INDICADORES QUÍMICOS ÁCIDO-BASE I Introducción. En 1664, Boyle escribió “The Experimental History of Colours”. En ella se inicia el reconocimiento de ácidos1 y bases a través de los cambios de color de extractos de plantas2. A partir de Boyle, el cambio de color del jarabe de violetas, sirvió para indicar la presencia de un ácido; en este momento nacen los indicadores químicos. Sin embargo el primer reconocimiento, no lo fue con motivo de los cambios de color, ya que 8 años antes, Glauber había definido la “efervescencia del espíritu ácido” como señal inequívoca de su existencia3. En 1671, Duclós llama “turnesol” (litmus), a un indicador extraído de líquenes, que le da un gran resultado4. Casi cien años después, James Watt, el inventor de la máquina de vapor y nominador del caballo de vapor como unidad de potencia, descubre que la lombarda (col roja) es uno de los mejores indicadores. Indicadores químicos ácido-base. Un indicador químico es un ácido o base débil cuya forma disociada tiene diferente color que la forma sin disociar5, ello es debido a que están formados por sistemas resonantes aromáticos, que pueden modificar la distribución de carga según la forma que adopten. Esta alteración por el desplazamiento hacia una forma mas o menos disociada, hace que la absorción energética del sistema se modifique y con ello el color. Se podría establecer un equilibrio de disociación para una forma de indicador ácido HIn:

HIn X In- + H+

Color A Color B La aplicación de la ley de acción de masas a este equilibrio, nos da que:

[ ][ ][ ]HIn

HInKa

+−

= , de lo que [ ][ ][ ]HInIn

HKa

−

+ = .

Si el medio es ácido, y aumenta la concentración de H+, deberá disminuir la relación [In-]/[HIn]. Para ello el equilibrio tendrá que desplazarse hacia la izquierda, aumentando la concentración de HIn, y dominando su color. Si el medio es básico, el cociente tendrá que aumentar, desplazándose el equilibrio hacia la derecha y dominando el color B. Naturalmente como se trata de un equilibrio, coexisten las dos formas, y por ello el color que toma procede de la mezcla de colores y de su proporción. Como los indicadores tienen diferentes constantes de equilibrio, por eso cambian de color en distintos intervalos de pH, esto suelo ocurrir aproximadamente a pH=pK"1 . Cuando coexisten varios equilibrios entre formas tautómeras, hay varios pK, y por lo tanto más de un cambio de color. 1 El concepto de ácido según Partington, ya aparece en el manuscrito indio Rasarnava, 1200 años A.C. Las bases eran conocidas como álcalis, debido a que el mas conocido (carbonato potásico) se extraía de las cenizas de la planta Kali (La primera referencia se da en la obra de Abu Mansur Monafir, siglo X d.C.). Existen referencias más antiguas, ya que en las tablas sumerias las cenizas vegetales eran conocidas como Te-Gaz. En el primer diccionario de Química publicado por Macquer en 1766, aparece como definición de los álcalis: sustancias que “vuelven verde el jarabe de violetas”.El término base, surge a mediados del siglo XVIII, y se debe al químico francés Rouelle, ya que eran la base de la formación de las sales al combinarse con los ácidos. 2 Escribe Robert Boyle:” Take good syrup of violeta, impregnated with he tincture of the flowers, drop a little or it upon a white paper (for by that means the change of colour will be more conspicuous, and the experiment may be practised in smaller quantities) and on this liquor let fall two o three drops of spirit, either of salt or vinegar or almost any other eminently acid liquor, and upon the mixture of these you shall find the syrup immediately turned red”. 3 Actualmente sería el desprendimiento de dióxido de carbono (antes gas silvestre, o gas fijo), cuando actúa sobre un carbonato. 4 El término tornasol, se conocía desde Plinio (I d.C.) y Dioscórides, aunque aplicado a determinadas plantas (heliotropo). Como colorante aparece mencionado en el “Art of Drawning”, de Peachan, publicado en 1606.El litmus, o littmose, aparece en uso desde 1518, derivado de lit (color) y mouse(aplicado a determinado tipo de plantas), por lo que vendría a ser un colorante extraído de plantas, como lo es en realidad. 5 Esta definición fue propuesta por Ostwald, en 1891, y publicada en 1894, en un contexto mucho mas amplio bajo el título:”Die wissenschaftlichen Grundlagen der analytischen Chemic”.

Indicadores químicos ácido-base naturales. Se deben fundamentalmente a la proporción que contengan de los pigmentos naturales conocidos como antocianinas y antoxantinas. La antocianina es roja en medio ácido, púrpura en medio neutro y azul en medio básico, sin embargo la antoxantina es amarilla en medio básico. La proporción en que se encuentre la mezcla de pigmentos hace que las flores tengan distintos colores y que se puedan modificar según el pH del medio. Son glucósidos, con estructura parecida, modificándose la posición de determinados grupos hidroxilo, con carácter ácido, que según el medio producen diferentes formas encuadradas en una tautomería ce-to-enólica. De su hidrólisis se extraen los pigmentos coloreados, las antocianidinas y antoxantidinas Así la forma más genérica de las antocianidinas, y su transformación sería: Mientras que para las antoxantidinas, sería: La mayoría de los pétalos de las flores contienen ambos pigmentos, por eso en medio ácido el jarabe de violetas producía color rojo, mientras que en medio básico era verde, combinación del amarillo y del azul, tal como se muestra en la simulación. Si domina más la concentración de amarillo, será verde amarillento.

Prácticas de indicadores químicos ácido-base naturales. 1. Con el extracto de violetas. Dado que históricamente fue el primer indicador, comenzaremos por él. Se cortan las hojas de violeta con cuidado y se extrae en una termobatidora, en caliente con agua hasta 80ºC. (25g de pétalos de violetas/ 50g de agua).El extracto toma color violeta pálido, casi incoloro (según la concentración). En el primer modelo de prácticas, observaremos a través de química de la gota de extracto de violetas en agua, la coloración que toma un ácido fuerte (H2SO4 6N), un ácido débil (acético 1M), una base débil (hidróxido amónico 1M) y una base fuerte (NaOH 6N). De esa forma se dispondrán en la caja Petri 4 gotas de los compuestos citados, rodeando unas gotas de indicador (fig.1). Posteriormente se pondrán en comunicación las gotas (fig.2), continuando con las figuras 3 y 4.

Como se observa a pH ácidos toma color rojizo, mientras que a pH básicos el color es verde amarillento, tal como se decía en los primeros estudios con indicadores naturales.

Fig. 1 Fig. 2

Fig. 4 Fig. 3

2. Con extracto de lombarda. La lombarda se extrae en una termobatidora, en frío con alcohol absoluto (50 g de lombarda troceada/ 100ml de etanol absoluto), y en caliente con agua hasta 80ºC. (250g de lombarda/ 500g de agua).El extracto alcohólico toma color rojo pálido, casi incoloro (según la concentración), mientras que el acuoso lo hace violeta. En el primer modelo de prácticas, observaremos a través de química de la gota de extracto de lombarda en agua, la coloración que toma un ácido fuerte (H2SO4 6N), un ácido débil (acético 1M), una base débil (hidróxido amónico 1M) y una base fuerte (NaOH 6N). De esa forma se dispondrán en la caja Petri 4 gotas de los compuestos citados, rodeando unas gotas de indicador (fig.5). Posteriormente se pondrán en comunicación las gotas (fig.6). En la sucesión de fotos (fig. 5, 6, 7 y 8), se observan los diferentes colores que toma la lombarda según el pH de medio. La difusión final separa en dos medios ácido fuerte y base fuerte (fig. 8).

Fig. 6 Fig. 5

Fig. 8 Fig. 7

En medio alcohólico, debido a la diferente tensión superficial, la gota de indicador se desparrama y es mucho más difícil delimitar las fronteras, sin embargo los colores se intensifican. La sucesión de fotos, se da en las figuras 9, 10, 11 y 12. Los cambios de color corresponden a los que toma para los diferentes pH, que se obtienen de la combinación de las gotas de los reactivos respectivos, según la tabla que se da: Valores de pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Lombarda en agua

Rojo Rojo violáceo Azul verdoso Verde Amarillo

Lombarda en etanol

Rojo Desde Violeta a azul pálido Verde Verde amarillento Verde azulado

Fig. 10 Fig. 9

Fig. 11 Fig. 12

3. Con extractos de pétalos de ciclamen rojo, similar a los pétalos de rosa roja. Se extrae con etanol absoluto, en frío, después de trocear los pétalos. Aproximadamente 25 g de pétalos con 50 mL de etanol). Se sigue el procedimiento habitual, obteniéndose la sucesión de figuras que se indica a continuación.

Como se aprecia en la sucesión de fotos (fig. 13, 14, 15 y 16), existe una diferencia sustancial frente a la lombarda, y es que en medio fuertemente básico, el color es marrón oscuro, mientras que en medio débilmente básico aparece violeta pálido. Valores de pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Ciclamen/ etanol

Rojo pálido

Desde rosa a violeta casi incoloro Marrón amarillento Marrón verdoso

Fig. 13

Fig. 15

Fig. 14

Fig. 16

4. Con extracto de fresas en etanol absoluto. Siguiendo el procedimiento habitual de unir las gotas (fig.17 y 18), se observa que a pH bajos, toma color naranja, pero si es algo es amarillo, con tintes violáceos. Si los pH son intermedios casi no se aprecia cambio de color (fig. 19 y 20).

Fig. 17

Fig. 19

Fig. 18

Fig. 20

5. Con tornasol (extracto de líquenes de los géneros Rocella, Variolaria y Lecanora). Los colores son muy débiles, en medio ácido tiende al rosa, y medio básico al azul grisáceo.

Fig. 21 Fig. 22

Fig. 23 Fig. 24

6. Extracto de amapolas En medio ácido resulta incoloro, mientras que en medio básico aparece marrón.

Fig. 25 Fig. 26

Fig. 27

INDICADORES QUÍMICOS ÁCIDO-BASE II

Indicadores ácido-base sintéticos La segunda mitad del siglo XIX, fue el inicio de las grandes síntesis orgánicas, y como no podía ser menos, también los indicadores ácido base, que habían sido empleados como productos naturales, iban a ser sintetizados a partir de 1868.

El primero indicador en ser sintetizado fue la fenolftaleína1, conseguida por Baeyer condensando el anhídrido del ácido ftálico (ortobencenodicarboxílico), con fenol, en 1871. De la fenolftaleína salieron otros muchos indicadores, potenciando los cambios de absorción al introducir derivados sulfonados y bromados, estudiados por Lubs y Clark a partir de 1915. Así aparecieron el rojo fenol, el azul de timol, la timolftaleína, el azul de bromotimol, azul de bromofenol y el cresol entre otros.

Antes, en 1859, el francés Verguin, había obtenido la fuchina2, oxidando por casualidad la anilina con cloruro de estaño(IV), que también fue obtenida por Hofmann poco después. Este compuesto sería el punto de partida de otros indicadores con estructura de trifenilmetano, como el violeta de metilo, verde de metilo, el verde brillante, el verde malaquita etc, caracterizados por tonalidades fuertes y brillantes a distintos pH.

Otra ruta de síntesis de indicadores fue de los colorantes azoicos, que dio lugar al

naranja de metilo (propuesto por Lunge en 1878). El segundo indicador ácido-base de este tipo en ser empleado, fue el rojo Congo3, descubierto por Böttiger en 1884. Después se usarían el rojo de metilo (introducido por Rupp y Loose en 1908), amarillo de alizarina etc. De estructura algo diferente entre los colorantes azoicos y el tipo fuchina es el rojo neutro que también será empleado en este trabajo. Uso de los indicadores ácido-base sintéticos.

Por lo general se suelen emplear en forma de sales sódicas, por ser solubles en agua. En caso contrario, se disolverían en etanol, lo cual tiene mas inconvenientes a la hora de usarse en la química a la gota, ya que la gota de alcohol tiende a extenderse y desparramarse contactando antes de tiempo con los diferentes medios.

Dado que se conocen los distintos pK, en los equilibrios tautoméricos entre las formas con distinto color y como se ha explicado anteriormente, en el tema Indicadores ácido-base I, el cambio de color o viraje se produce aproximadamente entre una unidad menos y otra mas del pK, se pueden comprobar los distintos cambios de color. Muchas veces el color esperado no es el que aparece, pues dado que se trata de formas en equilibrio, la combinación de colores produce el que se aprecia.

1 El origen del nombre de la fenolftaleína, parece sencillo si nos remontamos sólo a su sentido químico, sin embargo desde el punto de vista remoto, el fenol deriva del griego phaino (nV4<T), con el significado de “yo alumbro”, haciéndolo derivar del benzol (C6H6),que había sido descubierto por Faraday como residuo del gas del alumbrado de Londres, y la ftaleína, procede del término nafta, cuyo origen es muy remoto. Se podría considerar derivado del egipcio Na-Ptah, por que era empleado en el culto del dios egipcio del fuego, Ptah (Ftha), equivalente al Vulcano latino, ya que era un líquido negruzco traído de Persia, que ardía muy bien (petróleo). De él derivarán la naftalina, obtenida en 1820, por Garden como residuo de la destilación del alquitrán de hulla, el naftaleno etc. 2 Su origen procede del de la planta de color rojo, fucsia, nombrada así por el francés Plumier, en honor del botánico Leonhard Fuchs, que la descubrió y que coincidirá con el término alemán fuchs ( zorra), en francés, renard, nombre a su vez de la casa comercial Renard, que fabricó por primera vez la fuchina o fucsina en Lyon, en 1860. 3 Nombre impuesto por el marqueting de la casa alemana AGFA, que lo comercializó en 1888. Se eligió, debido a la fascinación que ejercían los términos africanos en la sociedad berlinesa, en la incipiente colonización de aquel continente. El término Congo es un hidrónimo de origen incierto, posiblemente portugués con alteraciones locales, ya que fue descubierto por el navegante portugués Diogo Cam. No tiene lógica emparentarlo con el bantú kong (montaña).

