mapeamento genomico

of 37/37
Mapeamento genético em procariotos Prof. Dra. Adriana Dantas Prof. Dra. Adriana Dantas Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia UERGS – Bento Gonçalves UERGS – Bento Gonçalves

Post on 01-Jun-2015

1.037 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • 1. Mapeamento gentico emprocariotos Prof. Dra. Adriana DantasEngenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaUERGS Bento Gonalves

2. Definies Mapa gentico: define a distncia entre mutaes em termos de freqncia de recombinao Mapa por restrio: Digesto do DNA com enzimas de restrio e medio da distncia entre os stios de quebra Mapa definitivo: conseguido atravs do seqenciamento do DNA 3. IntroduoNo mapeamento gentico, utilizamos conhecimentos de diversas reas da gentica, alm deprocedimentos estatsticos adequados.Assim, o mapeamento gentico envolve a gentica mendeliana, a citogentica, a gentica molecular, agentica quantitativa (para mapeamento de QTLs) e a gentica de populaes. 4. Variao genomicaFenotpico: funo do gene afetadaPolimorfismoFragmento de restrio: stio alvo deenzima afetadoSeqncia: anlise direta do DNA RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): diferenano mapa de restrio entre dois (ou mais) indivduos 5. Marcadores moleculares podem ser usados para mapeamento Marcadores so teis para a construo de mapas deligao e testes de paternidade. Mapeamento gentico: marcadores: RFLPs, SSR, AFLPs, RAPDs, enzimas,protenas, aminocidos, etc. gentipo e/ou fentipo de interesse freqncia de recombinao 6. Teoria Cromossmica da Herana De acordo com a teoria cromossmica... Se os genes R e G esto em cromossomos diferentes: observe os ncleos das clulas hbridas F1: RrGg 7. Consideraes Um indivduo possui duas cpias de cada partcula de herana (gene). Essas duas cpias so separadas durante a formao dos gametas e juntam-se novamente quando os dois gametas de encontram para formar um zigoto. Um locus (plural=loci) um local em um cromossomo onde ficam os genes. Os traos so distribudos independentemente quando os loci dos gene R e G esto em diferentes cromossomos. 8. Genes no mesmo cromossomo Se os genes estiverem no mesmo cromossomo, quando observamos o produto de diferentes meioses, temos os seguintes gametas: RG 50% : rg 50% ; Rg 0% : rG 0b De acordo com Mendel, os traos devem estar distribudos de maneira independente: RG 25% : rg 25% ; Rg 25% : rG 25% De acordo com a teoria cromossmica, os traos devem estar distribudos com os cromossomos : RG 50% ; rg 50% 9. Ento, qual o modo de herana real? Na verdade, pode haver um terceiro resultado quando os dois genes estono mesmo cromossomo. Observa-se tambm a prognie resultante dos gametas RG e rg em umamaior freqncia do que a prognie dos gametas Rg e rG. RG, rg so gametas do tipo parental (o cromossomo no gameta o mesmodos pais) = Rg e rG so gametas no parentais. Como isso acontece? Os gametas no-parentais Rg e rG so formados por meio de um processochamado de recombinao. 10. Crossing Over e Recombinao Permuta simples 11. Permutas duplas envolvendo 2 cromtides Permutas duplas envolvendo 3 cromtides 12. Permutas duplas envolvendo 4 cromtides 13. Ligao gnica um dos fenmenos genticos mais amplamente conhecidos e estudados. Logo aps a redescoberta dos trabalhos de Mendel, surgiram relatos degenes que no seguiam a lei de segregao independente. Batenson e Punnett foram os primeiros a relatar o fenmeno em 1905. No entanto, o trabalho mais clebre sobre ligao gnica deve-se a Morgan eseu discpulo Stutervant, em 1911. Estes autores relacionaram os desvios da segregao independente presena dos genes no mesmo cromossomo e propuseram a utilizao dafreqncia de recombinao para a realizao de mapeamento gentico. 