8/16/2019 MBM.5n

1/40

UJI AKTIVITAS ANTIJAMUR (+)-KATEKIN

DAN GAMBIR (Uncaria gambir, Roxb)

TERHADAP BEBERAPA JENIS JAMUR DAN

MEKANISMENYA

Muh. Yanis Musdja

8/16/2019 MBM.5n

2/40

 

PENDAHULUAN

8/16/2019 MBM.5n

3/40

LATAR BELAKANG

Menyirih merupakan

salah satu kegiatan yang

memanfaatkan tanaman

tradisional.

Gambir merupakan

salah satu bahan

menyirih.

Dibutuhkan penelitian ilmiah

(SAINTIFIKASI) tentang kegunaan

gambir

Penelitian antijamur

8/16/2019 MBM.5n

4/40

  Tujuan Penelitian 

Mengetahui aktifitas anti jamur

(+)- katekin gambir dan ekstrak air gambir

terhadap beberapa jamur.

Mengetahui mekanisme

penghambatan anti jamur (+)-katekingambir dan ekstrak air gambir

terhadap beberapa jamur.

8/16/2019 MBM.5n

5/40

Manfaat Penelitian 

Penelitian ini diharapkan memberikan

gambaran dan informasi tentang aktivitas anti

 jamur dari (+)-katekin dan ekstrak air gambir,

serta mekanisme panghambatannya terhadap

beberapa jamur untuk menunjang saintifikasi

gambir sebagai pengobatan tradisional.

8/16/2019 MBM.5n

6/40

8/16/2019 MBM.5n

7/40

Kandungan kimia

Kandungan Kimia Daun Gambir dan Bongkahan Gambir 

Kandungan katekin total daun gambir 13,7 % (Anggraini et

al , 2011), kandungan (+)-katekin daun gambir 9,4% (Das

N.P, 1967).

Kandungan utama bongkahan gambir adalah katekin (40-

60%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloid 

seperti gambirtannin, turunan dihidro dan okso-

gambirtannin. (Wiart, 2006; Amos, 2010).

Taniguchi et al  (2008) menemukan 9 jenis katekin padagambir, yakni, (+)-catechin, (-)-epicatechin Gambiriin A1,

Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin-(4α-8)-

ent-epicatechin, Gambirflavan D1 dan Gambirflavan D2.

http://id.wikipedia.org/wiki/Katekinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Alkaloidhttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gambirtannin&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gambirtannin&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gambirtannin&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Gambirtannin&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Alkaloidhttp://id.wikipedia.org/wiki/Katekin

8/16/2019 MBM.5n

8/40

Khasiat empir ik 

• Kegunaan gambir secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirih

dan obat-obatan, gambir juga digunakan untuk obat luka bakar, di

samping rebusan daun muda dan tunasnya digunakan sebagai obat diare

serta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan.

• Secara moderen gambir banyak digunakan sebagai bahan baku industri

farmasi dan makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati dengan

paten “catergen”, bahan baku permen yang melegakan kerongkongan bagi

perokok di Jepang karena gambir mampu menetralisir nikotin.

• Sedangkan di Singapura gambir digunakan sebagai bahan baku obat sakit

perut dan sakit gigi

8/16/2019 MBM.5n

9/40

(+)-Katekin 

• (+)-Katekin adalah golongan senyawa pilofenol

tipe flavonoid, yang banyak dijumpai pada

teh, anggur, buah-buahan dan tumbuh-

tumbuhan polon-polongan. Lima jenis katekin

terbesar yaitu (+)- katekin, (-)- epikatekin, (-)-

epigallokatekin (EGC), (-)- apikatekin gallat,

dan (-)- epikatekin gallat (I. C. W., Arts et al ,1998).

