laporan resmi biomol "merancang probe"

LAPORAN RESMIPRATIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULERMERANCANG PROBE

I. TUJUAN1. Merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blot dengan menggunakan Biofarmatics data base ( NCBI )2. Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik hibridasi metode Southern Blot.II. DASAR TEORICara untuk menyelidiki informasi yang terkandung dalam DNA sebelumnya adalah melalui genetika,yang memungkinkan deduksi fungsi-fungsi gen dari fenotip-fenotip organisme mutan serta keturunannya.Sekarang,telah disempurnakan dengan seperangkat teknik yang umum dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan.DNA merupakan polinukleotida yang terdapat dalam inti sel yang secara kimiawi berupa asam nukleat yang tersusun secara double helix.Sedangkan kromosom DNA adalah DNA yang tersusun secara kompak yang diikat oleh protein-protein.bagian dari kromosom adalah gen.Gen adalah suatu unit DNA yang diturunkan.Setiap GEN terdiri dari suatu rangkaian DNA yang membawa informasi dari suatu protein.Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friwdrich Miescher dari jerman yang megisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869. Dia menemukan bahwa di adalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (Deoxyribonucleicacid) dan RNA (ribonucleic acid) dari proten-protein yang melekatkan molekul asam nukleat tersebut sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula yang berbeda yaitu deoksiribosa(Yuwono,2005).Hasil-hasil eksperimen menunjukkan bahwa molekul yang merupakan bahan genetik di daalam sel adalah DNA. DNA merupakan salah satu makromolekul yang mempunyai peranan yang sangat penting pada jasad hidup. DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada jasad keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon (codon) yang berupa tiga pasang basa nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad(Yuwono,2005).Struktur molekul DNA pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick membuat model struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix). Untai-untai DNA terusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawana (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5 3, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3 5(Yuwono,2005). Di alam ada 20 macam asam amino yang umum terdapat di dalam struktur polipeptida jasad hidup. Masing- mising asam amino mempunyai kodon yang spesifik sedangkan nukleotida hanya ada 4 macam yaitu A, U, G, dan C. Jika suatu kodon hanya terdiri atas dua nukleotida maka hanya akan ada 4(=16) asam amino, tetapi apabila kodon disusun oleh nukleotida,maka akan diperoleh 4(=64) asam amino, sedangkan jumlah asam amino yang umum diketahui ada pada jasad hidup hanya 20 macam. Beberapa kodon diketahui mengkode asam amino yang sama. Fenomena ini dikenal sebagai genetic code redundancy(degeneracy). Oleh karena ada beberapa kodon yang berbeda umtuk satu asam amino yang sama, maka dikenal ada 64 macam kodon, tiga diantaranya yaitu TAA(UAA pada mRNA), TAG (UAG pada RNA) dan TGA (UGA pada RNA) tidak mengkode asam amino apapun karena ketiga kodon ini merupakan kodon untuk mengakhiri (terminasi) proses translasi.Ada bebarapa aspek yang perlu diketahui mengenai kode genetik, yaitu :1. Kode genetik bersifat tidak saling tumpang tindih (non-overlapping), kecuali pada kasus tertentu, misalnya pada bakteriofag OX174 yang mempunyai kodon tumpang tindih.2. Tidak ada sela (gap) diantara kodon satu dengan kodon yang lain.3. Tidak ada koma diantara kodon.4. Kodon bersifat degenerate, artinya ada bebeapa asam amino yang mempunyai lebih dari satu kodon.5. Secara umum kodon bersifat hampir universal karena pada beberapa organel jasad tinggi ada beberapa kodon yang berbeda dari kodon yang digunakan pada sitoplasma(Yuwono,2005).Reaksi hibridisasi adalah proses dimana singgle stand asam nukleat yang komplementer dapat dengan mudah membentuk double stand kembali. Pada reaksi hibridisasi rangkaian asam