt zur Membranfusion

Paramyxovirus F

• Fusion durch Rezeptorbindung

• separates Rezeptor-bindendes Protein: HN

• F0 (Vorläuferprotein) wird gespalten:

F1 und F2 (Disulfid-linked)

Fusionspeptid ursprünglich internal -> N-terminal in F1

• drei Domänen

• Furin-Spaltungsstelle =

Start von F1 (roter Pfeil)

• N-terminales

Fusionspeptid im F1

Trimer Monomer

Paramyxovirus F

Assoziations-Model

Dissoziations-Model

• F-Protein mit drei Domänen

• DI und DII: primär aus β-Faltblatt +

Linkerstrukturen

• Furin-Spaltungsstelle = Start von F1 (roter

Pfeil)

• N-terminales Fusionspeptid – im Trimer

verkeilt zwischen DII und DIII

Trimer Monomer

• Hairpin-Struktur

• lange coiled-coil- Struktur

mit 6 Helixbündeln

Klasse I Klasse II Klasse III

Beispiele Influenza -> HA

Paramyxovirus ->

F

HIV -> gp41

TBEV -> E

SFV -> E1/E2

VSV -> G

HSV-1 -> gB

Integraler

Membrantyp

Typ I Typ I Typ I

Lage der

Fusionspeptide

In der Nähe des N-

Terminus

Intern intern

proteolytische

Prozessierung

benötigt

Ja Ja Nein

Oligomerer Status

der nativen Form

Trimer Dimer Trimer bei VSV

Oligomerer Status

der fusionsaktiven

Form

Trimer Trimer Trimer

Sekundärstruktur

der fusogenen UE

α - Helix β - Faltblatt α - Helix

β - Faltblatt

Struktur der post-

Fusionsform

„hairpin“-Struktur

(„coiled-coil“,

6Helixbündel)

„hairpin“ – Struktur

(nicht- „coiled-coil“)

„hairpin“-Struktur

(bei VSV 6HB)

Klasse II-Fusionsprotein

• Die Faltblätter sind miteinander verbunden und formen

eine ikosaedrische Struktur

• sind assoziert mit einem Chaperonprotein

– zB. p62 bei SFV E1 oder prM bei TMEV E

– die Spaltung erfolgt während oder kurz nach dem Virusassembly

• Trigger: niedriger pH-Wert

TBEV

• Familie: Flaviviridae

• Gattung: Flavivirus

• Art: Tick-borne meningoencephalitis – Virus

• + ssRNA

• umhüllt, 40-60 nm Durchmesser

• Fusionsprotein: E

TBEV E

• anti-parallele Homodimere

• 3 Domänen,

– D II mit Fusionspeptid-Loops

und ij-Loop (Rolle beim Binden

der Zielmembran)

• Dimer

• Konformationsänderungen bei

niedrigen pH

Rotation fast des gesamten

Proteins

Bildung eines

homotrimerischen Pre-Hairpins

• Trimer

• Hairpin-Struktur

flexibler Linker

Dimer Pre-Hairpin Hairpin (Trimer)

Klasse I Klasse II Klasse III

Beispiele Influenza -> HA

Paramyxovirus ->

F

HIV -> gp41

TBEV -> E

SFV -> E1/E2

VSV -> G

HSV-1 -> gB

Integraler

Membrantyp

Typ I Typ I Typ I

Lage der

Fusionspeptide

In der Nähe des N-

Terminus

Intern Intern

proteolytische

Prozessierung

benötigt

Ja Ja Nein

Oligomerer Status

der nativen Form

Trimer Dimer Trimer bei VSV

Oligomerer Status

der fusionsaktiven

Form

Trimer Trimer Trimer

Sekundärstruktur

der fusogenen UE

α - Helix β - Faltblatt α - Helix

β - Faltblatt

Struktur der post-

Fusionsform

„hairpin“-Struktur

(„coiled-coil“,

6Helixbündel)

„hairpin“ – Struktur

(nicht- „coiled-coil“)

„hairpin“-Struktur

(bei VSV 6HB)

Klasse III- Fusionsproteine

• Fusionspeptid: sehr kurz, nur wenige hydrophobe AS

und diskontinuierlich

• zweiteilige internale Fusionspeptide aus zwei starren

Loops aus drei antiparallelen β-Strängen

• Trigger: niedriger pH-Wert, Rezeptorbindung

• Besonderheit: Konformationsänderung durch den pH ist

reversibel

VSV

• Ordnung: Mononegavirales

• Familie: Rhabdoviridae

• Gattung: Vesiculovirus

• Art: Vesicular stomatitis virus

• - ssRNA, linear

• umhüllt

• Fusionsprotein: G

VSV G

• neutraler pH

• Fusionspeptid und TM am gl.