La tabla de indicadores sintéticos empleados y sus cambios de color en función del pH, es la dada, señalándose las regiones del viraje: Problemas en su uso: Los cambios de color que se dan anteriormente, pueden experimentar numerosas variaciones, especialmente en la fotografía a la gota, que necesita de focos de luz, para poder captar desde muy cerca las variaciones de color. Estos focos producen un cierto calentamiento del sistema, que alteran el producto iónico del agua4. De forma que al aumentar la temperatura, se desplaza hacia el lado alcalino la coloración ácida del indicador sensible a las bases, por lo que un cambio de color tendrá lugar a una concentración de OH- mayor que a la temperatura normal. Con indicadores sensibles a los ácidos, esta desviación de la región del viraje, se produce hacia el lado ácido. De esta forma el anaranjado de metilo que tiene una región de viraje entre pH 3,1 y 4,4 a 18ºC, pasa a ser entre 2,5 y 3,7, si la temperatura aumenta hasta los 80ºC. Muchos de los colores indicados en la tabla en la región descrita, se producen por mezcla de otros colores, como por ejemplo en el caso del azul de bromotimol, cuyos cambios de color se deben a las absorciones de la luz de las siguientes formas en equilibrio

4 El producto iónico del agua es 10-14, a 25ºC, lo que produce un pKw=14. Si la temperatura disminuye, el pKw aumenta, hasta 14,5 a 15ºC, y si la temperatura aumenta, el pKw disminuye hasta 13,5 a 40ºC, que son los márgenes de temperatura entre los que oscila las experiencias presentadas.

La aparición del color verde en el medio de la región, se debe a la combinación de los colores azul y amarillo de las formas en equilibrio entre pH 6 y 8. Lo mismo ocurre con las combinaciones azul y rojo que produce una tonalidad violácea, a pH elevado. En otros indicadores, como el anaranjado de metilo o naranja de metilo (del tipo diazoico), dado que el cambio de color es menos radical (rojo-amarillo), no se producirá este fenómeno.

Práctica con indicadores sintéticos. 1. Fucsina o fuchina. El mecanismo empleado es mismo descrito en Indicadores ácido-base 1. O sea se disponen en una caja Petri cuatro gotas, de ácido acético 1N, ácido sulfúrico 6N, hidróxido amónico 1N e hidróxido sódico 6N, aproximadamente en los vértices de un cuadrado, y en su centro la gota de indicador (fig.1). Cuando éste está disuelto en alcohol, deberá dejarse mas sitio dado que la gota por su menor tensión superficial tiende a extenderse. Se unen las gotas (fig.2), y se observa la difusión de los diferentes medios a través del indicador (fig. 3 y 4)

Fig. 1 Fig. 2

Fig. 3 Fig. 4

2. Violeta de metilo. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 5 a 8.

El violeta de metilo destaca por los colores brillantes que toma, cambiando de color varias veces en el intervalo de pH 0-14. Sin embargo estos cambios son una demostración clara de la mezcla de colores por ejemplo el verde por combinación de azul y amarillo.

Fig. 5 Fig. 6

Fig. 7 Fig. 8

3. Verde de metilo. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 9 a 12.

Fig. 9 Fig. 10

Fig. 12 Fig. 11

4. Anaranjado de metilo. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 13 a 16.

Fig. 13 Fig. 14

Fig. 15 Fig. 16

5. Rojo de metilo. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 17 a 20.

Fig. 17 Fig. 18

Fig. 20 Fig. 19

6. Rojo Congo. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 21 a 24.

Fig.21 Fig. 22

Fig. 23 Fig. 24

7. Rojo neutro. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 25 a 27.

Fig. 25 Fig. 26

Fig. 27

8. Fenolftaleína Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 28 a 31.

Fig. 28 Fig. 29

Fig. 30 Fig. 31

8. Verde brillante. Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 32 a 34.

Fig. 32

Fig. 34

Fig. 33

9.Azul de bromotimol Se sigue la misma técnica anterior obteniéndose la sucesión de fotos de las figuras 35 a 39. Obsérvese la aparición del color verde en la fig 38 Combinación del amarillo y azul , y del malva en La 39, por combinación de azul y rojo

Fig. 36

Fig. 37 Fig. 38

Fig. 35

Fig. 39

CESAR MILSTEIN, PREMIO NOBEL DE MEDICINA 1984 Autor: Dr. César Lorenzano Profesor Titular de la Universidad de Buenos Aires Coordinador de la Cátedra de Metodología de la Investigación

Director de la Maestría y Doctorado en Epistemología e Historia de la Ciencia de la Universidad Nacional de Tres de Febrero Una versión de este artículo fue publicado en Médico Interamericano,

publicación oficial del Colegio Interamericano de Médicos y Cirujanos con sede en Nueva York, en un número monográfico dedicado a científicos notables de habla hispana, en diciembre de 2000.

Ante la pérdida irreparable de César Milstein, la Cátedra de Metodología de la Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires, donde obtiene su doctorado en 1957, rinde homenaje a su memoria dándolo a conocer a la comunidad universitaria, en primer lugar, y todos aquellos que quieran saber quién fue César Milstein, cómo vivió, y cuáles fueron sus aportes principales a la ciencia. Nos deja el recuerdo de su sabiduría, de su tesón como investigador, su integridad como hombre y ciudadano del mundo.

Incluimos asimismo una copia de la carta que el Dr. Milstein me hizo llegar comentando el articulo.

Introducción

El Dr. César Milstein obtiene en 1984 el Premio Nobel de Medicina, junto con su cercano colaborador, el Dr. George J. F. Köhler, por “el descubrimiento del principio que rige la producción de anticuerpos monoclonales”, y con el Dr. Niels Jerne, autor de al menos tres teorías fundamentales en inmunología, “que conciernen a la especificidad en el desarrollo y el control del sistema inmune”.1

Un currículum abreviado que muestre los principales hitos de su carrera hasta la fecha en que realiza el descubrimiento que le vale el Premio Nobel, nos dice que:

i. nace en Bahía Blanca, Argentina, el 8 de agosto de 1927;

1Los párrafos entrecomillados corresponden a la presentación de los Premios que hace la Fundación Nobel. El Dr. Köhler nace en la República Federal de Alemania en 1946, y llega a trabajar en el laboratorio de Milstein desde el Instituto de Inmunología de Basel, en Suiza, muriendo tempranamente en 1995. El Dr. Jerne, originario de Dinamarca, donde nace en 1911, realizó su obra principalmente en el Instituto de Inmunología de Basel. Muere en 1994. Su teoría acerca de la selección natural aplicada a la formación de anticuerpos indica que los individuos poseen anticuerpos para todos los antígenos hacia los cuales puede responder; cuando un antígeno entra al organismo, selecciona el anticuerpo correspondiente, uniéndose a él, lo que estimula su producción específica. Este punto de vista, que rompe con la visión anterior de que antígenos hacen que se produzcan los anticuerpos correspondientes, es el inicio de la moderna inmunología celular. Su segunda teoría nos muestra cómo el sistema inmunológico madura bajo la influencia de los antígenos endógenos, y cómo la rápida multiplicación de las células linfáticas lleva a acumular mutaciones que dan cuenta de nuevas especificidades inmunológicas. La tercera teoría predice cómo la respuesta inmune se encuentra regulada por una compleja red de anticuerpos y anti anticuerpos. Véase: Press Release: The 1984 Nobel Prize in Physiology or Medicin. Nobelförsamlingen Karolinska Institute. The Nobel Assembly at the Karolinska Institute Octubre de 1984.

1

ii. en 1944 completa sus estudios de Bachiller en Bahía Blanca; iii. en 1945 ingresa a la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de

Buenos Aires, obteniendo en 1952 el título de Licenciado en Ciencias Químicas;

iv. en 1952 comienza a investigar en el Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Buenos Aires, y culmina esta etapa de su vida con el grado académico de Doctor en Química en 1957;

v. ese año entra como miembro del grupo de investigadores del Instituto Nacional de Microbiología Dr. Malbrán, del que se ausenta en 1958 para ir al Departamento de Bioquímica de la Universidad de Cambridge, gracias a una beca del British Council;

vi. en 1960 obtiene el Doctorado de la Universidad de Cambridge, donde permanece un año más como investigador del Departamento de Bioquímica;

vii. en 1961, regresa como Jefe de la División de Biología Molecular al Instituto Nacional de Microbiología de Buenos Aires, donde permanece hasta 1963;

viii. ese año, regresa a Cambridge como miembro del equipo de investigación del Laboratorio de Biología Molecular, en el que realiza sus investigaciones mayores;

ix. en 1975 publica, junto con Köhler, las investigaciones que lo llevaron a obtener el Premio Nobel.2

En esta apretada síntesis no encuentra su lugar aquello que caracteriza a Milstein

como hombre y como investigador: sus orígenes, sus sueños, sus hallazgos y sus tropiezos.

En las páginas que siguen trataremos de dar una visión de su trayectoria personal e intelectual, desde sus comienzos hasta la obtención del Premio Nobel.

Milstein, el hombre3

El padre de Milstein era un inmigrante judío de origen ruso, que llega -solo- a Argentina con quince años recién cumplidos, a realizar el viejo sueño que compartieron millones de inmigrantes de diferentes orígenes, de vivir y progresar en una tierra nueva. Se casa hacia 1923 con una muchacha que había nacido en las colonias judías agrarias de Entre Ríos, Argentina. Viajante de comercio el padre, maestra de escuela la madre, compartían ideales socialistas y libertarios, y desarrollaban actividades culturales en medios judíos y laicos. Tuvieron tres hijos -César era el segundo-, a los que con grandes sacrificios enviaron a la Universidad.

Milstein reniega de su vida de pueblo chico en Bahía Blanca durante largos años, al cabo de los cuales, retrospectivamente, comienza a apreciar recordando sus lecturas en la Biblioteca Nacional, bien provista, y generosamente abierta, sus inicios como integrante de un coro, que continúa en Buenos Aires en el Collegium Musicum, y que hizo de la música parte de su vida. Y sobre todo, las clases de su profesor de química inorgánica en cuarto año del bachillerato, que le revelaron la belleza de la química y de las fórmulas que expresan su estructura.

2 Milstein, César. Curriculum Vitae. Manuscrito. 1989. 3 Milstein, César, Autobiography, en: Press Release. op. cit. 1984. Milstein, César, Entrevista, en: Barón, A., del Carril, Mario y Gómez A. Por qué se fueron. EMECE. Buenos Aires. 1995

2

Es posible que este sea el motivo por el cual, en su currículum vitae de 1989, incluya entre los premios, las distinciones, las membresías a las más altas sociedades internacionales, el ser nombrado en 1985 miembro honorario de las modestas Sociedad de Medicina Interna y Asociación Médica de su lejana Bahía Blanca natal.

A los 18 años se incorpora a la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de Buenos Aires, una institución sólida y con buenos profesores. Insiste Milstein en que no era un estudiante brillante; sin embargo, las clases prácticas intensivas para pocos alumnos que caracterizaban a la Facultad, lo formaron sólidamente aunque concentraba los períodos de estudio únicamente en las épocas de exámenes. Como muchos de su generación, se encontraba profundamente interesado en la sociedad, y en la posibilidad de cambiarla. La Reforma Universitaria de 1918, ese intenso movimiento estudiantil que cambió de raíz a la universidad argentina, y que extendió su ideario generoso por toda América, estaba viva en los estudiantes que la reivindicaban. Entre ellos se cuenta Milstein, que milita en el Centro de Estudiantes, llegando a ser su Presidente. El idealismo libertario de aquellos días persiste en su ausencia de ambición de poder, y en el trato igualitario que lo caracteriza. En algún momento expresó que si decidió ser científico, es porque la ciencia no da poder. Es probable que detrás del científico maduro que logra uno de los hallazgos con mayores consecuencias tecnológicas, y sin embargo deja que sea utilizado por todos aquellos que lo necesiten, sin trabas legales ni patentes excluyentes -renunciando a las riquezas que implica- se encuentren, intactas sus convicciones de juventud.

Una vez recibido, comienza a trabajar en la Facultad de Medicina con el Dr. Andrés Stoppani, un brillante bioquímico que lo acoge a su lado -por otra parte, el único científico argentino que cita en su Autobiografía Nobel-, en las consabidas precarias condiciones de los laboratorios argentinos de entonces, y que pese a ser el único profesor de dedicación exclusiva, bordeaba la pobreza. La modestia era un sello de marca de los científicos argentinos: cuenta Milstein que cuando quiso comenzar a investigar, fue a entrevistarse con el Dr. Federico Luis Leloir, quien años después obtendría el Premio Nobel de Química; al llegar al laboratorio, no reconoce al científico renombrado en ese individuo delgado, de guardapolvo gris, al que interpela como si fuera el encargado del edificio –en un estado lamentable, por otra parte-.

Se casa en 1953 con Celia, una compañera de estudios con la que comparte en las épocas de estudiante interminables caminatas en los legendarios -entre los universitarios argentinos- campamentos de Bariloche organizados por el Centro de Estudiantes de Química, o las remadas por los riachos de Tigre. Realizan con muy pocos recursos un viaje -iniciático- a Europa, viviendo en albergues de estudiantes, en casas de amigos, con la mochila y la carpa a cuestas, hasta llegar a Israel, donde trabajan en un kibutz.

Sin ningún apoyo económico -trabajando él y su esposa en un laboratorio de análisis clínico para subsistir- prepara su tesis de doctorado sobre cinética de enzimas, a raíz de la cual publica varios trabajos, uno de ellos en una revista del exterior.

Casi simultáneamente luego de doctorarse, gana un concurso en el Instituto Nacional de Microbiología “Dr. Malbrán” y una beca del British Council. Le guardan el puesto en el Instituto -incluso pagándole el sueldo- mientras permanece en Cambridge.

Una vez en Inglaterra, un suceso inesperado cambia su perspectiva de la ciencia. El supervisor que tenía asignado, Malcom Dixon, le propone muy vagamente un tema de investigación, mas no lo supervisa en su trabajo. Milstein comienza a investigar los mecanismos de la activación por metales de la enzima fosfoglucomutasa (no es ocioso recordar que las minuciosas investigaciones acerca una coenzima para la fosfoglucomutasa inician la secuencia de trabajos que condujeron al Dr. Leloir al

3

premio Nobel). Esto hace que entre en contacto con un joven premio Nobel, Frederick Sanger, quien trabaja en enzimas proteolíticas, el que le insiste que repita un experimento, aunque ya estuviera hecho, y su preparación tardara largos quince días. La insistencia de Sanger hace que invente un método por el cual los resultados se obtienen en un solamente un día, en vez de quince. Dice Milstein que en este momento abandona la cinética y se dedicó a la química de proteínas. En corto tiempo termina su tesis de doctorado, a la que añade sus nuevos hallazgos. Sus trabajos tienen repercusión internacional, publicando sus resultados en seis o siete artículos en revistas de primera línea, dos de ellos en colaboración con Sanger4.