8/16/2019 MBM.5n

10/40

Metode Pengujian Antimikroba 

Metode Difusi Metode Dilusi

8/16/2019 MBM.5n

11/40

  Bongkahangambir

Dilarutkandalamaquadest

Freeze

drying

Fraksinasi etil

asetat

Ekstrak etil asetat

gambir

Kromatografi

kolom

(+)-katekin

Ekstrak air

gambir

Uji aktivitas antijamur

8/16/2019 MBM.5n

12/40

Pengujian aktivitas antijamur

Pengujian kebocoran

membran sel

Analisa morfologi sel

dgn SEM

Penentuan MIC

Penentuan

zona hambat

Analisa

kebocoran

protein dan asam

nukleat dgn UV

Analisa kebocoran ion

logam dgn AAS

8/16/2019 MBM.5n

13/40

Analisis kerusakan bakteri (Carson et al . 2002)

Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500

rpm, 20menit

Filtrat dibuang, endapan

dicuci dan ditambahkan

buffer fosfat

Ditambahkan sampel

dengan dosis 1 KHM & 2

KHM

Diinkubasi shaker 24 jam,

150rpm

Suspensi disentrifuge, 15 mnt,

kec 3500 rpm

Disaring dengan kertas

saring sterilpellet

supernatan

Analisis kerusakan sel

dengan SEM

analisis kebocoran

protein dan asam nukleatdengan spektro UV-Vis

Analisis kebocoran

ion-ion logam K+ dan

Ca2+ dengan AAS

8/16/2019 MBM.5n

14/40

 

HASIL PENELITIAN

8/16/2019 MBM.5n

15/40

Isolasi dan Identifikasi (+)-Katekin

• Hasil dari KLT didapatkan beberapa fraksi yang

digabungkan, yaitu : 1-8, 9-10, 11-28, 29-40,

41-75.

• Persentase kadar (+)-katekin yang didapat

sebesar 22,54%

8/16/2019 MBM.5n

16/40

Pengujian zona hambat

Aktivitas Gambir dan Katekin terhadap 5 jamur

pada konsentrasi 7000 µg

No. Jamur uji Diameter hambat

1 Candida albicans  -

2 Saccharomyces cerevisiae  -

3 Fusarium oxysporum  -

4  Aspergillus niger   -

5  Aspergillus flavus  -

6 Kontrol pelarut -

8/16/2019 MBM.5n

17/40

Penentuan MIC

Penentuan nilai MIC2,5 mg/ml – 25 mg/ml

No. Jamur uji Nilai MIC (mg/ml)

Gambir (+)-katekin

1 Candida albicans  - -

2Saccharomyces cerevisiae 

7,5 12,5

3 Fusarium oxysporum 

- -

4 Aspergillus niger  

- -

5 Aspergillus flavus 

- -

6 Kontrol pelarut - -

8/16/2019 MBM.5n

18/40

Analisa kebocoran protein dan asam

nukleat dgn spektrofotometri UV VIS

Data Spektrofotometri UV VIS Gambir S.

cerevisiae

Panjang

gelombang

Absorbansi

Kontrol 1 MIC 2 MIC

260 nm0,693 0,747 0,873

280 nm0,870 0,895 0,957

8/16/2019 MBM.5n

19/40

Analisa kebocoran protein dan asam

nukleat dgn spektrofotometri UV VIS

Data Spektrofotometri UV VIS (+)-Katekin S.

cerevisiae 

Panjang

gelombang

Absorbansi

kontrol 1 MIC 2 MIC

260 nm0,693 1,575 1,816

280 nm0,870 2,032 2,658

8/16/2019 MBM.5n

20/40

8/16/2019 MBM.5n

21/40

Perubahan Morfologi Sel

Saccharomyces cerevisiae 

(a) (b) (c)

8/16/2019 MBM.5n

22/40

Perubahan Morfologi Sel

Saccharomyces cerevisiae 

(d) (e)

8/16/2019 MBM.5n

23/40

Perubahan Morfologi Sel

Saccharomyces cerevisiae 

• Morfologi sel S. cerevisiae kontrol (a), sel S.

cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 1

MIC (b), sel S. cerevisiae setelah perlakuan

dengan gambir 2 MIC (c), sel S.cerevisiaesetelah perlakuan dengan katekin 1 MIC(d),

dan sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan

katekin 2 MIC (e) (Pembesaran 15.000 kali).Tanda panah adalah terjadinya kerusakan sel.

8/16/2019 MBM.5n

24/40

KESIMPULAN

1. Persentase kadar (+)-katekin yang disiolasi darigambir yang berasal dari Payakumbuh,Sumatera Barat sebesar 22,54%.

2. Nilai MIC gambir pada S. cerevisiae (LIPIMC)adalah 7,5 mg/ml dan untuk (+)-katekin sebesar12,5 mg/ml. Sedangkan gambir dan (+)-katekintidak menunjukan aktivitas antijamur terhadap

C. albicans (LIPIMC), A. niger  (LIPIMC 759), A. flavus (LIPIMC 745), F.oxysporum (LIPIMC 762)hingga konsentrasi uji 25 mg/ml.

