LAPORAN RESMI PRAKTIKUM IMUNOLOGI

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN NANGKA

TERHADAP TITER ANTIBODI PADA MENCIT YANG DIVAKSINASI HEPATITIS B

DI SUSUN OLEH :

GOLONGAN IVFBA ‘05

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TOKSIKOLOGIBAGIAN KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI UGMYOGYAKARTA

2007

1

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN NANGKA

TERHADAP TITER ANTIBODI PADA MENCIT YANG DIVAKSINASI HEPATITIS B

4. TUJUAN

1. Mahasiswa mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun nangka dengan variasi

kadar terhadap respon imun tubuh mencit yang di vaksin dengan virus hepatitis B

2. Mahasiswa memahami preparasi pengambilan serum dari darah hewan uji (mencit)

yang telah diberi immunostimulator dan immunisasi

3. Mahasiswa memahami prosedur isolasi makrofag dan isolasi limfosit

4. Mahasiswa memahami prosedur pengukuran titer antibody menggunakan metode

ELISA

DASAR TEORI

Imunologi merupakan studi mekanisme yang melindungi individu dari injuri.

Injuri atau tantangan dapat berasal dari mikroorganisme eksogenus, zat-zat kimiawi

eksogenus atau sel-sel eksogenus.

Sistem imun menjalankan tiga fungsi, yaitu pertahanan, homeostatis dan

pengawasan. Fungsi pertahanan yang dimaksud adalah pertahanan melawan invasi

mikroorganisme. Jika elemen pertahanan seluler berhasil menyebar maka hospes akan

muncul sebagai pemenang. Tetapi bila elemen-elemen tersebut hiperaktif maka tanda-

tanda tertentu yang tidak diinginkan seperti alergi atau hipersensitivitas timbul.

Sebaliknya, jika elemen-elemennya hipoaktif maka kerentanan terhadap infeksi ulang

akan bertambah seperti terlihat pada penyakit defisiensi imun.

Homeostatis berfungsi untuk memenuhi kebutuhan umum dari organisme

multiseluler untuk mempertahankan keseragaman dari jenis sel tertentu. Homeostatis

tersebut memperhatikan fungsi degenerasi dan katabolit normal dari isi tubuh dengan

2

pembersihan elemen-elemen yang rusak, seperti eritrosit dan leukosit dalam sirkulasi.

Elemen-elemen sel ini mungkin rusak selama perjalanan jika hidup normal atau

sebagai akibat yang merugikan.

Pengawasan dini berfungsi untuk memonitor pengenalan jenis-jenis sel yang

secara tetap selalu timbul dalam tubuh. Sel-sel mutan tersebut dapat terjadi secara

spontan atau disebabkan oleh pengeruh virus tertentu. System imun diberi tugas

pengenalan atau pembuangan badan-badan baru yang di dapat, sebagian besar tugas

ini terjadi di permukaan sel.

Imunomodulasi merupakan cara untuk mengembalikan dan memperbaiki sistem

imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang fungsinya berlebihan.

Obat-obatan yang dapat mengembalikan ketidakseimbangan sistem imun disebut

imunomodulator. (Barathawidjaja, 2000)

Obat-obat golongan imunomodulator bekerja menurut tiga cara, yakni :

1) Imunorestorasi

Suatu cara untuk mengembalikan fungsi sistem imun yang terganggu dengan

memberikan berbagai komponen sistem imun, seperti immunoglobulin.

2) Imunostimulasi

Merupakan cara memperbaiki fungsi sistem imun dengan menggunakan bahan

yang merangsang sistem tersebut. Bahan-bahan yang dapat meningkatkan respon

imun disebut imunomodulator, misalnya levamisol. (Barathawidjaja, 2000)

3) Imunosupresi

Merupakan suatu tindakan untuk menekan respon imun. Kegunaannya di klinik

terutama pada transplatasi alat tubuh dalam usaha mencegah reaksi penolakan dan

pada penyakit autoimun untuk menghambat pembentukan antibodi. Contohnya

steroid.

Sedangkan cara untuk memasukkan bahan-bahan imunomodulator tersebut adalah

melalui imunisasi atau vaksinasi, yaitu suatu prosedur untuk meningkatkan derajat

imunitas seseorang terhadap patogen tertentu atau toksin. Idealnya adalah yang dapat

mengaktifkan sistem pengenalan imun dan sistem imun yang diperlukan. Menurut

Kato, vaksinasi adalah suatu cara memproduksi imunitas dengan memperkenalkan

3

antigen tidak toksik atau virus yang dilemahkan dalam wujud suatu vaksin.

Sedangkan imunisasi adalah suatu tindakan terhadap tubuh agar tubuh mempunyai

imunitas terhadap penyakit tertentu.

Definisi imunitas mencakup semua mekanisme fisiologi yang membantu tubuh

untuk mengenal pada dirinya, untuk menetralkan, menyisihkan atau memetabolisme

benda asing tersebut dengan atau tanpa kerusakan pada jaringannya.

Imunisasi sendiri dapat terjadi secara alamiah ataupun buatan, masing-masing

dibedakan menjadi imunisasi aktif dan pasif. Respon imun nonspesifik dapat terjadi

melalui mekanisme seluler dan humoral. Sedangkan respon imun spesifik

diklasifikasikan menjadi respon imun humoral serta respon yang diperantarai sel.

Respon imun humoral meliputi produksi antibodi oleh limfosit B dengan atau tanpa

bantuan limfosit T dan produk-produknya.

Limfosit

Limfosit diproduksi di sumsum tulang. Sekitar 20-30% leukosit darah

perifer tersusun atas limfosit. Sel ini mempunyai masa hidup lama. Limfosit bisa

diklasifikasikan menurut ukurannya, yaitu limfosit kecil (yang dibagi menjadi dua

tipe berdasrkan fungsinya yaitu limfosit T dan limfosit B), serta limfosit granula besar

(Large Granular Lymphocytes / LGL). Limfosit kecil berdiameter 8-10μm, dengan

perbandingan antara inti dan sitoplasma besar. Limfosit kecil ini tidak memiliki

granula sitoplasmik, sedangkan limfosit LGL mempunyai diameter lebih dari 16μm,

dengan perbandingan antara inti dan sitoplasma lebih kecil daripada limfosit kecil.

Sitoplasma ini bergranula.

Limfosit B menyusun kira-kira 5-10% dari limfosit total dan mengekspresikan

immunoglobulin permukaan. Immunoglobulin permukaan berfungsi sebagai reseptor

untuk antigen spesifik. Sebagian besar immunoglobulin permukaan adalah IgM dan

IgD. Beberapa sel B juga mengekspresikan IgA (Fike, 1997). Limfosit B

berdiferensiasi di sumsum tulang (Bellanti, 1993). Setelah matang sel B pindah ke

organ limfoid, seperti kelenjar getah bening ataupun limpa (Case dkk, 2001). Sel B

yang teraktivasi menghasilkan antibodi. Proses pembentukan antibodi dimulai ketika

sel B terpapar oleh antigen bebas atau ekstra seluler. Sel B menjadi teraktivasi,

4

membelah dan berdiferensiasi menjadi sebuah klon sel efektor yang disebut sel

plasma.

Makrofag

Sifat dasar fungsi makrofag adalah kemampuan mengingesti dan melenyapkan

bahan-bahan asing dan bahan yang mudah rusak. Proses endositik makrofag diduga

dimulai dengan interaksi bahan asing dengan membrane sel. Fagositosis dapat

dipermudah oleh adanya antigen yang diselimuti antibodi, ialah proses opsonisasi.

Antibodi dari bermacam-macam spesifitas dapat dilekatkan pada permukaan

makrofag melalui reseptor Fc-nya. Antibodi sitofilik ini memperlengkapi makrofag

dengan peningkatan kemampuan untuk mengenal, mengingesti, dan menghancurkan

substansi antigenic. Reseptor-reseptor untuk komponen-komponen yang tidak

tergantung pada reseptor-reseptor Fc juga membantu makrofag dalam melenyapkan

antigen-antigan dari lingkungannya.

Adjuvan adalah substansi-substansi yang dapat meningkatkan secara non spesifik

efektifitas imunologin pengimunisasi. Perannya yakni menambah area permukaan

antigen, memperlama penyimpanan antigen dlam tubuh, memberi kesempatan pada

sistem limfoid untuk menuju ke antigen.