nukleat yang komplamenter dengan konsentrasi rendah tetap dapat terdetekksi asalkan digunakan DNA probe sebagai indikatornya. Teknik hibridisasi ini juga dapat di gunakan untuk mencari gen yang tidak identik namun mempunyai suatu hubungan. Selain itu,DNA probe dapat digunakan untuk menyelidiki ekspresi gen (dalam reaksi hibridisasi dengan RNA). Hibridisasi DNA probe dengan RNA sel memungkinkan aktif tidaknya suatu gen. Selain itu dapat menentukan terjadinya perubahan akibat mekanisme kendali yang bekerja terhadap transkripsi DNA,splising RNA atau translasi molekul-molekul mRNA-nya yang sudah matang ke dalam protein jika ekspresi sebuah gen berubah.Probe adalah sekuens nukleotida single strand pendek (kira-kira 15-32 bp) yang komplemen dengan DNA target yang biasa digunakan untuk mendeteksi dan menganalisa keberadaan penyakit yang menginfeksi tubuh kita. Probe adalah agen yang dimasukkan kedalam sebuah medium untuk mendapatkan informasi tentang struktur maupun substansi tertentu. Probe memungkinkan kita untuk memvisualisasikan struktur DNA dan juga mendeteksi kelainan-kelainan yang ada pada suatu DNA. Probe dapat ditempeli zat radioaktif ataupun zat-zat fluorescence yang digunakan untuk menandai DNA target yang diinginkan. Penggunaan probe atau oligonukleotida pendek ber-radioaktif atau ber- fluorescence berguna dalam teknik FISH, teknik pendeteksian DNA target dengan menempelkan probe yang komplemen dan di deteksi langsung pada sampel tersebut. Probe dilabel baik dengan radioaktif maupun dengan molekul tertentu yang dapat dideteksi seperti biotin atau fluoresin. Untai DNA atau RNA dapat berhibridisasi dengan sekuens yang berkomplemen atau besesuaian dengannya. Oleh karena itu, probe dapat melabel plaques virus, koloni bakteri maupun pita pada gel yang mengandung gen yng menjadi minat dalam pelacaka atau deteksi. Prosedur ini dinamakan DNA hibridisasi dan bergantung pada pembentukan pasangan basa yang stabil antara probe dengan sekuens target.Untuk menganalisis RNA yang menyediakan suatu protein dengan DNA probe terhadap RNA digunakan cara yang disebut northern Blotting.Mula-mula molekul RNA yang masih utuh dari sel-sel suatu organ dipisah(fraksionasi)menjadi sederet pita pada gel elektroforesis.Selanjutnya agar molekul-molekul RNA itu dapat dimasuki oleh DNA probe perlu dibuat replika gel dengan cara memindahkan(blotting)molekul-molekul RNA yang telah difraksionasi pada sehelai kertas nitroselulosa atau kertas kertas nilon.Molekul-molekul RNA yang telah membentuk hybrid dengan DNA probe yang radioaktif(karena memiliki sebagian dari rangkaian gen yang normal) kemudian ditentukan lokasinya dengan menginkubasi kertas tersebut dengan larutan yang mengandung probe dan probe telah membentuk hybrida dideteksi dengan otoradiografi.Karena molekul-molekul asam nukleat yang kecil bergerak melintasi gel lebih cepat bila dibanding molekul-molekul yang besar,ukuransetiap RNA yang mengikat probe dapat ditentukan dari laju migrasi molekul-molekul RNA dengan ukuran yang diketahui(RNA standar).. Terjadinya ekspresi gen dapat diketahui dengan melacak keberadaan mRNA atau protein dari gen tersebut. Hibridisasi bisa terjadi antara :1. DNA target dengan pelacak cDNA / mRNA ( disebut Southern Blot Technique )2. RNA target dengan pelacak RNA / DNA ( disebut Northern Blot Technique )3. Protein target dengan pelacak anti bodi ( disebut Westhern Blot Technique )Probe yang spesifik akan melacak sekuens basa yang spesifik pula. Probe dengan spesifikasi tinggi ini diperlukan agar tidak terjadi kesalahan dalam pendeteksian, karena dalam prakteknya isolasi DNA/ RNA yang dilakukan akan mengisolasi semua DNA/ RNA. Probe yang tidak spesifik juga dapat berkomplemen dengan DNA / RNA lain yang tidak menjadi target pelacakan ( competitor ). Salah satu yang mempengaruhi kespesifikan suatu robe adalah panjang probe. Pada umumnya panjang probe adaah 100-1000 bp ( base pair ). Dengan adanya bioinformatics database dapat dilakukan perancangan suatu prrobe yang spesifik.