Varios motivos inciden para que decida en 1961 volver a radicarse en la Argentina. Al compromiso moral que tenía con el Instituto se une al hecho de que luego de 1955 se funda el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONICET- bajo la presidencia del Dr. Bernardo Houssay, el gran investigador argentino, iniciándose una etapa de un fuerte impulso para la investigación científica.

Además, el Instituto Nacional de Microbiología le ofrece la oportunidad de encabezar su propio grupo de investigación como Jefe de División de Biología Molecular. Tiene 33 años, y trae al país una intensa experiencia, y un incipiente, pero sólido prestigio científico.

Ya en el Instituto Malbrán realiza con su equipo trabajos de primer nivel; tanto, que Fritz Lippman, un premio Nobel, que investiga dentro del mismo campo de estudios, le escribe desde los Estados Unidos que quería ver lo que hacían en el laboratorio, pues estaban obtenido resultados que sobrepasaban los suyos. Cuando en 1963 llega Lippman a Buenos Aires a dar un seminario en el Instituto, éste se encuentra intervenido, un comité de investigaciones persigue a su director, el Dr. Piroski, y había gente dejada cesante. Milstein niega toda autoridad a quienes interrogan inquisitorialmente a los investigadores, y renuncia cuando dejan cesante a cuatro miembros de su equipo. Pese a contar con todo el apoyo de Houssay y Leloir, la renuncia no tuvo ningún efecto sobre las autoridades. Es bueno recordar -para su vergüenza- que el Dr. Tuburcio Padilla, Ministro de Salud Pública del gobierno civil controlado por los militares del Dr. José María Guido, hace esperar más de cuarenta minutos en su antesala al Dr. Leloir cuando lo visita para pedirle que no dejara ir a Milstein, pues si no se desarmaba un importantísimo equipo de investigaciones. El ministro solo contesta -obtuso- “que pase lo que tenga que pasar”. Antes de eso, en una visita al Instituto, sugirió que los investigadores se fueran del país, ya que “acá no se puede hacer nada”.

Milstein, que no tenía “la piel de elefante que hay que tener para aguantar lo que viniera en esa universidad, en ese país” -como se lo dijo el eminente científico Dr. De Robertis5- y conservaba la dignidad de sus épocas de militante estudiantil, regresó a Cambridge, donde se reencuentra con Frederick Sanger, quien había sido nombrado Jefe de División de Química de las Proteínas en el recién formado Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigaciones Médicas. El reencuentro es crucial, pues lo pone en la línea de investigación que lo lleva al premio Nobel, abandonando el campo de la bioquímica para adentrarse en la inmunología.

4Milstein, C., Sanger, F. The amino acid sequence around the serine phosphate in phosphoglucomutase. Biochim. Biophys 1960. Acta 42. 173-174. Milstein, C., Sanger, F. an amino acid sequence in the active center of phosphoglucomutase. Biochem. J. 1961; 79: 456-469. 5 La cita es textual, y se encuentra en Milstein, C. “Entrevista”. op. cit. 1995.

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A partir de ese momento, el Milstein hombre se identifica con el Milstein científico. Esta etapa de su vida es la que vamos a narrar a continuación. Ya un científico maduro, la estabilidad académica de Cambridge le brinda una tranquilidad por la cual, pasados los años mozos, su existencia transcurre sin sobresaltos.

Puede, por fin, dedicarse exclusivamente a investigar en Inglaterra, donde en su juventud supuso se hacía la mejor ciencia del mundo. El lugar por el que transitaron antes que él quien fue el primero en enseñarle lo que es la ciencia, el Dr. Stoppani, y el Dr. Leloir, que trajeron consigo la manera inglesa de hacer ciencia, que tan bien se adapta a las austeras condiciones argentinas, y que consiste en profundizar en un puñado de temas elegidos, con pocas herramientas técnicas -en contraste con tradiciones que privilegian el ataque de los problemas con una inversión grande en tecnología-. Leloir, además, recomendaba eludir los temas que se hubieran trabajado extensamente, donde para avanzar era necesario dominar una literatura inmensa, y buscar aquellos problemas sobre los que no se había escrito mucho, y en los cuales se pudiera trabajar directamente.

Con todo, no olvida a ese país en el que transcurrió su juventud, en el que “aprendió las canciones de cuna”6; ese país que maltrata y expulsa a sus científicos; que los forma aunque restrinja luego sus oportunidades de investigar, y vuelve, una y otra vez, a brindar su consejo y su apoyo cada vez que es convocado por sus amigos, sus colegas o un gobierno democrático.

Los anticuerpos monoclonales

Para el Instituto Karolinska de Suecia, en su sucinta presentación de los Premios Nobel de 1984, el reconocimiento a la obra de Milstein y Köhler se debe a, como mencionáramos, “el descubrimiento del principio que rige la producción de anticuerpos monoclonales”, que se concreta en la “técnica del hibridoma, que representa el avance metodológico más importante en el campo de la biomedicina durante los setentas”, con importantes consecuencias tecnológicas para el tratamiento y el diagnóstico.

Sin embargo, el lenguaje técnico con el cual se refieren a las investigaciones de Milstein no puede opacar el deslumbramiento que produce un hallazgo que entronca con al menos dos de las líneas de investigación más caras dentro de la historia de la biología en general, y de la inmunología en particular. Tampoco ocultar que se realiza en el seno de investigaciones básicas relevantes y originales, y que a su vez revierte sobre los temas más básicos de la ciencia. No es una simple herramienta tecnológica, ni una manera de hacer más fácilmente lo que la naturaleza hace por sí sola, sino que es un resultado inscripto en conocimientos básicos avanzados, que redunda en un dispositivo tecnológico -artificial, como toda tecnología- que a su vez hace avanzar aún más las investigaciones.

A fin de presentarlas, voy a relatar primeramente el problema teórico que se intentaba resolver, y para cuya solución se crean esos instrumentos técnicos que son los anticuerpos monoclonales y su producción; a continuación, mostraré en qué consiste dicho hallazgo y cuáles son sus consecuencias tecnológicas y científicas, para concluir indicando las grandes tradiciones de investigación a las que continúa, y que despertaron

6 La frase la pronuncia Milstein en la entrevista publicada en el libro Los que se fueron, refiriéndose a que nunca conocerá las canciones de cuna inglesas, en respuesta a la pregunta sobre su sentimiento de pertenencia a Inglaterra, luego de tantos años de residencia en Cambridge.

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la adhesión de sus colegas, al coincidir con problemas hondamente sentidos por la comunidad de investigadores biomédicos.7

Los anticuerpos y su producción natural Es sabido desde el principio de las investigaciones inmunológicas que los

animales reconocen un cuerpo extraño –antígeno-, sea una bacteria, un virus o una sustancia aislada, y lo neutralizan o lo destruyen con sus anticuerpos. Se sabe asimismo que esta respuesta es específica para cada sustancia, y que la misma es elaborada por los linfocitos, esas células blancas de la sangre, bazo, timo y ganglios, también de manera específica. Dado que los antígenos son numerosos –a decir verdad, millones de sustancias pueden comportarse como tales-, los anticuerpos son igualmente numerosos, y por lo tanto, hay millones de linfocitos que difieren sólo en el anticuerpo que producen. Cuando una sustancia ingresa al organismo, aquellos linfocitos que se encuentran capacitado para producir el o los anticuerpos que la neutralizan, comienzan a reproducirse y a producir cantidades cada vez mayores del anticuerpo específico. Puesto que todas son hijas idénticas de un mismo linfocito -pertenecen a una misma línea de linfocitos- se denominan clones, y el anticuerpo, producido por una única variedad de clones, monoclonal.

La forma natural de reaccionar que tiene un organismo ante la invasión de una sustancia extraña, es reproduciendo la estirpe específica de linfocitos, a fin de que produzcan anticuerpos monoclonales.

¿Cómo es posible que en el organismo exista tal diversidad de linfocitos, preparados para responder a sustancias frente a las cuales el organismo nunca se enfrentó anteriormente? Una respuesta posible consiste en decir se encuentra predeterminado por el código genético, y que en consecuencia, existen numerosísimos segmentos de ADN destinados a darles origen, quizás tantos como el número de los linfocitos que difieren por su secreción de anticuerpos.

Cuando Milstein comienza a investigar, esta respuesta no es viable, puesto que se conoce que los anticuerpos poseen una porción constante para todos los anticuerpos, y una porción variable –formada por dos cadenas de sustancias, una liviana y otra pesada- unidas por puentes de disulfuro. Al menos la porción constante provendría de una única secuencia de ADN.8

Ahora bien. Hacia 1970, Milstein pensó que si existía una porción constante, y las porciones variables o hipervariables podían ser reducidas a unas pocas familias o grupos de secuencias9, provenientes de un número relativamente pequeño de genes individuales, la respuesta correcta a la diversidad de los anticuerpos debía consistir en mutaciones somáticas, ocurridas durante el proceso mediante el cual se generan los linfocitos. A fin de investigar esta hipótesis, decide estudiar la posibilidad de 7 Se tomaron como referencia para elaborar esta síntesis de la labor de Milstein básicamente los siguientes trabajos: Milstein, César. “From Antibody Structure to Inmunological Diversification of Inmune Response”, en: Science. 14 March 1986. Vol. 231: 1261-1268. Milstein, César. Main points of my research in Immunology. Manuscrito 1989. Milstein, César. “Monoclonal antibodies”, en: Scientific American. 1980. 243. No. 4: 56-64. 8 La sugerencia de que la unión los elementos de las porciones que forman un anticuerpo lo hacía moléculas de disulfuro fue la primera intuición de Milstein en este campo. Véase: Frangione, B., Milstein, C., y Pink, J.R.L., “Structural studies of inmunoglubin G”, en: Nature 1969; 221: 145-148. En este artículo se establece la estructura de los puentes de disulfuro. 9 Milstein, C. “Linked groups of residues in inmunoglobin chains”, en: Nature 1967; 216: 330-332. En este artículo se establece la existencia de familias básicas o subgrupos en la región variable e hipervariable.

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mutaciones en un cultivo de células de mieloma, un tumor cuyas células poseen la particularidad de producir una proteína, una inmunoglobulina, que aunque posee la estructura de un anticuerpo, no actúa frente a ningún antígeno. Precisamente esta cualidad hizo que fueran elegidas para los estudios, una vez que fueron excluidos los propios linfocitos como célula experimental por su conocida incapacidad de mantenerse y reproducirse en un medio de cultivo el tiempo necesario para encontrar en la sucesión de las generaciones a las supuestas mutaciones.

Sin embargo, a partir de este momento aparece un interesante problema metodológico, que puede ser planteado de la siguiente manera. La forma de saber si se ha producido una mutación, es detectando cambios en la proteína que producen los mielomas. Pero la complejidad de su estructura química hace inviable su análisis detallado, por lo que la respuesta no podía provenir únicamente de la química de proteínas. Tampoco podía estudiarse su acción como anticuerpo, pues no la poseen.

Dadas estas condiciones, se imponía la necesidad de contar con una línea de células que segregue una inmunoglobulina que exhiba una actividad de anticuerpo, y que ésta sea fácilmente detectada, a fin de investigar las mutaciones en su sector variable. Era evidente que no existía tal línea de células.

Si recapitulamos, la preocupación teórica esencial consiste en averiguar cómo es posible la diversidad de la respuesta inmunológica, a cargo de anticuerpos específicos y cómo se generan los linfocitos que los producen. El camino para probar la existencia de mutaciones que den cuenta de la variabilidad inmunológica, llevó, inesperadamente, a plantear la necesidad de un método de detección de los mutantes que no fuera el análisis químico de los anticuerpos que producen. Este método fue el de los hibridomas, y la consecuente producción de anticuerpos monoclonales a voluntad.

Hibridomas y anticuerpos monoclonales La propia lógica de la investigación de mutantes en cultivos de células

mielomatosas, cuyo paso posterior fue fusionar dos tipos de células de mieloma y mostrar que el híbrido resultante produce inmunoglubulinas de ambas células progenitoras10, lleva gradualmente a su mayor descubrimiento.

Corre el año 1973, cuando al conocer estos resultados, George Köhler se incorpora como becario al equipo de Milstein. El camino que finalmente encuentran para proseguir las investigaciones, es el de producir ellos mismos la línea de células que buscan. Una tarde en que Milstein y Köhler conversan acerca de unas experiencias en las cuales diversos virus infectan a los linfocitos, transformándolos en células tumorales, pensaron si no fuese posible que una fusión entre un linfocito y una célula tumoral diera por resultado esa célula que necesitaban.

Esa misma noche Köhler, siguiendo las indicaciones de Milstein, puso en marcha el experimento. A la mañana siguiente, comprueba que se había producido un híbrido de mieloma y de linfocito, un hibridoma –como se denomina al híbrido de mieloma- que elabora anticuerpos.11

El hibridoma toma del mieloma la posibilidad de reproducirse indefinidamente en un medio de cultivo, y del linfocito, la de producir anticuerpos.

10 Cotton, R.G.H., Milstein, C. “Fusion of two inmunoglobulin-producing myeloma cells”, en: Nature 1973, 197; 3: 244: 42-43. En este artículo se presenta la primera hibridación exitosa de células de mieloma. 11 Los resultados fueron comunicados en: Köhler, G., Milstein, C., “Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumour lines by cell fusion”, en: European Journal of Immunology 1976; 6: 511-519.

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Se abre la posibilidad de producir anticuerpos a voluntad, y en cantidades considerables, si se parte de la hibridación con una línea de linfocitos dada, puesto que la capacidad de producir anticuerpos la comparte toda su descendencia monoclonal.

El procedimiento, a grandes rasgos, es el siguiente: se inmuniza a un ratón con un antígeno dado. Se toman a continuación de su bazo los linfocitos que producen los anticuerpos correspondientes, y se los fusiona con células mielomatosas, para originar un conjunto de hibridomas, que se cultivan en delante de manera indefinida.

Fig. Primera Fase del procedimiento

Pero todavía no es un conjunto monoclonal. Esto es así, puesto que un agente

antigénico dado -sea simple o complejo- provoca la producción de diversos anticuerpos dirigidos contra él. Como cada uno de estos anticuerpos es segregado por una línea diferente de linfocitos, el primer cultivo de hibridomas resulta una mezcla de líneas diversas.

