libro icy iii

8/18/2019 Libro Icy III

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I N V E S T I G A C I Ó NFORENSE III

10594 - interior CIENCIAS FORENSE.indb 1 02-09-2014 10:33:54


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Investigación Forense IIIEdición: Instituto Dr. Carlos Ybar (ICY)Servicio Médico Legal (SML), Chile.

ISSN: 0719-3815Coordinadora académica de la edición:

Dra. Gianna Gatti OrellanaSecretaria Ejecutiva, ICY

Editora Periodística: Águeda Sáez Fick

Comité Editorial:Dr. Patricio Bustos Streeter (SML), Dra. Gianna Gatti Orellana (ICY-SML), Pro. Ilse López Bravo(UCH), Luis Ciocca Gómez (UCH), Dr. David Montoya Esquifi (SML), Dr. Patricio Varas Figue-roa (UDD), Dr. Sergio Vargas Munita (UCH), Dr. Juan Rojas Pavez (USACH), Dr. Bernardo Mora-les Catalán (U. Central).

Colaboradores:Raael Cangas Alig, Hernán Castillo ejías, Alejandra Didier Pérez, Myriam Gallo Jiménez, FresiaHernández Valenzuela, Carlos Osses Miranda, Marcos Palma Fuentes.

Concepto gráfico y diseño de portada: Marcela Vidal Elgueta

eatinos 240, Santiago de ChileFono: (+56 – 2) 2892 9304

www.sml.cl www.institutodrcarlosybar.sml.cl

Diagramación e impresión: Gráfica LOM

Impreso en Santiago de Chile, año 2014



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ÍNDICE

Pág. 7

Pág. 6

Pág. 5

Pág. 27

Pág. 47

Pág. 63

Pág. 75

PrólogoDr. Patricio Bustos Streeter, Director Nacional del ServicioMédico Legal, Chile.

PrólogoDra. Gianna Gatti Orellana, Secretaria Ejecutiva del Instituto

Dr. Carlos Ybar.

Un abordaje histológico para la estimación de la edad enantropología forense: un estudio preliminarRicardo Afonso de Melo Pessoa Gomes, Eugenia GuedesPinto Antunes da Cunha y Carlos Jácome Hernández. Trabajoganador de la Distinción Dr. Carlos Ybar, año 2014

Intoxicación por veneno paralizante de moluscos bivalvos:análisis post-mortem en muestras de tejidos y fluidos

corporales de víctimas humanas en los fiordos de laPatagoniaDra. María del Carmen Bravo González, D. Carlos García,Marcelo Lagos y Néstor Lagos. Trabajo acreedor de la MenciónHonrosa en el IV Concurso Distinción Dr. Carlos Ybar, año 2014.

Conducta suicida en jóvenes de Puerto Aysén, 1995-1999, dubitada por su comunidadDr. Jaime Arturo Ceballos Vergara.

Acreditación de lesiones y trauma dento alveolar: undesafíoDra. Claudia Contreras Reyes y Dra. Blanca HermosillaHermosilla.

Anatomía de los vasos temporales profundos (VTP) y surelación con el diseño del colgajo muscular temporal enla cirugía maxilofacial.Dr. Marcelo Veloso Olivares



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Identificación de elementos idóneos para la obtención

de perfiles genéticos con fines de identificaciónhumana, relacionados a casos de manipulación deartefactos explosivos en Chile.BQ. Marcelo Alonso Concha.

Concordancia entre la causa de muerte de diagnósticoclínico y causa de muerte de diagnóstico autópsico, enmuertes en accidentes de tránsito, 2009-2012Dra. Vivian Bustos Baquerizo y Cecilia G. Lizama

Evaluación del uso de alcotest en la prevención delconsumo de alcohol en conductores: 2012-2013QF. Cecilia Cáceres Sandoval, Erwin Nahuelpán López yVíctor Vidal Pérez

Uso de odontometría en la determinación del género enpoblación adulta de la Quinta Región, ChileDr. Yerko Gómez Castro y Camilo I. Campos.

Suicidios en menores de edad en la región

Metropolitana, periodo 2008-2011Dra. Daniela Quezada Reyes, Dra. Karen Torres Sáez, Dra.Ximena Díaz Tebot, D. Gonzalo Morales Herrera, Dra. PamelaBórquez Vera y D. Erwin Nahuelpán López.

Homicidio y la violencia en Chile, desde la informaciónmédico LegalErwin Nahuelpán López, José Varas Insunza y JessicaCancino González.

Fibroelastosis endocárdica como causa de muerte

súbita en el lactante. Reporte de un casoCristián Villarroel y Dra. María del Carmen Bravo González.

Enseñanza de la medicina legal por medio demetodología basada en competenciasDra. Vivian Bustos B.

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PrólogoLa tercera edición de Investigación Forense nos permite reflexionar sobre temas quemuchas veces se extravían en la cotidianidad siempre urgente y demandante y quedificulta la sistematización y socialización del conocimiento.

Es un desaío introducir en nuestra práctica institucional el estudio con miras a laconstrucción de conocimiento científico para desarrollar un trabajo sistemático deobservación, reflexión y análisis del cual derive hacer investigación, docencia y acti-

vidades de extensión hacia la ciudadanía.

El reto de ortalecer a la comunidad científica orense nacional a través de investiga-ciones colectivas, debates académicos e intercambio de conocimientos es un princi-pio irrenunciable, relacionado estrechamente con los derechos de las personas en laposibilidad de elaboración de políticas públicas certeras y eficaces.

Al enunciar el compromiso de garantizar a la ciudadanía el tener un acceso igualitarioa la justicia, nos reerimos a todos: niños y niñas, jóvenes, adultos y ancianos y a susdierentes derechos que pudiesen ser vulnerados, como: la paternidad, el buen trato,el discernimiento, la vida sexual consentida y el conocimiento de las causas de muertede una persona querida.

Cumplir con las orientaciones técnicas validadas internacionalmente complementariasa los tratados internacionales suscritos por nuestro país, como: la Declaración Universalde Derechos Humanos, Derechos de Niños, Niñas y Adolescentes, Convención Sobrela Eliminación de odas las Formas de Discriminación Contra la Mujer (CEDAW)

y la Convención 169 de la OI sobre pueblos indígenas y tribales, entre otros, exigenun accionar proesional y científico de alta complejidad para descirar y documentarlos problemas que se viven en una sociedad moderna e integrada mundialmente comola nuestra. Asimismo, continuar con las investigaciones para contribuir al estableci-miento de las verdades –aún pendientes– por las violaciones a los derechos humanospor razones políticas cometidas durante la dictadura cívico-militar en las causas por

tortura, ejecuciones y desaparición orzada de personas, cuya impunidad posibilita lareiteración de estas prácticas criminales.

Esta publicación es producto de un trabajo coordinado que permite complementarespacios de inormación y debate entre las distintas instituciones académicas y deadministración de justicia con el objetivo de que, desde la práctica proesional coti-diana, se promueva una visión multidisciplinaria e intersectorial en aras de entregarun mejor servicio a la ciudadanía.

Dr. Patricio Bustos Streeter

Director Nacional SMLMinisterio de Justicia



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Prólogo a la tercera ediciónCrear la publicación Investigación Forense, allá por el año 2009, tenía el propósitode acoger las investigaciones realizadas al interior del SML e incentivar a todos losproesionales a integrar la investigación dentro de su quehacer habitual utilizando lariquísima inormación que se genera a partir del trabajo pericial.

Con el tiempo, esta publicación se ha ido abriendo espacio dentro de la comunidadorense y se ha transormado en un ágora donde se crea conocimiento y se debatentópicos reerentes a la disciplina.

Su mérito principal ha sido transormarse en la publicación orense del país, ya queantes de ella todo aquel que quisiera publicar un trabajo de medicina legal debía re-mitirse a las revistas que mantienen distintas instituciones universitarias y de salud.Hoy se dispone de este espacio.

Paralelamente con ello, esta revista aporta a la institución, mostrando al Servicio Médi-co Legal como un organismo que se desarrolla realizando investigación y colaborandocon la ormación de los proesionales que marcarán el uturo de la justicia en el país.

El éxito de los primeros dos números nos ha permitido transormarla en una publica-ción anual, que esta vez se abre a la comunidad orense nacional y recibe colaboracionesde universidades, instituciones afines e incluso particulares.

engo el agrado de presentar Investigación Forense III, la cual en esta edición traeinteresantes aportes. En primer lugar publicamos los trabajos ganadores del ConcursoDistinción Dr. Carlos Ybar 2014, amén de otros, de no menor interés, que aportan a ladisciplina desde diversos ámbitos: odontología orense, laboratorio orense, toxicologíaorense y otros. Así mismo, hemos incorporado estudio de casos y reportes reerentesa la docencia universitaria.

Los invito a recorrer las páginas de Investigación Forense III.

Dra. Gianna Gatti O.Secretaria Ejecutiva del Instituto Dr. Carlos Ybar.

Servicio Médico Legal.



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UN ABORDAJE HISTOLÓGICO PARA

LA ESTIMACIÓN DE LA EDAD ENANTROPOLOGÍA FORENSE: UN

ESTUDIO PRELIMINAR

Ricardo Gomes1,2, Carlos Jácome Hernández 1, Eugénia Cunha2,3

1 Departamento de Sociología y Antropología de la Universidad de Concepción, Chile.2 Centro de Investigaçao em Ciências Forenses (CENCIFOR), Portugal.3

Departamento de Ciências da Vida da Universidade de Coimbra, Portugal.



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UN ABORDAJE HISTOLÓGICO PARA LAESTIMACIÓN DE LA EDAD EN ANTROPOLOGÍA

FORENSE: UN ESTUDIO PRELIMINAR

Resumen

La histología ósea se presenta como unaherramienta importante en la estimaciónde la edad en contextos orenses. Distintoshuesos y características histológicas puedenser estudiados, con varias técnicas a dispo-sición para la preparación de muestras.

El principal objetivo de esta investigaciónes demostrar el potencial del área corticalrelativa ósea (RelCt.Ar) para estimar laedad de adultos. Se utilizaron muestras decontexto orense, de la región media de ladiáfisis de clavículas de 18 individuos, defiliación portuguesa.