14. Propores na prognie proporo na prognie: 944 : 965 : 206 : 185 Nmeros 944 e 965 so do tipo parental. Nmeros 206 e 185 no so do tipo parental (recombinantes). Se os genes b e vg estiverem em cromossomos diferentes, a proporo 1 :1 : 1 : 1 poderia ser esperada para os gentipos Se os genes b e vg estiverem nos mesmos cromossomos, a proporo 1 :1 : 0 : 0 poderia ser esperada para os gentipos 15. Recombinaao na meiose A recombinao ocorre durante a metfase da meiose I, (clulas so 4n, cadacromossomo duplicado e os cromossomos homlogos so alinhados). Partes de cada cromossomo homlogo realizam o crossing over, trocando, deforma eficaz, o material gentico Recombinao (evento de crossing over) ocorre com uma certa freqncia . Os tipos no parentais (recombinantes) so produzidos durante a recombinao. - As clulas em meiose foram estudadas e observou-se os cromossomos setocando para formar o quiasma (crossing-over). 16. Seria essa uma evidncia de que a recombinao ocorreu? Para provar que houve recombinao, necessrio observar o nmero derecombinaes produzidas. A freqncia da recombinao (FR) uma medida da probabilidade de trocagentica Se os dois genes esto prximos, a freqncia de recombinao baixa 0% Se dois genes esto distantes, a freqncia de recombinao alta ~50% Diz-se que os genes esto ligados em um mesmo cromossomo se FR for menordo que 50% Diz-se que os genes no esto ligados se FR for ~ 50%. Eles podem estar bem distantes em um cromossomo ou podem estar emcromossomos diferentes. 17. Frequncia de recombinao (FR) calculado 18. Mapas Genticos Um Mapa de Ligao Gentica mostra a ordem dos genes em um cromossomo. A ordem est baseada nos dados de freqncia de recombinao entre os genes Alfred Sturtevant, um aluno no laboratrio de T. H. Morgan, usou os dados de freqnciade recombinao para construir mapas de ligao gentica. Troca da material gentico resultam em gametas b+ e vg+ Ele usou valores de FR para atribuir distncias entre os genes em unidades do mapa(m.u) Exemplo: os genes b e vg em um cromossomo mostram uma freqncia derecombinao de 17% Portanto, o valor FR informa que os genes b e vg esto separados por 17 unidades demapa no mesmo cromossomo 19. Sturtevant sabia que a RF entre o gene vg e um outro gene chamado cinnabar (cn) era de 8% Sturtevant descobriu que se os cromossomos fossem entidades lineares, ento haveria duaspossibilidades: Descobriu que a freqncia de recombinao entre ao genes b e cn era de 9%, assumindo entoque o mapa #2 estava correto. Sturtevant compilou todos os dados de ligao e desenvolveu um mapa gentico bem maisextenso. Ele inferiu que os genes residiam em cromossomos e conseguiu mapear os genes noscromossomos observando os dados de FR entre os genes. 20. Recombinao entre dois genes1) Para a recombinao ocorrer entre dois genesligados deve ocorrer crossing overentre eles.2) A probabilidade do crossing ocorrer entre doisgenes ligados diretamente proporcional distncia entre eles.3) Ento, a freqncia de recombinao podeser usada como um indicador da distncia entredois genes. 21. Analise de recombinao A anlise de recombinao a tcnica usada para determinar quo freqentemente um crossing pode ocorrer entre dois genes durante a meiose e portanto quo distantes esses genes esto um do outro. 22. Para fazer anlises de recombinao :1) Um heterozigota para dois genes conhecidos nomesmo cromossomo.2) Um homozigota recessivo para fazer o cruzamentoteste (assim cada gentipo ter um fentipo nico).3) Suficiente descendncia para clculos acurados daprogenie proveniente ou no de crossing over. 23. Mapeamento do cromossomo de E. coli Recombinao entre genes marcadores apstransferncia A transferncia entre um cruzamento deduzidada existncia de recombinantes produzidos pelocruzamento Antes de ser produzido um gene estvel, os genestransferidos devem ser integrados ou incorporadosao genoma receptor por um mecanismo de troca. 