El siguiente paso consiste en aislar híbrido por híbrido -detectándolos por sus anticuerpos- y cultivarlos separadamente. La estirpe que resulta de cada uno de ellos, es efectivamente monoclonal, y produce un sólo tipo de anticuerpo, que puede recolectarse en el medio de cultivo. Si el clon se inyecta a un ratón, éste desarrolla un tumor que produce cantidades grandes de anticuerpo, susceptible de ser aislado del suero del animal, o del líquido de ascitis.

Sorprendentemente, el resultado que se obtiene mejora las condiciones en las que se desenvuelve la anterior selección natural, pues mientras que sólo el uno por ciento de los linfocitos que se usan en la fusión segregan anticuerpos, cerca del diez por ciento de los hibridomas lo hacen, mejorando notablemente su selección.

Si bien es cierto que se seleccionan híbridos que fabrican anticuerpos de ciertas propiedades deseadas, si el animal del que se obtienen los linfocitos no los produce aunque se lo haya inmunizado previamente, no hay forma de inmortalizar su elaboración. Afortunadamente, puntualiza Milstein, se puede ir más allá. La ingeniería genética permite modificar los anticuerpos, y fabricar nuevas variaciones que son, a su vez, elaborados por los hibridomas, construyéndolos a medida de los antígenos que se desea neutralizar.

Fig. 2. Segunda Fase del procedimiento

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Finalmente habían obtenido una línea de células que producía un anticuerpo

específico, y podían utilizarla para explorar los mutantes de la región hipervariable de los anticuerpos. Sin embargo, la lógica propia del descubrimiento llevaría rápidamente a explorar otros horizontes.

Las consecuencias tecnológicas y científicas Casi inmediatamente fue evidente que la capacidad de producir anticuerpos a

voluntad podía utilizarse para fines diagnósticos, de purificación de sustancias, terapéuticos, o de investigación básica.

El primero de los caminos explorados por Milstein, tiene que ver con la producción de reactivos estándar tales como los antígenos para anti-histocompatibilidad y para grupos sanguíneos.12 Luego se desarrollarían técnicas adecuadas para diagnosticar diversas enfermedades virales, bacterianas, parasitarias, inmunológicas, etc.

Otra particularidad de la técnica consiste en que hace posible desentrañar la composición exacta de una mezcla “sucia” de elementos, aislando cada uno de ellos. Una de las pruebas más exigentes a las que se la sometió fue el aislamiento y purificación de interferón, una sustancia de difícil identificación con medios

12 Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, C.W., Howard, J.C. “Antibodies to major histocompatibility antigens produces by hybrid cell lines”, en: Nature 1877; 266: 550-552. Voak, D., Sacks, S., Anderson, T., Takei, F., Lennox, E.S., Jarvis, J.M., Milstein, C., Darnborough, J., “Monoclonal anti-A from a hybrid mieloma: Evaluation as a blood grouping reagent”, en: Vox. Sang. 1980; 39: 134-140.

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convencionales, y que luego fue utilizada en gran escala por la industria biofarmacéutica.

En cuanto a las posibilidades terapéuticas que se abren a partir de las investigaciones de Milstein, cabe mencionar las que hacen al tratamiento de tumores, y a los problemas de rechazo observados en transplantes.

Es posible, sin embargo, que pese a las enormes consecuencias “tecnológicas”, utilitarias, de la máquina biológica de producir anticuerpos monoclonales, una de sus mayores contribuciones sea para la investigación básica.

Podríamos citar la posibilidad de establecer la estructura de las membranas celulares; de arrojar nueva luz sobre la teoría de cómo los anticuerpos se ligan a los antígenos y originan un precipitado en los tubos de ensayo, así como nuevas interpretaciones acerca de la reacción antígeno-anticuerpo; de utilizarlos en estudios embriológicos, de receptores para hormonas, o de neurotransmisores.13

En el camino de las mejores tradiciones Es probable que en la visión del jurado de la Academia de Ciencias que otorgó

el premio Nobel a Milstein y a Köhler hubiera algo más que el reconocimiento al descubrimiento de la producción de anticuerpos monoclonales, de indudables valores intrínsecos. El mismo lenguaje con el que se describe la técnica, o se encabeza su descripción general –empleando términos por otra parte ya utilizados por el propio Milstein en sus artículos- es altamente sugestivo de un valor simbólico adicional. Se lee, así que “ellos inmortalizaron células que producen anticuerpos fusionándolas con células tumorales”, o que el hibridoma es “una técnica para la eterna producción de anticuerpos monoclonales en células cultivadas”. Milstein en reiteradas ocasiones menciona los términos inmortal, inmortalizar o inmortalidad para referirse a los anticuerpos o a los hibridomas, en expresiones tales como: “inmortalizar las células del ratón”, “inmortalizar la expresión de las células plasmáticas”, “aparentemente estábamos consiguiendo selectividad junto con inmortalidad”, “el híbrido resultante era una célula inmortal capaz de expresar la actividad de producir anticuerpos de la célula paterna, y la inmortalidad adquirida del mieloma”, “inmortalizamos el anticuerpo en forma de un híbrido de mieloma”, etc.14

Para la biología, la ciencia de la vida, su perduración no es un asunto trivial. Ya Alexis Carrel, premio Nobel de medicina en 1912 por sus avances técnicos en cirugía vascular, había sorprendido al mundo científico manteniendo en cultivo por tiempo indefinido un tejido embrionario de pollo. La posibilidad de inmortalizar la capacidad de producir anticuerpos entronca con esta tradición de investigación biológica, que abreva además en terrenos preparados por mitologías ancestrales.

La segunda tradición que continúa Milstein se encuentra en los orígenes de la inmunología, expuesta posiblemente por vez primera por Paul Ehrlich, cuando expresa que “las sustancias inmunes, a la manera de balas mágicas, buscan al enemigo”. La asombrosa capacidad de la técnica de anticuerpos monoclonales para identificar y producir todo tipo de anticuerpos, lleva consigo el viejo sueño de la “bala mágica”, la búsqueda interminable del remedio preciso que da en el blanco de la enfermedad, dejándola fuera de combate, pero que al mismo tiempo respeta los componentes sanos del organismo, a su más alto nivel.

13 Cuello, A.C., Galfre G., Milstein, C., “Detection of substance P in the central nervous system by monoclonal antibody”, en: Proc. Natl. Acad. Science 1979, USA; 76: 3532-3536. 14 Estas expresiones figuran en: Milstein, C. (1980), Milstein, C. (1986), y Karolinska I. (1984)

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Cuando Ehrlich habla de esta manera, no se refiere únicamente a la especificidad de los anticuerpos, que la recién fundada teoría inmunológica explica tan bien. Se refiere asimismo a esa “bala mágica” que es la quimioterapia, de quien fue el iniciador, cuando utiliza la afinidad que tienen los colorantes con las diversas estructuras celulares, una propiedad que posibilita su tinción en los preparados histológicos, distinguiéndolas, para buscar sustancias –asimismo colorantes en un comienzo- que posean la misma selectividad con respecto a los microorganismos y a sus toxinas. Así se descubrieron el rojo Trypan, destinado a destruir al tripanosoma de la enfermedad del sueño, o el Salvarsán, para la sífilis: utilizando sistemáticamente las afinidades de los colorantes químicos para fabricar artificialmente sustancias que actúan como antígenos, hasta llegar al Prontosil, la primera de las sulfamidas.

Comenta agudamente George Canguilhem que “una nueva técnica sustituye la extracción de sustancias por la producción de productos: no hay quimioterapia sin una sociedad científica, sin una sociedad industrial”, y a su vez cita a Bachelard, quien dice que “quien fabrica la anilina (el colorante por antonomasia de entonces) conoce la realidad y la racionalidad de los colores”.15 Ya Pasteur habría conocido la modificación experimental de los productos naturales como un recurso teórico de análisis de lo real, con los problemas técnicos que involucra.

Canguilhem nos muestra dos hechos que subyacen al descubrimiento de la quimioterapia. En primer lugar, las estrechas relaciones entre el desarrollo de la sociedad, y el descubrimiento científico. La sociedad industrial lleva en su lógica a la producción de las anilinas, y de allí –utilizándolas- a la producción artificial de antitoxinas. Sin las condiciones de posibilidad que le brinda, esto es imposible. En segundo lugar, y de manera más provocativa, que para desentrañar los secretos de un fenómeno natural, es central reproducirlo artificialmente, mediante estructuras que no existen en la naturaleza.

De la misma manera, es a través de una estirpe artificial de células monoclonales que fabrican anticuerpos a pedido, como se posee la clave para comprender la complejidad de los anticuerpos, y de las estructuras antigénicas que la genera.

En este sentido, más profundo que el de la metafórica bala mágica, la obra de Milstein continúa, por otros medios, la tradición de los fundadores de la inmunología. En su Conferencia Nobel, expresa acorde con la misma: “Mientras que la selección es la estrategia de la respuesta de anticuerpos de un animal, la inmunoquímica del futuro volverá a una clase de aproximación similar a la de la teoría de la instrucción (la que decía que el anticuerpo era fabricado a medida del antígeno) en la que el antígeno nos dirá cuál es la estructura del anticuerpo que construiremos”16.

Son palabras en las que se trasparenta un viejo anhelo que proviene de los albores de la inmunología.

BIBLIOGRAFÍA

15 Canguilhem, George (1986), pp. 70-71. Bachelard, Gaston (1953) p. 202. Véase asimismo: Silverstein, A. (1989) 16 Milstein, C. (1986) op. cit. p. 126.

11

Bachelard, Gaston, (1953), Le matérialisme rationnel, PUF. Paris. Canguilhem, George (1986), “L´effet de la bacteriologie dans la fin de “Théories Médicales” u XIXe siècle”, en Canguilhem G., Ideologies scientifiques et medicales, PUF, París. Cotton, R.G.H., Milstein, C. (1973), “Fusion of two inmunoglobulin-producing myeloma cells”, Nature, 197, 3, pp. 244: 42-43. Cuello, A.C., Galfre G., Milstein, C. (1979), “Detection of substance P in the central nervous system by monoclonal antibody”, Proc. Natl. Acad. Science, 76, pp. 3532-3536. Frangione, B., Milstein, C., y Pink, J.R.L. (1969), “Structural studies of inmunoglubin G”, Nature, 221, pp. 145-148. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, C.W., Howard, J.C. (1977), “Antibodies to major histocompatibility antigens produces by hybrid cell lines”, Nature, 266, pp. 550-552. Köhler, G., Milstein, C., “Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumour lines by cell fusion”, en: European Journal of Immunology 1976; 6: 511-519. Milstein, C. (1967), “Linked groups of residues in inmunoglobin chains”, Nature, 216, pp. 330-332. Milstein, C. (1980) “Monoclonal antibodies”, Scientific America, 243, No. 4, pp. 56-64. Milstein, C. (1984), “Autobiography”, Press Release, op. cit. Milstein, C. (1989), Main points of my research in Immunology, manuscrito. Milstein, C. (1995), “Entrevista”, en Barón, A., del Carril, Mario y Gómez A., Por qué se fueron, Buenos Aires, EMECE. Milstein, C. (14 March 1986), “From Antibody Structure to Inmunological Diversification of Inmune Response”, Science, vol. 231, pp. 1261-1268. Milstein, C., Sanger, F. (1960), “The amino acid sequence around the serine phosphate in phosphoglucomutase”, Biochimistry. Biophys, Acta 42, pp. 173-174. Milstein, C., Sanger, F. (1961) “An amino acid sequence in the active center of phosphoglucomutase”, Biochemtry Journal, 79, pp. 456-469. Nobelförsamlingen Karolinska Institute. The Nobel Assembly at the Karolinska Institute (Octubre 1984), “Press Release: The 1984 Nobel Prize in Physiology or Medicin”. Silverstein, A. (1989), “Magic Bullets and Poisoned Arrows: The Uses of Antibody”, en: Silvertein A. A History of Immunology. Academic Press. San Diego. 1989. Voak, D., Sacks, S., Anderson, T., Takei, F., Lennox, E.S., Jarvis, J.M., Milstein, C., Darnborough, J. (1980), “Monoclonal anti-A from a hybrid mieloma: Evaluation as a blood grouping reagent”, Vox. Sang., 39, pp. 134-140.

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Teoría de la red idiotípica (1984) Niels Kaj Jerne (1911-1994)

HIPOTESIS DE JERNE: Teoría de la red idiotípica.

Algunas porciones variables del Ac (IDIOTIPOS) pueden comportarse como determinantes antigénicos.• Los Ac anti-idiotipo actúan de reguladores de la actividad del idiotipo y de los TCR (linfocitos T)•

Según la teoría de la red de Jerne, frente a los idiotipos se formarían anticuerpos que al unirse a los mismosformarían un entramado (?red?) de anticuerpos unidos a otros anticuerpos que tendrían como acción final laregulación del proceso de síntesis de nuevas inmunoglobulinas. Cada uno de los idiotipos se encuentrarepresentado en tan pequeña cantidad que pasa desapercibido para el sistema inmune, sin embargo, cuando undeterminado clon de células B reconoce su antígeno especifico, prolifera, se diferencia a célula plasmática yproduce una gran cantidad de inmunoglobulinas de una misma especificidad, sus determinantes idiotipicospasaran a encontrarse en mucha mayor cantidad y ahora sí darán lugar a una respuesta de anticuerpos contra ellos,anticuerpos anti-idiotipo, que podrán unirse a las inmunoglobulinas que ocasionaron su generación. La unión delos anticuerpos anti-idiotipo al idiotipo que los origino podrá dar lugar al bloqueo de las inmunoglobulinassolubles que compartan ese idiotipo o unirse a las inmunoglobulinas de membrana presentes en linfocitos B de lamisma especificidad, o incluso a las regiones hipervariables del receptor para el antígeno de la célula T quereconocen ese mismo antígeno, con efectos en cada uno de los casos inhibidores o estimuladores.

Los idiotipos se encontraron mediante estudios serológicos, al observarse que cuando en un conejo se inyectabananticuerpos antisalmonella de otro conejo del mismo alotipo, producían anticuerpos que reaccionaban con elanticuerpo inyecta−do, incluso aunque los dos conejos fueran genéticamente idénticos. Estos anticuerposanti-idiotipo, en la mayoría de los casos, están dirigidos contra la estructura exclusiva de la porción fijadora deantígeno y por tanto solo reconocen a inmunoglobulinas de la misma especificidad, sin embargo en algunos casos,los anticuerpos anti-idiotipo pueden estar dirigidos contra zonas de la región hipervariable distintas de la porciónfijadora del antígeno y en este caso podrán unirse a inmunoglobulinas de varias especificidades distintasregulando la respuesta inmune frente a varios antígenos.