Los resultados ueron condicionados porel reducido tamaño de la muestra. Por estarazón, el estudio presenta un carácter pre-liminar. Sin embargo, ue posible observarque individuos más jóvenes presentan va-lores más altos de RelCt.Ar, comparati- vamente a individuos mayores. De algunaorma el sexo del individuo parece influen-ciar la evaluación.

La presente investigación demuestra laposibilidad de utilizar una técnica histo-morométrica para estimar la edad, sin lanecesidad de recurrir a equipos complejos.Las alteraciones en la RelCt.Ar puedenrealmente estar correlacionadas con la edad,

Ricardo Gomes, Carlos Jácome Hernández y Eugénia Cunha

Abstract

Bone histology has proved to be a relevanttool or age estimation in orensic contexts.Different bones and histological compo-nents can be used, and differences regar-ding the preparation o thin sections areobserved, as well.

Te main goal o this research is to de-monstrate the potential o the relativecortical bone area (RelCt.Ar) in age esti-mation o adults, using a microscopic reemethod. For this purpose, 18 identifiedsamples were collected rom the midshato clavicles, in a Portuguese orensic con-text. Results were highly conditioned bythe sample size. For this reason, the studyhas a preliminary character. However, it was possible to observe that younger individuals presented higher values o RelCt.Ar relatively to older ones. Sex might also

have influence on this histological eature,as the preliminary results indicate.

Te current study demonstrates that it ispossible to use a histomorphometric ap-proach or age estimation, without usingcomplex equipment. Alterations in theRelCt.Ar might be correlated with age,as preliminary data suggest. Nevertheless,it is necessary to increase the sample sizeto apply suitable statistical tests, in order



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|10 Investigación Forense III

1. Introducción

La investigación de la muerte y de todo el proceso médico-legal asociado, pasa obli-gatoriamente por la colaboración de varias áreas del conocimiento. Dependiendodel tipo de situación que el patólogo orense enrenta, puede surgir la necesidadde colaborar con distintos especialistas. El análisis de restos óseos humanos es unproblema clave para los médicos orenses, y a raíz de esta necesidad la AntropologíaFísica se torna un uerte aliado del universo médico-legal.

La estimación de la edad, con base en la observación de restos óseos humanos, es unade las principales responsabilidades del antropólogo orense. Se puede decir que laedad determina varios aspectos de la vida de un individuo. A la luz de este complejo

escenario, es inevitable una dosis de atención cuando se incluye esta variable encualquier investigación antropológica, sea esta de contexto arqueológico o orense4.

No obstante, el establecimiento de la osteobiograía del individuo es vital para lasinterpretaciones antropológicas. Los patrones que emergen de un buen análisis delos restos óseos pueden aislar tanto actores biológicos como sociales que permitanla identificación del individuo allecido.

La estimación de la edad está asociada a un error estándar, ya que existe una des-igualdad entre la edad observable en los restos esqueléticos y la que el individuo tiene

en la realidad, o sea una dierencia entre la edad biológica y la edad cronológica5

. Pordefinición, la edad biológica corresponde a la edad que es conocida por los elementosóseos, siendo dependiente de la singularidad del esqueleto. A su vez, la edad cronoló-gica dice relación con la edad calendarizada y se mide en días o años. Siguiendo estalínea de raciocino, la edad biológica presenta una correlación con la edad cronológica,sin embargo no una relación directa. Más que esto, esta relación es variable a lo largode la historia de vida de un individuo. A medida que el tiempo pasa, las alteraciones

4 Iscan, 1989.5

Introna y Campobasso, 2006.

como sugieren los datos. No obstante, esnecesario utilizar una muestra con un ta-maño más significativo para que sea posibleaplicar los testes estadísticos apropiados, y

así asegurar la correcta aplicación de estatécnica en la práctica cotidiana del antro-pólogo orense.

Palabras clavesCiencia orense; histomorología, adultos,estimación de la edad, clavícula.

to ensure that this methodology can easilybe used in the current practice o orensicanthropology.

KeywordsForensic science; histomorphology; adults;age-at-death; clavicle.



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11|Investigación Forense III

biológicas y biomecánicas en el esqueleto se acumulan, pero no en una configuraciónlineal. Así, la estimación de la edad en individuos más jóvenes será siempre más fiablecomparativamente a la estimativa hecha en individuos mayores.

En la opinión de Rösing et al. (2007), los métodos de estimación de la edad puedenser divididos en dos grandes categorías, los que son simples pero poco exactos, ylos que son más complejos, con resultados que presenten tasas de fiabilidad másaceptables. En estos últimos, los autores incluyen la determinación de la edad conbase en la histología ósea y dental. Se debe tener presente, sin embargo, que lasmetodologías descritas como “simples” se deben usar de todas ormas en un primerabordaje analítico.

Así, la histomorometría ósea se utiliza para auxiliar a los proesionales en la esti-mación de la edad. Su relevancia se destaca principalmente en situaciones donde los

restos humanos se encuentran con un elevado grado de ragmentación debido, porejemplo, a la acción del uego6.

Desde la introducción de la metodología de Kerley (1965) muchas otras se siguieron.No obstante, autores como Crowder y Peiffer (2010) admiten que la eficiencia delanálisis cuantitativo de la histología ósea aún no está completamente comprobada.Sin embargo, análisis como las de Alciati, Drusini, Bacco y Pezzulli (1994), entreotros, demuestran cómo un abordaje histológico puede traer ventajas significativaspara la estimación de la edad.

Es importante reerir que existen determinados actores que pueden condicionar elanálisis histológico del tejido óseo. La variación asociada al dimorfismo sexual esmencionada por algunos autores como Crowder (2011). Sin embargo, estudios como

Tomas, Feik y Clement (2005) no indican la presencia de dierencias significativaspara este parámetro. Factores como la actividad ísica, la variación poblacional, pato-logías (especialmente metabólicas) y aún la propia dieta pueden aectar directamentetodo el análisis histológico. Al nivel de la variación poblacional, algunas investiga-ciones7 destacan que el desarrollo de los métodos debe ser específico en una determi-nada población. Entonces, se puede afirmar que la variación poblacional es un actorimportante a considerar en la evaluación de la edad, con base en la histología ósea8.

En resumen, se puede decir que la histología se ha utilizado en algunos estudios enel ámbito específico de la estimación de la edad. Sin embargo, no se compara a lasinnúmeras publicaciones que se pueden encontrar de métodos macroscópicos. Es ne-cesario investigar en este campo, sobre todo, a nivel de un abordaje holístico, entre las

varias técnicas histológicas y los diversos elementos osteológicos posibles de análisis.

6 Cattaneo, 2009.7 Cho et al., 2002.8

Robling y Stout, 2008; Crowder, 2011.



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2. Objetivos

Objetivo general

El principal objetivo de la presente investigación está relacionado con la aplicaciónde la histología como herramienta auxiliar del proceso de identificación de restosóseos. Para alcanzar esta propuesta se utilizó el área cortical relativa (RelCt.Ar)obtenida a partir de la región medial de la diáfisis de clavículas pertenecientes aindividuos portugueses, una vez que el contexto poblacional es un condicionante dela microestructura ósea.

Objetivos específicos

- Ponderar si la histología ósea aporta buenos indicadores para estimar la edadcronológica de los individuos;

- Verificar si la histología es un proceso tan complejo como algunos piensan;

- Evaluar la necesidad de conocimientos previos y experiencia en el área de lamicro-anatomía ósea para realizar e interpretar los resultados histológicos;

- Averiguar si la elección de la clavícula como el hueso a analizar es una opción viable para la aplicación en estudios uturos.

- Cuestionar si el área cortical relativa es o no una buena indicadora para diagnos-ticar la edad de un individuo al momento de su muerte.

3. Material y Método

Muestra y diseño metodológico

Diseño

La realización del actual proyecto depende del conocimiento de la edad cronológicade los individuos, ya que solo así es posible establecer una relación entre la edad esti-mada por el análisis histológico y la edad real del individuo. Dicho esto, para obteneruna muestra con estas particularidades se puede recurrir a colecciones osteológicasidentificadas, o trabajar con las organizaciones médico-legales en la colecta de materialóseo para análisis. En esta investigación se utilizaron los dos abordajes.



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Muestra Poblacional

La muestra poblacional utilizada en la realización del presente estudio es constituidaen su mayoría por ejemplares de contexto de necropsia. El material ue colectadoen colaboración con el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses -Portugal (INMLCF, I.P.), con la autorización previa del Director de esta institución.

La afiliación poblacional era conocida, una vez que esta ejerce algún tipo de in-fluencia en la evaluación. La potencial presencia de patologías metabólicas, lesionestraumáticas y otros se usó como criterio para la exclusión. El registro de las edadesde los individuos era conocido, y se estableció un límite mínimo de edad, toda vezque este estudio tiene por objetivo evaluar la edad solamente de adultos. Así la edadmínima de la muestra es de 30 años, una vez que se estima que este es promedioetario de la finalización del proceso de usión de la extremidad esternal de clavícula.Es importante mencionar que el compromiso asumido con el INMLCF, I.P., reflejauna preocupación de cumplir todas las normativas legales y éticas en vigor en estamisma institución, como por ejemplo, la consulta previa del Registro Nacional deNo Donadores (RENDA).

Para potenciar el número de individuos en la muestra también se utilizaron ejemplaresde una colección identificada, con depósito en el Departamento de Ciencias de laVida de la Universidad de Coímbra. La “Colección de Esqueletos Identificados delsiglo XXI” (CEI/XXI), cuenta con las inormaciones biográficas de los individuos.Con un total de 77 individuos, que allecieron entre los años de 1995 y 2001, esta

colección tiene, según las normativas legales de este país, una significación orense.Como la histología implica la destrucción irreversible del hueso, la autorizaciónde realizar muestras histológicas estaba condicionada a clavículas que presentasenalgún tipo de destrucción post mortem. Por esta misma razón, de los 77 individuospresentes en la colección solamente se han podido analizar 6.

