laboratorium - biotransformacje vi sem. technologia chemiczna

Laboratorium specjalistyczne – Biotransformacje Semestr VI

1

WYKORZYSTANIE METOD BIOTECHNOLOGICZNYCH DO OTRZYMYWANIA

OPTYCZNIE CZYNNYCH ALKOHOLI

1. Wstęp

Problem otrzymywania czynnych optycznie enancjomerów ma podstawowe znaczenie

w wielu gałęziach przemysłu chemicznego, np.: spożywczym, kosmetycznym, a szczególnie w

przemyśle farmaceutycznym, gdzie czystość optyczna związku bardzo często decyduje o

możliwości stosowania go jako leku. Dlatego opracowano wiele różnych metod otrzymywania

czystych enancjomerów, ale uzyskiwane wyniki są bardzo różne, często niezadowalające ze

względu na konieczność stosowania drogich odczynników i zbyt małą czystość optyczną

produktów. Ogromny postęp w otrzymywaniu optycznie czynnych związków nastąpił po

opracowaniu metod biotechnologicznych i reakcji biotransformacji.

Pod pojęciem produkcji biotechnologicznej rozumie się procesy wykorzystujące

metabolizm organizmów żywych, które z prostego źródła węgla (glukoza) i ewentualnie

odpowiedniego prekursora w trakcie skomplikowanych przemian biochemicznych wytwarzają

bardziej złożony związek chemiczny np. penicylinę G. Biotransformacje natomiast obejmują

pojedyncze, konkretne przekształcenia chemiczne katalizowane najczęściej przez izolowane

enzymy, preparaty enzymatyczne lub mikroorganizmy np. redukcja grupy karbonylowej ketonu.

O dużej atrakcyjności metod „bio” decydują następujące zalety:

Wysoka chemo-, regio-, stereo- i enancjoselektywność

Efektywność katalizy – reakcje przebiegają 108-1015-razy szybciej, a wystarczy stężenie

10-3-10-4 %mol (chemiczne: 0,1-1%mol)

Możliwość sterowania parametrami biokatalizatorów dzięki zastosowaniu narzędzi

biologii molekularnej

Reakcje przebiegają w łagodnych warunkach (temp. pokojowa, pH neutralne)

Reakcje mogą przebiegać w wodzie, jak i w rozpuszczalnikach organicznych

Nie zachodzą reakcje uboczne

Biodegradowalność katalizatorów

Kompatybilność – enzym jest wybiórczy w stosunku do danego substratu – synteza „one-

pot”

Enzymy są katalizatorami produkowanymi przez organizmy żywe, wpływającymi na

szybkość i specyficzność tysięcy reakcji chemicznych. Źródłem enzymów mogą być

mikroorganizmy (bakterie, drożdże, grzyby makroskopowe), komórki roślinne i zwierzęce.

Chociaż są syntetyzowane w komórkach, mogą także działać poza nimi. Wiele enzymów po

wyekstrahowaniu zachowuje w pełni swoją aktywność, którą można jeszcze poprawić przez

oczyszczanie, wysalanie, immobilizację czy modyfikację chemiczną lub metodami biologii

molekularnej.

Jak już wspomniano, enzymy są podstawowymi katalizatorami przemian chemicznych

zachodzących w przyrodzie. Ich liczba jest ogromna, do tej pory sklasyfikowano kilka tysięcy

różnych enzymów. Nazwy są tworzone przez dodanie końcówki –aza, np. ureaza, lipaza, kinaza.

Najczęściej nazwa enzymu nawiązuje do przekształcanego substratu lub do typu reakcji, którą

enzym katalizuje. Na przykład enzym rozkładający celulozę nazywa się celulazą. Bardzo często

łączy się nazwę reakcji z nazwą substratu, np. dehydrogenaza alkoholowa, dekarboksylaza

argininy, izomeraza retinalu. Niektóre enzymy posiadają tylko nazwy zwyczajowe, jak pepsyna (gr.

pepsis – trawienie), papaina (izolowana z papai), bromelaina (izolowana z owoców ananasa).


2

Można także spotkać się z nazwami enzymów o końcówce –zym np. lizozym (powoduje lizę

niektórych bakterii).

W celu ujednolicenia nazewnictwa wprowadzono międzynarodowy system nomenklatury

enzymów, który dzieli je na sześć klas w zależności od typu prowadzonej reakcji (tabela 3.1).

Każdemu enzymowi przypisuje się numer EC składający się z czterech liczb. Przykładowo

trypsyna sklasyfikowana jest jako 3.4.21.4, co oznacza:

a) 3 – hydrolaza

b) 4 – proteaza hydrolizująca wiązanie peptydowe

c) 21 – proteaza serynowa (seryna jest głównym aminokwasem w centrum aktywnym)

d) 4 – czwarty enzym przypisany do tej klasy

Pod numerami EC bardzo rzadko występuje tylko jeden enzym. Najczęściej jest to grupa

strukturalnie i funkcyjnie podobnych enzymów, które zostały wyizolowane z różnych

organizmów lub nawet tkanek. W taki sposób trypsyna izolowana z trzustki człowieka pod

względem sekwencji aminokwasowej, struktury przestrzennej i właściwości (punkt izoelektryczny,

optymalne pH) może różnić się od trypsyny produkowanej przez np. tygrysa. Enzymy takie

nazywane są izoenzymami, natomiast mechanizm działania i substrat jest ten sam.