III. ALAT DAN BAHANa. Alat 1. Laptop 2. Carger 3. Stop kontak4. Modemb. Bahan 1. Situs NCBI2. Kode genetik-latihan:( NM_000125)-tugas:( NM_198253.2)

IV. CARA KERJA A. Latihan (kode gen: NM_000125)Di buka situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)

Kotak pilihan all database diganti nucleotide

kotak search nucleotide fordiisi dengan nama gen (NM_000125) dicari CDS (Coding sequens)

Dengan mengacu pada sekuens cDNADibuat probe dengan memblok sekuens pada origin yang masuk dalam region CDS sepanjang yang diinginkan

Dicopy

Dibuka lagi situs yang sama , klik menu BLAST

Diklik nucleotide blast ( blasn ).

Di paste-kan rancangan probe tersebut pada kotak QYUER untuk mencari komplemennya

Diisi kotak JOB TITLE dengan nama praktikan

Pada kotak database diklik Human genomic + transcript

Ditekan BLAST. Akan muncul halaman baru yang berisi hasil format pada new window

Dilakukan analisis lanjut probe spesifik atau tidak dengan memperhatikan banyaknya kompetitor dan presentase komplemennya dibandingkan dengan gen target (hanya pada human bukan organisme lain)

Probe pendek: 200 bpProbe sedang : 500 bpProbe panjang : 900 bpDirancang 3 buah probe dan bandingkan mana yang paling baik beserta alasannya

Ditentukan promotor / TATA box dari gen tersebut

V. HASIL PENGAMATAN1. LATIHAN 1 (Probe Pendek)Kode Gen : NM_000125Nama Gen: Homo sapiens estrogen receptor 1CDS: 235......2022Probe: 241-480 ( panjang probe 240 bp)NoKode genDeskripsiMax Score% Query

1NM 001291241.1Homosapiens estrogen receptor 1 (ESR1), transcript variant 6, mRNA444100 %






Kompetitor:

1NC 000006.12Homosapiens chromosome 6, GRCh 38.p2 Primary Assembly444100 %

2NC 018917.2Homosapiens chromosome 6, alternate assembly CHM1 1.1438100 %

2. LATIHAN 2 (Probe Sedang)Kode Gen : NM_000125Nama Gen: Homo sapiens estrogen receptor 1CDS: 235......2022Probe: 241-840 ( panjang probe 600 bp)NoKode genDeskripsiMax Score% Query







Kompetitor:



2. LATIHAN 3 (Probe Panjang)Kode Gen : NM_000125Nama Gen: Homo sapiens estrogen receptor 1CDS: 235......2022Probe: 1081-1980 ( panjang probe 900 bp)NoKode genDeskripsiMax Score% Query







Kompetitor:



Kesimpulan:Semakin panjang probe yang digunakan semakin spesifik.