Así, como se observa en la figura 1, la muestra está constituida por un total de 18individuos, 12 recogidos de autopsia y 6 de la CEI/XXI. El promedio de edades esde 63 años (x = 63,12) y la amplitud de la muestra varía entre los 29 y los 92 años.



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0

2

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50-5940-4930-39

Fig 1. Representación del número de individuos analizados (contexto de necropsia y CEI/XXI) por clase etaria y sexo.

Procedimiento

La elección de la clavícula para realizar este procedimiento está relacionada con losobjetivos planteados, una vez que su uso evita disecciones innecesarias9. Además, supropia anatomía la torna buena para la histología, una vez que es un hueso largo, conuna porción cortical, pero con dimensiones más reducidas. Así, se eligió la regiónmedia de la diáfisis de la clavícula, ya que tiene pocas inserciones musculares y no

está constituida por hueso particularmente denso. Se debe resaltar el hecho de quese atribuyó, a cada uno de los especímenes, un acrónimo de trabajo (CVL).

A las clavículas recuperadas del contexto de necropsia se les tuvo que retirar los tejidos blandos. Para tal eecto se utilizó la técnica sugerida por Fenton et al. (2003).Como este procedimiento exige una cierta dosis de experiencia, se ha eectuado unensayo con huesos animales. De una orma general, para la remoción de los tejidosblandos se utiliza un líquido caliente (agua corriente) para “cocinar” las partes blandas

y acilitar su remoción. Además, se adjunta un componente enzimático que acilite ladegradación de las zonas blandas. En este caso, se utilizó detergente de ropa común y

una porción de carbonato de sodio en las concentraciones debidas10. Al final el huesose encontraba completamente libre de tejidos blandos (figura 2).

9 Stout y Paine, 1992.10 Para más inormación consultar la publicación original de Fenton et al. (2003) presente en la

Bibliograía.



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Figura 2. Clavícula izquierda humana, enposición posterior. (A) Localización aproximadadel área de la muestra; (B) Tuberosidad costal.

AB

Después que la clavícula estuvo completamente libre de las partes blandas, se eec-tuó un registro otográfico de todos los ejemplares, antes de retirar junto a la zonalateral a la tuberosidad costal una porción de hueso, que no sobrepasó los 5 mm de

espesor (figura 2).

El procedimiento siguiente es el tratamiento para la histología. En la realización deeste paso, se utilizó la metodología desarrollada por Maat, Van Den Boss y Aarents(2006), aunque con ligeras alteraciones, de orma a optimizar la obtención de las lá-minas histológicas. Se eligió esta metodología, sobre todo por su relativa simplicidad,además las publicaciones se hacen acompañar de figuras ilustrativas que auxilian entodo el proceso.

Los materiales y el procedimiento específico pueden ser consultados en detalle en

Maat, Van Den Boss y Aarents (2006). De orma breve este método consiste endesgastar el hueso de orma manual, con la presencia de agua, recurriendo a doshojas de papel de lija.

Una vez obtenida la lámina histológica con el espesor deseado se va, al fin, a analizarel área cortical relativa, que es una variable intrínseca a la porción cortical del hueso.

El área cortical relativa es definida por “la cantidad de hueso cortical que está presenteen una determinada sección de hueso”11. En realidad, la medición de esta variableno es directa. Para lograr calcular este parámetro, es necesario realizar mediciones

del área total de la muestra en análisis (t.Ar) y del área de la cavidad medular (En.Ar). Después basta sustraer el valor de área medular al área total, obteniendo así elárea cortical (Ct.Ar). Por fin se divide en área cortical por el área total y se obtieneel área cortical relativa (RelCt.Ar)12:

RelCt.Ar = (t.Ar – En.Ar) t.Ar

11 Stewart, 2012:112

Cho et al., 2002



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Recientemente Stewart y colaboradores (2012) realizaron una pesquisa comparativapara determinar cuál es el método que mejor analiza el área cortical relativa. Entreestos, se destaca uno, que debido a su ácil aplicabilidad, se eligió para la presenteinvestigación. Entonces, para determinar el RelCt.Ar al revés de ocupar un micros-copio clásico, las imágenes ueron digitalizadas a través de un escáner (HP DeskjetF4180). odas la imágenes ueron seleccionadas para una definición de 2400 PPI(pixels per inche) y se guardaron con la extensión .IF.

odas las imágenes tenían agregada una escala, con unidad de medida de centímetro,necesaria al posterior análisis en el sotware inormático.

El tratamiento de las imágenes y todas las mediciones mencionadas anteriormentese realizaron en el sotware inormático Adobe Photoshop CS5. Además de lasrespectivas áreas, se evaluaron variables como el perímetro, la circularidad, la altura

y la anchura de los ejemplares. odos los datos ueron exportados para una hojade cálculo Excel Microsot Office 2010, donde se calcularon las áreas corticales ycorticales relativas.

Finalmente, se evaluó también el error intra e interobservador, con el objetivo detestear la fiabilidad de las metodologías aplicadas. El análisis de este parámetro per-mite de alguna orma diagnosticar si la identificación de las estructuras histológicases accesible, necesitando poca experiencia por parte de los observadores, o no.

4. ResultadosAntes de empezar la presentación de los resultados obtenidos, importa resaltar unasituación en particular que constituyó una uerte condicionante del proceso de estu-dio. No ha sido posible aplicar un análisis estadístico a los datos obtenidos, ya que lamuestra reveló no soportar tal abordaje, por esta razón se presentaran los casos másimportantes y más destacables de esta investigación.

Dicho esto, se comienza por presentar la distribución del área cortical relativa por las4 clases etarias previamente establecidas, como se observa en la figura 3.

Importa destacar que las principales dierencias se presentan en los dos extremosetarios, esto significa que los individuos más jóvenes presentan un área cortical re-lativa superior (63,66%), cuando son comparados a los individuos mayores (57,96%).



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Figura 3 -. Distribución del área cortical relativa, en porcentaje, por las distintas

clases etarias. N=18

Aludiendo a la figura 3 se creyó pertinente ilustrar en qué medida el análisis de lasimágenes refleja las dierencias etarias entre el área cortical y el área medular, deacuerdo a los intervalos etarios. Por ende, la figura 4 representa el individuo CVL9(sexo masculino), ya que este es el individuo más joven de toda la serie, con 29 años.La selección verificada en las figuras dice relación con el análisis del área total y delárea medular, respectivamente.

A B

Figura 4 – Digitalización a 2400 ppi de la muestra CVL 9 correspondienteal individuo más joven (29 años;♂). A - Es posible observar la seccióndel área total (122,23mm2). B - Es posible observar la sección del áreamedular (41,54 mm2).

En seguida se presenta las muestras correspondientes el individuo mayor de la mues-

tra, CVL 5, con 92 años de sexo emenino. De la misma orma que la anterior, lafigura 5 muestra el análisis del área total y área medular para este individuo.



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Figura 5 - Digitalización a 2400 ppi de la muestra CVL 5correspondiente al individuo mayor (92 años; ♀). A- Esposible observar la sección del área total (127,58 mm2).B- Es posible observar la sección del área medular (50,59mm2).

A B

Se destaca la dierencia entre el área ocupada por el tejido cortical con relación alárea total. En términos cuantitativos, el área cortical relativa del individuo CVL 9corresponde a 65,91% del área total (122,23 mm2), mientras en el individuo CVL 5esta corresponde solamente al 51,01% del área total (127,58 mm2).

Basado en el análisis elaborado, se expone una posible relación entre el área corticalrelativa y el sexo de los individuos. La figura 6 representa la distribución etaria delárea cortical relativa por clase etaria, teniendo en consideración el sexo.

Como se observa en la figura 6, existe una única situación (30 y 39 años), donde elporcentaje del área cortical relativa emenina excede la masculina en cerca de 1,45%.

Figura 6. Distribución del área cortical relativa masculina y femenina, en porcentaje,por las varias clases etarias. N♂= 10 y N♀= 8.

Es importante resaltar que en este intervalo etario existen 2 individuos del sexomasculino y 1 del sexo emenino. De una orma general se denota una dominanciadel sexo masculino, ya que estos individuos presentan un porcentaje más elevado detejido cortical. La disparidad más clara se observa al nivel de los 40 a los 49 años,con una dierencia de aproximadamente 16%. Una vez más se resalta el hecho de queexiste solamente un individuo emenino.



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eniendo en cuenta esto, la clase etaria que presenta, en principio, los resultados máscreíbles es la que engloba los individuos con más de 60 años, una vez que existen 5individuos masculinos y 5 emeninos. En esta situación la dierencia entre los sexoses de aproximadamente 5,3%, lo que puede ser un indicador del vínculo entre estasdos variables.

Para ilustrar esta posible relación es relevante presentar las tablas descriptivas de unaposible dierencia entre el área total, con relación al sexo de los individuos. La tabla1 alude la distribución de las áreas corticales, medulares y totales en individuos delsexo masculino.

Tabla 1. Distribución de las áreas corticales, medulares y totales por clases etarias, enindividuos del sexo masculino. Se observa también el promedio de edades por intervaloetario, sí como el número de individuos que se ubican en cada uno de ellos.

IntervaloEtario

Promediode edad

N° deIndividuos

Área Cortical(mm2)

Área Medular(mm2)

Área Total(mm2)

30-39 32 2 85,03 50,11 135,1440-49 44 2 80,54 26,13 106,6750-59 50 1 87,74 25,65 115,24≥60 75 5 71,33 46,27 117,61

La tabla 2 remite, de igual modo, a la distribución de las áreas corticales, medulares y totales, sin embargo en individuos de sexo emenino.

Tabla 2. Distribución de las áreas corticales, medulares y totales por clases etarias, enindividuos de sexo femenino. Se observa también el promedio de edades por intervaloetario, así como el número de individuos que se alojan en cada uno de ellos.

