luh pt desy,,mikromol

Download Luh Pt Desy,,Mikromol

Post on 12-Dec-2015

213 views

Category:

Documents

1 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

sip

TRANSCRIPT

NAMA : Luh Putu Desy Puspaningrat, NRP: B253140131JUDUL ARTIKEL : ESX-1-mediated Translocation To The Cytosol Controls Virulence Of Mikobakteri

ABSTRAKSpesies Mikobakteri, termasuk Mycobacterium TBC dan Mycobacterium lepra merupakan bakteri patogen yang dapat menginfeksi manusia. Patogen ini secara eksklusif melokalisasi dalam phagosome sel inang. Namun sebagai relevansi biologis translokasi mikrobakteri untuk sitosol masih belum jelas. Penelitian ini menggunakan teknik mikroskop elektron untuk membangun hubungan yang jelas antara translokasi dan virulensi Mycobacterium. Spesies Mycobacterium patogen ditemukan mentranslokasi ke sitosol, sedangkan spesies non-patogenik tidak melakukan translokasi. Peneliti mampu menghubungkan translokasi sitosol dengan patogenisitas dengan memperkenalkan system sekresi ESX-1 (tipe VII) dalam nonvirulent Mikobakteri bovis BCG. Selain itu, peneliti menunjukkan bahwa translokasi tergantung pada C-terminus dari awal-disekresi antigen ESAT-6. Pemotongan C-terminal dari ESAT-6 terbukti menghasilkan hubungan translokasi ke virulensi pada tikus yang telah dilemahkan. Penelitian ini menjelaskan mekanisme molekul translokasi dari mikobakteri.

PENDAHULUANBakteri pathogen telah berevolusi dalam mekanisme infeksi untuk menghindari sistem imun sel inang. Mycobacterium tidak terkecuali, dan beberapa spesies pathogen dapat menyebabkan penyakit yang parah pada manusia. Tuberculosis telah menyebabkan lebih dari 2 juta kematian per tahun, dan lepra telah menyerang 2-3 juta orang. Memahami mekanisme virulensi Mycobacterium adalah penting untuk pengembangan vaksin dan pengobatan infeksi. Kemampuan Mycobacterium dalam menyerang phagosomal yang matang dan berada dalam phagosomal di makrofag sel inang merupakan dasar virulensi mikobakteri tersebut. Namun Baru-baru ini peneliti melaporkan bahwa Mycobacterium tuberculosis mampu mentranslokasi dari phagolysosomal ke dalam sitosol sel inang (van der Wel et al.,2007). Dalam penelitian ini, peneliti menyelidiki apakah ada hubungan antara kehadiran sekresi ESX - 1 diberbagai spesies Mycobacterium ( baik patogen atau nonpathogenic ) untuk mentranslokasi ke sitosol. Peneliti menunjukkan virulensi yang sangat berkorelasi dengan kemampuan mikobakteri untuk mentranslokasi ke sitosol pada sel fagosit manusia. Selain itu, peneliti menunjukkan bahwa semua spesies patogen memiliki sebuah system sekresi ESX - 1 yang mengeluarkan ESAT - 6. Untuk menguji apakah sistem sekresi ESX - 1 diperlukan dan cukup untuk translokasi, peneliti memperkenalkan kembali perpanjang dari gen RD1 cluster dari M. tuberculosis dalam M. bovis BCG ( Pym et al . , 2003) dan menunjukkan bahwa BCG dengan RD1, sistem sekresi ESX 1 mentranslokasi ke sitosol dan memperlihatkan fenotipe lebih pathogen. Penelitian ini menunjukkan bahwa translokasi sitosol adalah proses ESAT - 6 tergantung hanya relevan untuk pathogen spesies mikobakteri. Temuan ini memberikan wawasan penting tentang virulensi mikobakteri dan menunjukkan translokasi yang merupakan kunci untuk patogenesis mikobakteri .

METODE

METODE

Kultur BakteriCultur Sel

SDS-PAGE dan ImmunoblotMikroskop Electron

Cultur Sel Sel THP - 1 dikultur dalam medium RPMI -1640 ( Invitrogen ) dengan 10 % FCS dan 100 unit ml - 1 penisilin / streptomisin pada 37 derajat dan 5 % CO2 . Diferensiasi dari garis sel monositik menjadi makrofag distimulasi dengan menambahkan 10 ml ng - 1 phorbol 12 - miristat 13 - asetat ( PMA ) 1 hari sebelum infeksi. Hari selanjutnya, sel diberi media segar tanpa PMA dan pen/strep. DC primer manusia diinfeksi dengan M. tuberculosis H37Rv.