Ésta teoría está relacionada con la regulación de la respuesta inmune y sugiere que existe una autoregulación pormedio de la estimulación de la producción de células complementarias anti-idiotípicas por antígenos receptores-idiotipos-. Estas células o sus productos disminuirían la producción del idiotipo original. Los genes de las clasesII y III, especialmente los localizados en la región HLA-D/DR -genes de respuesta inmmune (Ir)-,proporcionarían una gran individualidad y especificidad a la respuesta inmune y determinan las interaccionesentre linfocitos y células del Sistema Fagocitario Mononuclear para la presentación de antígenos y la proliferaciónde linfocitos.

La idea de las redes idiotípicas, y su posible implicación en la regulación del sistema inmune se debe a NielsJerne (quien la propuso en 1973, y que obtuvo por ello el premio Nobel en 1984).

Como sabemos, durante el desarrollo del sistema inmune se establece la tolerancia a los auto-antígenos,esencialmente porque se eliminan los clones de linfocitos autoreactivos (que reconocen moléculas propias).

Consideremos las inmunoglobulinas como auto-antígenos. En las primeras fases de vida, se induce la toleranciahacia las porciones constantes (Fc) porque globalmente existen en grandes concentraciones, pero no se inducetolerancia frente a los idiotipos, (residentes en la parte variable de Fab) porque cada uno de ellos está presente enmuy pequeñas cantidades: esta es la razón por la que las inmunoglobulinas son inmunogénicas en el mismoindividuo.

Teoría_de_la_red_idiotápica

1

Consideremos un antígeno que entra a un individuo, y fijémonos en uno de los péptidos que resultan de suprocesamiento. Frente a dicho péptido el sistema inmune monta una respuesta humoral a base de anticuerpos(llamémosles Ac#1). Pues bien, por las razones del párrafo anterior, dicho Ac#1 provocará a su vez la producciónde otros anticuerpos (Ac#2), que reconocen los idiotopos del primero: a estos segundos anticuerpos se lesdenomina anticuerpos anti-idiotípicos. A su vez, estos Ac#2 podrían inducir una tercera "oleada" de anticuerpos(Ac#3, anti-anti-idiotípicos), etc. De esta forma, se iría formando una red (red idiotípica) que se autorregula. Elmismo principio se puede extender a los receptores clonotípicos (TCR) de los linfocitos T.

Aunque estas ideas son muy atractivas, el papel real de la red idiotípica en el control normal del sistema inmuneaún no está aclarado del todo, estando sujeto a debates.

Un corolario (confirmado) de la teoría de la red idiotípica es que algunos de los anticuerpos anti-idiotípicosreconocerán al paratopo del Ac#1, y por lo tanto, son como la imagen interna que tiene el organismo del epitopodel antígeno exógeno. Esta imagen interna podría servir para seguir activando al sistema inmune aun cuandohubiera desaparecido el antígeno exógeno que desancadenó la respuesta, asegurando suficiente expansión clonal ycélulas de memoria.

Hay algunas evidencias experimentales de que la red idiotípica actúa fisiológicamente: Ya se están ensayandovarias aplicaciones clínicas de estos hallazgos, principalmente el diseño de vacunas más seguras a base deanti-idiotipos que sean la imagen interna de determinado antígeno. Esto puede ser interesante sobre todo cuandose desconoce el antígeno exógeno real o cuando éste es carbohidrato o glucoproteína, y por lo tanto no se puederecurrir a la clonación de genes.

Ejemplos de vacunas basadas en anti-idiotipos que se han usado con éxito experimentalmente en animales delaboratorio:

vacunas frente a virus (de Newcastle, Sendai, reovirus, virus de la rabia, hepatitis B, citomegalovirus)• vacunas frente a bacterias (Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae)• vacunas frente a parásitos (Schystosoma mansoni, Trypanosoma rhodiense).•

Se han hecho intentos de vacunas anti-idiotípicas frente al VIH (virus del sida), a base de anti-Id hacia anticuerposanti-CD4. Aunque el anti-Id es capaz de neutralizar al virus tanto in vitro como in vivo, la incertidumbre sobre sucapacidad de provocar respuestas celulares ha hecho que no se empleen clínicamente.

Una línea interesante que se está explorando en ratones es el uso de ciertos anti-Id como vacunas neonatalescapaces de superar el efecto inhibidor de las IgG maternas:

Los ratones neonatales no pueden vacunarse frente a E. coli K-13 por el efecto supresor de las IgGmaternas recibidas pasivamente. Se ha obtenido IgG1 monoclonal anti-idiotípica frente a una IgMmonoclonal que se sabía era capaz de conferir inmunidad pasiva. Pues bien, la vacunación de ratonesneonatos con esa IgM o con IgG1 les capacitaba para resistir una infección letal de E. coli. En estascondiciones el anti-Id (imagen interna) era eficaz, mientras que el antígeno real no lo era. Además, siinyectamos ese anti-Id a las hembras que acaban de parir, confieren inmunidad pasiva (a través de laleche) a las crías.

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Referencias

Curso de Inmunología General - Universidad de Granada1.

Teoría_de_la_red_idiotápica

Referencias 2

THE GENERATIVE GRAMMAR OF ,THE IMMUNE SYSTEM

Nobel lecture, 8 December 1984

by

NIELS K. JERNE

Château de Bellevue, F-30210 Castillon-du-Gard, France

Grammar is a science that is more than 2000 years old, whereas immunologyhas become a respectable part of biology only during the past hundred years.Though both sciences still face exasperating problems, this lecture attempts toestablish an analogy between linguistics and immunology, between the descrip-tions of language and of the immune system. Let me first recall some of theessential elements of the immune system, with which I shall be concerned. In1890, von Behring and Kitasato (12) were the first to discover antibodymolecules in the blood serum of immunized animals, and to demonstrate thatthese antibodies could neutralize diphtheria toxin and tetanus toxin. They alsodemonstrated the specificity of antibodies: tetanus antitoxin cannot neutralizediphtheria toxin, and vice versa. During the first 30 years, or more, after thesediscoveries, most immunologists believed that all cells of our body are capableof producing antibodies, and it took until the 1950’s before it became clear, anduntil 1960 before it was demonstrated (13), that only the white blood cellsnamed lymphocytes can produce antibodies. The total number of lymphocytesrepresent a little more than 1% of the body weight of an animal. Thus, it wouldnot be wrong to say that our immune system is an organ consisting of about l0 12

lymphocytes(human) immune system = 1012 lymphocytes

or in a mouse that is 3000 times smaller than WC

(mouse) immune system = 3x108 lymphocytes

This brief description of the immune system disregards the fact that lympho-cytes interact with most other cells in the body, which in my definition do notbelong to the immune system sensu strictu.

Let me draw attention to the fact that this number of lymphocytes in theimmune system is at least one order of magnitude larger than the number ofneurons in the nervous system. Also, we should note that lymphocytes travelamong most other cells of our body, that they circulate in blood and lymph,and occur in large concentrations in the spleen, lymph nodes, appendix,thymus and bone marrow. Strangely enough, however, they seem to beexcluded from the brain. The 1960’s was a very fruitful decade of immunologicaldiscoveries, of which I shall name a few: In the beginning of the decade, theprimary structure of antibody molecules was clarified (14, 15); then followedthe demonstration that the dictum of Burnet (2,16) was correct, namely that all

212 Physiology or Medicine 1984

antibody molecules synthesized by one given lymphocyte are identical; andfinally, towards the end of that decade, lymphocytes were shown to fall into twoclasses, called T cells and B cells, existing in the body in almost equal numbers(17, 18, 5). Only B lymphocytes, or B cells, however, can produce and secreteantibody molecules.

Schematically, I could picture this as in Fig. 1.

Fig. 1.

What I should like you to retain from this picture is both what we know as wellas what we do not know at present. Thus, B lymphocytes are known to carryso-called receptor molecules on their surface (about 105 identical receptors perB cell), and when such a “resting” B cell is properly stimulated to divide and tomature, its descendants will end up excreting about 2000 antibody moleculesper second, all of which are identical, and similar or identical to the receptorsthat the resting B cell originally displayed. This clonal nature of antibodyformation was clearly demonstrated in the early 1970’s (19, 20). The normalantibody response of an animal to a foreign antigen involves a large number ofdifferent clones, however, and is characterized by the polyclonal production,usually of several hundreds of different antibody molecules (21). T lympho-cytes are also known to carry receptor molecules on their surface, but firstlythese molecules are yet not well known because they have been discovered onlyduring the past two years and secondly, the T cells do not excrete suchmolecules: these T cell receptors are antigen-recognizing molecules, but theydo not contribute to the population of freely circulating antibody moleculeswhich are purely B cell products. Furthermore, there are at least two differenttypes of T cells, one of which is called T helper cells (T H) (22) because they

The Generative Grammar of the Immune System 213

help B cells to become stimulated (or, in their absence, they deny B cells toreceive a proper stimulus); the other type is called T killer cells (TK) (23)because they are capable of killing other cells which they consider undesirable(such as virus-infected cells, or cells transplanted from another individual);moreover, as suppressor cells, they may prevent B cells from being stimulated

(6).Thus, in this picture, B cells have the single-minded desire to express their

antibody language, but are subordinate to the T cells, that can either enhanceor suppress this capacity.

Before looking at grammar, I must briefly describe the structure of anantibody molecule. No matter what you try to investigate in biology turns outto become increasingly complex – thus also the structure of antibody mole-cules. The basic element of all antibody molecules has been shown to be a Y-shaped protein structure (26) of about 150,000 daltons molecular weight. Thisis a three-dimensional structure, like all molecules and cells that biology has todeal with. Three-dimensionality tends to perplex our mind which is most atease with one-dimensional, linear sequences, but I shall try to make a roughtwo-dimensional sketch of an antibody in Fig. 2.

Fig. 2.

214 Physiology or Medicine 1984

We can make some important cuts through this molecule. The vertical cutshows symmetry. It divides the antibody molecule in two identical halves. Thetwo other cuts separate a so-called “constant” part (c) from a “variable” part(v). By constant part, we mean that molecules of different antibody specificityhave this part in common (such as, for example, diphtheria antitoxin andtetanus antitoxin). By variable part, we mean that this is the region of theantibody molecule that determines its “specificity”. The two variable parts areidentical; that is to say, that the molecule, with regard to specificity, is divalent.The difficulty we face is not to transform this sketchy two-dimensional pictureinto a one-dimensional primary structure, but into a three-dimensional tertiarystructure. The primary structure (14, 15) has been clarified: the half moleculeis made up of a light polypeptide chain of about 214 amino acid residues, and aheavy polypeptide chain of a little more than 400 amino acid residues, as in Fig.3.

Fig. 3.

It turned out that antibody molecules of different specificity have identicalamino acid sequences in their carboxyl-ended regions, but that they vary withrespect to the amino acid sequences in the amino-ended regions of both heavyand light chains (24). It became obvious immediately that the great diversity ofantibody molecules, the great number of different molecules which antibodies

can recognize, or in other words, the great repertoire of antibody specificities,must result from an enormous number of varieties in the variable regions withrespect to amino acid sequences. This insight does not solve our problems,however. It is like saying that the great variety of words or sentences in alanguage results from the enormous number of varieties with respect to thesequences of letters or of phonemes.

Interpretation in immunology remained practically as it had traditionallybeen, namely that the variable region of an antibody molecule forms a three-dimensional “combining site”, and that “specificity” simply means thatthis combining site is complementary in shape to part of the three-dimensional profile of an antigen molecule. Antigen is the word that was given,and is still in use, for molecules that can induce the immune system to producespecific antibodies which can recognize these antigens. Traditionally, the anti-body combining site was conceived of as a cleft which recognizes a protuber-ance on the outer shape of an antigenic molecule, and all antibodies werenamed after the antigens that they recognized, such as diphtheria antitoxin,antisheep red blood cell antibodies, anti-TNP, etc. (25). I shall now try to giveyou an impression of the size of this system of antigens and specific antibodymolecules. Let us first consider macromolecules of molecular weights exceeding10,000 daltons; they may be polysaccharides, proteins, lipoproteins, nucleicacids, viruses, bacteria – in fact any such molecule or particle existing in theworld is an antigen to which the immune system can make specific antibodies.Moreover, molecules such as nitrophenol, or arsonate, or any organic orinorganic molecules you care to mention are antigenic when attached to a so-called carrier molecule, for example to a protein: the immune system will thenproduce antibodies that specifically recognize these molecules, even if theyhave been synthesized in a chemical laboratory without ever before havingexisted in the world (1). How is this possible? For example, the immune systemof a mouse possesses no more than about 108 B lymphocytes, which would bethe maximal available repertoire of variable regions on its antibody molecules.We realize that “recognition” need not be perfect, and that the same “combin-ing site” might recognize, with more or less precision, a number of similarantigens.

I shall now turn to some remarkable discoveries, made during the past 25years, showing that the variable regions of antibody molecules are themselvesantigenic and invoke the production of anti-antibodies. Kunkel (27) showedthat monoclonal myeloma antibodies, when injected into another animal,induce specific antibodies which recognize the particular myeloma antibodiesused, but which do not recognize any other myeloma antibodies isolated fromother myeloma patients. This work was extended by others, but mainly byJacques Oudin and his colleagues in Paris, who showed that ordinary antibodymolecules that arise in an immunized animal are antigenic and invoke theformation of specific anti-antibodies (28, 29, 30, 31). In other words, thevariable region of an antibody molecule constitutes not only its “combiningsite”, but also presents an antigenic profile (named its idiotype) against whichanti-idiotypic antibodies can be induced in other animals. Moreover, it turned

216 Physiology or Medicine 1984

out that this antigenic, idiotypic profile of the variable region of a givenantibody molecule is not a single site, but consists of several distinct sitesagainst which a variety of different anti-idiotypic antibody molecules can bemade. These individual sites are now named idiotopes, implying that theidiotype of one antibody molecule can be described as a set of differentimmunogenic idiotopes. And finally, it has been shown that the immune systemof a single animal, after producing specific antibodies to an antigen, continuesto produce antibodies to the idiotopes of the antibodies which it has itself made.The latter anti-idiotopic antibodies likewise display new idiotypic profiles, andthe immune system turns out to represent a network of idiotypic interactions(7, 8, 9, 10, 11).