1. TUGAS 1 (Probe Pendek)Kode Gen: NM_198253.2Nama Gen : Homo sapiens telomerase transcriptase (TERT)CDS : 59.....3457Probe : 241-480 ( 240 bp) NoKode GenDeskripsiMax Score% Query

1NM 198253.2Homosapiens telomerase reverse transcriptase (TERT), transcript variant1, mRNA444100%

2NM 001193376.1Homo sapiens telomerase reverse transcriptase (TERT), transcript variant2, mRNA444100%

Kompetitor:

1NC 018916.2Homosapiens chromosome 5, alternate assembly CHM 1 1.138187%

2NC 000005.10Homosapiens chromosome 5, GRCh38.p2 Primary Assembly38187%

2. TUGAS 2 (Probe Sedang)Kode Gen: NM_198253.2Nama Gen : Homo sapiens telomerase transcriptase (TERT)CDS : 59.....3457Probe : 1021-1620 ( 600 bp) NoKode GenDeskripsiMax Score% Query



Kompetitor:



3. TUGAS 3 (Probe Panjang)Kode Gen: NM_198253.2Nama Gen : Homo sapiens telomerase transcriptase (TERT)CDS : 59.....3457Probe : 618-1517 ( 900 bp) NoKode GenDeskripsiMax Score% Query



Kompetitor:



VI. PEMBAHASAN

Praktikum kali ini melakukan perancangan dan menganalisa probe. Probe merupakan suatu indikator untuk mendeteksi ekspresi dari suatu gen pada reseptor yang dilakukan secara komputerisasi.perancangan probe sangat bermanfaat untuk mengetahui desain probe sebelum mensintesisnya.Desain probe yang ideal di antaranya dapat membedakan dengan baik antara target yang diinginkan dan non target, selain itu juga dapat mendeteksi perbedaan konsentrasi gen di bawah kondisi hibridisasi. Penerapan DNA Probe itu sendiri meliputi pemilihan rekombinan cDNA tentang kloning.Dan Microarray DNA, dapat digunakan untuk mendeteksi perbedaan dalam ekspresi gen tingkatan dalam populasi yang berbeda dari sel-sel pada tingkat genome.Pada praktikum ini kita merancang,menganalisis probe secara komputerisasi menggunakan biofarmasetics database (NCBI), dilakukan dua percobaan pada gen Homo sapiens estrogen receptor 1, transcript variant 1, mRNA dengan kode gen NM_000125 dan Homo sapiens telomerase transcriptase (TERT) dengan kode gen NM_198253.2Dari data NCBI diketahui kode gen NM_000125 (Homo sapiens estrogen receptor 1, transcript variant 1, mRNA) memiliki panjang probe 6330 bp. Versi update terakhir pada tanggal 15 Maret 2015 dengan versi kode gen NM_000125.3. Gen ini merupakan gen pada manusia yang diketahui dengan melihat organism= Homo sapiens. Dari data NCBI juga diketahui adanya jurnal-jurnal terkait dengan gen ini. Referensi no.1 merupakan jurnal yang paling baru. CDS atau coding sequens menunjukkan sekuens yang ditranslasi menjadi protein. Potongan DNA merupakan gen panjang gen ini diketahui dari 1-6330 bp. Sedangkan yang menjadi protein diketahui dari nilai yang ditunjukkan oleh CDS. Dari data NCBI kode gen memiliki CDS dari basa 235....2022. Percobaan dilakukan dengan memblok sebagian dari CDS sebagian probe. Ada tiga probe yang dibandingkan dengan range sebagai berikut:Probe pendek yang diambil antara 241.....480 (240 bp)Probe sedang yang diambil antara 241....840 (600 bp)Probe panjang yang diambil antara1081......1980 (900 bp)Gen ini mengkode reseptor estrogen, ligan yang aktif dari faktor transkripsi terdiri dari beberapa domain yang penting untuk mengikat hormon, mengikat DNA, dan aktivasi transkripsi. Protein melokalisasi ke nukleus sehingga dapat membentuk homodimer dengan reseptor estrogen 2. Estrogen dan reseptornya sangat penting untuk perkembangan seksual dan fungsi reproduksi, akan tetapi memiliki peran dalam jaringan lain seperti tulang. Reseptor estrogen juga terlibat dalam proses patologis seperti pada kanker payudara, kanker endometrium, dan osteoporosis. Promotor alternatif penggunaan dan hasil splicing alternatif dalam puluhan transkrip varian, tetapi sifat yang lengkap dari banyak varian belum dapat ditentukan. Dalam merancang probe harus diantara region CDS yang telah ditetapkan sesuai dengan kode gen untuk memperoleh gen yang baik. Apabila rancangan probe diambil diluar region CDS akan menghasilkan kompetitor yang banyak, serta dapat memungkinkan basa yang bersesuaian dengan DNA yang jumlahnya sedikit. Penentuan probe yang spesifik dilakukan dengan membuat dan membandingkan tiga kombinasi probe yakni probe panjang, sedang, dan pendek yang diambil dari sekuen origin yang termasuk dalam range CDS. Probe panjang ialah probe yang mempunyai 900 pasang basa, probe sedang mempunyai 500 pasang basa, dan probe pendek mempunyai 200 pasang basa.Tiga parameter yang digunakan untuk menentukan suatu probe spesifik atau tidak yaitu skor makin tinggi maka makin bagus, jumlah kompetitor semakin banyak maka semakin tidak spesifik, persen coverage harus 100%, dan kompetitor nilainya harus berbeda dengan probenya, jika nilai kompetitornya sama dengan probe maka tidak spesifik.Pada probe I sepanjang 240 bp dihasilkan skor maksimal 444 dengan 2 kompetitor yang satu bernilai 444 yang lain bernilai 438. Hal ini menunjukkan bahwa probe tidak spesifik karena memiliki skor yang sama yaitu 444 dan walaupun berbeda hanya memiliki selisih 6 poin. Probe II sepanjang 600 bp dihasilkan skor maksimal 1109 dengan 2 kompetitor yang memiliki maksimal skor yaitu, 826 dan 815 . Hal ini menunjukkan bahwa probe spesifik karena memiliki skor yang lebih tinggi dan selisih yang ditunjukkan lebih besar. Probe III sepanjang 900 bp dihasilkan skor maksimal 1663 dengan 2 kompetitor masing-masing skor yaitu 464 dan 459. Hal ini menunjukkan bahwa probe sangat spesifik karena mempunyai skor yang tinggi dan selisih yang ditunjukkan semakin besar. Probe ke III ini merupakan probe yang hasilnya terbaik. Percobaan kedua adalah gen Homo sapiens telomerase transcriptase (TERT) dengan kode gen NM_198253.2 . Gen ini memiliki panjang probe 4018 bp. Kode gen NM_198253.2 merupakan versi update terakhir yaitu pada tanggal 15 Maret 2015. Gen ini merupakan gen pada manusia yang diketahui dengan melihat organism= Homo sapiens. Dari data NCBI juga diketahui adanya jurnal-jurnal terkait dengan gen ini. Referensi no.1 merupakan jurnal yang paling baru. Dari data NCBI kode gen memiliki CDS dari basa 59....3457. Percobaan dilakukan dengan memblok sebagian dari CDS sebagian probe, ada 3 yang dibandingkan dengan range sebagai berikut:Probe pendek yang diambil antara 241.....480 (240 bp)Probe sedang yang diambil antara 1021......1620 (600 bp)Probe panjang yang diambil antara 618...... 1517 (900bp)Pada probe I sepanjang 240 bp dihasilkan skor maksimal 444 dengan 2 kompetitor masing-masing skornya yaitu 381. Hal ini menunjukkan bahwa probe spesifik karena memiliki skor maksimal yang berbeda dengan kompetitor. Probe II sepanjang 600 bp dihasilkan skor maksimal 1109 dengan 2 kompetitor yang memiliki skor maksimal yang sama, hal tersebut berarti probe tidak spesifik karena skor maksimal tidak berbeda. Probe III sepanjang 900 bp dihasilkan skor maksimal 1663 dan 1242 dengan 2 kompetitor dengan skor maksimalnya yaitu 355. Hal ini menunjukkan bahwa probe III paling spesifik karena mempunyai skor maksimal yang paling tinggi dan selisih antara gen target dan kompetitor sangat besar. Probe ke III ini merupakan probe yang hasilnya terbaik. .