Kultur BakteriBeberapa spesies mikrobakteri patogen, oportunistik dan non-patogenik diisolasi atau diperoleh melalui beberapa laboratorium (Tabel S1). Semua strain mikobakteri ditumbuhkan untuk log-fase dalam 7H9 dilengkapi dengan 10% ADC dan 0,05% Tween80. Bakteri dicuci dengan media RPMI-1640, disentrifugasi dua kali di 750 r.p.m. selama 7 menit dan ditambahkan ke sel THP-1. Strain mutan BCG :: pYUB, BCG :: ESX-1, H37RvDRD1 dan H37Rv EsxAD84-95 dikultur dalam 7H9 dengan ADC, 0,05% Tween80 dan higromisin. Mutan disonikasi ditambahkan ke sel di sebuah MOI 10, kecuali untuk M. tuberculosis H37Rv yang digunakan MOI 2, percobaan berlangsung hingga hari ke 6. Sel yang diinkubasi dengan bakteri selama 1 jam pada 37 C (M. marinum dan M. gilvum pada 32 C), dan kemudian sel dicuci 3 kali dengan RPMI- 1640 untuk menghilangkan bakteri ekstraseluler. Infeksi berhenti pada titik-titik waktu yang ditentukan dengan menambahkan paraformaldehid atau paraformaldehid / glutaraldehid (Peters et al., 2006). Kultur dilanjutkan sampai sel mati atau sampai hari ke-14 untuk infeksi BCG

Mikroskop ElectronSemua sampel disiapkan untuk mikroskop electron. Untuk pelabelan immunogold, monoklonal LAMP - 1 ( PharMingen H4A3 ) 1 : 150, monoklonal LAMP - 2 ( H4B4 ), CD63 monoklonal ( Sanquin M1544 ) 01:15, ubiquitin poliklonal ( Sigma U5379 ) 1 : 300 atau pelabelan berurutan dengan pertama anti - ubiquitin dan kemudian digunakan anti - LAMP 1. Untuk menentukan spesifisitas antiubiquitin poliklonal, ubiquitin murni ditambahkan di konsentrasi yang berbeda. Untuk antibodi monoclonal ditambahkan dengan anti - tikus ( DAKO) 1 : 200. Untuk visualisasi antibodi yang mengikat, 10 nm protein A emas digunakan dan untuk pelabelan ganda pertama 5 nm protein A emas dan kemudian 10 nm protein A emas digunakan. Sampel dianalisis oleh kuantifikasi double-blind menggunakan mikroskop elektron CM10 ( FEI , Eindhoven , Belanda ) .

SDS-PAGE dan ImmunoblotBakteri dicuci dan ditumbuhkan di media 7H9 kemudian ditambah dengan 0,2 % dekstrosa dan 0,05 % Tween80. Pelet dan supernatan kemudian dipisahkan dari media log fase. Protein dalam supernatan diendapkan dengan 5 % TCA ( w / v ), dan pelet disonikasi. Protein dipisahkan dengan SDS -PAGE 16 % gel polyacrylamide. Immunoblots diwarnai dengan antibody monoklonal ESAT - 6 (Staten Serum Institute, Hyb76-8 ) 1 : 500 dan kehadiran antibodi sekunder peroxidase - conjugated terdeteksi melalui pewarnaan 4-chloronaphthol / 3,3-diaminobenzidine

Table 1. Karaktersitik dari Spesies MikrobakteriStrain Mikobakteri Patogenitas di Manusia Gen ESX-1Sekresi ESAT-6 Transokasi di sel