Pemilihan adjuvan sangat mempengaruhi rute injeksi. Imunogen yang terlarut

dapat diberikan dengan cara intra dermal, intra peritoneal, sub cutan, intra muscular,

dan intra vena. Sebagai alasan perbedaan ini adalah bagaimana cepatnya imunogen

dibersihkan dari tempat injeksi dan kecenderungannya mencapai pusat limfoid yang

sangat penting.

Nangka

Nangka adalah nama sejenis pohon, sekaligus buahnya. Pohon nangka termasuk

ke dalam suku Moraceae; nama ilmiahnya adalah Artocarpus heterophyllus. Dalam

bahasa Inggris, nangka dikenal sebagai jackfruit.

Kerajaan : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

5

Ordo : Rosales

Famili : Moraceae

Genus : Artocarpus

Species : Artocarpus Heterophyllus

Pemerian

Pohon nangka umumnya berukuran sedang, sampai sekitar 20 m tingginya,

walaupun ada yang mencapai 30 m. Batang bulat silindris, sampai sekitar 1 m garis

tengahnya. Tajuknya padat dan lebat, melebar dan membulat apabila di tempat

terbuka. Seluruh bagian tumbuhan mengeluarkan getah putih pekat apabila dilukai.

Daun tunggal, tersebar, bertangkai 1-4 cm, helai daun agak tebal seperti kulit,

kaku, bertepi rata, bulat telur terbalik sampai jorong (memanjang), 3,5-12 × 5-25 cm,

dengan pangkal menyempit sedikit demi sedikit, dan ujung pendek runcing atau agak

runcing. Daun penumpu bulat telur lancip, panjang sampai 8 cm, mudah rontok dan

meninggalkan bekas serupa cincin.

Tumbuhan nangka berumah satu (monoecious), perbungaan muncul pada ketiak

daun pada pucuk yang pendek dan khusus, yang tumbuh pada sisi batang atau cabang

tua. Bunga jantan dalam bongkol berbentuk gada atau gelendong, 1-3 × 3-8 cm,

dengan cincin berdaging yang jelas di pangkal bongkol, hijau tua, dengan serbuk sari

kekuningan dan berbau harum samar apabila masak. Setelah melewati umur

masaknya, babal akan membusuk (ditumbuhi kapang) dan menghitam semasa masih

di pohon, sebelum akhirnya terjatuh. Bunga betina dalam bongkol tunggal atau

berpasangan, silindris atau lonjong, hijau tua.

Buah majemuk (syncarp) berbentuk gelendong memanjang, seringkali tidak

merata, panjangnya hingga 100 cm, pada sisi luar membentuk duri pendek lunak.

'Daging buah', yang sesungguhnya adalah perkembangan dari tenda bunga, berwarna

kuning keemasan apabila masak, berbau harum-manis yang keras, berdaging,

terkadang berisi cairan (nektar) yang manis. Biji berbentuk bulat lonjong sampai

jorong agak gepeng, panjang 2-4 cm, berturut-turut tertutup oleh kulit biji yang tipis

coklat seperti kulit, endokarp yang liat keras keputihan, dan eksokarp yang lunak.

Keping bijinya tidak setangkup.

6

Ekologi dan Ragam jenis

Nangka tumbuh dengan baik di iklim tropis sampai dengan lintang 25˚ utara

maupun selatan, walaupun diketahui pula masih dapat berbuah hingga lintang 30˚.

Tanaman ini menyukai wilayah dengan curah hujan lebih dari 1500 mm pertahun di

mana musim keringnya tidak terlalu keras. Nangka kurang toleran terhadap udara

dingin, kekeringan dan penggenangan.

Irisan buah nangka

Pohon nangka yang berasal dari biji, mulai berbunga pada umur 2-8 tahun.

Sedangkan yang berasal dari klon mulai berbunga di umur 2-4 tahun. Di tempat yang

cocok, nangka dapat berbuah sepanjang tahun. Akan tetapi di Thailand dan India

panen raya terjadi antara Januari – Agustus, sementara di Malaysia antara April –

Agustus atau September – Desember.

Varian nangka amat banyak jenisnya, baik dengan melihat perawakan pohon dan

bagian-bagian tanamannya, rasa dan sifat-sifat buahnya, maupun sifat-sifat yang tak

mudah dilihat seperti kemampuan tumbuhnya terhadap variasi-variasi lingkungan.

Dari segi sifat-sifat buahnya, umum mengenal dua kelompok besar yakni:

nangka bubur (Indonesia dan Malaysia), yang disebut pula sebagai khanun

lamoud (Thailand), vela (Srilangka) atau koozha chakka (India selatan); dengan

daging buah tipis, berserat, lunak dan membubur, rasanya asam manis, dan berbau

harum tajam.

nangka salak (Ind.), nangka belulang (Mal.), khanun nang (Thai), varaka

(Srilangka), atau koozha pusham (India selatan); dengan daging buah tebal, keras,

mengeripik, rasa manis agak pahit, dan tak begitu harum.

Nangka dapat berkawin silang dengan cempedak secara alami. Hasil silangannya

dinamai nangka cempedak.

7

Kandungan kimia

Kayu : morin, sianomaklurin ( zat samak ), flavon, tannin

Kulit kayu : tanin

Getah : asam serotat

Daging buah :

Mineral ( kalsium, besi, magnesium, phosphor, potassium, sodium, seng,

tembaga mangaan, selenium ),

Vitamin (vit. A, B-6, B-12, C, E, thiamin, riboflavin, niacin, folate )

Lemak ( asam lemak jenuh, saturated; asam lemak tak jenuh, monounsaturated;

asam lemak tak jenuh, polyunsaturated )

Karbohidrat

Albunimoid

Manfaat

Nangka terutama dipanen buahnya. "Daging buah" yang matang seringkali

dimakan dalam keadaan segar, dicampur dalam es, dihaluskan menjadi minuman

(jus), atau diolah menjadi aneka jenis makanan daerah: dodol nangka, kolak nangka,

selai nangka, nangka-goreng-tepung, keripik nangka, dan lain-lain. Nangka juga

digunakan sebagai pengharum es krim dan minumnan, dijadikan madu-nangka,

konsentrat atau tepung. Biji nangka, dikenal sebagai "beton", dapat direbus dan

dimakan sebagai sumber karbohidrat tambahan.

Babal alias tongtolang nangka

Buah nangka muda sangat digemari sebagai bahan sayuran. Di Sumatra, terutama

di Minangkabau, dikenal masakan gulai nangka. Di Jawa Barat buah nangka muda

antara lain dimasak sebagai salah satu bahan sayur asam. Di Jawa Tengah dikenal

8

berbagai macam masakan dengan bahan dasar buah nangka muda (disebut gori),

seperti sayur lodeh, sayur megana, oseng-oseng gori, dan jangan gori (sayur nangka

muda). Di Jogyakarta nangka muda terutama dimasak sebagai gudeg. Sementara di

seputaran Jakarta dan Jawa Barat, bongkol bunga jantan (disebut babal atau

tongtolang) kerap dijadikan bahan rujak.

Daun-daun nangka merupakan pakan ternak yang disukai kambing, domba

maupun sapi. Kulit batangnya yang berserat, dapat digunakan sebagai bahan tali dan

pada masa lalu juga dijadikan bahan pakaian. Getahnya digunakan dalam campuran

untuk memerangkap burung, untuk memakal (menambal) perahu dan lain-lain.

Kayunya berwarna kuning di bagian teras, berkualitas baik dan mudah dikerjakan.

Kayu ini cukup kuat, awet dan tahan terhadap serangan rayap atau jamur, serta

memiliki pola yang menarik, gampang mengkilap apabila diserut halus dan digosok

dengan minyak. Karena itu kayu nangka kerap dijadikan perkakas rumah tangga,

mebel, konstruksi bangunan, konstruksi kapal sampai ke alat musik. Dari kayunya

juga dihasilkan bahan pewarna kuning untuk mewarnai jubah para pendeta Buddha.

Levamisol

Levamisol merupakan derivate tertramizol yang sebelumnya digunakan untuk

mengeliminasi parasit intestine. Levamisol merupakan imunomodulator yang

memperbaiki fungsi system imun yang menurun. Levamisol dapat menstimulasi

pembentukan antibody yang bermacam-macam, mempertinggi respon sel T melalui

aktivasi dan proliferilasi sel T, fungsi makrofag dan monosit potensial yang meliputi

fagositosis, kemotaksis, peningkatan pergerakan dan perlekatan.