8/16/2019 MBM.5n

25/40

KESIMPULAN

3. Mekanisme penghambatan gambir dan katekinterhadap Saccharomyces cerevisiae adalah denganmengganggu permeabilitas membran sel.

4. Karena gambir dan (+)-katekin terhadap C. albicans, 

 A. niger , A. flavus , F.oxysporum , dan S. cerevisiae tidak menunjukan aktivitas hingga konsentrasi 25mg/ml, maka sampel uji diklasifikasikan sebagaiantimikroba resistant  menurut data pengujianUniversity of Pennsylvania dalam University ofPennsylvania Medical Centre Guide Lines forAntimicrobial Therapy.

8/16/2019 MBM.5n

26/40

saran

1. Perlu diperhatikan kualitas gambir, agar

didapatkan hasil uji yang lebih baik.

2. Perlu dilakukan penelitian terhadap (+)-katekin dan gambir untuk pemanfaatan

lainnya.

8/16/2019 MBM.5n

27/40

8/16/2019 MBM.5n

28/40

• Pembuatan Medium

• Potato Dextrose Agar (PDA)• Serbuk PDA sebanyak 39 gram dilarutkan

dalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampai

mendidih sehingga larut. Larutan tersebutkemudian disterilkan dalam autoklaf pada

suhu 121 °C selama 15 menit.

8/16/2019 MBM.5n

29/40

8/16/2019 MBM.5n

30/40

• Pembuatan larutan Uji

• Larutan uji dibuat dengan melarutkan gambir

dengan DMSO 10% dan katekin dilarutkan dalamaseton (pengujian zona hambat) dan dalam

methanol 20% (pengujian MIC). Untuk

penentuan zona hambat antijamur, konsentrasi

larutan uji yang dibuat sebesar 350 mg/ml untuk

penentuan zona hambat jamur. Sedangkan untuk

penentuan nilai MIC konsentrasi larutan uji yang

digunakan adalah 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5

mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml.

8/16/2019 MBM.5n

31/40

• Pembuatan Stok Jamur

• Jamur uji diinokulasi dalam media agar PDA

yang dibuat membentuk agar miring dengancara menggoreskan masing-masing jamur

menggunakan jarum ose steril ke dalam 5 ml

media agar miring PDA dan diinkubasi padasuhu ruang selama waktu tumbuh optimum

masing-masing jamur.

8/16/2019 MBM.5n

32/40

• Pembuatan Suspensi Jamur

•   Biakan jamur yang telah

diremajakan tersebut, diambil sebanyak 1 osedan disuspensikan ke dalam tabung reaksiyang berisi 5 ml media cair PDB kemudiandiinkubasi dengan shaker inkubator  pada suhu

ruang °C selama waktu tumbuh optimummasing-masing jamur. Jumlah jamur yangterdapat dalam suspensi dihitung dengan

menggunakan metode cawan hitung. Jumlah jamur tersebut nantinya digunakan untukpengujian aktivitas antimikroba.

8/16/2019 MBM.5n

33/40

• Penentuan Diameter Daerah Hambat

•   Penentuan aktivitas antijamur dari gambir dan (+)- katekinterhadap Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus

niger, Aspergillus flavus ,dan Fusarium oxysporum dilakukan denganmetode difusi agar menggunakan kertas cakram. Media agar PDAyang sudah dicairkan sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petristeril dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, suspensi darisetiap jamur sebanyak 0,1 ml disebar ke permukaan agar secaramerata pada cawan yang berbeda. Kertas cakram steril diletakkan di

atas medium agar dan ditetesi larutan uji sebanyak 20 µl. Untukkontrol negatif digunakan pelarut DMSO 10% (pengujian gambir)dan aseton (pengujian katekin) sebanyak 20 µl pada setiap jamuruji. Masing-masing cawan petri diinkubasi pada suhu ruang selamawaktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Aktivitas antijamurdiamati berdasarkan diameter daerah hambat yang terbentuk di

sekeliling kertas cakram. Pengujian dilakukan secara duplo.