24. Troca gentica em procariotos Em procariotos no ocorre entre dois genomas inteiros (como ocorre em eucariotos)+a exogenoto+ a a- (a) Ocorre entre genoma completo, derivados de F-,a-a+ a- endogenoto chamados endogenoto, e um incompleto, derivado do doador, chamado exogenoto.merozigotoinvivel A genetica por recombinaao em bacterias a (a)Um nico crossing leva a cromossomoa+ genetica de merozigotos. linear parcialmente a + (b)diplidea-(b) Um numero par de a- crossing leva a um anel mais um invivel fragmento linearvivel 25. Possibilidades de crossing Um nico crossing no muito til para gerarrecombinantes viveis, pois o anel quebrado paraproduzir um cromossomo estranho, linear,parcialmente diplide. Para haver o anel intacto, deve haver um numeropar de crossing. O fragmento produzido apenas um genomaparcial, o qual perdido durante crescimentocelular. 26. Gradiente de Transferncia Em geral apenas um fragmento do cromossomodoador aparece no receptor Ocorre a quebra espontnea dos pares conjugantes,de modo que o cromossomo inteiro raramentetransferido Isso cria um gradiente de transferncia natural, oqual torna menos provvel que uma clulareceptora receba marcadores genticos mais finais(marcadores mais longe da origem). 27. Cruzamentos de marcadores doados por Hfr na ordem met, arg, leu Ocorre muitos fragmento contendo met do que o locus arg, e o locus leu esta met + arg + met + presente apenas num fragmento. met + arg + met + met + arg + met + Desta forma, quanto mais met + arg + met + prximo o marcador esta de met + arg + met + origem, maior a chance de que ele seja transferido durante a conjugao. met + arg + met + 28. Mapeamento por FR em cruzamentos de bactrias Para obtermos uma resoluo alta entre o loci marcador que esto prximos ao gene Usamos a FR para medir essa ligao. Para medir a ligao e obter a distancia de mapa calculada, necessrio que o marcador tenha chance igual de ser transferido junto ao gene. 29. Trs marcadores: met, arg, leu A ordem met, arg, leu met transferidomet+ arg+met+ primeiro e leu por ultimomet+ arg+met+ Fragmento transferido de cromossomo Hfrmet+ arg+met met+Porque o ultimo o leu?met+ arg+met+Leu- arg -met - Porque se selecionamosmet+ arg+met+o ultimo, ento saberemos que todas asmet+ arg+met+Cromossomo F - clulas que receberam o fragmento contendo esse ultimo marcador tambm receber os outros, met e arg. 30. Clculo da distancia do mapa Unidade do mapa (u.m) igual a 1 por cento de crossingno respectivo intervalo. Na pratica isso calculado, entre o total de recombinantesrecuperados, a porcentagem de recombinantes produzidospor crossings entre dois marcadores. Por definio, uma unidade de mapa gentico (cM)corresponde a 1% de recombinao. Entretanto, no existe uma relao direta entre cM enmero de pares de bases (pb) pois a freqncia derecombinao influenciada por muitos fatores. 31. Mapeamento cromossmico Mapas em bactrias combina as tcnicas demapeamento de conjugao interrompida,mapeamento de recombinao, transformaao etransduo. Mapas atuais so utilizados linhagens de Hfr quetransferem a partir de pontos diferentes docromossomo. Em 1963, o mapa de E. coli j detalhava 100 genes, em 1990 mais de 1.400 genes 32. Mapa genetico de 1963 de E. coli 33. Fatores de recombinao Dentre os fatores ambientais, os que mais alteram as taxas de permutagentica so: status inico celular, nutrio, idade e temperatura Em estudos de mapeamento, no entanto, deve-se manter o ambiente omais homogneo possvel para assegurar a confiabilidade dos dadosobtidos. A freqncia de recombinao varia significativamente ao longo doscromossomos, ocorrendo muito mais recombinao nas regiesmedianas dos cromossomos que em regies estruturais comocentrmeros e telmeros. A escolha dos cruzamentos utilizados para mapeamento gentico deveser criteriosa, pois a freqncia de recombinao extremamentedependente dos gentipos parentais.