Levamisol dapat menstimulasi system imun normal dan menurun dan sering

diklasifikasikan keduanya dalam imunoregulator dan imunostimulan. Levamisol

mempengaruhi imunitas humoral dan imunitas yang ditengahi oleh sel dan telah

menunjukkan perbaikan pergerakan netrofil pada pasien yang terinfeksi virus herpes

simpleks. Levamisol mempengaruhi sel T pada tingkat yang lebih besar daripada sel

B, menimbulkan reaktivitas kutaneus pada hipersensitif tipe diperlambat dan

peningkatan fungsi sel T helper, supresor, dan sitotoksik (Anonim, 2003)

9

Menurut Barathawidjaja (2000), levamisol merupakan obat cacing yang dapat

meningkatkan proliferasi dan sitotoksisitas sel T serta mengembalikan energi (tidak

adanya daya untuk bereaksi) pada penderita kanker (imunostimulasi nonspesifik).

Levamisol juga dapat meningkatkan efek berbagai bahan seperti antigen, mitoxin, dan

factor kemotaktik.

Untuk merangsang limfosit, granulosit dan makrofag levamisol telah pula

digunakan dalam penanggulangn arthritis rheumatoid, penyakit virus dan lupus

eritematosus sistemik. Dosis yang diberikan 2,5 mg/kg BB secara oral untuk dua

minggu berturut-turut setiap hari dan sesudah itu, kalau masih perlu dapat diberikan

beberapa hari dalam seminggu. Efek sampingnya adalah mual, muntah, urtikaria, dan

agranulositosis (Barathawidjaja, 2000).

Levamisol ini mempunyai nama dagang Askamex (Konimex) tablet 25 mg dan

Ascaridil (Johnson and Johnson Indonesia) tablet 25 mg, 50 mg (Anonim, 2002)

Prednison

17-hydroxy-17-(2-hydroxyacetyl)-10,13-dimethyl- 7,8,9,10,12,13,14,15,16,17-decahydro- 6H-cyclopenta[a]phenanthreen-3,11-dione

Prednisone merupakan senyawa sintetik kortikosteroid biasanya diberikan secara

per oral atau dapat pula diberikan secara injeksi intramuskuler. Senyawa ini memliki

glukokortickoid effect. Prednisone merupakan suatu prodrug yang dalam hati

dimetabolisme menjadi prednisolosn, yang merupakan obat yang aktif dan beresifat

steroid.

Dosis : 20-80mg per hari, 1 mg/kg untuk anak-anak yang beratnya lebih dari

50mg.

Efek samping dari obat ini sam denga obat glukokortikoid, yaitu mengakibatkan

kadar gula darah yang tinggi, apalagi padsa pasien penderita diabetes melitus. Efek

10

samping yang imsomnia, euphoria, pada pemejanan yang lama dapat mengakibatakan

Cushing's syndrome, kegemukan, osteoporosis, glaukoma, DM tipe II, serta depresi.

Hepatitis B

Istilah hepatitis dipakai untuk semua jenis peradangan hati (liver). Penyebabnya dapat

berbagai macam, mulai dari virus sampai obat-obatan, termasuk obat tradisional.

Virus hepatitis ada beberapa jenis, yakni hepatitis A, B, C, D,E, F, dan G. manifestasi

penyakit hepatitis akibat virus bisa akut (Hepatitis A) dapat pula hepatitis kronik

(hepatitis B,C) dan ada pula yang kemudian menjadi kanker hati (hepatitis B,C)

(Anonim, 2003).

Enzime Linked Immunosorbent Assay (ELISA )

ELISA merupakan immunoassay heterogen paling popular yang

mempunyai label enzim dan menggunakan fase padat dalam teknik pemisahan

(Sheehan, 1997). Ciri utama teknik ini adalah dipakai indicator enzim untuk reaksi

imunologi (Burgess, 1995).

ELISA digunakan untuk menemukan antibodi. Dalam hal ini antigen

mula-mula diikat benda padat kemudian ditambah antibodi yang akan dicari. Setelah

itu ditambah lagi antibodi yang bertanda enzim, seperti periksodasefosfatase.

Akhirnya ditambahkan substrat kromogenik yang bila bereaksi dengan enzim dapat

menimbulkan perubahan warna. Perubahan warna yang terjadi sesuai dengan jumlah

enzim yang diikat dan sesuai pula dengan kadr antibodi yang dicari (Barathawidjaja,

2000).

Menurut Burgess (1995), ELISA dapat dikelompokkan ke dalam lima

konfigurasi, yaitu :

I. ELISA langsung

Merupakan konfigurasi ELISA paling sederhana. Antigen secara langsung

diabsorpsikan ke substrat padat permukaan substrat di cuci dan antibodi yang

ditempeli enzim digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Hasilnya kan

terlihat bila ditambah substrat. Konfigurasi ini memerlukan antiserum spesifik

11

untuk antigen yang dimaksud. Antiserum ini harus dikonjugasikan pada enzim.

Keterbatasan konfigurasi ini berkaitan dengan sifat pengikatan substrat padat dan

kualitas antibodi indikator. Pembatas utama sistem ini adalah tidak adanya

fleksibilitas. Keuntungan utama adalah kesederhanaan sistem. Konfigurasi ini

biasanya digunakan dalam assay untuk mengenali antigen.

II. ELISA tidak langsung

Merupakan konfigurasi paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur

titer antibodi. Antigen terabsorpsi pada substrat padat. Antibodi primer tidak

belabel dan dapat diperoleh dari serum atau cairan tubuh lain. Antibodi sekunder

terikat pada enzim ayng sesuai. Antibodi ini biasanya disebut dengan konjugat.

Hasil akan tampak jika ditambah substrat. Antigen dan antibodi sekunder

biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer. Kerapatan

optik berhubungan dengan konsentrasi antibodi primer. Kelemahan utama

konfigurasi ini terletak pada tidak adanya spesifitas. Sebagai akibat bereaksi

dengan antigen yang tidak murni.

III. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich

Konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk

menangkap antigen secara spesifik. Jika tingkat antibodi yang terdapat dalam

tubuh harus diukur, konfigurasi sisanya serupa dengan ELISA tak langsung.

Antibodi penangkap antigen dan sistem indikator dan yang akan berubah adalah

titer antibodi primer untuk antigen spesifik.

IV. ELISA penangkap antibodi

Konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat.

Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempeli antigen

berlabel.

V. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok

12

Teknik ini dapat digunakan dalam sejumlah konfigurasi dasar. Kompetisi dapat

terhadap antigen atau antibodi. Assay kompetitif membutuhkan antigen untuk

ditangkap antigen secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat

padat. Antibodi yang telah dikenal bersaing dan antibodi yang tidak dikenal akan

mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui

dapat dilabel atau dideteksi menggunakan antibodi anti spesiesnya. Cara ini dapat

membedakan respon imun terhadap organisme yang dekat hubungannya.

Kelebihan ELISA adalah cukup sensitif, reagen mempunyai self life cukup

panjang, dapat menggunakan spektrofotometer biasa dan mudah dilakukan untuk

automatisasi dan yang paling penting adalah tidak mengandung bahan radioaktif

(Kresno, 1996). Tiap plate dapat mengandung sampai dengan 96 sumuran sehingga

sampel yang banyak dapat diukur. Prosedur ini dari observasi mempunyai

keuntungan bahwa permukaan plastik dapat mengabsorpsi rendah tapi mampu

mendeteksi sejumlah protein (Kenney and Arakawa, 1997).

Penerapan klinik metode ELISA bermacam-macam, baik untuk diagnosis

serologic infeksi, misalnya penerapan antibody terhadap bakteri, parasit, atau virus

maupaun serodiagnosis yang lain, misalnya penetapan petanda ganas, alergi, penyakit

autoimun, dan sebagainya.