8/16/2019 MBM.5n

34/40

• Penentuan MIC (Minimum Inhibitor Concentration) 

• Penentuan MIC gambir dan (+)-katekin dilakukan dengan metodemakrodilusi dengan menggunakan petridish. Untuk pengujian MICdengan metode makrodilusi masing-masing petridish diisikan

medium PDA yang telah mengandung seri konsentrasi sampel uji2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml;17,5 mg/ml dan 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml, kemudianditotol suspensi jamur dan di inkubasi selama waktu tumbuhoptimum masing-masing jamur pada suhu ruang. Setelah prosesinkubasi, diamati masing-masing seri konsentrasi larutan uji

terdapat pertumbuhan atau tidak. Untuk kontrol digunakan empatmacam kontrol yaitu

• kontrol media, hanya berisi media PDA

• kontrol negatif, berisi media PDA dan pelarut

• kontrol bakteri, berisi media PDA dan suspensi jamur

•Kontrol pelarut, berisi media PDA, suspensi bakteri dan pelarut

•   Dari prosedur tersebut diperoleh nilai MICgambir dan katekin. Nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasiterkecil dari sampel uji yang dapat menghambat pertumbuhan jamur uji.

8/16/2019 MBM.5n

35/40

• Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002)

• Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakanspektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan padapanjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asam

nukleat) dan panjang gelombang 280 nm (untuk kandungannitrogen dari protein). Suspensi jamur uji sebanyak 10 ml, yangtelah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media PDB, disentrifusdingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuanglalu endapan sel disuspensikan dengan 9,5 ml buffer fosfat pH 7,0.Selanjutnya ditambahkan sampel uji dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dan

kontrol, diinkubasi dalam shaker inkubator  selama 48 jam. Setelahdiinkubasi, suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama15 menit, lalu disaring untuk memisahkan supernatan dari sel.Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjanggelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakanspektrofotometer UV. Pellet jamur dikoleksi untuk difoto dengan

SEM dengan perlakuan pada prosedur

8/16/2019 MBM.5n

36/40

• Analisis Kebocoran Ion-Ion Logam

• Untuk analisis kebocoran ion-ion diukur dalam

bentuk ion Ca2+ dan K+ yang keluar dari

membran sel jamur akibat perlakuan dengan

sampel. Kebocoran ion Ca2+ dan K+ dideteksi

dengan menggunakan AAS. Sampel untukanalisis kebocoran ion logam berupa cairan

supernatan yang berasal dari perlakuan pada

prosedur

d h b b k

8/16/2019 MBM.5n

37/40

Penentuan diameter zona hambat bakteri 

PDA steril yang telah memadat

Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel

bakteri

Diratakan dengan batang spreader

Diletakan kertas cakram steril

Diteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak Gambir

Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam

Diukur zona bening disekitar cakram

Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-Katekin

8/16/2019 MBM.5n

38/40

Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-KatekinMicroplate

+100 µl MHB, + 100 µl

suspensi bakteri

150 µl

MHB+100

µl suspensi

bakteri

Diinkubasi 24 jam, 37o C

Larutan uji dan pembanding (+50 µl) Larutan kontrol

(+)-KatekinEkstrak Gambir100 µl

MHB+100

µl

suspensi

bakteri

+50 µl

pelarut

200 µl

MHB+50

µl pelarut

250

µl

medi

um

Di plating, diinkubasi selama 24 jam37o C Diamati pertumbuhan bakteri

Analisis kerusakan Jamur (C l 2002)

8/16/2019 MBM.5n

39/40

Analisis kerusakan Jamur (Carson et al . 2002)

Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500

rpm, 20menit

Filtrat dibuang, endapan

dicuci dan ditambahkan

buffer fosfat

Ditambahkan sampel

dengan dosis 1 KHM & 2

KHM

Diinkubasi shaker 24 jam,

150rpm

Suspensi disentrifuge, 15 mnt,

kec 3500 rpm

Disaring dengan kertas

saring sterilpellet

supernatan

Analisis kerusakan sel

dengan SEM

analisis kebocoran

protein dan asam nukleatdengan spektro UV-Vis

Analisis kebocoran

ion-ion logam K+ dan

Ca2+ dengan AAS

P di h b b k i

8/16/2019 MBM.5n

40/40

Penentuan diameter zona hambat bakteri 

MHA steril yang telah memadat

Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel

bakteri

Diratakan dengan batang spreader

Diletakan kertas cakram steril

Diteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak Gambir

Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam

Diukur zona bening disekitar cakram