Ende lokalisiert

• Fusionloops offen liegend

• nach pH-↓: ähnliche

Konformationsänderungen wie

bei Influenza HA

• Hairpin-Struktur

unstruktur. Linker

gD -> specific host-cell receptor

-> gD is activated

interaction with gH/gL and/or gB

-> core fusion complex

Herpesvirus membrane fusion – a hypothesis

gD -> specific host-cell receptor

-> gD is activated

interaction with gH/gL and/or gB

-> core fusion complex

PM

VM

FAST-Proteine

FAST – Proteine - eine eigene

Klasse von Fusionsproteinen

• FAST = fusion-associated small transmembrane

• Familie: Reoviridae

Gattung: Orthoreovirus Aquareovirus

Spezies: Avian reovirus (ARV) Atlantic salmon reovirus

Nelson bay virus (NBV) (AtSRV)

Baboon reovirus (BRV)

Reptilian reovirus (RRV)

– Nicht-umhüllte Viren

– dsRNA, segmentiert

– ikosaedrisch

Was sind FAST-Proteine?

• Nicht-Strukturproteine

– nicht beim Eintritt in die Zelle beteiligt !!!

– werden in infizierten Zellen exprimiert und über den

ER-Golgi-Weg an die Plasmamembran gebracht

• Akkumulierung der FAST-Proteine auf der

Zelloberfläche führt zur Fusion mit benachbarten

(nicht-infizierten) Zellen

Merkmale der FAST-Proteine

• Kodiert durch ein

polycistronisches Segment

• kaum/keine direkten Sequenzhomologien

– ARV & NBV (33% gleich)

– RRV

– BRV

Merkmale der FAST-Proteine

• Klein mit 95-140 AS (Fusionsproteine umhüllter Viren: 150-300 AS)

• Nexoplasmatisch/ Ccytoplasmatische räumliche Struktur in der Plasmamembran– damit ein Typ III – Membranprotein

– Typ I: Nexo/Ccyt; Typ II: Cexo/Ncyt

• basische Domäne

• Stück mit hydrophoben Resten– übernimmt evt. Funktion als Fusionspeptid

Vergleich zu anderen

Fusionsproteinen

• keine „verlängerten“ heptad repeat -

Strukturen

– > keine coiled-coil Domänen

• kein typisches Fusionspeptid-Motiv

• keine langen, komplexen, multimere

Ektodomänen

Modell des p10-Protein von ARV

und NBV

• hydrophobe Domäne mit kurzer heptad repeat - Struktur – einzige Ähnlichkeit zu Fusionspeptiden

evt. in „Membran-suchenden“ helikalen Konformation

• basische Domäne beeinflusst Membranorientierung

evt. auch Viroporin-ähnliche Membran-destabilisierende Aktivität

• konservierte Cystein-Reste in Cytoplasmatischen Domäne

evt. palmityliert ähnlich dem „Adenovirus death protein“

TM

Abgrenzung von Viroporinen

FAST-Proteine

• nackte Viren

• 95-140 AS-Reste

• Nichtstrukturproteine

• basische Domäne

• für Synzytienbildung verantwortlich– löst Apoptose aus und

damit Virusfreisetzung

– keine Permeabilitätsveränderung der Membranen

Viroporine

• behüllte und nackte Viren

• 60-120 AS-Reste

• oft Nichtstrukturproteine

• polybasische Domänen

• Donormembran-störend– evt. mitwirkend am CPE und

an Freisetzung von Virionen

– Veränderung der Permeabilität der Membran zB. Ionentransport möglich

• zB bei Influenza M2

FAST – Protein -

Fusionsmechanismus

• whl. keine größeren Konformationsänderungen möglich

• Hypothese: FAST-Proteine lösen indirekt eine Fusion

aus?