5. ALAT DAN BAHAN

Alat:

- Pipa kapiler

- Ependrof

- Jarum suntik ujung tumpul (per-oral)

- Jarum suntik (intraperitoneal)

- Erlenmeyer

- Gabus

- Aluminium foil

- Jarum penthul

- Mikropipet

13

- Alat sentrifuge

- Sumuran

- Inkubator

- ELISA reader

Bahan:

- Mencit jantan dan betina (jenis Swiss)

- Daun nangka

- Kloroform

- CMC

- Levamisol

- Prednison

- Vaksin Hepatitis B

- OPD (Ortho-phenylendiamine)

- BSA1%

- PBS

- PBST20

- RPMI

6. CARA KERJA

Penentuan Perlakuan pada Hewan Uji

Mencit (Swiss) dibagi untuk 9 kelompok

(@ 6 mencit)

Masing-masing mencit ditimbang

14

Kontrol CMC

Levamisol

Prednison

Ekstak polar 50 mg/kg

BB

Ekstrak polar 100

mg/kg BB

Ekstrak polar 200 mg/ kg

BB

Ekstrak non-polar

50 mg/kg

BB

Ekstrak non-polar 100

mg/kg BB

Ekstrak non-polar 200

mg/kg BB

Diambil sampel darah dari vena cavila occulair

Diberi perlakuan per-oral

Imunisasi pada Hewan Uji

Vaksin hepatitis B diberikan

Secara intraperitoneal

Imunisasi pertama dilakukan setelah 7 hari perlakuan

Imunisasi kedua dilakukan pada hari ke- 21

Imunisasi ketiga dilakukan pada hari ke-35

Pengumpulan Serum dari Darah Hewan Uji

Gunakan pipa kapiler untuk mengalirkan darah

dari vena cavila occulair

Tampung darah dalam ependrof

Diamkan selama 1 jam pada suhu kamar

Sentrifugasi

Ambil serrumnya

Serum diisolasi dan disimpan dengan temperatur –200C

Pengukuran titer antibodi dengan metode ELISA

Mikropipet dilapisi vaksin Hepatitis B 100 mikroltr dalam PBS 10 ml

15

Masukkan pada tiap sumuran

Inkubasi pada suhu 40C

Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali

Pada sumuran ditambahkan BSA 1% dalam PBS 100 mikroliter

Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C

Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali

Pada sumuran diberi serum yang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 100

mikroliter

Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C

Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali

Ditambah konjugat yang telah diencerkan PBS

Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C

Cuci sumuran dengan PBST20 sebanyak 3 kali

Ditambah substrat ODP 100 mikroliter

Inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar

Amati warna yang terbentuk

16

Baca pada Elisa reader

Isolasi Limfosit dan Makrofag

Mencit dimatikan dengan kloroform

Mencit ditelentangkan pada gabus yang telah dilapisi alumunium foil dan dijepit

di kedua kaki tangannya

Kulit bagian perut dibuka

Selubung peritoniumnya disterilisasi dengan alkohol 70%

Suntikkan RPMI sebanyak 5-7 ml pada rongga peritonium hingga

menggelembung, namun tidak bocor

Ditepuk perlahan-lahan

Campuran media dan makrofag diaspirasi kembali dari rongga peritoneal

Limfosit dilisis dengan Natrium Hiperklorat

Sentrtifuge

Hitung jumlah limfosit dan makrofag dengan alat hemositimeter di bawah

mikroskop

7. DATA DAN PERHITUNGAN

UJI SIGNIFIKANSI ANTARA BASE LINE DENGAN SERUM HARI KE-14 DAN HARI KE-28 DENGAN UJI PAIR SAMPLE T TEST (WILCOXON SIGNED RANKS TEST)

NPar TestsWilcoxon Signed Ranks Test

17

Ranks

14a 17.36 243.00

23b 20.00 460.00

0c

37

Negative Ranks

Positive Ranks

Ties

Total

O.D14 - BaseLineN Mean Rank Sum of Ranks

O.D14 < BaseLinea.

O.D14 > BaseLineb.

O.D14 = BaseLinec.

Test Statisticsb

-1.637a

.102

Z

Asymp. Sig. (2-tailed)

O.D14 -BaseLine

Based on negative ranks.a.

Wilcoxon Signed Ranks Testb.

Ranks

12a 11.29 135.50

9b 10.61 95.50

0c

21

Negative Ranks

Positive Ranks

Ties

Total

O.D.28 - BaselineN Mean Rank Sum of Ranks

O.D.28 < Baselinea.

O.D.28 > Baselineb.

O.D.28 = Baselinec.

Test Statisticsb

-.695a

.487

Z

Asymp. Sig. (2-tailed)

O.D.28 -Baseline

Based on positive ranks.a.

Wilcoxon Signed Ranks Testb.

HipotesisHo: tidak ada perbedaan nilai optical density sebelum dan sesudah diberi vaksin.Ha: ada perbedaan nilai optical density sebelum dan sesudah diberi vaksin.Pengambilan keputusanJika sig>0.05 maka Ho diterimaJika sig<0.05 maka Ho ditolak

UJI DISTRIBUSI HASIL ELISA DENGAN UJI KOLMOGOROV-SMIRNOV

18

NPar Tests

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Base Line O.D.14 O.D.28N 54 37 21

Normal Parameters(a,b)Mean .0667 .0682 .0551Std. Deviation .05657 .05626 .04520

Most Extreme Differences

Absolute .190 .201 .227Positive .190 .201 .227Negative -.158 -.159 -.134

Kolmogorov-Smirnov Z 1.394 1.224 1.042Asymp. Sig. (2-tailed) .041 .100 .228

a Test distribution is Normal.b Calculated from data.

OnewayTest of Homogeneity of Variances

pengambilan1

Levene Statistic df1 df2 Sig.

3.584 8 28 .006

NPar TestsKruskal-Wallis Test

Ranks

4 24.00

3 22.33

3 19.17

6 11.75

4 5.13

3 27.00

4 14.00

5 23.80

5 27.10

37

kelompok1

2

3

4

5

6

7

8

9

Total

O.D14N Mean Rank

19

Test Statisticsa,b

16.692

8

.033

Chi-Square

df

Asymp. Sig.

O.D14

Kruskal Wallis Testa.

Grouping Variable: kelompokb.

HipotesisHo: tidak ada perbedaan nilai optical density antar kelompok pada pengambilan serum.Ha: ada perbedaan nilai optical density antar kelompok pada pengambilan serum.Pengambilan keputusan

Jika sig>0.05 maka Ho diterimaJika sig<0.05 maka Ho ditolak

Tabel Signifikansi Antar Kelompok Pada Serum Hari Ke-14 (Mann-Whitney)

Kelompok (I) Kelompok (J) Signifikansi (I-J)1 2

3456789

1.0000.8570.0380.0290.8570.2001.0000.556

2 3456789

1.0000.1670.0570.7000.6291.0000.571

3 456789

0.3810.1140.4000.6290.7860.250

4 56789

0.1710.0480.7620.0520.082

5 6789

0.0570.3430.0160.016

6 789

0.0570.7860.571

7 89

0.4130.111

8 9 0.841

20

ANALISIS PEMBERIAN EKSTRAK NANGKA SEBAGAI IMUNOMODULATOR

Data dan Perhitungan ELISATabel Optical Density setelah dikurangi blangko

Absorbansi blangko rata-rata:

Kelompok Perlakuan Serum M1 M2 M3 M4 M5 M6 Rata-rataI CMC Base line

Hari 14Hari 28

0.0390.0930.028

0.0410.1320.115

0.0260.043-

0.081--

0.0420.0470.031

0.087--

0.0530.0790.058

II Levamisol Base lineHari 14Hari 28

0.095--

0.0480.0330.015

0.078--

0.0530.0460.032

0.0400.1510.037

0.071--

0.0640.0770.028

III Prednison Base lineHari 14Hari 28

0.103--

0.019--

0.0610.101-

0.2500.025-

0.056--

0.0620.053-

0.0920.060-

IV Ekstrak Polar 50mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.0190.025-

0.0800.088-

0.0100.0180.013

0.0100.0300.017

0.0150.0360.005

0.0170.0310.033

0.0250,0380,017

V Ekstral Polar 100 mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.055--

0.0230.021-

0.0210.024-

0.0410.027-

0.0280.021-

0.018--

0,0310,023-

VI Ekstrak Polar 200mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.0660.0630.082

0.044--

0.088--

0.0560.0900.084

0.0600.103-

0.065--

0,0630,0850,083

VII Ekstrak Non Polar 50mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.105--

0.097--

0.0340.035-

0.2770.0080.048

0.0360.0430.085

0.0720.057-

0,1040,0360,067

VIII Ekstrak Non Polar 100mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.2680.2710.133