IntervaloEtario

Promediode edad

Nº deIndividuos

Área Cortical(mm2)

Área Medular(mm2)

Área Total(mm2)

30-39 31 1 65,16 35,68 100,8440-49 47 1 91,36 62,77 153,1450-59 56 1 53,90 22,22 76,12≥60 83 5 55,60 50,71 105,94

Como se observa, solamente con una excepción, los individuos masculinos presen-tan un área cortical superior a los individuos del sexo emenino (x ♂ = 78,81 mm2

mientras x ♀ = 61,05 mm2). odavía, este valor no se verifica con la misma expresiónen el porcentaje del área cortical relativa (figura 6), una vez que el área total de lasmuestras masculinas es superior a la de las muestras emeninas (x ♂ = 119,07 mm2

y x ♀ = 107,43 mm2).

eniendo en consideración lo expuesto, se presentan dos imágenes pertenecientes algrupo etario de los mayores de 60 años, una vez que los individuos presentados tienenedades bastante próximas. Con esto se pretende evidenciar la posible influencia del



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sexo en el análisis de esta variable. Así, la figura 7A representa el individuo CVL 3,del sexo masculino, con 72 años. A su vez la figura 7B representa un individuo con71 años del sexo emenino. En esta situación, el porcentaje de área cortical relativaen la muestra masculina (figura 7A) es de 72,09%, en comparación con los 57,16%de la muestra emenina (figura 7B), ilustrando una clara desigualdad entre los sexos.

Figura 7. A. Digitalización a 2400 ppi de la muestra CVL 3 (72 años)perteneciente a un individuo de sexo masculino, ubicado en el grupo etariode los ≥ 60 años. És posible observar una sección del área total (125,88 mm2)B. Digitalización a 2400 ppi de la muestra CVL 10 (71 años) perteneciente aun individuo de sexo femenino, ubicado en el grupo etario de los ≥ 60 años.Es posible observar el corte de área total (113,14 mm2).

A B

Por fin, se ha considerado la posible existencia de dierencias en la selección de lasestructuras necesarias para el cálculo del área cortical relativa, sea entre el mismoobservador en dos momentos distintos, o en el análisis de un segundo observador(figura 8).

Figura 8. Distribución del área cortical relativa, en porcentaje, por grupo etario, teniendoen consideración el análisis del observador número 1 en dos momentos distintos y elanálisis del observador número 2.

Analizando la figura 8 es posible afirmar que no existen grandes dierencias entre los

análisis eectuados. La divergencia más notoria se registra en el análisis del observador



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número 1 en el intervalo etario de los 50 a los 59 años, con una dierencia de 2,14%entre una primera y una segunda observación, sin embargo esta no es una dierenciaconsiderable. De una orma general, la distribución etaria del área cortical presentauna configuración homogénea en las 3 situaciones descritas.

5. Discusión y conclusiones

No existe, en verdad, un gran número de publicaciones que opten por el examenhistológico de la clavícula; se destacan los trabajos de Stout y Paine (1992) y Stoutet al. (1996).

La mayoría de los estudios que utiliza la histología para estimar la edad de los restosóseos, se basan en la creación de un modelo estadístico de regresión lineal con un

error estándar asociado. Una vez que, uno de los uertes condicionantes de la presenteinvestigación ha sido el tamaño de la muestra, tal abordaje no se ha podido aplicar.En la práctica, el tamaño de la muestra está siempre relacionado con la recolecciónde los datos y, principalmente con el tipo de investigación que se lleva a cabo, ya queesta condiciona el potencial estadístico de la muestra influenciando la detección dedierencias significativas y de relaciones e interrelaciones entre las variables. Dichoesto, se puede afirmar que la aplicación de un análisis estadístico, como una regresiónlineal, u otra similar, que exija un uerte poder estadístico no se puede realizar eneste proyecto. Como se ha mencionado, la muestra total es de 18 individuos, númeroque no garantiza una distribución normal, lo que hace que las pruebas estadísticas

tengan poca fiabilidad.

Aunque Portugal tenga un buen sistema a nivel de la recogida de piezas óseas, encontexto de autopsia, por motivos externos a los investigadores, la recolección de lamuestra no se ha hecho en orma ágil.

Otro problema relacionado con ese hecho, previamente mencionado, es que la muestrapresenta un perfil envejecido. La edad media de los individuos es de 63 años, y unpoco más de la mitad de la muestra (55,6%) presenta edades superiores a 60 años.

Con relación a la metodología, como se planteó en los objetivos, se pretendía presentarla histología como una técnica rápida y al alcance de la práctica diaria del antropólogoorense. De una orma general, las metodologías aplicadas en el procesamiento de lamuestra van de acuerdo a esta necesidad. No obstante, en determinadas situaciones,estas metodologías dichas un poco “rudimentarias” necesitan usarse con precaución.El método de la digitalización del espécimen, y posterior análisis en el Photoshopreveló ser una metodología bastante eficiente y de ácil aplicabilidad.

Por último, queda analizar si el área cortical relativa es un buen componente paraestimar la edad. Existen pocos estudios que utilizan esta variable para diagnosticar la

edad, pero se destacan investigaciones como las de akahashi y Frost (1966), Cho et



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al. (2006), aunque todos ellos se hayan desarrollado en costillas y por eso es necesariaalguna precaución en la comparación de los datos.

El único estudio que relaciona directamente el área cortical relativa con la edad cro-nológica de los individuos, es el estudio de Cho et al. (2006). odavía, el objetivo delos autores pasa por un análisis multivariado, con la creación de modelos estadísticosespecíficos para estimar la edad en grupos de poblaciones distintas (Arican-American

y European-American). Aun así, estos terminan presentando una correlación entreel área cortical relativa y la edad, presentando dentro del mismo grupo poblacionalun r2 = 0,589. La relación entre las dos variables no es la mejor, como ya indicabael valor del r2. No obstante, esta prueba ue aplicada en costillas, por ende, cuandose cambia el tipo de hueso puede que los resultados suran algún tipo de variación.

Dicho esto, es posible observar en el estudio de Cho et al. (2006), que cuando aumenta

la edad el área cortical relativa parece disminuir. De alguna orma, el proceso normalde envejecimiento se asocia a una pérdida de material óseo. Esta misma constataciónse puede observar en la presente investigación (figura 3). Los individuos más jóvenespresentan una dierencia positiva de aproximadamente 6% cuando ueron comparadoscon individuos mayores.

Según Cho et al. (2006), la disminución del área cortical que expresa una reduc-ción de la densidad ósea con el avance de la edad, puede estar relacionada con unaalteración de la tasa de remodelación ósea. Siguiendo esta línea de pensamiento,se preconiza que la tasa de remodelación ósea es menor en individuos mayores, lo

que es ventajoso para estos, una vez que la masa ósea se mantiene. La actividad deremodelación introduce porosidad en el hueso y se observa una ormación continuade hueso. Además, asociada a esta disminución, está una rápida acumulación demicroracturas que tornan el hueso más rágil.

A pesar de que la muestra coincide parcialmente con lo esperado, se verifica unaumento del área cortical relativa, de los 30 a los 50 años, lo que no sería de esperar.Se sabe que la disminución de la tasa de remodelación se empieza a sentir aproxi-madamente a los 50 años13, como tal no sería de prever esta subida. Una de las pocasexplicaciones para esto, es el bajo tamaño de la muestra, significando que esta no

expresa las características generales de la población. De acuerdo a akahashi y Frost(1966) el área cortical alcanza su máximo entre los 25-30 años, después se estabiliza

y empieza a decrecer en torno a los 55-60 años. Los resultados obtenidos están, decierta orma, de acuerdo con esto, y aunque se verifique un aumento de esta variablede los 30 para los 40 años, esta baja esencialmente a partir de los 60 años.

13

Cho et al., 2002; akahashi y Frost, 1966.



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Con base en el análisis elaborado se creyó pertinente exponer una posible relaciónentre el área cortical relativa y el sexo de los individuos (figura 6). La gran mayoríade los estudios14 llama la atención para este mismo hecho. El sexo es un actor im-portante, que aecta la remodelación del hueso, una vez que la pérdida de materialóseo es exacerbada por el aumento de la actividad de sus componentes celulares.

La menopausia puede ser el gran actor por detrás de las dierencias sexuales en-contradas, una vez que los autores indican que las divergencias encontradas son másgrandes en los intervalos etarios correspondientes a la edad media del cierre del cicloovárico en la mujer. A nivel fisiológico, se piensa que la disminución del estrógenoasociada a la no ovulación, suprime la reabsorción y la ormación de hueso, haciendoque el área cortical disminuya. Esta dierencia puede también estar asociada a lalocalización de la muestra, en el hueso, ya que al interior del mismo hueso se puedenobservar dierencias debido a constricciones musculares dispares.

Los resultados obtenidos están de acuerdo con la teoría presentada, incluso porqueantes de la edad media de la menopausia, los individuos emeninos exhiben un por-centaje del área cortical ligeramente superior al de los individuos masculinos. Estoes bastante lógico, ya que la tasa de estrógeno presente en las mujeres aun no iniciósu disminución. Por el contrario, la subida verificada en los individuos pertenecientesal intervalo etario de los 50 a 59 años, no se encuadra en el patrón esperado, lo queno es tan extraño una vez que en esta clase etaria existe solamente un individuo decada sexo.

En resumen, aunque el área cortical relativa, según los datos bibliográficos15 no esla variable más fiable para estimar la edad, se piensa que más allá de que no existaun método desarrollado para la clavícula, la metodología necesita una verificaciónminuciosa, donde el área cortical relativa sea el único elemento en análisis.

La estimación de la edad es probablemente uno de los mayores desaíos que el an-tropólogo orense se propone. La aplicación de metodologías histológicas tiene es-pecial importancia en situaciones de huesos cremados o ampliamente aectados porla taonomía, donde esta metodología puede uncionar no solo para estimar la edad,sino también para hacer la distinción entre hueso humano y animal.

Este proyecto tiene como objetivo desmitificar cualquier idea preconcebida que puedaexistir con relación a la utilización de la histología. No es, en realidad, una prácticaque tarde tanto en aplicarse, y que puede obtener buenos resultados dependiendo deltipo de estructuras analizadas.

14 akahashi y Frost, 1966; Cho et al , 2002; Cho et al, 2006.15

Cho et al., 2006.