I shall now show, in Fig. 4, a preliminary picture of how we might vaguelytry to imagine the shape of the variable region of an antibody molecule.

Fig. 4.

This picture is an historical compromise: we uphold our antigen-centeredtradition (25) by retaining the notion of a “combining site” which enables theantibody molecule to recognize the antigenic molecule that induced its produc-tion, and we simply add a number of idiotopes on the same variable region,which are capable of inducing the production of other antibody molecules thathave “combining sites” recognizing these idiotopes.

We are now getting into trouble, however, when trying to interpret ourexperimental results. As I said earlier, a resting B lymphocyte displays on itssurface about 100,000 identical receptor molecules which are representations ofthe type of antibody molecules this B cell and its progeny will produce ifstimulated by an antigen.

The Generative Grammar of the Immune System 217

Fig. 5.

Let us return to this picture for a moment, as in Fig. 5,and let us make an enlargement, in Fig. 6, of a small part of the surface of this Bcell, focusing on one receptor molecule only, making the usual cuts betweenconstant and variable regions:

Fig. 6.

218 Physiology or Medicine 1984

As you see, I have retained the traditional distinctions between the antigen-recognizing combining site, and a number of antigenid idiotopes. I have alsoadded an imaginary profile of an antigenic molecule, part of which is recog-nized by the combining site of the B cell receptor. This is the basic picture ofthe selective theories of antibody formation, as most clearly formulated byBurnet (16, 2). The antigen “selects” the lymphocytes by which it is recog-nized, and stimulates these cells to proliferate, to mature, and to secreteantibodies with fitting combining sites. Clearly, T cell control is also involved,as well as growth factors, maturation factor, etc., but this picture remains thebasic idea of antibody induction. Fig. 7 shows one of these antibody molecules,which recognizes part of the surface profile (“epitope”) of the antigen.

Fig. 7.

Now imagine, however, that this antibody molecule (Abl), displaying both itscombining site as well as its antigenic idiotopes, is itself used as antigen. It isthen possible to envisage two situations, a and ß.

Fig. 8 shows, schematically, a freely circulating Abl molecule which recognizes,and sticks to, a receptor on a B cell. The figure envisages the stimulation of twodifferent B cells by Abl molecules now acting as antigens. In the α case, thecombining site of the receptor on a B cell recognizes an idiotope of Abl, and thecell may be stimulated to produce the corresponding anti-idiotopic antibodies(Ab2). In the β case, however, it is the combining site of the Abl moleculewhich recognizes an idiotope of the receptor on a B cell which may thus bestimulated to produce antibodies which possess idiotopes that have a shapethat is similar to the epitope displayed by the original antigen. Experimentshave shown both these situations actually to occur. For example, if the originalantigen is insulin, and Abl is an anti-insulin antibody, then some of the anti-idiotypic antibodies (Ab2) of the ß type show a similarity to insulin and have

The Generative Grammar of the Immune System

Fig. 8.

219

been shown, by Sege and Peterson, to function like insulin (32). Similar resultsin other systems have been obtained by Cazenave and Roland, by Strosberg, byUrbain, and their colleagues, and by others (33, 10, 39, 35).

The point I wish to make, however, is to consider whether the two situationsα and ß are fundamentally different, or not. Is there a difference betweensaying that Abl recognizes Ab2 or that Ab2 recognizes Abl? Can we, at thisthree-dimensional, molecular level, distinguish between “recognizing” and“being recognized”? If not, it becomes meaningless to distinguish betweenidiotopes and combining sites, and we could merely say that the variable regionof an antibody molecule displays several equivalent combining sites, or a set ofidiotopes, and that every antibody molecule is multi-specific. I do not have tobelabour this point which has been made repeatedly (36, 37, 38, 25). Instead, Ishould now like to introduce some numerology into this discussion. How largeis the number of different antibodies that the immune system of one singleanimal (be it a human or a mouse) can make? This number, during the pastfew decades, has been estimated, on more or less slender evidence, to exceedten millions, and this enormous diversity has been designated as the “reper-toire” of the B lymphocytes. Such a “repertoire” has been characterized byCoutinho as “complete” (39). “Completeness” means that the immune systemcan respond, by the formation of specific antibodies, to any molecule existing inthe world, including, as I said earlier, to molecules that the system has never

220 Physiology or Medicine 1984

before encountered. Immunologists sometimes use words they have borrowedfrom linguistics, such as “immune response”. Looking at languages, we findthat all of them make do with a vocabulary of roughly a hundred thousandwords, or less. These vocabulary sizes are a hundred-fold smaller than theestimates of the size of the antibody repertoire available to our immune system.But if we consider that the variable region that characterizes an antibodymolecule is made up of two polypeptides, each about 100 amino acid residueslong, and that its three-dimensional structure displays a set of several combin-ing sites, we may find a more reasonable analogy between language and theimmune system, namely by regarding the variable region of a given antibodymolecule not as a word but as a sentence or a phrase. The immense repertoire ofthe immune system then becomes not a vocabulary of words, but a lexicon ofsentences which is capable of responding to any sentence expressed by themultitude of antigens which the immune system may encounter.

At this point, I shall make a quotation from Noam Chomsky (3) concerninglinguistics: “The central fact to which any significant linguistic theory mustaddress itself is this: a mature speaker can produce a new sentence of hislanguage on the appropriate occasion, and other speakers can understand itimmediately, though it is equally new to them … Grammar is a device thatspecifies the infinite set of well-formed sentences and assigns to each of theseone or more structural descriptions. Perhaps we should call such a device agenerative grammar … which should, ideally, contain a central syntactic compo-nent …, a phonological component and a semantic component.” That is theend of my quotation. For the size of the set of possible sentences in a language,Chomsky uses the word “open-endedness”, and I now think that “open-ended” is the best description also of the “completeness” of the antibodyrepertoire. As for the components of a generative grammar that Chomskymentions, we could with some imagination equate these with various featuresof protein structures. Every amino acid sequence is a polypeptide chain, butnot every sequence will produce a well-folded stable protein molecule withacceptable shapes, hydrophobicity, electrostatics, etc. Some grammatical ruleswould seem to be required. It is harder, however, to find an analogy tosemantics: does the immune system distinguish between meaningful and mean-ingless antigens? Perhaps the distinction between “self’ and “non-self’ is avalid example. It would seem, at first sight, that the immune response to asentence presented by an invading protein molecule is merely to select, fromamongst its enormous preformed antibody repertoire, a suitable mirror imageof part of this antigenic sentence. As you will know, Leonardo da Vinci wrotehis private journal in the mirror image of ordinary handwriting. It is difficult,without considerable practice, to write and read mirror handscript. Let meshow you an example in Fig. 9.

Fig. 9.

The Generative Grammar of the Immune System 221

On the following two figures, I shall use the device of showing ordinary lettersin black, and of using greyly marked zones to indicate the mirror images ofthese letters.

Fig. 10.

Fig. 10 shows an antigenic “sentence”, part of which is mirrored by Abl. Theanti-idiotopic Ab2 mirrors part of Abl, but bears no relation to the originalantigen. Fig. 11 is a little more complex. Here, the original antigen is insulin,and the letter-sequence “OF INSULIN DE” represents its active site, which ismirrored by Abl. Of the two anti-idiotopic antibodies shown, Ab2a and Ab2ß,the latter mirrors this mirror image, and thus displays the active site of insulin

(32).

Physiology or Medicine 1984

Fig. II.

I should perhaps again emphasize that the sentences representing antibodiespossess partial mirror images of an antigenic sentence. These antibodies are notechoes of the invading antigen, but were already available to the animal in itsrepertoire of B cells before the antigen arrived. This is the important insightthat followed the introduction into immunology of the selective theories in the1950’s. Also, I must emphasize another important quantitative aspect of thesituation facing the immune system. It has been estimated that one humanindividual produces about 10,000 different proteins, such as enzymes, hor-mones, cell surface proteins, etc. At the same time, we estimate that theimmune system maintains a repertoire exceeding ten million different proteins,namely antibody molecules. This is a thousand-fold more than all other bodyproteins taken together. Man and mice, normally, have about ten milligrams ofantibodies in a milliliter of their blood. Thus, a normal human possessesbetween about 50 to 100 grams of freely circulating antibodies, called immuno-globulins. If we divide this figure by l07 different specificities, we are still leftwith an average of 5 to 10 micrograms of every specificity in the availablerepertoire, representing an average of about 3×1013 monoclonal antibodies ofevery specificity. For mice that are 3000 times smaller, we would have to dividethese figures by 3000, which would still leave a mouse with an average of 2 to 3nanograms of antibodies of every of l07 specificities. That even such nanogramquantities of monoclonal anti-idiotypic antibodies, when introduced into mice,produce remarkable effects has been shown by Rajewsky and his colleagues(40, 41, 42).

The Generative Grammar of the Immune System 223

I should therefore like to conclude that in its dynamic state our immunesystem is mainly self-centered, generating anti-idiotypic antibodies to its ownantibodies, which constitute the overwhelming majority of antigens present inthe body. The system also somehow maintains a precarious equilibrium withthe other normal selfconstituents of our body, while reacting vigorously toinvasions into our body of foreign particles, proteins, viruses, or bacteria, whichincidentally disturb the dynamic harmony of the system.

The inheritable “deep” structure of the immune system is now known:certain chromosomes of all vertebrate animals contain DNA segments whichencode the variable regions of antibody polypeptides. Furthermore, experi-ments in recent years have demonstrated the generative capacities of thisinnate system. In proliferating B lymphocytes, these DNA segments are thetargets for somatic mutations, which result in the formation of antibody vari-able regions which differ, in amino acid sequences, from those encoded by thestem cell from which these B cells have arisen (43, 44, 45, 46, 47). Theexperiments showed that it was still possible, however, to identify the originalstem cell genes that must have undergone these mutations. Expressed inlinguistic terms, such investigations belong to the etymology of the immunesystem.

As immunologists, we should like to know the semantics of the inheritablegene structures. What is the meaning of the basic lexicon, or what are thespecificities of the antibodies, B cell receptors and T cell receptors as encodedin the genes of our germ cells? It is known that B cells recognize the language ofthe T cell receptors. I have said so little about the latter because T cellreceptorology is still in too early a stage of development. An immune system ofenormous complexity is present in all vertebrate animals. When we place apopulation of lymphocytes from such an animal in appropriate tissue culturefluid, and when we add an antigen, the lymphocytes will produce specificantibody molecules, in the absence of any nerve cells (48). I find it astonishingthat the immune system embodies a degree of complexity which suggests somemore or less superficial though striking analogies with human language, andthat this cognitive system has evolved and functions without assistance of thebrain.

It seems a miracle that young children easily learn the language of anyenvironment into which they were born. The generative approach to grammar,pioneered by Chomsky (4), argues that this is only explicable if certain deep,universal features of this competence are innate characteristics of the humanbrain. Biologically speaking, this hypothesis of an inheritable capability tolearn any language means that it must somehow be encoded in the DNA of ourchromosomes. Should this hypothesis one day be verified, then linguisticswould become a branch of biology.

224 Physiology or Medicine 1984

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FROM THE STRUCTURE OF ANTIBODIES TOTHE DIVERSIFICATION OF THE IMMUNERESPONSE

Nobel lecture, 8 December, 1984

by

CÉSAR MILSTEIN

Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Hills Road,Cambridge, U.K.

Cuando se acerca elfin, escribió Cartaphilus, ya no quedan imágenes de1recuerdo; sólo quedan palabras. Palabras, palabras desplazadas y mutiladas,palabras de otros, fué la pobre limosna que le dejaron las horas y lossiglos.

J. L. Borges

When an animal is infected, either naturally or by experimental injection, witha bacterium, virus, or other foreign body, the animal recognises this as aninvader and acts in such a way as to remove or destroy it. There are millions ofdifferent chemical structures that the animal has never seen and yet which it isable to recognise in a specific manner. How is this achieved? Scientists havebeen fascinated by this question for most of this century, and we continue to befascinated by the intricacies and complexities that still need to be clarified.Even so, looking back over the years since I myself became involved in thisproblem, progress in the understanding of the process has been phenomenal.Suffice it to remind our younger colleagues that 20 years ago we were stilltrying to demonstrate that each antibody differed in its primary amino acidsequence.

What attracted me to immunology was that the whole thing seemed torevolve around a very simple experiment: take two different antibody mole-cules and compare their primary sequences. The secret of antibody diversitywould emerge from that. Fortunately at the time I was sufficiently ignorant ofthe subject not to realise how naive I was being.

Back in 1962, when I had by accident become the supervisor of Roberto Celisin Argentina, it occurred to me that antibody diversity might arise from thejoining by disulphide bridges of a variety of small polypeptides in combinator-ial patterns. I don’t know whether anybody else had the same idea at that time,but of-all the prevailing theories about antibody diversity that I am aware of,this is one that was widest of the mark. I hold it to my credit that I never put itinto print. But it was of great value to me as it provided an intellectualjustification to work on disulphide bonds of antibodies. By the time I joined theLaboratory of Molecular Biology in 1963, the model of two heavy and two light

248

From the Structure of Antibodies 249

Light

Fig. 1. Antibodies are made of two or more pairs of heavy and light chains joined by disulphide

bonds. Each chain has two regions. The variable region differs in structure from one antibody to

another and contains the combining site. The antibody combining site is located at the tips of a Y-

shaped three-dimensional structure. The constant region is invariant within a given class or

subclass, and is responsible for effector functions (complement binding, attachment to and trans-

port across membranes etc). The number and posit ion of the interchain disulphide bonds is

characteristic for the different classes and subclasses. In this figure, the structure depicted is the

mouse myeloma protein MOPC 21 which was the subject of much research in our laboratory.

chains joined by disulphide bonds (Fig. 1) had been established (l), and I waseager to accept Dr. Sanger’s proposal that I should engage in studies ofantibody combining sites.

The nature of antibody diversityAt first I looked for differences in fingerprints of digests of iodinated antibodiesdirected against different antigens. The pattern that emerged from those stud-ies implied that purified antibodies were too complex and differed only in asubtle quantitative way from the totally unfractionated immunoglobulin. Inever published those results, which only led me to the conviction that theprotein chemistry of antibodies at that level was too difficult to tackle, and thata different approach was needed.