0.106--

0.0740.137-

0.0470.0520.034

0.0390.0320.033

0.0470.0370.057

0,0970,1060,064

IX Ekstrak Non Polar 200mg/kgBB

Base lineHari 14Hari 28

0.0620.0270.022

0.051--

0.1520.1840.188

0.0620.152-

0.0720.1060.050

0.0900.086-

0,0820,1110,087

Perbandingan Optical Density antara Ekstrak Nangka dengan Kontrol CMC Ekstrak terenapkan etanol

Kadar 50 mg/kg BB

21

Kadar 100 mg/kg BB

Kadar 200 mg/kg BB

Ekstrak tak terendapkan etanolKadar 50 mg/kg BB

Kadar 100 mg/kg BB

Kadar 200 mg/kg BB

Kontrol positif

Kontrol negatif

22

Serum Optical Density Kontrol CMC

Perlakuan-dosis

Optical Density

Indeks Efek imunostimulansia menurut Wagner

Hari-14 0.079 Polar-50Polar-100Polar-200Non polar-50Non polar 100Non polar 200LevamisolPrednison

0.0380.0230.0850.0360.1060.1110.0770.060

0.4810.2911.0760.4561.3421.4050.9750.759

ImunosupresanImunosupresanTidak aktifImunosupresanImunostimulan sedangImunostimulan sedangImunostimulan ?Imnosupresan

Hari-28 0.058 Polar-50Polar-100Polar-200Non polar-50Non polar 100Non polar 200LevamisolPrednison

0.017-0.0830.0670.0640.0870.028-

0.293-1.4311.1551.1031.5000.483-

Imunosupresan-Imunostimulan sedangTidak aktifTidak aktifImunostimulan sedangImunosupresan-

PEMBAHASAN

Penentuan Perlakuan pada Hewan Uji

Praktikum kali ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun

nangka dengan variasi kadar terhadap respon imun tubuh mencit yang di vaksin dengan

virus hepatitis B. Selain itu, agar mahasiswa mengetahui prosedur isolasi makrofag dan

isolasi limfosit serta memahami prosedur pengukuran titer antibody menggunakan

metode ELISA.

Untuk menjalankan serangkaian praktikum ini, praktikan dibagi menjadi sembilan

kelompok. Masing-masing kelompok diberi enam ekor mencit percobaan, dengan

pembagian sebagai berikut: Kelompok 1 diberi perlakuan sebagai control CMC,

kelompok 2 diberi Levamisol, kelompok 3 diberikan Prednison, kelompok 4 perlakuan

ekstrak polar 50 mg/kg BB, kelompok 5 perlakuan ekstrak polar 100 mg/kg BB,

23

kelompok 6 perlakuan ekstrak polar 200 mg/kg BB, kelompok 7 perlakuan ekstrak non-

polar 50 mg/kg BB, kelompok 8 perlakuan ekstrak non-polar 100 mg/kg BB, kelompok 9

perlakuan ekstrak non-polar 200 mg/kg BB.

Langkah pertama, masing-masing hewan uji ditimbang, agar volume pemberian

larutan perlakuan dapat dihitung. Sebelum diberikan perlakuan, terlebih dahulu sampel

darah dari masing-masing mencit diambil melalui vena cavila occulair agar lebih mudah

mendapatkannya dan tidak menyakiti hewan uji bila prosedur pengambilan dijalankan

dengan cara yang benar. Setelah itu, baru diberikan larutan perlakuan secara per oral.

Imunisasi pada Hewan Uji

Imunisasi dilakukan setelah 7 hari mencit diberi perlakuan. Tujuan imunisasi

adalah untuk mengenalkan antigen yang akan menstimulasi system imun dalam

memproduksi antibody. Untuk imunisasi digunakan vaksin hepatitis B yang berisi protein

virus hepatitis B yang telah mengalami proses pengurangan virulensi yang dikenal

sebagai atenuasi (perlemahan). Pada atenuasi, meskipun organisme itu hidup tetapi tidak

dapat menyebabkan penyakit.

Imunisasi yang dilakukan adalah imunisasi aktif secara buatan karena yang diberikan

adalah vaksin. Vaksin mengandung antigen yang merangsang system imun tubuh untuk

membentuk antibody guna melawan antigen yang dianggap sebagai benda asing pada

imunisasi aktif. Perlindungan tidak terbentuk segera, tetapi sekali terbentuk akan

berlangsung lama. Pemberian imunisasi ulang akan mengakibatkan peningkatan tanggap

kebal sekunder.

Injeksi dilakukan secara intraperitoneal, karena rongga peritoneal relatif besar

sehingga volume antigen yang diinjeksikan dapat lebih banyak. Penyuntikan secara

intraperitoneal tidak secara langsung membawa antigen ke dalam sirkulasi sistemik

sehingga partikulat antigen dapat menstimulasi respon imun. Pada penelitian yang

dilakukan Kahl dkk (1989), menunjukkan bahwa imunisasi secara intraperitoneal pada

mencit menghasilkan titer antibody lebih tinggi dibandingkan subkutan.

Kemudian, imunisasi kedua dilakukan pada hari ke-21. Injeksi sekunder ini

dilakukan pada hari ke-21 agar antibody yang terbentuk dari imunisasi pertama telah

mencapai puncak sebelum imunisasi yang kedua. Injeksi sekunder dimaksudkan untuk

24

memberikan antigen pada pemaparan yang kedua sehingga system memori dari system

kekebalan tubuh dapat aktif dan menghasilkan antibody lebih cepat dibandingkan pada

pemaparan antigen yang pertama.

Imunisasi ketiga dilakukan pada hari ke-35, yaitu satu minggu sebelum dilakukan

kultur limfosit dan makrofag. Injeksi ini dilakukan untuk menginduksi respon imun yang

baik dan kuat. Selain untuk menginduksi respon, injeksi ini bertujuan untuk menghindari

shock anafilaksis (hipersensitivitas tipe cepat berupa gangguan pernafasan).

Pengumpulan Serum dari Darah Hewan Uji

Pengambilan darah dari mencit dilakukan pada hari ke-0, 14, dan 28. Sampel

diambil pada waktu tersebut karena diperkirakan jumlah antibody yang terbentuk akibat

vaksinasi dengan vaksin hepatitis B telah mencapai kadar puncak sehingga dapat

dideteksi dengan metode ELISA.

Darah yang telah diambil, didiamkan selama satu jam pada suhu kamar agar

terjadi koagulasi sempurna, kemudian disentrifuge sehingga didapatkan serum. Serum

diisolasi dan disimpan pada temperatur –200C sampai saat akan digunakan.

ELISA

Enzyme Ling Immuno Sorbent Assay merupakan metode biokimia yang digunakan

dalam immunologi untuk mendeteksi antibody maupun anti gen dalam suatu sampel.

Prinsip dasar kerja Elisa adalah bahwa suatu antibody dapat mengenali epitop tertentu

secara spesifik. Ikatan kovalen kompleks antigen-antibody tersebut kemudian

divisualisasi dengan cara penambahan antibody kedua yang dikonjugasikan dengan suatu

enzim atau senyawa fluoresens. Kemudian kompleks tadi dipaparkan pada kompleks

tertentu sehingga akan terbentuk warna yang dapat diukur menggunakan metode

kolorimetri maupun spektrofotometri.

Penetapan kadar immunoglobulin dalam percobaan ini menggunakan metode

ELISA tidak langsung dengan sampel serum. Sampel serum dipilih karena di dalam

serum tersebut mengandung berbagai bahan larut tanpa sel, jumlah protein yang lebih

sedikit daripada plasma karena ribrin dan fibrinogennya telah digunakan untuk

pembekuan darah.

25

Prinsip metode elisa tidak langsung adalah mereaksikan antigen dalam hal ini

antigen HAV (Havrix) yang sudah dilekatkan pada permukaan sumuran dengan antibody

serum, kemudian direaksikan lagi dengan antigen spesifik berlabel enzim (AgE) yaitu

antimouse peroksidase sehingga membentuk kompleks Ag-Ab-AgE. Sehingga ketika

ditambahkan substrat yang sesuai maka kompleks tersebut akan menghidrolisis substrat.

Substrat yang dipilih adalah substrat yang kromogenik sehingga ketika dihidrolisis akan

menghasilkan senyawa berwarna yang dapat diukur intensitasnya (optikal density).