VII. KESIMPULAN1. Probe adalah indikator untuk mendeteksi ekspresi gen secara komputerisasi dengan beberapa metode, seperti northern blot (untuk RNA), southern blot (untuk DNA), dan western blot (untuk protein).2. Semakin panjang probe maka semakin akurat dan spesifik data yang didapat terhadap gen target.3. Probe dengan kode gen NM_000125.3 probe yang paling spesifik adalah probe yang ke 3 (panjang) daripada probe ke 2 (sedang) dan probe ke 1 (pendek) , dan probe ke 2 (sedang) lebih spesifik dari probe ke 1 (pendek).4. probe dengan kode gen NM_198253.2 yang spesifik adalah probe yang ke 3 (panjang) daripada probe ke 2 (sedang) dan probe ke 1 (pendek) , dan probe ke 1 (pendek) lebih spesifik dari probe ke 2 (sedang).

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Anonim 2015.Buku Petunjuk Praktikum Biologi Sel Molekular.Universitas Wahid HayimSemarangFatchiyah. 2000. Polymerase chain reaction. Brawijaya University. Malanghttp://www.ncbi.hlm.nih.gov (diakses tanggal 28 Maret 2015)Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga: Jakarta.

LAMPIRANHomo sapiens estrogen receptor 1 (ESR1), transcript variant 1, mRNANCBI Reference Sequence: NM_000125.3LOCUS NM_000125 6330 bp mRNA linear PRI 15-MAR-2015DEFINITION Homo sapiens estrogen receptor 1 (ESR1), transcript variant 1, mRNA.ACCESSION NM_000125VERSION NM_000125.3 GI:170295798KEYWORDS RefSeq.SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo.CDS 235..2022Summary: This gene encodes an estrogen receptor, a ligand-activated transcription factor composed of several domains important for hormone binding, DNA binding, and activation of transcription. The protein localizes to the nucleus where it may form a homodimer or a heterodimer with estrogen receptor 2. Estrogen and its receptors are essential for sexual development and reproductive function, but also play a role in other tissues such as bone. Estrogen receptors are also involved in pathological processes including breast cancer, endometrial cancer, and osteoporosis. Alternative promoter usage and alternative splicing result in dozens of transcript variants, but the full-length nature of many of these variants has not been determined. [provided by RefSeq, Mar 2014].

Homo sapiens telomerase reverse transcriptase (TERT), transcript variant 1, mRNANCBI Reference Sequence: NM_198253.2FASTA Graphics LOCUS NM_198253 4018 bp mRNA linear PRI 15-MAR-2015DEFINITION Homo sapiens telomerase reverse transcriptase (TERT), transcript variant 1, mRNA.ACCESSION NM_198253 NM_003219VERSION NM_198253.2 GI:109633030KEYWORDS RefSeq.SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo.CDS 59..3457Summary: Telomerase is a ribonucleoprotein polymerase that maintains telomere ends by addition of the telomere repeat TTAGGG.The enzyme consists of a protein component with reverse transcriptase activity, encoded by this gene, and an RNA component which serves as a template for the telomere repeat. Telomerase expression plays a role in cellular senescence, as it is normally repressed in postnatal somatic cells resulting in progressive shortening of telomeres. Deregulation of telomerase expression in somatic cells may be involved in oncogenesis. Studies in mouse suggest that telomerase also participates in chromosomal repair, since de novo synthesis of telomere repeats may occur at double-stranded breaks. Alternatively spliced variants encoding different isoforms of telomerase reverse transcriptase have been identified; the full-length sequence of some variants has not beendetermined. Alternative splicing at this locus is thought to be one mechanism of regulation of telomerase activity. [provided by RefSeq, Jul 2008].

laporan resmi biomol "merancang probe"

Documents