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Se puede afirmar que existen, aun, una gran cantidad de estudios que pueden serdesarrollados con base en la técnica histológica, pero particularmente en la poblaciónportuguesa. Sería interesante estudiar otras variables y hacerlo también con recursosa distintos tipos de huesos, probando métodos ya desarrollados y proyectando otros.

Finalmente, es necesario que este tipo de estudios nunca dejen de ser realizados,aunque los resultados no sean los deseados. al hecho no es sinónimo de una malainvestigación, ya que la única orma de seguir la búsqueda del conocimiento es através del error, de la percepción de este, de su aceptación y por fin de su superación.

6. Referencias y bibliografía

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INTOXICACIÓN POR VENENO

PARALIZANTE DE MOLUSCOSBIVALVOS: ANÁLISIS POSTMORTEM

EN MUESTRAS DE TEJIDOS Y FLUIDOS

CORPORALES DE VÍCTIMAS HUMANAS

EN LOS FIORDOS DE LA PATAGONIA.

Carlos García1, María del Carmen Bravo2, Marcelo Lagos1, Néstor Lagos2

1 Bioquímica de Membrana, Depto. de Fisiología y Bioísica, Facultad de Medicina, Universidadde Chile, Casilla 70005, Correo 7, Santiago, Chile.

2

Medicina Forense Servicio Médico Legal XII Región, Punta Arenas, Chile.



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INTOXICACIÓN POR VENENO PARALIZANTEDE MOLUSCOS BIVALVOS: ANÁLISIS POST

MORTEM EN MUESTRAS DE TEJIDOS Y FLUIDOS

CORPORALES DE VÍCTIMAS HUMANAS EN LOS

FIORDOS DE LA PATAGONIA

Carlos García, María del Carmen Bravo, Marcelo Lagos y Néstor Lagos

Resumen

El día 5 de julio de 2002, pescadores quetrabajaban en la cosecha del erizo de mar(Loxechinusalbus) en los fiordos de laPatagonia chilena, se intoxicaron por elconsumo de bivalvos filtradores Aulacom- yaater. res horas después de la ingestiónde 7-9 cholgas, dos pescadores murieron.El examen orense de las víctimas mostróalteraciones patológicas inespecíficas, tales

como pulmones congestivos, edematosos ycongestión visceral diusa. La muestra decholgas tóxicas mostró una toxicidad me-dida por bioensayo en ratones de 8575 µgde SX (Saxitoxina) equivalente por 100gr. de tejido de molusco. Usando el mé-todo de HPLC con derivatización post-columna y detección con fluorescencia enlínea, ue posible medir la concentraciónde cada toxina del veneno paralizante demoluscos (VPM). Estas toxinas del VPM

se identificaron en el contenido gástrico,fluidos corporales (orina, bilis y líquido ce-alorraquídeo) y muestras de tejido (hígado,riñón, pulmón, estómago, bazo, corazón,cerebro, glándulas suprarrenales, páncreas ytiroides). Se presentan los perfiles de toxinaparalizante encada una de las muestras detejidos y fluidos corporales. Las toxinas delVPM encontradas en el contenido gástricoueron SX y las gonyautoxinas (GX4,GX1, GX5, GX3 y GX2) las cuales

mostraron ser las principales concentracio-

Abstract

In July 5, 2002 fishermen working in har- vesting sea urchin (Loxechinusalbus) in thePatagonia Chilean fords were intoxicatedby consumption o filter-eeder bivalveAulacomyaater. Ater the ingestion o 7–9ribbed mussel, two fishermen died 3–4 hater shellfish consumption. Te orensicexamination in both victims did not showpathological abnormalities with the ex-

ception o the lungs conditions, cracklingto the touch, pulmonary congestion andedema. Te toxic mussel sample showeda toxicity measured by mouse bioassay o8575 mg o SX (saxitoxin) equivalent by100 g o shellfish meat. Using post-columnderivatization HPLC method with fluo-rescent on line detection was possible tomeasure mass amount o each paralyticshellfish poisoning (PSP) toxin yieldingindividual toxin concentrations. Tese PSP

toxins were identified in the gastric con-tent, body fluids (urine, bile and cerebrospi-nal fluid) and tissue samples (liver, kidney,lung, stomach, spleen, heart, brain, adrenalglands, pancreas and thyroids glands). Tetoxin profiles o each body fluid and tis-sue samples and the amount o each PSPtoxin detected are reported. Te PSP toxinsound in the gastric content, were SX andthe gonyautoxins (GX4, GX1, GX5,GX3 and GX2) which showed to be the

major amount o PSP toxins ound in the



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nes de toxinas del VPM encontradas enlas muestras biológicas de las víctimas.Lacomposición de toxinas del VPM en orina ybilis mostró que la principal concentración

de toxinas ue neoSaxitoxina (neoSX) yepímeros GX4/GX1, ambos análogosde SX con un grupo hidroxilo (-OH) enN1 del núcleo tetrahidropurina. NeoSXno estaba presente en la muestra de con-tenido gástrico, lo que indica que la oxida-ción de N1 en el núcleo tetrahidropurinade SX resultó en neoSX, de una mane-ra similar que epímeros GX3/GX2 setransormaron en epímeros GX4/GX1.Relacionada con esta transormación me-

tabólica, también se detectó hidrólisis delgrupo carbamoil de SX transormándoseen el análogo decarbamoil, decarbamoil-Saxitoxina, detectada en hígado, riñones ypulmones. Estos dos hallazgos muestranque las toxinas del VPM surieron trans-ormación metabólica durante las 3-4 ho-ras del período de intoxicación humana,en el que las toxinas de VPM mostraronoxidación enzimática de N1 en el nucleo-tetrahidropurina, produciendo neoSX yepímerosGX4/GX a partir de SX yepímerosGX3/GX2, respectivamente.Este estudio concluye que las toxinas delVPM son transormadas metabólicamen-te por los seres humamos y eliminadas delcuerpo por excreción en la orina y las hecescomo cualquier compuesto xenobiótico.

Palabras clavesIntoxicación por veneno paralizante demoluscos; toxina paralizante; fiordos de laPatagonia.

victims biological samples. Te PSP toxincomposition in urine and bile showed asmajor PSP toxins neoSaxitoxin (neoSX)and GX4/GX1 epimers, both SX

analogues with an hydroxyl group (–OH)in the N1 o the tetrahydropurine nucleus. Te neoSX was not present in the gastriccontent sample, indicating that the oxida-tion o N1 in the SX tetrahydropurinenucleus resulted neoSX, in a similar waythat GX3/GX2 epimers were transor-med in GX4/GX1 epimers. Beside thismetabolic transormation, also the hydroly-sis o carbamoyl group rom SX to ormits decarbomoyl analogue decarbamoyl-

saxitoxin was detected in liver, kidney andlung. Tese two findings show that PSPtoxins went under metabolic transorma-tion during the 3–4 h o human intoxica-tion period, in which PSP toxins showedenzymatic oxidation o N1 in the tetrahy-dropurine nucleus, producing neoSX andGX4/GX1 epimers starting rom SXand GX3/GX2 epimers, respectively. Tis study conclude, that PSP toxins aremetabolically transormed by humans andthat they are removed rom the body by ex-cretion in the urine and eces like any other xenobiotic compound.

KeywordsParalytic shellfish poisoning, paralytic she-llfish toxins, high perormance liquid chro-matography analysis, casualties, patagoniafords, Chile.



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1. Introducción

El continuo aumento en el número de especies de microalgas tóxicas asociado alaumento de la incidencia de brotes de estas especies provocan una amenaza constan-

te para la salud pública mundial. Floraciones de microalgas tóxicas, popularmenteconocidas como mareas rojas, representan una amenaza en expansión para la saludhumana y los recursos pesqueros en todo el mundo (White, 1988; Smayda, 1992;Hallegraeff, 1993). El impacto de este enómeno va desde la enermedad y la muer-te de los consumidores humanos de mariscos contaminados hasta la alteración delecosistema con una mortalidad masiva de peces, aves y mamíeros marinos (Geraciet al., 1989; Anderson, 1989; Smayda, 1992; Hallegraeff, 1993; Lagos, 1998, 2003).

Hasta ahora, se han descrito seis enermedades humanas asociadas a las toxinas demicroalgas (Hallegraeff, 1993; Yasumoto and Murata 1993; Falconer, 1996); de ellas

la intoxicación por veneno paralizante de mariscos (VPM) constituye la amenazamás grave para la salud pública en todo el mundo, debido a su alta tasa de mortali-dad (Lagos, 1998) y en el caso de Chile debido a la alta toxicidad encontrada en losmoluscos de los fiordos de la Patagonia (Lagos et al., 1996; Compagnon et al., 1998;Lagos, 1998, 2003). El VPM está ormado por al menos 26 toxinas paralizantesanálogas que se producen naturalmente (Oshima, 1995a; Onodera et al., 1997; Lagos,1998, 2003; Molica et al., 2002).

La intoxicación por VPM ha sido reconocida por más de un siglo como una entidadclínica de la parte austral de América del Sur. En 1908 P.A. Segers documentó la ma-

siva intoxicación de gente nativa debido al consumo de mejillones en Ushuaia (CanalBeagle). Este es el primer inorme de intoxicación por VPM en este ámbito. Hastaahora, sólo el dinoflagelado A. catenella ha sido descrito como el productor de toxinasdel VPM, esta especie se encuentra principalmente en las regiones más australes deChile, 1500 km de distancia entre 42º00”00” hasta 56º00”00” Lat. S. (Lagos, 2003).

Desde 1972, las floraciones tóxicas de A. catenella han provocado la intoxicación de527 personas, con 32 víctimas mortales (documentos oficiales del Departamento deSalud Ambiental del Ministerio de Salud de Chile). odos ellos intoxicados por elconsumo de moluscos recolectados en las tres regiones más australes de la Patagonia

chilena (Montebruno, 1993; Lagos, 1998, 2003). La más alta contaminación demariscos por VPM ha sido reportada en esta parte de Sud América (Benavides et al.,1995; Compagnon et al., 1998). Desde 1993, la aparición de intoxicación por VPMes considerada endémica en los fiordos del sur de Chile (Uribe 1993; Compagnon etal., 1998; Lagos, 1998, 2003).