Dalam praktikum ini digunakan OPD (Ortho-phenylendiamine). Intensitas warna

akan sebanding pula dengan banyaknya substrat yang terhidrolisis dan secara otomatis

akan sebanding pula dengan banyaknya antibody yang ada dalam serum. Hidrolisis

substrat biasanya memerlukan waktu tertentu dan untuk menghentikan reaksinya

digunakan asam atau basa kuat. Reaksi ELISA harus dalam keadaan optimal, konsentrasi

reaktan, suhu maupun wqaktu inkubasi. Biasanya tiap kit reagen memberikan petunjuk

yang berbeda-beda.

Pengukuran titer antibodi dengan metode ELISA

Titer antibodi diukur dari serum mencit yang diambil setelah vaksinasi.

Pengambilan dilakukan sebanyak tiga kali yaitu sebagai base line, hari ke-14, dan hari

ke-28 Kemudian dianalisis antibodinya menggunakan ELISA. Metode ELISA yang

digunakan adalah ELISA tak langsung karena metode tersebut karena metode merupakan

metode yang paling sederhana yang dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi

dimana antigen antigen teradsorbsi secara pasif pada matriks padat. Matriks yang

digunakan adalah mikroplate karena mudah dipakai bila jumlah sampelnya banyak.

Mikroplate ini juga dapat digunakan pada percobaan dengan rektan yang sedikit dan

hasilnya dapt ditentukan dengan mengukur substrat yang teredegradasi. Titer yang diukur

tidak spesifik satu jenis saja, dan merupakan antibodi polimonoklonal. Akan tetapi

sebagian besar berupa subkelas IgG karena divaksinasi Havrix secara i.p. untuk IgM dan

IgA akan lebih besar keluar jika divaksinasi secara rectal.

Langkah pertama yang dilakukan pada percobaan ini adalah mikropipet dilapisi

dengan vaksin hepatitis B 100 µl dalam coating buffer sebanyak 10 ml. Dalam hal ini

coating buffer yang digunakan adalah PBS. Kemudian dimasukkan pada tiap sumuran

kemudian diinkubasi 4°C agar antigen benar-benar teradsorbsi kuat pada mikroplet.

26

Lama inkubasi harus diperhatikan dan tidak boleh terlalu lama yaitu sekitar 1jam, karena

jika terlalu lama akan menimbulkan reaktivitas antigen-antibodi akibat pelapisan yang

berlebihan. Peningkatan jumlah antigen maka laju pelepasan antigen akan lebih cepat.

Hal tersebut akan menghambat pengikatan antibody terhadap antigen sehingga akan

menurunkan sensitivitas. Konsentrasi antigen yang tinggi juga dapat menyebabkan

kerapatan pengikatan antigen yang tinggi pada matriks padat sehingga dapat merubah

konformasi antigen serta mengurangi tempat pengikatan sterik antibody. Hal tersebut

dikarenakan oleh susunannya yang rapat dan berlapis-lapis.

Langkah berikutnya yaitu mencuci dengan PBST20 sebanyak tiga kali. Tujuan dari

pencucian ini adalah untuk menghilangkan antigen yang terikat pada pada mikroplate

untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik. Mikropipet kemudian dilakukan

pemblokingan menggunakan BSA 1% dalam PBS sebanyak 100µl kemudian diinkubasi

selama 1 jam pada suhu 37ºC. dengan pemblokingan ini cairan BSA 1% akan menutupi

tempat-tempat yang kosong sehingga reaksi non-spesifik dapat dihambat. Penghambatan

ini sangatlah penting karena karena jika tidak dihambat akan mengganggu hasil analisis.

Perlakuan inkubasi dimaksudkan agar pemblokingan dapat terjadi secara sempurna.

Kemudian dicuci kembali menggunakan PBST20 sebanyak tiga kali, untuk

menghilangkan BSA yang tidak terikat. Sumuran kemudian ditambahkan dengan serum

yang telah diencerkan dengan PBS, dengan faktor pengenceran 10 kali. Serum yang

ditambahkan pada tiap sumuran adalah sebanyak 100µl. Setelah penambahan serum

maka mikroplate diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37ºC. Hal ini dimaksudkan agar

antibodi yang terkandung dalam serum dapat dapat mengenali dan berikatan dengan

antigen yang telah terikat pada mikroplate. Kemudian dilanjutkan dengan pencucian

kembali menggunakan PBST20 sebanyak tiga kali, dengan maksud untuk menghilangkan

bahan-bahan lain serta antibodi yang tidak terikat pada antigen pada mikropiopet,

sehingga gangguan analisis dapat diminimalisir.

Kemudian dilakukan penambahan konjugat sebanyak 100µl yang telah

diencerkan dengan PBS sebanyak 10 kali. Setelah penambahan konjugat maka dilakukan

inkubasi selama 1 jam dalam suhu 37 ºC. Hal ini dimaksudkan agar konjugat dapat terikat

sempurna dengan antibodi yang telah berikatan dengan antigen. Konjugat ini merupakan

antibodi kedua yang membawa enzim. Konjugat yang digunakan adalah Whole conjugate

27

yang berisi IgA, IgM, IgG, dan enzim pendegradasi substrat. Selanjutnya dilakukan

pencucian kembali menggunakan PBST20 untuk menghilangkan konjugat yang tidak

terikat dengan antibodi pertama. Kemudian ditambahakan substrat ODP (O-

Phenilenediamine). Substrat yang dimasukkan dalam tiap sumuran sebanyak 100 µl yang

kemudian diinkubasi selama 10 menit dalam suhu kamar. Substrat yang digunakan ini

bersifat sebagai kromogenik sehingga saat substrat terdegradasi oleh enzim yang terikat

pada konjugat maka akan terbentuk warna yang dapat terbaca pada ELISA reader.

Perlakuan inkubasi dimaksudkan agar reaksi degradasi substrat oleh dapat dapat berjalan

sempurna. Pada akhir perlakuan dilakukan penyetopan menggunakan H2SO4 2.5

sebanyak 10 µ untuk tiap sumuran. Tujuan pemberian H2SO4 ini dimaksudkan agar

menghentikan reaksi degradasi yang terjadi. Tahap akhir yaitu pembacaan absorbansi

pada 492 nm denagn ELISA reader dan hasilnya dianalisis secara statistic dengan

membandingkan nilai absorbansi yang terbentuk yang dianalogkan dengan jumlah

antibody yang terikat pada mikroplate untuk tiap-tiap perlakuan yang diambil serumnya

pada hari yang bertahap.

Langkah ELISA diawali dengan berikatannya antigen yang dilapisi pada

mikroplate dengan antibodi yang berasal dari mencit. Antibodi tersebut merupakan

antibodi pertama. Ikatan antigen-antibodi pertama akan kuat adan tidak terlepas saat

pencucian jika antigen spesifik terhadap antibodi pertama. Konjugat yang ditanbahkan

merupakan antibodi kedua yang mengikat enzim, antibodi kedua ini berikatan secara

spesifik dengan antibody pertama. Pada tahap kahir, ditambahkan substrat kromogenik.

Substrat secara spesifik akan berikatan dengan dengan enzim yang dibawa oleh antibodi

antibodi kedua dan substrat akan terdegradasi oleh enzim kan membentuk warana yang

dapat dibaca oleh ELISA. Pada warna yang terbentuk adalah orange. Absorbansi yang

terukur menunjukkan keberadaan antibodi yang pada serum mencit karena absorbansi

setara dengan jumlah substrat yang terdegradasi oleh enzim. Jumlah substrat sertara

dengan enzim, dan jumlah enzim setara dengan jumlah antibodi kedua. Antibodi kedua

ini jumlahnya sebandung dengan antibodi pertama. Maka secara tidak langsung

absorbansi menggambarkan jumlah antibodi pertama yang terdapat dalam hewan uji.

Maka ELISA yang dipakai dalam percobaan in adalah ELISA secara tidak langsung.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam ELISA:

28

1. Pencucian harus mengenai seluruh bagian sumuran dan diulangi sebanyak tiga

kali setiap pencucian agar reaktan yang tidak diperlukan tidak ikut dalam reaksi-

reaksi selanjutnya. Pencucian dilakukan untuk menghilangkan semua materi dari

luar dan yang ikatannya longgar dari permukaan fase padat. Jika pencucian tidak

dilakukan maka akan terbentuk ion berlapis ganda diffuse pada permukaan plastik

sumuran yang biasanya bermuatan negative sehingga pada bidang temu

lapisannya terganggu. Pencucian dilakukan sebanyak 4 kali:

a. Pencucian I : dilakukan setelah penempelan antigen pada substrat padat.