The study of the amino acid sequence around the disulphide bonds of theimmunoglobulins was my own short-cut to the understanding of antibodydiversity. I soon recognised the existence of what appeared to be a variable

250 Physiology or Medicine I984

disulphide bridge and a common disulphide bridge (2,3), but the full meaningof that observation only became obvious when Hilschmann and Craig de-scribed the variable and constant halves of antibody light chains (4). Thevariable half contained one disulphide bond, and the constant half the other.This was followed, in later studies with Pink, Frangione, Svasti and others, bythe observation of the repeating pattern of similar S-S loops as a distinctivecommon architectural feature of the different classes and subclasses of immu-noglobulin chains. What distinguished them from each other was the diversityof interchain S-S bonds (5).

The period between 1965 and 1970 was full of excitement, both at theexperimental and theoretical level. How were these variable and constantregions going to be explained? It was now not only a problem of millions ofantibody structures, but that in addition those millions of structures were partof a polypeptide which otherwise had an invariant primary sequence encodedby only one or very few genes. How to solve the puzzle? Dreyer and Bennett (6)suggested that there were thousands of genes in the germline and that theparadox was easy to solve if we postulated a completely unprecedented scheme.This became known as the “two genes-one polypeptide” hypothesis. At thetime we did not like that, and proposed a mechanism of hyper-mutationoperating on selected segments of a gene (7). There were other ideas at the timeto generate antibody diversity. One of them, widely discussed in a Cold SpringHarbor Symposium in 1967, was based on a mechanism of somatic cross-overbetween gene-pairs (8). It was very exciting for me when soon after thesymposium I could show that in the human kappa chains at least three genesmust be involved (9). The predicted thousands of V-regions could be groupedinto a small number of families or subgroups. The fact that these families wereencoded by non-allelic V-genes (10) - coupled to the genetics of the C-region,which indicated a single Mendelian C-gene - provided the experimentalevidence that convinced me and many others that the “two genes-one poly-peptide” hypothesis was inescapable.

After that, there was a period of consolidation and extension of the results.The concept of V-gene families or subgroups became firmly established, as wasthe existence of hypervariable residues within the variable segment (9,ll).Crystallographic data showed that such hypervariable residues were near toeach other, justifying the idea that they were part of the antibody combiningsite. This was directly shown with crystals of myeloma protein-antigen com-plexes (12). The work with myelomas was not only totally vindicated, but alsogenerally accepted. The idea of separate pools of V- and C-genes that wereunder continuous expansion and contraction was the last element added to thepicture. By 1970 we became convinced that “the section of the genome involvedin the coding of immunoglobulin chains undergoes an expansion-contractionevolution: that the number of individual genes coding for basic sequences is notlarge, and that it varies in different species and even within species at differentstages of its own history. The task of providing for the endless variety ofindividual chains is left to somatic processes” (13).

From the Structure of Antibodies 251

Light chain mRNA and the signal for secretionI now began to feel a bit restless. It seemed that protein chemistry alone wasnot going to get us much further. Furthermore, there was a lot of excitement inthe laboratory with the new methods for sequencing RNA being developed bySanger and his group. Perhaps even more important, one of my closest friendsat the laboratory, George Brownlee, was beginning to feel that the time wasripe to attack molecules more complicated than 5S or 6S RNA. So we joinedforces in an attempt to isolate immunoglobulin mRNA. This was a difficultproblem and when George’s new research student, Tim Harrison, joined us wedecided to move from solid tumours (14) to cell lines in culture which werekindly provided by colleagues from the Salk Institute (15). The first importantbreakthrough in the field was a paper reporting in vitro synthesis of immunoglo-bulin light chains (16). We immediately set to work to follow up that approach,and to our delight ran into the unexpected observation of the existence of abiosynthetic precursor of light chains. Further experiments led us to proposethat the extra N-terminal sequence was a signal for vectorial transport acrossmembranes during protein synthesis. That was the first evidence which indi-cated that the signal for secretion was an N-terminal segment, rapidly cleavedduring protein synthesis (17,18).

However, our major concern remained the sequence of the messenger RNAfor the light chains. In those days there was no DNA sequencing, only mRNAsequencing via elaborate fingerprints of radioactive mRNA. Every radioactivemessenger preparation on which we could do sequence analysis involved thelabelling of cells with inorganic 32P- hosphate at levels of 50 mCi. So there wepwere, dressed up in our new-style laboratory coats (namely heavy lead aprons),behind a thick plastic screen, labelling cells and then frantically working up ourmessenger purification procedures and performing fingerprinting experiments,before the inexorable radioactive decay. Although we didn’t go very far in oursequencing, we could isolate oligonucleotides that corresponded to the proteinsequences (19). Among these were oligonucleotides spanning the V- and C-regions, demonstrating that the protein chain was made from a single messen-ger RNA and that, therefore, integration of the V- and C-genes did nottake place during or after protein synthesis (20). At this stage the radioactiveapproach was stopped and we tested alternative methods for the sequencing ofmRNA, using synthetic primers and cDNA synthesis. This approach went onin the background while our main efforts were moving in a different direction.Eventually however, it paid off (21). I will come back to that later, because itforms part of my story.

Spontaneous somatic mutants of a myeloma proteinThe introduction of tissue culture methods to our laboratory had a majorimpact on the direction of our research. With my new research student, D. S.Secher, and soon after with R. G. H. Cotton, we decided to embark on ananalysis of the rate and nature of somatic mutation of myeloma cells in culture.We were hoping that we might reveal a high rate of mutation of the hypervaria-

252 Physiology or Medicine 1984

Fig. 2. Protocol used for the screening of the isoelectric focusing pattern of the immunoglobulin

secreted by 7,000 clones of P3 myeloma cells. Mutants were detected and their primary defect

analysed by amino acid and mRNA sequence analysis. The results are described in Table 1 (taken

from Ref. 23).

ble segments. (The protocol is described in Fig. 2.) A continuous culture wasgrown for a minimum of three months to allow mutants to accumulate, andindividual cells were taken and grown as colonies. These were incubated withlabelled amino acids and the radioactive immunoglobulin analysed to detectmutants with altered electrophoretic properties. Our first structural mutantappeared after a few thousand clones (22), and the final analysis of 7,000individual clones gave us a pool of mutants which are described in Table 1. Wewere believed that this elaborate experiment provided the first evidence at theprotein and nucleic acid levels of the existence of somatic mutations of mamma-lian cells (23). Furthermore, the rate at which these mutations occurred sug-gested an important role in the generation of diversity (24). But the mutationswere not in the variable region, and we were forced to conclude that in the cells

From the Structure of Antibodies 253

IF3

IF4

we were studying, there was no evidence for a hypermutable segment. So thatin a sense we were back to square one.

Hybrid myelomasWhile this work was going on, Cotton was preparing another type of experi-ment which turned out to be more important than we anticipated (25). Thisinvolved the fusion of two myeloma cells in culture (Fig. 3). That fusiondemonstrated that the phenomenon of allelic exclusion was not dominant. Onthe contrary, fusion of two myeloma cells gave rise to a hybrid co-dominantlyexpressing the antibody chains of both parents. In addition, we proved that theexpression of V- and C-regions was cis, probably because the V- and C-segments were already integrated at the DNA level by a translocation event inthe precursors of plasma cells. This was in contrast to the assembly of heavyand light chains, which combined with each other to give rise to hybridmolecules.

Armed with these results, I went to Base1 to give a seminar, and theimportant consequence was that Georges Köhler came to Cambridge. Hejoined in our main research project of looking at somatic mutants in immuno-globulin-producing cells, and in the other minor project concerning the pheno-typic expression of somatic cell hybrids prepared between myelomas andmyeloma mutants. It became increasingly clear that we could not go on lookingfor mutants by the procedure we had employed before, and the only way aheadwas to use a culture of a myeloma cell line capable of expressing an antibody.Mutants from that cell could then be made based on the antibody activity.Although at that time there had been reports in the literature of myeloma cells

254 Physiology or Medicine I984

Fig. 3. Co-dominant cis expression of antibody genes in hybrids of myeloma cells. The diagram

describes data taken from Ref. 25.

capable of fulfilling that role, none proved suitable in our hands. The myelomacell line P3 (MOPC 21) would have been ideal from a chemical point of view,because at the time sequencing the protein was a major undertaking andwe knew how to deal with MOPC 21. But we were unable to find a suitableantigenic binding activity to this myeloma protein. We failed, but others whowere pursuing similar types of experiments succeeded. Scharff and his co-workers were the first to demonstrate that one can isolate somatic mutants of avariable region in that way (26).

From the Structure of Antibodies … 255

Fig. 4. The first successful hybridoma was prepared from cells from a mouse immunized with sheep

red blood cells (SRBC) (56). These were fused to a myeloma cell line producing the IgG protein

MOPC 21 (Fig. 1) growing in tissue culture and made resistant to azaguanine. Hybrids w e r eselected by growth in HAT medium (57).

And yet in a funny way our lack of success led to our breakthrough; because,since we could not get a cell line off the shelf doing what we wanted, we wereforced to construct it. And the little experiment being done in the backgroundconcerning hybridization between myeloma cells developed into a method for

256 Physiology or Medicine 1984

the production of hybridomas. Thus, as illustrated in Fig. 4, instead of hybri-dizing two myelomas, we hybridized a myeloma and an antibody producingcell. The resultant hybrid was an immortal cell capable of expressing the

I

Fig. 5. Most generally used protocol for the derivation of hybridomas (taken from Ref. 58)

From the Structure of Antibodies … 257

antibody activity of the parental antibody-producing cell the immortalitybeing acquired from the myeloma.

So finally, we were able to obtain a continuously-growing cell-line expressinga specific antibody and use it to search for mutants of the hypervariable region.This was undertaken by my research student, Deborah Wilde. While she gotmore and more discouraged by her lack of success in what she called “lookingfor a needle in a haystack”, it dawned on me that it was up to us to demonstratethat the exploitation of our newly-acquired ability to produce monoclonalantibodies “á la carte” was of more importance than our original purpose.After our early success we ran into technical difficulties and could not get our

Table 2. Selected list of monoclonal antibodies derived in our laboratory

258 Physiology or Medicine 1984

fusion experiments to work for quite some time. Then Giovanni Galfré, whohad recently joined us, got us out of the deadlock when he discovered that oneof our stock solutions had become contaminated with a toxic substance. Afterthis an improved reliable protocol was developed (Fig. 5) and quick progressmade towards the first practical applications of the technology. For severalyears I shelved the antibody diversity problem to demonstrate the practicalimportance of monoclonal antibodies in other areas of basic research and inclinical diagnosis (Table 2). W e were able to show that the hybrid myelomaswere capable of being used for the production of standard reagents such as anti-histocompatibility antigens (27) and anti-Ig-allotypes (28). The procedure wasideally suited to the study of cell surface and tumour antigens and to providingreagents for cell fractionation (29-3 1). Monoclonal antibodies produced inthis way were suitable for radioimmunoassays and for neuropharmacology(32), as blood group reagents (33) and for large scale purification of naturalproducts (34). We also extended the hybrid myeloma technology to a secondspecies-the rat (35) and to the production of bi-specific immunoglobulins(hybrid-hybridomas) (36).

Genetic origin of antibody diversityIn the period 1970- 1975, a considerable effort was being made to measure thenumber of germline genes coding for the variable regions of immunoglobulinchains. Our own contributions started when we persuaded Terry Rabbitts tojoin us. After considerable effort and a lot more radioactivity we obtainedresults indicating that the number of germ line genes was not much higher thanwould be predicted from our understanding of subgroups, and this view wasshared and reinforced by parallel work being conducted by others (37,38). By1976 this view was gaining general support (39). But then the impact of therecombinant DNA revolution began to be very strongly felt. Within a fewyears, and largely through the work of Tonegawa, Leder, Rabbitts, Hood,Baltimore, and others, a coherent picture of the arrangement and rearrange-

From the Structure of Antibodies 259

ment of immunoglobulin genes and their involvement in the generation ofdiversity began to emerge (40).

The precursors of the antibody producing cells do not express an immuno-globulin, but during their differentiation into pre-B cells and B cells, theyexpress first the heavy chain and then the light chain (Fig. 6). The firstantibody produced is membrane bound and functions as a receptormolecule, which receives antigenic signals. Triggered cells divide and differen-tiate to antibody producing cells and memory cells. These events at the cellularlevel are correlated with changes in the DNA structure (Fig. 7). The germlineDNA contains the V- and C-genes on different DNA fragments, as predicted.But in addition, there are further fragmentations, and only some of them areshown in the figure. Light and heavy chains can only be transcribed andtranslated when certain fragments (one of the V and J in light chains, V, D andJ in heavy chains) are integrated by a deletion mechanism. During this processof integration enormous diversity is generated.

To theorize about the genetic origin of antibody diversity was a “must”among molecular immunologists for quite a number of years. How do thosetheories contrast with the reality of today? The hard experimental facts madepossible by the methodological advances in molecular biology show that, whilenone of them was right, most of them contained at least a grain of truth. Therewere two major currents of opinion. One consisted of germline theories where-by all the diversity was inherited as genes present in the germline. The otherincluded somatic diversification theories, whereby somatic processes were re-sponsible for the generation of diversity, starting from a small number ofgermline genes. As it turns out, the genetic mechanisms responsible for the

Fig. 7. Genetic arrangement of immunoglobulin genes in the germline. During differentiation into

pre B cells and B cells large deletions of DNA lead to the integration of fragments (rearranged

genes). Further proliferation leads to somatic mutation of the integrated gene and this is of major

importance in the maturation of the response.