Presentamos dos pérdidas de vida humana que se produjeron en los fiordos de laPatagonia, cerca del estrecho de Magallanes, incluyendo el análisis post-mortem de lastoxinas del VPM en los tejidos y fluidos corporales con un método de CromatograíaLíquida de Alta Resolución (HPLC) con derivatización post- columna y detección de

fluorescencia (Lagos, 1998). Con esta herramienta de análisis ue posible obtener el



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perfil de toxinas del VPM de las muestras de tejidos y fluidos corporales de víctimasintoxicadas por toxinas del VPM. Este estudio supera todos los problemas técnicospara medir estas toxinas en muestras biológicas humanas, mostrando los datos máscompletos del análisis de las toxinas del VPM en los fluidos corporales y tejidoshumanos post-mortem hasta ahora reportados.

2. Materiales y método

Químicos

Heptano sulonato de sodio sal, ácido periódico, osato de potasio dibásico, tetra-butilamonio osato, ueron adquiridos de SIGMA (Sigma Chemical Co, St Louis,Mo, USA). Solventes de grado HPLC (acetonitrilo, HCL, ácido acético) obtenidosde Fisher Scientific (New Jersey, USA), ácido osórico, hidróxido de amonio ueronadquiridos de Merck (MERCK, Darmstadt, Germany). El agua de alto grado depureza ue obtenida mediante elución a través de un cartucho de intercambio iónico

y luego por ebullición durante 2 horas con burbujeo de nitrógeno.

Preparación de muestras post-mortem

Las toxinas son extraídas en medio ácido y a ebullición, centriugadas y purificadas.Posteriormente el extracto se analiza por HPLC provisto de un detector de fluo-rescencia mediante derivatización post columna. Veinte microlitros del filtrado se

aplicaron a la HPLC. Las muestras de tejido y fluidos humanos ueron recogidas porun médico orense oficial del Servicio Médico Legal de Punta Arenas, XII Región,Chile. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité de Ética, Facultad deMedicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Análisis de las toxinas del VPM por cromatografía líquida de altaresolución

Las toxinas del VPM se midieron en las condiciones descritas anteriormente medianteHPLC con derivación post-columna y detección con fluorescencia en línea(HPLC-

FLD) (Andrinolo et al., 1999). Brevemente, 20 µl de fluidos corporales (bilis, líquidocealorraquídeo, orina y humor vítreo) o extractos de muestras de hígado, músculopapilar, riñón, bazo, glándula tiroides, estómago, contenido gástrico, páncreas, glán-dula adrenal, sustancia gris, sustancia blanca, epicardio, miocardio, endocardio, aorta ypulmones; ueron inyectados (Rheodynemodel 7725i) en una columna de sílice de aseinversa (Supelcosil 5 um, C-8, 46 X 150 mm, SUPELCO, Belleonte, PA, USA) y lassiguientes ases móviles usadas ueron: para el grupo de SXs, 2 mM de heptanosulo-nato en 30 mM de osato de amonio buffer pH 7.1: acetonitrilo (100:3), una velocidadde flujo de 0,7 ml/min y para el grupo de gonyaulatoxinas, 2 mM heptano sulonatoen 10 mM de osato de amonio buffer pH 7.1. Las racciones eluidas de la columna se

mezclaron continuamente con 7mM de ácido periódico en 10 mm de osato de potasio



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buffer pH 9.0 a 0.4 ml/min, se calentó a 65ºC pasando a través de una bobina de tubode teflón (0,5 mm. de diámetro y 10m. de largo), y luego se mezcla con 500 mM deácido acético a 0.3 ml/min antes de entrar en el monitor. El monitor fluorométrico sefijó en una longitud de onda de excitación de 330 nm y una longitud de onda de emisiónde 390 nm. Para el procedimiento de HPLC, se utilizó un cromatógrao de líquidosShimadzu LC-10AD en línea con un detector espectro fluorométrico Shimadzu RF-551. El reactivo oxidante y el ácido se bombeó mediante una bomba de doble cabezal(modelo SP-D-2502, Nihon Seimitsu Kagadu). La adquisición y procesamiento de losdatos se realizaron con un sotware Shimadzu CLASS-CR 10. Las concentracionesde las toxinas se midieron mediante la comparación de las áreas de los picos para cadatoxina con las de los estándares. Soluciones de toxinas puras ueron calibradas poranálisis de nitrógeno de combustión y HPLC-MS ueron utilizados como patronesexternos. (Lagos, 1998; Andrinolo et al., 2002).

Con el fin de evitar alsa identificación de toxinas del VPM, las muestras se volvierona analizar por el procedimiento de HPLC sustituyendo el reactivo de oxidación poragua destilada, en donde sólo se produjo una oxidación suave (Onodera et al., 1996;Lagos et al., 1999).

3. Resultados

Reporte de un caso

El 5 de julio de 2002, en la isla Augusta (51º15́ 00´´S; 75º05´00´́ W) cerca del canalSan Blas, a 140 millas de Puerto Natales, Chile (Fig. 1), un grupo de tres pescadoresque cosechaban erizo de mar (Loxechinusalbus) decidieron en torno a las 02:30 P.M.extraer Aulacomya ater, un bivalvo filtrador (cholga). Los demás barcos pescadorestambién estaban en el mismo lugar de la cosecha del erizo de mar. odos teníanconocimiento de que la cosecha de bivalvos filtradores se prohíbe oficialmente enla zona desde 1994. Solamente el buzo decidió no unirse al consumo de moluscos,siendo el único sobreviviente.



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Fig. 1. Mapa y localización geográfica de la isla Augusta(51º15´00´´ S; 75º05´00´´W). Canal San Blas, fiordos de laPatagonia chilena.

De acuerdo a la declaración oficial realizada por el buzo a la policía, después de 30minutos del consumo de moluscos, uno de los pescadores comenzó a mostrar síntomasde intoxicación: parestesia en los labios, náuseas y debilidad muscular, regresandoel patrón del barco inmediatamente a Puerto Natales en busca de ayuda médica.Alrededor de las 05:00 P.M., el pescador intoxicado murió, paralelamente el patróndel barco comenzó a presentar debilidad de las extremidades superiores y parálisisde la lengua, una hora más tarde estaba muerto. La declaración oficial inormó que

ambas víctimas comieron de 7 a 9 cholgas. El buzo ue rescatado en torno a las 10:00P.M. por un buque de la armada chilena. Un día después, cuando los barcos llegarona Puerto Natales, el marisco contaminado ue confiscado por la policía y una muestraue enviada al Laboratorio de Marea Roja, donde se realizó estudio por bioensayoen ratón de las muestras de los moluscos consumidos por las víctimas. El laboratorioreportó 8575 ug de SX equivalente por 100 gramos de tejido de molusco. El límitede seguridad según el reglamento internacional es de 80 ug de equivalente de SXpor 100 g de tejido de molusco.

Examen forenseEn el estudio anatomopatológico de las víctimas (abla 1), los hallazgos más destaca-dos se asociaron a las condiciones de los pulmones: aumentados en peso, crepitantesal tacto, congestión y edema pulmonar al corte. Estos hallazgos son indicativos delos eectos graves sobre los músculos respiratorios, debido al mecanismo paralizantede la toxina. El aspecto opaco y bajo volumen de orina encontrada en la vejiga deambas víctimas se correlacionan muy bien con el hallazgo reportado por Andrinoloet al. (1999) en un modelo experimental in vivo en gato, en que ue anestesiado yasistido permanentemente por ventilación artificial, donde la inyección intravenosade SX redujo drásticamente la presión sanguínea con la consecuente caída de la

diuresis (Andrinolo et al., 1999, 2002; Lagos and Andrinolo, 2000).



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Tabla 1: Examen patológico forense

Víctima Nº1Salida de líquido sanguinolento por fosas nasales.

Corazón 482 grs. válvulas cardiacas y vasos coronarios sin lesiones.Pulmones de 1.100 grs cada uno aprox., crepitante al tacto, edema y congestión pulmonar.Riñones de aspecto normal.Vejiga con orina opaca.Hígado normal sin lesiones aparentes.Contenido gástrico semisólido con restos de mariscos.Mucosa gástrica congestiva.Congestión visceral difusa.

Víctima Nº2

Corazón 371,5 grs. válvulas cardiacas y vasos coronarios sin lesiones.Pulmones de 1.300 grs cada uno aprox., crepitante al tacto, edema y congestión pulmonar.Riñones sin hallazgos patológicos.Vejiga con escasa orina en su interior.Hígado normal sin lesiones aparentes.Congestión visceral difusa.Mucosa gástrica hemorrágicaModerado contenido gástrico de color verdoso con restos de mariscos.

Análisis por HPLC de las toxinas del VPM contenidas en las muestras de

tejidos y fluidos corporalesHPLC con detección fluorescente en línea (FLD) es el enoque más adecuado parael análisis cuantitativo de las toxinas del VPM. Por otra parte, este método es elúnico que permite obtener el perfil de toxinas de las muestras, es decir entrega inor-mación adicional tales como las transormaciones metabólicas de las toxinas con lamodificación de los perfiles de las toxinas del VPM (Oshima, 1995a; Lagos, 1998).Las muestras de orina y sangre muestran normalmente compuestos fluorescentes queconsiguen excitar y emitir la señal fluorescente en el mismo rango de onda de 330nm (excitación) y 390 (emisión) utilizadas para la detección de las toxinas del VPM.Por esta razón los procedimientos de matriz limpia desarrolladas por Andrinolo et

al. (1999) se utilizaron con el fin de evitar los pigmentos fluorescentes en muestrasbiológicas. Fig. 2 muestra ejemplos de cromatogramas de HPLC-FLD de algunosextractos de tejidos y fluidos corporales, junto con los de los estándares. La mezclaestándar, muestra tres picos: GXs, neoSX y SX con tiempos de retención de6:99, 9:44 y 14:24 min respectivamente (Fig. 2A). Fig. 2B, ilustra que el extracto debilis también muestra los mismos tres picos con tiempos de retención idénticos. Laase móvil utilizada (2mM heptanosulonato en 30 mM osato de amonio buffer,pH 7.1, conteniendo 3% de acetonitrilo) sólo resuelve las toxinas del VPM que per-tenecen al grupo de las SXs y algunas de ellas son neosaxitoxina (neoSX), decar-bamoilneosaxitoxina (dcneoSX), decarbamoilsaxitoxina (dcSX) y SX, de ellas,

neoSX (Rt=9:39 min) y SX (Rt=14:21 min) se ven claramente. Posteriormente se



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observó un pico extra sólo después de los pigmentos iniciales con un Rt=6:97, éstecorresponde a las gonyautoxinas, un grupo de toxinas del VPM que se resolverá conotra ase móvil (ver Sección 2). Para gonyaulatoxinas se utilizó otra mezcla estándarcomo se muestra en la Fig. 3.