Pencucian ini dilakukan untuk menghilangkan antigen yang tidak terikat

pada substrat. Karena jika tidak dihilangkan maka antigen ini akan

berkompetisi dengan antigen yang terikat pada substrat padat dalam

mengikat antibody pada sampel.

b. Pencucian II : pencucian kedua dilakukan setelah antibody terikat pada

antigen (Ab-Ag). Hal ini bertujuan untuk menghilangkan antibody yang

tidak terikat pada antigen, antiboby berafinitas rendah serta senyawa lain

dalam serum yang dapat menggangu reaksi selajutnya. Di dalam tubuh

terdapat antibody yang berafinitas tinggi dan rendah, semakin tinggi

afinitasnya maka semakin kuat pula respon imunnya.

c. Pencucian III : pencucian ketiga dilakukan setelah panambahan AgE dan

kompleks Ag-Ab-AgE terbentuk. Pencucian ini bertujuan untuk

menghilangkan Age yang tidak terikat pada Ag-Ab.

d. Pencucian IV : pencucian keempat dilakukan setelah penambahan substrat

dan terjadi hidrolisa substrat ortho-phenylendiamine (OPD) oleh kompleks

Ag-Ab-AgE menjadi senyawa berwarna. Pencucian ini dilakukan untuk

menghilangkan substrat yang tidak terhidrolisis.

2. Sebaiknya dilakukan pengenceran sempel dengan mengunakan PBS yang

mengandung Tween 20 untuk menghindari absorbsi non spesifik pada dinding

sumuran oleh partikel. Selain itu digunakan control sebagai pembanding.

3. Pengaruh pinggir lempeng mikro, menurut dogma pengaruh pinggir atau

terbentuknya warna yang tidak terduga lebih banyak pada pinggir sumuran

lempeng mikrotiter adalah karena perbedaan suhu antara bagian dalam dan luar

29

sumuran. Hal demikian benar terjadi apabila regen yang disimpan pada suhu

kamar atau suhu yang lebih rendah ditamba kelempeng mikrotiter yang kemudian

diinkubasi pada suhu 37 C. Namun ada 2 hipotesis suhu yang perlu dikemukakan:

a. Pengaruh pinggir ditemukan meski reagen diseimbangkan pada suhu

tertentu dan diinkubasi yang dilakukan pada suhu ini.

b. Gradient suhu yang terlihat paling banyak 1-2 c, tidak cukup tinggi untuk

menyebabkan serum dengan antigen fase padat.

Uji signifikansi antara base line dengan serum hari ke-14 dan hari ke-28 dengan

uji Pair Sample T Test ( Wilcoxon Signed rangks Test). Dari hasil uji tersebut taraf

signifikansi optikal density hari ke-14 dan hari ke-28 dengan base line adalah sebesar

0,102 dan 0,487. Hasil keduanya menunjukan tidak ada perbedan signifikan antara base

line dengan serum hari ke-14 maupun hari ke-28. Tidak adanya perbedaan nilai optikal

density sebelum dan sesudah diberi vaksin ditunjukkan dengan nilai signifikansi yang

didapat lebih besar dari 0,05. Hal ini menunjukan bahwa ada kemungkinan mencit pernah

terpapar antigen sebelum diberi vaksin.

Uji Statistic Data Elisa

Suatu data dikatakan baik jika data tersebut terdistribusi normal. Oleh karena itu

perlu dilakukan uji normalitas untuk mengetahui apakah data tersebut terdistribusi normal

atau tidak. Uji ini dilakukan dengan uji normalitas Kolmodorof-Smirnov, uji ini

sebaiknya dilakukan sebelum data diolah berdasarkan model-model penelitian. Uji

normalitas ini bertujuan untuk mengetahui distribusi data dalam variable yang akan

digunakan dalam penelitian. Data yang baik dan layak digunakan dalam penelitian adalah

data yang memiliki distribusi normal. Dari uji distribusi hasil ELISA dengan uji

Kolmogorof-Smirnov (NPar Tests) menunjukan hasil terdistribusi normal. Untuk

meyakinkan bahwa data tersebut terdistribusi normal maka dilakukan uji homogenitas

varian (Oneway). Dari hasil uji homogenitas varian di dapat taraf signifikansi sebesar

0,006 yang berarti data tersebut tidak homogen. Taraf signifikansi menunjukkan

homogenitas data, sedangkan suatu data dikatakan homogen jika taraf signifikansinya di

atas 0,005. Oleh sebab itu, uji Anova tidak dapat dilakukan dan untuk uji stastistiknya

dilakukan dengan uji Kruskal-Wallis.

30

Uji Kruskal-Wallis

Uji Kruskal-Wallis dilkukan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan nilai

optical density antar kelompok pada pengambila serum. Dari table hasil uji Kruskal-

Wallis didapat nilai signivikansi antar kelompok pada pengambilan serum hari ke-14

sebesar 0,033 dan nilai signifikansi antar kelompok pada pengambilan serum hari ke 28

sebesar 0.147. hal ini berarti pada pengambilan serum hari ke 14 terdapat perbedaan nilai

optical density yang signifikan antar kelompok karena nilai signifikansi dibawah 0,05.

Sedangkan pada pengambilan serum hari ke 28, tidak terdapat perbedaan nilai optical

density yang signifikan antar kelompok karena nilai signivikansinya di atas 0,05. Uji ini

tidak dapat menunjukkan kelompok mana saja yang berbeda signifikan dan kelompok

mana yang tidak berbeda signifikan. Oleh karena itu untuk mengetahui kelompok mana

saja yang berbeda signifikan dan yang tidak berbeda signifikan, maka dilakukan uji

Mann-Whitney. (hasil output SPSS ada di lampiran)

Uji Mann-Whitney

Uji Mann-Whitney merupakan bagian dari statistic non parametric yang bertujuan

untuk membantu para peneliti di dalam membedakan hasil kinerja kelompok yang

terdapat dalam sempel kedalam 2 kelompok dengan dua criteria yang berbeda. Uji ini

digunakan untuk mengetahui beda dengan menggunakan rata-rata variable dengan jumlah

data sample penelitian yang sangat sedikit (kurang dari 30). Uji mann-whitney di

gunakan untuk menguji satu variable kategori dengan satu variable ordinat. (Tommi

poltak Mario, hal 78). Data dikatakan berbeda secara signifikan apabila memiliki taraf

signifikansi < 0.05. Data yang berbeda signifikan adalah data antara kelompok: 1-4, 1-5,

4-6, 5-8, dan 5-9

Analisis pemberian ekstrak nangka sebagai immunomodulator.

Dari perbandingan optical density antara ekstrak nangka dengan kontrtol CMC

didapat indeks fagositik untuk menentukan kriteria immunostimulansi (menurut Wagner)

Indeks immunostimulan menurut wagner yaitu aktif sebagai immunostimulan

jika nilai indeks fagositik ( K) berbeda diantara 1-1,5.

Jika 1< k ≤1,5 bersifat immunostimulan sedang.

31

Jika nilai K > 1,5 bersifat immunostimulan kuat.

jika nilai K < 1,5 maka bersifat immunosupresan

Dari indeks fagositik (K) yang menunjukkan hasil:

a. immunosupresi = serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 50,

serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 100,

serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 100

serum hari ke-28 perlakuan dosis polar 50.

b. immunostimulan aktif sedang = serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 100

serum hari ke-14 perlakuan dosis non polar 200,

serum hari ke-28 perlakuan dosis polar 200

serum hari ke-28 perlakuan dosis non polar 200

c. immunostimulan tidak aktif = serum hari ke-14 perlakuan dosis polar 200

serum hari ke-28 perlakua dosis non polar 50

serum hari ke-28 perlakuan dosis non polar 100.

Isolasi Makrofag dan Limfosit

Makrofag merupakan antigen yang membantu proses antigen sedemikian rupa

sehingga menimbulkan interaksi dengan sel sistem imun spesifik. Makrofag dapat

diisolasi dari rongga peritonial atau perut mencit, mencit yang digunakan adalah mencit

jenis swiss.