Tabela 1. System międzynarodowej klasyfikacji enzymów

Klasa Nazwa Typ katalizowanej reakcji Przykład

1 Oksydoreduktazy Przenoszenie elektronów A- + B A + B- Dehydrogenaza

mleczanowa

2 Transferazy Przenoszenie grup

funkcyjnych A-B + C A + B-C glukokinaza

3 Hydrolazy Reakcje hydrolizy A-B + H2OA-H + B-OH α-chymotrypsyna

4 Liazy

Rozszczepienie wiązań C-C,

C-O, C-N i innych, często

tworzenie wiązania

podwójnego

dekarboksylaza

argininy

5 Izomerazy Przenoszenie grupy w

obrębie cząsteczki

Izomeraza

retinalu

6 Ligazy Tworzenie wiązań sprzężone

z hydrolizą ATP A + B A-B

Karboksylaza 2-

oksoglutaranu

Mechanizm działania enzymów polega na wiązaniu substratów w odpowiednim położeniu,

które umożliwia zajście reakcji, a powstałe produkty są następnie uwalniane (rys. 1.). Należy

zwrócić uwagę, że proces jest odwracalny, czyli enzymy mogą katalizować reakcje w obu

kierunkach, w zależności od warunków.


3

Rys.1. Reakcja katalizowana enzymatycznie (G.L. Patrick Chemia medyczna WNT 2003);

Wiązanie substratów i właściwa reakcja następuje w specyficznej części cząsteczki enzymu.

Fragment ten nazywany jest miejscem (centrum) aktywnym (rys. 2.). Mówiąc o części cząsteczki

enzymu, mamy na myśli fragment jego struktury przestrzennej, a nie fragment łańcucha

peptydowego. W rzeczywistości ze względu na pofałdowanie łańcucha białkowego, aminokwasy

budujące centrum aktywne mogą być od siebie bardzo oddalone w sekwencji. Centrum

katalityczne najczęściej znajduje się na powierzchni enzymu lub w jej pobliżu, tak aby substraty

miały do niego łatwy dostęp, a produkty mogły być szybko usuwane. Może mieć ono kształt

rowka lub zagłębienia.

Rys. 2. Miejsce aktywne enzymu (G.L. Patrick Chemia medyczna WNT 2003);

Niektóre z enzymów występujących w przyrodzie rozpoznaje i katalizuje przemianę tylko

jednego, konkretnego substratu. Właściwość tą określa się mianem wąskiej specyficzności

substratowej np. ureaza katalizuje rozkład mocznika, katalaza – nadtlenku wodoru. Jednakże

zdecydowana większość enzymów toleruje szeroką grupę związków o podobnej budowie,

w strukturze których występuje tylko charakterystyczny element lub wiązanie. Takimi enzymami

są lipazy, które katalizują hydrolizę wiązań estrowych w różnych tłuszczach. O takich enzymach

mówi się, że posiadają szeroką specyficzność substratową. Można także wyróżnić enzymy które

przekształcają ten sam typ wiązania, ale w określonych przypadkach. Na rys. 3. przedstawiono

dwa enzymy produkowane w trzustce, które hydrolizują wiązania peptydowe w białkach –

trypsynę i α-chymotrypsynę.

Największe zastosowanie w syntezie znajdują hydrolazy. Enzymy te nie wymagają

współdziałania żadnych dodatkowych małocząsteczkowych związków tzw. kofaktorów,

w związku z tym są bardzo proste w użyciu. Poza tym produkowane są na ogromną skalę jako

dodatki do proszków do prania i innych produktów gospodarstwa, jako dodatki podnoszące

walory smakowe żywności itd., dlatego są łatwo dostępne i względnie tanie. Dzieli się je na

podklasy w zależności od typu hydrolizowanego wiązania, najpopularniejsze to:


4

Rys. 3. Specyficzność substratowa trypsyny i α-chymotrypsyny

Proteazy (peptydazy) hydrolizujące wiązania amidowe w białkach – trypsyna,

α-chymotrypsyna, papaina, subtilizyna, acylaza penicylanowa

Esterazy hydrolizujące wiązania estrowe – acetylocholnoesteraza (AChE), esteraza

z wątroby świńskiej (PLE)

Lipazy hydrolizujące wiązania estrowe w tłuszczach – lipazy z Pseudomonas fluorescens (PFL),

lipaza z Pseudomonas cepacia (PCL), lipaza B z Candida antarctica (CAL-B)