El cromatograma de toxinas del VPM de la glándula suprarrenal y tejido de la aortatambién se muestran en Fig. 2 C y 2 D, respectivamente, ambos son ejemplos deciclos cromatográficos típicos de las muestras de tejido de las víctimas. En la muestrade glándula suprarrenal, se observaron dos picos, SX (Rt=14:30 min) y la corres-pondiente a la mezcla de gonyaulatoxinas (Rt=6.95 min) (Fig. 2C). En el caso deltejido de la aorta, solamente ue detectada gonyaulatoxinas (Rt=6:95 min) (Fig. 2D).

La cantidad de cada toxina del grupo de las SXs detectado en las muestras detejidos y fluidos corporales, se muestran en la abla 2. La cantidad de cada toxina se

obtuvo mediante la comparación de las áreas de los picos de cada toxina con los delos estándares (Lagos, 1998). Para las muestras de tejido la cantidad es expresada enmicrogramos por gramos de tejido y en el caso de fluidos corporales en microgramospor mililitro de fluido.

Fig. 2. Ejemplos de cromatogramas de HPLC–FLD de toxinas del VPM PSPusando la fase móvil y condiciones para el análisis del grupo de las STXs. A.Cromatograma estándar incluye STX (STX 1⁄4 9.4 mM), neosaxitoxina (neoSTX1⁄4 14.7 mM) y gonyaulatoxina (GTX 1⁄4 1.94 mM). B. Cromatograma de lamuestra de Bilis. C. Cromatograma de la muestra de Glándula Suprarrenal yD. Cromatograma del tejido de la Aorta.

La mayor cantidad de las toxinas del VPM se encuentra en el contenido gástrico (39,69µg de STX/gr. de tejido). La muestra se obtuvo durante el examen de autopsia, recogidos



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directamente luego de la apertura de la curvatura mayor del estómago; la mayor parteera contenido sólido sin digerir (comida y mariscos). Como la muestra es más sólidaque líquida, se pesó y el contenido de la toxina se expresó en microgramos de toxina porgramo de sólido. En el análisis de esta muestra buscamos cuidadosamente la presencia

de neoSTX, pero no fue encontrada. El perfil de las toxinas del contenido gástricoes importante, porque el contenido gástrico se corresponde con la imagen de lo queestaba presente en los moluscos contaminados. Es importante señalar que las víctimasmurieron 3-4 hrs. después del consumo de los moluscos y la secreción gástrica en elestómago mantiene los alimentos en condiciones ácidas, que es la mejor condición paramantener estas toxinas químicamente estables. Las toxinas del VPM son muy establesdesde el punto de vista químico, ellas son estables en ebullición 0.1N HCL. Este es elprocedimiento de extracción de rutina realizada para bioensayo en ratón (Cunniff, 1995).

Los fluidos corporales: orina, bilis y líquido céfalo raquídeo y los tejidos del bazo y el pán-

creas fueron las muestras que mostraron la presencia de neoSTX (Tabla 2). Con el fin deevitar una falsa identificación de neoSTX, su posterior análisis se llevó a cabo de acuerdoa Lagos et al. (1999). En todas las muestras donde neoSTX fue detectada, las muestraspurificadas se volvieron a analizar por el mismo procedimiento de HPLC pero ahorareemplazando el reactivo oxidante por agua destilada. Como era de esperar, la intensidadde fluorescencia del pico de neoSTX aumentó varios puntos en relación a la toxina estándar.

Fig. 3. Ejemplos de cromatogramas HPLC–FLD de las toxinas del VPMbajo condiciones apropiadas y fase móvil para análisis de gonyautoxinasA. Cromatograma estándar para Gonyautoxinas incluyendo gonyautoxina 4(GTX4 1⁄4 0.52 mM), gonyautoxina 1 (GTX1 1⁄4 1.52 mM), gonyautoxina 5 (GTX51⁄4 0.70 mM), gonyautoxina 3 (GTX3 1⁄4 0.15 mM) y gonyautoxina 2 (GTX2 1⁄4 0.44mM).B. Cromatograma de la muestra del tejido del estómago. C. Cromatogramade la muestra de tejido esplénico y D. Cromatograma de la muestra de tejidorenal.



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Este comportamiento es típico de las toxinas del VPM que tiene un grupo hidroxilo(-OH) en el nitrógeno 1 (N1) de su estructura química, como es el caso de neoSX(Lagos et al., 1999). Por lo tanto, el pico con una retención de 9:39 min correspondea neoSX. Las muestras de hígado, riñón y pulmón mostraron una pequeña cantidadde dcSX (abla 2), esta toxina no estaba presente en la muestra de contenido gás-trico. Normalmente, la presencia de esta toxina se asocia con SX y se ha reportadotransormación metabólica entre ellas (Sullivan et al., 1983). SX ue la toxina delVPM detectada con mayor recuencia en todas las muestras de tejido y en la mayo-ría de los casos era la más importante, también SX ue la toxina del VPM que semostró en mayor cantidad en el contenido gástrico.

Como ejemplos, Fig. 3 muestra los cromatogramas HPLC- FLD de algunas muestrasde tejido, incluyendo los ciclos cromatográficos estándares de Gonyautoxina (Fig.3A). En estos ensayos, la ase móvil utilizada ue 2 mM de ácido 1-heptanosulónico

en 10 mM de osato de amonio buffer, pH 7.1. Bajo esta condiciones posible resolversólo las toxinas del VPM que pertenecen al grupo de la gonyautoxinas (epímerosGX4/GX1, GX5 y epímeros GX3/GX2). Estas cinco toxinas del VPMson resueltas en una HPLC de ejecución de 20 min como se muestra en la Fig. 3A.aquí el cromatograma tiene cinco picos correspondientes a GX4, GX1, GX5,GX3 y GX2 con tiempos de retención de 9:43, 10:90, 13:80, 14:80 y 17:24 min,respectivamente (Fig. 3A). El cromatograma de la muestra del tejido del estómagomuestra tres picos correspondiendo a GX5 (Rt=13:76 min) y a los epímeros GX3/GX2 (Rt= 14:87 y Rt= 17:27 min), siendo este último la principal toxina detectadaen la muestra (Fig. 3B). Fig. 3C muestra el cromatograma de la muestra del tejido

esplénico, este también muestra tres picos, pero ahora los epímeros GX4/GX1(Rt=9:42 y Rt=10:98, respectivamente) como las principales toxinas del VPM , sinla aparición de los epímeros GX3/GX2. Ambas muestras mostraron la presenciade GX5 (Rt=13:77 min). Finalmente, la Fig. 3D muestra el cromatograma de lamuestra de riñón, aquí se detectaron cinco gonyautoxinas mostrando un cromato-grama similar al estándar con prácticamente los mismos tiempos de retención (Fig.3A). Este método encontró claramente las cinco gonyautoxinas en las muestras detejidos y fluidos corporales. Las gonyautoxinas se reconocen lejos del inicio, dondese pueden ver picos adicionales, estos corresponden a los pigmentos presentes en lamuestra y no tienen relación con las toxinas del VPM.

Tabla 2: Perfiles de saxitoxinas en muestras de tejidos y fluidos corporales de víctimas deVPM.

Muestras neo-STX dc-STX STX

(µg/g tejido) (µg/g tejido) (µg/g tejido)

Glándula Tiroides n.d n.d 2,86

Estómago n.d n.d 14,24

Contenido gástrico n.d n.d 39,69



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Bazo 0,22 n.d 0,43

Hígado n.d 0,04 0,55

Páncreas 1,3 n.d 8,18

Riñones n.d 0,01 0,26Glándulas adrenales n.d n.d 1,52

Fluidos

Bilis 0,69 n.d 1,53

Líquido Cefalorraquídeo 0,77 n.d n.d

Orina 22,33 n.d 1,8

Humor vítreo n.d n.d n.d

CerebroSustancia gris n.d n.d 0,65

Sustancia blanca n.d n.d 0,08

Corazón

Pericardio n.d n.d 0,37

Miocardio n.d n.d 0,67

Endocardio n.d n.d n.d

Músculo papilar n.d n.d 0,63

Aorta n.d n.d n.d

Pulmón n.d 0,06 0,75

n.d., no detectado; neoSTX, neoSaxitoxina; dcSTX, decarbamoyl- Saxitoxina; STX, Saxitoxina

aµg/ml

El cromatograma de gonyautoxina estándar que se muestra en la Fig. 3A se utilizópara la determinación de los picos de gonyautoxinas en cada una de las muestras detejidos y fluidos corporales. Las cantidades de cada una de las GXs se muestranen la abla 3, la cantidad de toxinas se obtuvo mediante la comparación de las áreasde los picos de cada toxina con la de los estándares (Lagos, 1998). Para las muestrasde tejido la cantidad se expresa en microgramos por gramo de tejido y en el caso demuestras de fluidos en microgramos por mililitro de fluido corporal (abla 3)

Se detectaron las cinco gonyautoxinas sólo en el contenido gástrico, hígado y riñón. Lamuestra de contenido gástrico mostró la mayor cantidad de gonyautoxinas (abla 3).Las tres muestras presentan GX5 como la GX de menor cantidad. Las muestrasde tejido pulmonar mostraron tanto epímeros GX4/GX1 y GX3/GX2, peroGX5 no ue detectada en esas muestras. GX5 ue la gonyautoxina detectada enmenor cantidad en el contenido gástrico. La muestra de tejido del estómago muestra



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GX5 y los epímeros GX3/GX2, estas toxinas se corresponden a las encontradasen el contenido gástrico con GX3 como la más importante en ambas muestras,asemejándose a la composición de gonyautoxinas del contenido gástrico. El restode las muestras de tejido y fluido sólo mostraron epímeros GX4/GX1(abla 3).