Pertama-tama mencit dikorbankan dengan memasukkannya ke dalam wadah yang

telah dijenuhi oleh kloroform, tutup rapat-rapat. Setelah didiamkan, mencit yang mati

dibiarkan terlentang pada gabus yang telah diberi aluminium foil dan dijepit di kedua

kaki tangannya. Langkah berikutnya adalah, kulit bagian perut dibuka atau dibedah,

selubung peritoniumnya dilakukan sterilisasi dengan menggunkan alkohol 70%.

Kemudian disuntikkan RPMI sebanyak sekitar 5 ml pada rongga peritonium hingga

mengelembung, namun tidak sampai bocor, kemudian ditepuk-tepuk atau ditekan-tekan

secara perlahan-lahan agar makrofag yang berada dalam jaringan ikat dapat larut dalam

larutan RPMI. Pengambilan ini dipilah dalam rongga peritonium karena secara teoritis,

makrofag akan bermigrasi besar-besaran ke tempat terjadinya infeksi.

32

Vaksinasi yang dilakukan adalah secara intraperitonial maka dapat diasumsikan

makrofag akan banyak terdapat di rongga peritonial karena di sanalah terjadi infeksi.

Setelah campuran media dengan makrofag diaspirasi kembali ke rongga peritonial, maka

cairan tadi disenterifuge dan dihitung jumlahnya dengan menggunakan alat

hemositimeter di bawah mikroskop. Sebelum disentrifuge, limfosit dilisis dengan bantuan

Natrium Hiperklorat. Namun ternyata uji dengan alat hemositometer tidak dilaksanakan

karena alat yang tidak ada atau terbatas . Namun secara teoritis memperlihatkan bahwa

jumlah makrofag lebih kecil daripada limfosit, kadang hasil ujinya menunjukkan

kenaikan seiring dengan kenaikan kadar pemberian ekstrak daun nangka. Hal ini

kemungkinan besar karena antigen yang disuntikkan pada mencit adalah antigen spesifik

sehingga ketika dipaparkan , antibodi spesifik langsung diproduksi untuk mengikat

antigen tersebut. Hal ini menunjukkan adanya sel memori,yang mengenali antigen

bersangkutan, yang dihasilkan terhadap antigen karena vaksinasi dilakukan sebanyak tiga

kali pemejanan. Sebab, makrofag dikenal sebagai pengaktif limfosit karena salah satu

fungsinya adalah sebagai Antigen Presenting Cell(APC). Sebenarnya jumlah limfosit dan

makrofag pada manusia adalah sama, namun pada mencit jumlah limfositnya lebih

banyak daripada makrofag.

Pada praktikum, dilakukan dua kali sentrifugasi yaitu pada suhu kamar dan suhu

40 derajat celcius. Ternyata dihasilkan adanya perbedaan letak endapan. Pada suhu ruang

atau kamar, hasil endapannya terletak pada dinding sisi ependorf, sedangkan pada suhu

40 derajat celcius letak endapannya terletak di bawah. Jumlah makrofag mencit yang telah

diberi perlakuan ekstrak daun nangka memperlihatkan jumlah yang lebih besar pada

kontrol negatif dan pada kadar 10%, jumlahnya tampak lebih besar daripada perlakuan

dengan levamisol. Dengan demikian dapat disimpulkam bahwa meningkatnya kadar,

maka jumlah makrofagnya dan limfosit semakin meningkat. Kemampuan ekstrak daun

nangka relatif lebih besar daripada kekuatan levamisol dalam menginduksi proliferasi

makrofag dan limfosit karena jumlah limfosit dan makrofag yang dihasilkan ekstrak daun

nangka lebih banyak daripada perlakuan dengan levamisol.

Faktor-faktor kesalahan yang terjadi dalam praktikum ini sehingga datanya tidak

begitu signifikan, disebabkan oleh.:

1. faktor hewan uji

33

faktor kejiwaan mencit, yaitu mengalami sterss karena perlakuan yang lama,

perkelahian denagn sesamamanya di tempat dan pengambilan serum darah dari vena

mata yang memungkinkan menimbulkan respon imun yang tidak maksimal.

Suhu ruangan yang terlalu panas sehingga metabolisme tubuh dan kekebalan mencit

tidak teratur.

2. faktor praktikan

pemberian makan yang kurang teratur, atau tidak pasti setiap harinya.

Pemberan ekstrak yang dimuntahakan mencit karena ketidakatepatan dalam

menyuntikkannya.

Penyuntukan vaksin yang tidak tssepat pada rongga peritonial.

Pengambilan darah yang tidak tepat karena tekanan oleh tangan praktikan

Waktu yang tidak sama saat pendiaman darah saat koagulasi , dikhawatirkan jika

terlalu lama terdapat protein pengganggu dan terjadi hemolisis.

Kekeliruan saat pelabelan mencit

Warna limpa hasil isolasi yang tidak sesuai yang diharapkan, karena sel limfosit yang

tidak semuanya bisa dikeluarkan.

Kebocoran selaput peritonial saat isolasi makrofag yang kemungkinan makrofag ada

yang tercecer.

Masih adanya sisa pereaksi pada alat–alat ELISA karena pencucian yang tidak

sempurna.

Pengenceran yang tidak tepat

Ketelitian saat penghitungan jumlah limfosit dan makrofag pada hemositimeter

3. faktor alat dan bahan

spesifitas dan sensitivitas alat yang kuranag sempurna karena memberikan serapan

meskipun dalam keadaan kosong.

pereaksi elisa yang sudah tidak murni lagi dan terkontaminasi sehingga ikatan antara

antigen antibodinya kurang kuat.

enzim yang digunakan sudah berkuarang aktivitasnya sehingga terjadi penurunan

kemmpuan mengikat substrat.

34

blanko yang digunakan tidak murni lagi , justru memberikan serapan lebih besar

daripada sampel.

saat pengambilan serum , mikropipetnya tidak disertai heparin sehingga banyak darah

yang tertinggal dalam mikropipet sehingga didapat serum yang kurang mencukupi.

8. KESIMPULAN

1. Imunisasi atau vaksinasi adalah suatu prosedur untuk meningkatkan derajat

imunitas seseorang terhadap patogen tertentu atau toksin.

2. Obat-obat golongan imunomodulator bekerja menurut tiga cara, yakni:

imunorestorasi, imunostimulasi, dan imunosupresan.

3. Imunisasi sendiri dapat terjadi secara alamiah ataupun buatan, masing-masing

dibedakan menjadi imunisasi aktif dan pasif.

4. Percobaan yang dilakukan kali ini termasuk imunisasi aktif. Karena hepatitis B

mengaktifkan limfosit

5. Levamisol merupakan imunomodulator yang memperbaiki fungsi system imun

yang menurun.

6. Tidak ada perbedaan nilai optikal density sebelum dan sesudah diberi vaksin,

ditunjukkan dengan nilai signifikansi yang didapat lebih besar dari 0,05.

7. Suatu data dikatakan baik jika data tersebut terdistribusi normal dengan dilakukan

uji normalitas.

8. Meningkatnya kadar ditunjukkan dengan jumlah makrofag dan limfosit yang

semakin meningkat.

9. Ekstrak daun nangka sebagai imunostimulan pada ekstrak non polar 50 mg/kgBB

(hari ke 28), non polar 100 mg/kgBB dan 200 mg/kgBB.

10. Ekstrak daun nangka sebagai imunosupresan terdapat pada ekstrak polar 50

mg/kgBB, polar 100 mg/kgBB dan non polar 50 mg/kgBB.

11. Pengaruh ekstrak nangka sebagai imunomodulator dipengaruhi oleh dosis, rute

pemberian dan waktu pemberian, serta kondisi hewan uji.

12. Ekstrak daun nangka memberikan perubahan terhadap titer antibodi pada mencit

yang diinduksi oleh vaksin Hepatitis B.

35

9. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, Modulasi Respon Imun Spesifik dan Non-spesifik oleh Daun Dewa [Gynura

Procumbens (Lour.) Merr, Asteraceae] pada Mencit BALB/c, Departemen

Farmasi FMIPA ITB: Bandung

Iwo, Maria Immaculata, dkk, 2004. Risalah Ilmiah Nasional Hasil Penelitian Farmasi.

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Yogyakarta

Mario, Tommi Poltak, dkk, 2006. SPSS untuk Paramedis. Ardana Media: Yogyakarta

Yogyakarta, 14 Mei 2007

Praktikan,

Golongan IV FBA

36