– Einsatz von Actionmycin D -> Wirtszelltranskription gestört

– kein Effekt auf Reovirustranskription oder Synzytienformation

• FAST-Proteine sind Fusionsproteine, die direkt zu einer

Fusion führen

• Hemifusions-Weg?

It‘s good not all

can fuse !

Sebastien Igonet and Felix Rey, Cell 151, December 21, 2012

Physik der Membranfusion

Zell-Zell Membranfusion

• Vorhandensein von fusogenen Proteinen

die unabhängig von der intrazellulären

Fusion sind.

• Zwei verwandte Proteine (EFF-1 und AFF-

1) werden

hauptsächlich für die epitheliale Zellfusion

benötigt.

Zell-Zell Membranfusion

• EFF-1 ist selbstoligomerisierend und

bindet sich in trans, wenn in beiden F.-

Partnern vorhanden.

• EFF-1 vermittelt die Fusion direkt und wird

am Kontaktpunkt angereichert.

• Auch alleine schon fusogene

Eigenschaften -> Syncytienbildung

SNAREs und SM-Proteine

SNARE-Komplex besteht meist aus Qa-,

Qb-, Qc-,

und R-SNAREs

Wichtigster Bestandteil: SNARE-Motiv (4x α-

Helices)

Besitzen Transmembrandomäne

(Ausnahmen!)

Synaptische Vesikelfusion

Regulation der Vesikelausschüttung über

Ca²+

Nur in aktiven Zone ausgelöst (präsyn.

Spalt)

Verzögerungszeit von >1ms evtl. >100µs

Vesikelausschüttung nahezu synchron

Synaptische Vesikelfusion

Reaktionszeit legt nahe dass :

- Fusionsprozess zuvor bereits

stattfand (z.T.)

(SNARE-Assemblierung, Hemifusion,

…)

- aktive Zonen besitzen große

unlösliche

Proteinkomplexe

Literatur

• Corcoran, J. A. and R. Duncan (2004). "Reptilian reovirus utilizes a small type III protein with an

external myristylated amino terminus to mediate cell-cell fusion." J Virol 78(8): 4342-4351.

• Harrison, S. C. (2008). "Viral membrane fusion." Nat Struct Mol Biol 15(7): 690-698.

• Racine, T., T. Hurst, et al. (2009). "Aquareovirus effects syncytiogenesis by using a novel member

of the FAST protein family translated from a noncanonical translation start site." J Virol 83(11):

5951-5955.

• Salsman, J., D. Top, et al. (2005). "Extensive syncytium formation mediated by the reovirus FAST

proteins triggers apoptosis-induced membrane instability." J Virol 79(13): 8090-8100.

• Sapir, A., O. Avinoam, et al. (2008). "Viral and developmental cell fusion mechanisms:

conservation and divergence." Dev Cell 14(1): 11-21.

• Shmulevitz, M. and R. Duncan (2000). "A new class of fusion-associated small transmembrane

(FAST) proteins encoded by the non-enveloped fusogenic reoviruses." EMBO J 19(5): 902-912.

• Wessels, L. and K. Weninger (2009). "Physical aspects of viral membrane fusion."

ScientificWorldJournal 9: 764-780.

• White, J. M., S. E. Delos, et al. (2008). "Structures and mechanisms of viral membrane fusion

proteins: multiple variations on a common theme." Crit Rev Biochem Mol Biol 43(3): 189-219.

HIV Attachment und Penetration

SNAREs und SM-Proteine

Brücke zwischen Rab-Zyklus und SNARE-Komplexen sind

die SM-Proteine (vermutlich)

SM-Proteine sind essentiell (SNAREs nicht unbedingt)

Regulieren die SNARE-Assemblierung a.d. Membran

Verhindern SNARE-Fehlpaarungen

Synaptische Vesikelfusion

Ca²+ Sensor (Synaptotagmin 1) sitzt an Exocyt.seite

Mehrere Ca²+ binden an einen Sensor

Fungiert als zurückhaltende Fusionsklammer

Oft Ziel von Neurotoxinen (Botulinus, Tetanus Toxin)

Membranfusion

Sekretorischer Weg:

Rab GTPasen, SNAREs,

SNARE-assoziierte Proteine (SM, NSF, SNAP

…)

Arbeiten mit speziellen Lipiden zusammen um die

Fusion auszulösen.