260 Physiology or Medicine 1984

Table 3. Mechanisms that generate antibody diversity

I . GERMLINE: multiple V-gene segments

2. COMBINATORIAL: a) Different combinations of V-(D)-J

b) Different combinations Of VH a n d VL

3. JUNCTIONAL: variation at at V-J, V-D, and D-J boundaries

4. SOMATIC POINT MUTATION: nucleotide substi tutions throughout the V region

generation of diversity include a little bit of everything (Table 3). There arebetween 50 and 300 gene fragments in the germline encoding the light or theheavy chains. The number varies from species to species. So there is a consider-able germline contribution. Recombination and gene conversion arc probablyimportant genetic events in the evolution and maintenance of that germlinegene pool. We still do not know whether these events are significant as somaticgenerators of diversity (41). As shown in Fig. 7, the V-region is encoded by V,D and J segments (heavy chain) and V and J segments (light chain). Theircombinatorial integration into a single gene, although an important componentof the generation of diversity, is not the critical mechanism predicted by themini gene hypothesis (42). Also important is the diversity generated during thejoining process, and this contains an element of the errors and aberrationsduring repair predicted by other theories (7,43). And then there are the somaticpoint mutations for which a mechanism remains to be elucidated. It mayinvolve error-prone repair enzymes (7), genetic hot-spots (24), appropriateselection either by antigen (44) or by other network elements (45), or quitepossibly by a mixture of all or some of these. The instructional theories werelargely forgotten as soon as the chemical diversity of antibodies was established(46). Yet they also may contain a grain of truth. It has recently been proposedthat peptide segments of the antigen which appear to be mobile are betterimmunogens, presumably because they adapt their structure to a predefinedantibody structure (47,48). It is also possible that to some extent the antibodycombining site itself has a certain degree of mobility, which has a limitedcapacity to accommodate its own structure to that of the antigen. Of coursedynamic adaptation has a price to pay in terms of affinity. Adaptability shouldnot be confused with the generation of specificity. As I discuss below, animproved fit of binding to the ligand is the result of somatic mutation andantigenic selection.

Molecular analysis of an immune response using monoclonal antibodies and mRNA

sequencingLet us return to an animal that is being immunized with a certain substance.The immune system recognizes the substance as foreign, and the B cells aretriggered to produce antibody (Fig. 8). The different antibodies are secretedand mixed in the serum. The individual antibody molecules are extremelysimilar and once mixed cannot be separated from each other. For this reason,and until the advent of the hybridoma technology, it was impossible to studythe diversity of the antibody response to a given immunogen. The derivation ofimmortal cell hybrids solved this problem, because it affords individual anti-

From the Structure of Antibodies 261

Fig. 8. The dissection of the immune response by the hybridoma techniquc. When an animal is

injected with an immunogen the animal responds by producing an enormous diversity ofantibody

structures directed against different antigens, different determinants of a single antigen, and even

different antibody structures directed against the same determinant. Once these are produced they

are released into the circulation and i t is next to impossible to separate all the individual

components present in the serum. But each antibody is made by individual cells. The immortaliza-

tion of specific antibody-producing cells by somatic cell fusion followed by cloning of the appropri-

ate hybrid derivative allows permanent production of each of the antibodies in separate culture

vessels. The cells can be injected into animals to develop myeloma-like tumours. The serum of the

tumour-bearing animals contains large amounts of monoclonal antibody.

262 Physiology or Medicine I984

bodies separately produced, in culture vessels and as mouse myelomas. Thispermits dissection of the individual components of the antigen. Monoclonalantibodies prepared against hitherto undefined cellular components can them-selves be used to identify the chemical nature of those components, to probe fortheir function, and later for use as reagents for diagnostic and therapeuticpurposes. These are the fundamental properties behind the most important ofthe general applications of monoclonal antibodies. When we started to explorethese applications, and until some years ago, it was possible to some extent to

summarize the main results obtained (49). In recent years their application tobasic research, clinical biochemistry, medical therapy, and in industry hasbeen so widespread that I do not intend even to attempt to discuss it anyfurther here.

Fig. 9. Derivation of monoclonal antibodies at the onset and during the maturation of the response

to oxazolone.

From the Structure of Antibodies 263

Fig. IO. Avidity of monoclonal antibodies 7 and 14 days after immunization. Haptenated phage

inhibition (HPI) per µg of anti-phlOx immunoglobulin from supernatants of IgG-secreting hybri-

domas. Those on the left were from day 7 and those on the right from day I4 fusions. Black circles

represent oxazolone idiotype-positive IgG and open circles represent idiotype-negative IgG (taken

from Ref. 50).

Different antibodies recognize different antigenic determinants of the im-munogen, and the recognition of each determinant is complex in itself (Fig. 8).It has been known for a long time that even the simplest antigenic determinantsare recognized by an unknown variety of antibody molecules. Monoclonalantibodies can be made pure and used to answer the old questions of howcomplex the collection of antibody molecules produced by the animal as aresponse to a particular antigen is, and how the individual molecules differfrom each other. This brings me back to sequencing messenger RNA.

While in the late ’70s the excitement about monoclonal antibodies and DNArecombinant methods was simmering, Pamela Hamlyn was quietly adaptingSanger’s fast DNA sequencing methods to the sequencing of light chainmRNA. Her eventual success (21) added to our capacity to derive cell linessecreting monoclonal antibodies to a predefined antigen, and to our ability to

264 Physiology o-r Medicine 1984

sequence quickly the messenger RNA of the antibody molecule they produce.So, instead of asking the question “What is the nature of antibody diversity?“,we were now in a position to ask the question “How do antibodies diversifyduring an immune response?” In other words, how, in real life in the animal,are all those genetic events capable of producing antibody diversity actuallyoperate in response to an antigenic stimulus?

In collaboration with Matti Kaartinen, Gillian Griffiths and Claudia Berek,we have been conducting a study of the response to the hapten phenyl oxazo-lone (50,51). The essence of the experiment is described in Fig. 9. The haptenconjugated to chicken serum albumin as carrier is injected into mice, and 7days and 14 days later animals are sacrificed, hybridomas are prepared and anumber of random clones isolated in each case. Other animals are left for acouple of months, and hybridomas of the secondary response arc prepared.

Hybridomas prepared 7 days and 14 days after primary immunization arecompared in Fig. 10. Each point on the figure represents the avidity of each oneof 32 monoclonal antibodies. The mixture of antibodies at each stage, as a firstapproximation, represents a cross-section of the complexity of a typical anti-serum. The average titres of the antibodies at both stages are not very different,although the day 14 average is slightly higher. This is as expected. Theantibody titre of an antiserum, as well as its average avidity, increases duringthe course of an immunization. It is what we refer to as the maturation of theresponse. What distinguishes the results of the day 7 and day 14 is that whilethe day 7 results cluster around the average, the scatter at day 14 is muchwider.

Since each monoclonal antibody was the product of an immortal hybridoma,we could go one step further and study the total amino acid sequence of eachone of these monoclonal antibodies. Better still, we could study the sequence of

Fig. 11. mRNA sequencing strategy. Synthetic oligonucleotide primers designed to pair with

defined bases within segments of mRNAs were used to init iate reverse transcription. Using

dideoxynucleotides, specific stops in the cDNA can be generated and the nucleotide sequence

determined by gel methods (taken from Ref. 59).

From the Structure of Antibodies 265

the mRNA coding for each amino acid sequence. This not only provided moreinformation, but was also technically simpler. To do so, RNA was preparedfrom the hybridoma cells and direct sequencing done on the impure messengerpreparations, as shown in Fig. 11. In this way, sequences of antibodies atdifferent stages of the immune response could be compared.

What we have learned from this is that the majority of antioxazoloneantibodies at day 7 express a single set of germline V-genes taken from the totalpool of over 100 for each of the two chains (Fig. 12). This pair of germline genes(which we refer to as VH-Ox1 and Vk-Ox1) are at this stage expressed in theirunmutated form. The few differences between them arise by junctional diversi-ty - that is the variations introduced during integration of the DNA fragmentsV, D and J which make up the variable region of the antibodies. At day 14 thesame germ line genes VH-Ox1 and Vk-Ox1 still seem to dominate the response.

Fig. 12. Diagrammatic comparison of the mRNA sequences from anti-phOx-secreting hybridomas

derived at different stages after immunization with Ox-CSA. Only sequences closely related to the

prototype are shown. The variable region sequences of each hybridoma have been compared with

the sequences of VH-Ox1 and V h-Ox1 respectively. Unbroken horizontal l ines denote identical

sequences, broken lines represent extensive sequence differences. A black circle indicates that these

changes predict an amino acid difference at this position. Complementarity determining regions

(CDR-1, -2, -3) have been marked as have the D and J regions. Where different J segments are

observed these are represented accordingly. Dissociation constants determined by fluorescence

quenching (Kd in moles/litre) are shown on the right (taken from Ref. 51).

266 Physiology or Medicine 1984

However, in sharp contrast to day 7, the day 14 antibodies express a smallnumber of point mutations which are responsible for a significant increase inaffinity for the same hapten. In other words, as the response matures, newsomatic mutants appear in a seemingly endless variety.

The antibodies obtained during the secondary response, expressing thegermline gene combination characteristic of the primary response, show afurther small increase in point mutations (Fig. 12). However, the most impor-tant feature of the secondary response is a shift towards other germline genes(see Table 4).

It appears therefore that the development and maturation of the immuneresponse to oxazolone - which we take as a model system - proceeds basicallyin three stages. In the first the majority of the antibody reflects a very restrictedchoice from a vast repertoire of germline gene combinations, self-selected fortheir capacity to bind the antigen. In the second stage, cells expressing thesecombinations proliferate, and during this proliferation mutants arise whichimprove the affinity of the antibody for the antigen. In the third stage, as thefirst type of germline gene combinations and their mutants reach a certain limitof dissociation constants, new germline gene combinations and somatic mu-tants arc selected for further improvements. Of course the three stages are notabsolutely separate and all three processes overlap to a certain extent. In manyways, the system behaves as a Darwinian system, where adaptation is animprovement in antigen binding. It remains to be seen to what extent otherregulatory constraints are critical to the process.

From monoclonal antibodies to antibody engineeringThe immortalization of antibody-producing cells not only allows the perma-nent supply of an antibody of a constant chemical structure but, more impor-tant, affords all the advantages that can be derived from the techniques of cellculture and somatic cell genetics. The most obvious is cell cloning, and this hasbeen at the root of the explosion in the use of this technology. And yet thederivation of cell lines producing specific antibodies cannot go beyond theimmortalization of what already exists. We select hybrids producing mono-clonal antibodies of desired properties, but if the immunized animal does notmake it, there is no way of immortalizing it. Fortunately we can go further.

Hybridomas are established cell lines and are therefore capable of other “invitro” manipulations using somatic cell genetic and molecular engineeringtechniques. We are at the beginning of a new era of immunochemistry, namelythe production of “antibody based” molecules. The derivation of hybrid hybri-

From the Structure of Antibodies… 267

domas is one example of the utilization of such methods for the biosynthesis ofbi-specific antibodies (36). Another example is the derivation of class switchmutant antibodies (52).

Some years ago, I discussed the eventual use of recombinant DNA tech-niques to make more drastic changes (53). R ecent developments have shownthe feasibility and potential of the approach. Antibody genes have been put intosuitable vectors, propagated, modified and re-introduced into myeloma cellswhich will then secrete recombinant antibodies possessing novel properties.For instance, in my laboratory Neuberger has developed a cell line whichsecretes a mouse-human antibody molecule with a mouse anti-nitrophenacetylvariable region and a human epsilon heavy chain constant region (54). Inanother example, the Fc portion of the mouse antibody was replaced bystaphylococcal nuclease (55). A novel antibody was thus made which containsan antigen specific Fab portion joined to an enzymatic effector function replac-ing the normal Fc portion.

More elaborate modifications will be made possible by the fast-developingtechniques of site-directed mutagenesis. These will allow well-planned specificmodifications of antibody combining sites. In this way we will be able to testthe contribution of individual point mutations to the generation of high affinityantibody during the process of the maturation of the response. This brings usback to the problems of the diversity of molecular recognition and the matura-tion of the immune response.

Exciting as these prospects are, they still require the basic starting genestaken from a hybridoma line. With them, we can introduce changes at theamino acid sequence level but with the exception of simple changes, theultimate folding pattern and their effect on protein-ligand interaction cannotyet be reliably predicted. This will remain so for the time being. Total construc-tion of antibody molecules to suit specific needs depends on a much betterunderstanding of protein folding.

While selection is the strategy of the antibody response of an animal, theimmunochemistry of the future will revert to an instructional approach wherethe antigen will tell us what antibody structure we should construct. Althoughthis is not science fiction, we need to overcome the theoretical problemsinvolved in the translation of one-dimensional reality into a valid three-dimen-sional prediction. Although the way ahead is full of pitfalls and difficulties, thisis indeed an exhilarating prospect. There is no danger of a shortage of forth-coming excitement in the subject. Yet, as always, the highlights of tomorroware the unpredictabilities of today.

AcknowledgementsThe hybridoma technology was a by-product of basic research. Its success inpractical applications is to a large extent the result of unexpected and unpre-dictable properties of the method. It thus represents another clear-cut exampleof the enormous practical impact of an investment in research which might nothave been considered commercially worthwhile, or of immediate medical rel-evance. It resulted from esoteric speculations, for curiosity’s sake, only motivat-

268 Physiology or Medicine I984

ed by a desire to understand nature. It is to the credit of the Medical ResearchCouncil in Britain to have fully appreciated the importance of basic research toadvances in medicine. We are delighted to belong to the small, lucky group ofthose who are at the window-dressing end of the justification for the wisdom ofthat policy.

I learned what research was all about as a research student of Stoppani inArgentina, and then with Sanger in the Department of Biochemistry at Cam-bridge. I owe an enormous debt to the atmosphere of the Laboratory ofMolecular Biology, where all the work I have described here was done, mostlyunder the Chairmanship of Max Perutz, and within the Division of Protein andNucleic Acid Chemistry, of which Fred Sanger was the Head. From them, Ialways received an unspoken message which in my imagination I translated as“Do good experiments, and don’t worry about the rest”.

During my lecture I have tried to acknowledge those of my collaboratorswhose contributions were critical at specific stages of the work. In addition, sofar unmentioned, is John Jarvis, my personal assistant for well over 20 years -only months less than my involvement with immunology. Since this prizementions the discovery of the principles of the hybridoma technology, I wouldlike to acknowledge specifically the importance of the contributions of DickCotton and David Secher, with whom preliminary work leading to that discov-cry was made, and my tissue culture assistant, Shirley Howe, who was directlyinvolved not only in the preliminary work but also in some of the specificexperiments conducted with Georges Köhler. I would also like to acknowledgeother collaborators who were concerned in our own contributions to the dem-onstration of the practical potential of the hybridoma technology in a variety offields, particularly G. Galfré, A. F. Williams and A. C. Cuello, and thetechnical assistance of Mr. B. W. Wright. The list of acknowledgements iscertainly much longer, but I wouldn’t like to end it without recording myindebtedness to my secretaries, Margaret Dowding, and Judith Firth. Theirhandling of the press in the immediate period after the announcement of thisprize ranks high among my memories of that exciting moment.

From the Structure of Antibodies… 269

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