M. tuberculosis H37RvPathogenic+++

M. tuberculosis ancient BeijingPathogenic++*+

M. tuberculosis BeijingPathogenic++*+

M. tuberculosis HarlingenPathogenic++*+

M. tuberculosis 1243Pathogenic++*+

M. lepraePathogenic++**+

M. bovisPathogenic+++

M. marinumPathogenic+++

M. szulgaiOpportunistic+++/-

M. kansasii type IOpportunistic+++/-

M. kansasii type VNon-pathogenic++-

M. smegmatisNon-pathogenic++***-

M. aviumOpportunistic---

M. fortuitumOpportunistic---

M. bovis BCGNon-pathogenic---

M. gilvumNon-pathogenic--*-

Kehadiran gen - ESX 1 diwakili sebagai ( + ) dan kompleks yang tidak lengkap atau tidak adanya gen - ESX 1 (- ). Sekresi ESAT - 6 dilakukan dengan analisis Western blot. Referensi menunjukkan data yang ditunjukkan oleh orang lain . * Hasil tidak terlihat, ** T sel dari pasien lepra bereaksi kuat ke ESAT-6 M. leprae, *** M . smegmatis sebelumnya menampilkan sekresi ESAT - 6 dalam beberapa kondisi, ( dan ) dalam mensekresi ESAT - 6 tidak terlalu banyak. Kemampuan untuk mentranslokasi di sel THP - 1 sel dan diberi tanda (+) ketika persentase bakteri dalam sitosol lebih tinggi dari 20 % , (+/-) ketika persentase itu antara 2 % dan 20 % dan ( - ) ketika persentase lebih rendah dari 2 %

HASIL dan PEMBAHASANSekresi ESAT-6 dari Mikrobakteri terpilih Dalam penelitian ini, peneliti memilih beberapa spesies dengan derajat virulensi yang berbeda (Tabel 1). Ini termasuk lima strain M. tuberculosis, H37Rv dan empat isolat pasien yaitu M. bovis, M. marinum (E11 dan M), M. leprae, M. szulgai, M. avium, M. fortuitum, M. gilvum, M. jenis kansasii I dan V, M. smegmatis dan M. bovis BCG (Denmark) (Tabel S1). Untuk tes pertama apakah kehadiran ESAT-6 spesifik untuk spesies mikobakteri patogen yang dilakukan dengan pemeriksaan terhadap filtrat kultur M. marinum, M. szulgai, M. jenis kansasii I dan V, yang mengkodekan ESX-1 dan ESAT-6, dan non-patogenik (Kurang ESX-1) M. fortuitum untuk sekresi ESAT-6. Sekresi ESAT 6 dari mikobakteri yang berbeda yaitu M. marinum E11, M. szulgaiand, M. kansasii menunjukkan ekspresi dan sekresi dari ESAT - 6 dalam fraksi supernatan, terdeteksi dengan monoklonal a- ESAT - 6 antibodi Hib 76-8. M. fortuitum, yang tidak memiliki wilayah RD1 adalah negatif untuk ESAT - 6. Semua uji ESX-1- mengandung mikobakteri yang mensekresikan ESAT-6, meskipun jumlah bervariasi. Data dikombinasikan dengan data dari literatur (Tabel 1) menunjukkan bahwa semua spesies patogen mensekresikan ESAT-6. Namun, kehadiran dari ESX-1 tidak berhubungan dengan virulensi.

Translokasi Sitosol dari Mikrobakteri Patogen Untuk menguji apakah translokasi sitosol mikobakteri berhubungan dengan fenotipe patogen, peneliti memeriksa lokalisasi subselular dari mikobakteri ( Tabel 1 ) menggunakan elektron mikroskop. Mikobakteri dikultur ke OD600 0,5 dan digunakan untuk infeksi PMA-activated sel myeloid THP - 1 manusia. Setelah 1-10 hari ( waktu tergantung pada berapa lama sel kuat di infeksi setiap spesies mikobakteri ) sel-sel yang diproses untuk mikroskop electron cryo-immunogold. Untuk kuantifikasi tingkat translokasi, hanya sel yang sesuai yang akan dianalisis, karena morfologi sel yang tidak sesuai dalam eksperimen infeksi sering mempengaruhi. Bahkan meskipun pelabelan immunogold penanda lisosom yang tidak sesuai, sel M. tuberculosis yang terinfeksi berbeda dari sel yang tidak sesuai yang terinfeksi M. bovis BCG, penentuan lokalisasi subselular dilakukan dalam sel yang sesuai saja. Gambar yang diperoleh dan dianalisis secara double blind untuk subselular lokalisasi untuk semua spesies (Ga