4. Discusión y conclusiones

El análisis de las toxinas del VPM en las muestras de tejidos y fluidos corporalesha sido complicado debido a la baja sensibilidad y alta de especificidad de los mé-todos y procedimientos utilizados para detectar y cuantificar estas toxinas. En estetrabajo, se utilizó un método de HPLC con derivatización post-columna y FLDpara cuantificar la cantidad de masa de las toxinas del VPM. El HPLC-FLD es unmétodo analítico que tiene la capacidad de medir cada toxina del VPM en muestras

de pequeño tamaño (20 ul), que producen una única concentración de toxina. Estemétodo, junto con los procedimientos que utilizan columnas de cartuchos y filtrosde microcentríuga, logra mediciones tan bajas como 1 pmol de toxina del VPMen las muestras de tejidos y fluidos corporales. Este procedimiento desarrollado porAndrinolo et al. (1999) demostró ser muy potente en el análisis de muestras biológicashumanas, como se muestra en este documento.

Considerando el perfil de las toxinas del contenido gástrico, como el de los moluscoscontaminados, estos contienen las toxinas SX, GX4, GX1, GX5, GX3 yGX2. Este perfil se corresponde con la composición media de latoxina del VPM

(% en moles) que se encuentra en Mytthilus chilensis (mejillón azul); otro bivalvosimilar, también presente en la zona.

La biotransormación de un xenobiótico consiste undamentalmente en incrementarsu polaridad para posibilitar la eliminación, es decir convertir un compuesto no polaren uno soluble en agua. Este es el mecanismo mas común que usan los organismospara transormar y eliminar los xenobióticos ambientales. Las reacciones de bio-transormación son conversiones enzimáticas de sustancias xenobióticas lipoílicas,generalmente a productos hidroílicos mas eliminables o excretables. El conjunto dereacciones biotransormadoras de xenobióticos suele agruparse en dos ases: I yII. Las

reacciones de ase I comprende modificaciones oxidativas, reductivas e hidrolíticas,mientras que las reacciones metabólicas de ase II son reacciones de conjugación(glucoronidación). Los compuestos glucoronidados son muy solubles en agua y apa-recen en la orina y la bilis. En la ase de reacción I se consideran normalmente comolas reacciones de uncionalización que preparan a los xenobióticos para la siguienteetapa de desintoxicación enzimática. Considerando a las toxinas del VPM como

xenobióticos, éstos deben pasar a la llegada al hígado por estas reacciones de la aseI y por lo tanto deben ser transormadas químicamente. La oxidación enzimática deN1 en el núcleo tetrahidropurina de la SX pudo generar neoSX y una reacciónde uncionalización similar pudo transormar los epímeros GX3/GX2 en losepímeros GX4/GX1.



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Debido a que los xenobióticos se excretan principalmente por las heces y la orina,estas muestras de fluidos corporales ueron analizadas con especial cuidado. Ambasmuestras mostraron epímeros GX4/GX1, neoSX y SX. Los epímeros y neoSX pertenecen al grupo de los análogos de SX que tienen un grupo hidroxilo(-OH) en N1 del núcleo tetrahidropurina común para todas las toxinas del VPM.Ambas muestras no mostraron los epímeros GX3/GX2, las gonyautoxinas delcontenido gástrico. Por otra parte, ambos fluidos corporales mostraron la excreción deneo SX, una toxina del VPM que tampoco ue detectada en el contenido gástrico.En el caso de la orina la cantidad de neoSX (22,33 ug/ml) ue sorprendentementealta, sólo es comparable con la cantidad de SX encontrada en el contenido gástrico,la cantidad más alta de toxina del VPM medido en todas las muestras analizadasen este trabajo.

Tabla 3: Perfil de Gonyautoxinas en muestras de líquidos corporales y muestras de tejidoen víctimas de VPM

Muestras GTX 4 GTX 1 GTX 5 GTX 3 GTX 2

(µg/g tejido) (µg/g tejido) (µg/g tejido) (µg/g tejido) (µg/g tejido)

Glándula Tiroides 0,31 2,33 n.d. n.d. n.d.

Estómago n.d. n.d. 0,22 1,04 0,57

Contenidogástrico

1,29 1,26 0,1 2,64 1,15

Bazo 0,23 0,01 0,29 n.d. n.d

Hígado 0,34 0,13 0,21 0,01 0,01

Páncreas 0,1 1,44 n.d. n.d. n.d.

Riñones 0,14 0,07 0,06 0,01 0,05

Glándulasadrenales

0,13 0,25 n.d. n.d. n.d.

Fluidos

Bilis 0,41 0,09 n.d. n.d. n.d.

Líquido

Cefalorraquídeo0,02 0,06 n.d. n.d. n.d.

Orina 2,14 0,03 n.d. n.d. n.d.

Humor vítreo n.d n.d. n.d. n.d. n.d.

Cerebro

Sustancia gris 0,05 0,65 n.d. n.d. n.d.

Sustancia blanca 0,04 0,57 n.d. n.d. n.d.



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Corazón

Pericardio 0,02 0,65 n.d. n.d. n.d

Miocardio 0,05 1,52 n.d. n.d. n.d

Endocardio 0,1 2,25 n.d. n.d. n.dMúsculo papilar 0,06 1,03 n.d. n.d. n.d

Aorta 0,8 0,57 n.d. n.d. n.d.

Pulmón 0,14 0,16 n.d. 0,05 0,03

n.d., no detectado; GTX 1, Gonyautoxina 1; GTX 2, Gonyautoxina 2; GTX 3, Gonyautoxina 3,GTX 4, Gonyautoxina 4; GTX 5, Gonyautoxina 5.

aµg/ml

Por otro lado, la mayoría de las muestras de tejido incluyendo la muestra de líqui-

do cealorraquídeo sólo mostraron la presencia de neoSX y los epímeros GX4/GX1 y nuevamente ninguno de los epímeros GX3/GX2 ueron detectados enesas muestras. Estos dos resultados claramente muestran que las toxinas del VPMpresentaron transormación metabólica, en la que la mayor parte de las toxinas delVPM mostraron oxidación enzimática de N1 en el núcleo de tetrahidropurina, pro-duciendo neoSX y epímeros GX4/GX1 a partir de SX y epímeros GX3/GX2 respectivamente. SX no tiene un grupo hidroxilo en N1 del núcleo detetrahidropurina, esto no sólo es necesario para el siguiente paso de la transorma-ción enzimática, sino que constituye un mecanismo importante para la excreción detoxinas del VPM, tal como se demostró por la alta cantidad de neoSX encontrada

en la orina (22,33 ug/ml, abla 2).

Andrinolo et al., (1999 and 2002) usando un gato como modelo vivo bajo condicionescontroladas (ventilación mecánica), mostró que los gatos con parámetros cardiovascu-lares y diuresis normal, excretan SX y epímeros GX3/2 por filtración glomerular.Durante las cuatro horas de tiempo experimental, ninguna otra toxina a excepción dela SX (Andrinolo et al., 1999) o epímeros GX3/2 (Andrinolo at al., 2002) uerondetectadas en las muestras de fluidos y tejidos corporales. Los autores concluyeron quelos gatos no podían metabolizar toxinas del VPM y que sólo la excretan por la orina.Por otra parte no se encontraron toxinas del VPM en la bilis. Sabiendo que la reacción

de ase I se considera normalmente como reacción de uncionalización que prepara alos xenobióticos para la siguiente etapa de desintoxicación enzimática, siendo el gatola excepción entre los mamíeros, en tener la glucoronidación metabólica (Kasperand Henton, 1980), es posible comprender que SX y epímeros GX3/GX2 nomostraron ninguna transormación metabólica en el gato en estudios in vivo.

A partir de los registros médicos y análisis de muestras de VPM de personas intoxi-cadas durante 1994 en la isla Kodiak, Gessner et al. (1997) inormaron dierenciasentre la composición de las toxinas de los mejillones en la orina y el suero. Sugirieronque las toxinas del VPM podrían metabolizarse en el ser humano. Más reciente-

mente, el análisis post-mortem de muestras de orina y suero de una víctima humana



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por envenenamiento mortal causada por el cangrejo xanthid, permitió a los autoresconcluir que se produjo metabolización de las toxinas del VPM, lo que sugiere quela conversión de la toxina se inició a nivel intestinal de la víctima (Llewellyn et al.,2002).Hasta ahora, no hay ningún inorme de estudios metabólicos en mamíerosasociados a las toxinas del VPM, por lo tanto, no hay evidencia directa de la trans-ormación del VPM en los mamíeros, pero sí ha sido demostrado en microalgas,bacterias y mariscos (Shimizu and Yoshioka, 1981; Sullivan et al., 1983; Shimizu,1993; Oshima, 1995b).

En este estudio se demostró la oxidación enzimática del grupo N1 para ormar elanálogo de hidroxilo, que transorma SX a neoSX y epímeros GX3/GX2 aepímeros GX4/GX1, también se detectó la hidrólisis del grupo carbamoilo paraormar el análogo decarbamoil SX (dcSX). La dcSX ue identificada en mues-tras de hígado, riñón y pulmón, todos ellos tejidos muy activos en la transormación

metabólica enzimática, en particular la toxina del VPM manteniendo el núcleo detetrahidropurina. La secreción de bilis es necesaria para la digestión y absorción delos lípidos. ambién es necesaria para la eliminación de productos endógenos (porejemplo colesterol y pigmentos biliares), así como productos químicos o xenobióticosadministrados exógenamente, por ejemplo ármacos y toxinas.

En este trabajo se muestra la presencia de neoSX, SX, y epímeros GX4/GX1en la muestra de bilis, mostrando por primera vez que las toxinas del VPM tambiénse excretan por las heces en cantidades significativas.

D

libro icy iii

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