Amylazy hydrolizujące wiązania glikozydowe w wielocukrach – α-amylaza, amylazy

z kiełkującego jęczmienia

Hydrolazy epoksydów hydrolizujące pierścień epoksydowy – EH z Aspergillus niger

W syntezie optycznie czynnych alkoholi stosuje się najczęściej lipazy. Enzymy te ze względu

na rolę fizjologiczną (hydroliza wiązań estrowych w tłuszczach) są naturalnie przystosowane do

katalizowania reakcji nie tylko w wodzie, ale dobrze pracują także w obecności rozpuszczalników

organicznych. Możliwe jest także prawie całkowite wyeliminowanie wody i zastąpienie jej

niepolarnym rozpuszczalnikiem np. heksanem, eterem tert-butylo-metylowym. Niewielka ilość

wody w układzie (1-2%) jest niezbędna aby enzym zachował właściwą strukturę przestrzenną,

która warunkuje właściwości katalityczne. Polarne rozpuszczalniki organiczne można stosować

jako dodatki poprawiające rozpuszczalność (do 10%, czasami w specyficznych przypadkach do

50% v/v) ponieważ dezaktywują enzymy (denaturują białko). Wyeliminowanie wody z układu

reakcyjnego powoduje, że można prowadzić także reakcje estryfikacji i transestryfikacji. Poza tym

dużo łatwiej jest wyizolować produkty z mieszaniny poreakcyjnej, ponieważ enzym

w rozpuszczalniku organicznym nie rozpuszcza się i można go usunąć przez filtrację.

Lipazy znajdują zastosowanie w następujących procesach:

Hydroliza lub estryfikacja racemicznych lub prochiralnych substratów – estrów lub alkoholi

Dyssymeryzacja mezo-estrów lub dioli

Reakcje z udziałem związków racemicznych realizowane są na drodze rozdziałów

kinetycznych czyli opierają się na różnej szybkości, z jaką enancjomery są przekształcane przez

enzym. Różnica ta wynika z odmiennego dopasowania przestrzennego izomerów do centrum

aktywnego, dzięki czemu reakcja przebiega szybciej w stosunku do jednego z enancjomerów (R),

jednakże równocześnie drugi enancjomer (S), chociaż wolniej, także jest przekształcany (rys 4).


5

Rys. 4. Rozdział kinetyczny racemicznych alkoholi

Reakcje enzymatyczne są w większości procesami odwracalnymi. Jest to duży problem,

ponieważ powstający produkt (R) jest także dobrym substratem dla enzymu a reakcja odwracalna

prowadzi do znacznego obniżenia nadmiarów enancjomerycznych. Rozwiązaniem jest

zapewnienie takich warunków, w których równowaga będzie przesunięta na korzyść produktów

w takim stopniu, że reakcja stanie się praktycznie nieodwracalna lub pseudoniedwracalna.

Najczęściej stosowanymi typami reakcji spełniającymi to założenie są reakcje hydrolizy

(przebiegające w obecności znacznego nadmiaru wody) oraz reakcje transestryfikacji z

zastosowaniem estrów enoli, estrów „aktywnych” i bezwodników kwasowych (rys.5).

Rys. 5. Rozdział kinetyczny z zastosowaniem estrów enoli

Wyrażenie efektywności rozdziału kinetycznego za pomocą stałych szybkości reakcji bywa

problematyczne, ale można efektywność rozdziału matematycznie powiązać z stopniem

konwersji (c) reakcji i nadmiarami enancjomerycznymi nieprzereagowanego substratu (ees) i

produktu (eep).

Stosunek enancjomeryczny E charakteryzuje selektywność reakcji enzymatycznej i

wyraża się wzorami:

Dla produktu;

Dla substratu;

Wartości E obliczone za pomocą dwóch powyższych równań nie są miarodajne

w przypadku bardzo małych albo bardzo wysokich stopni konwersji (błędy wynikają

z niedokładności pomiarów). Dlatego wygodniejsze jest użycie poniższego równania, w którym

uwzględnia się tylko nadmiary enancjomeryczne.

Zależność „absolutna”


6

Na rys. 6 przedstawione są przykładowe wykresy zależności nadmiarów enancjomerycznych

od konwersji dla reakcji o niskiej (E=8) i wysokiej (E=43) enancjoselektywności dla reakcji

transestryfikacji alkoholi z udziałem octanu winylu.

Rys.6. Zależności nadmiarów enancjomerycznych od konwersji w przypadku reakcji o niskiej i

wysokiej enancjoselektywności

Jak widać produkt (ester) o wysokiej czystości optycznej może być otrzymany, kiedy

konwersja reakcji nie przekracza 50%, a enzym możne swobodnie wybierać enancjomer lepiej

dopasowany do centrum aktywnego. Powyżej 50% przereagowania, kiedy stężenie szybciej

reagującego izomeru jest już niewielkie, czystość optyczna estru maleje i zależy od szybkości,

z jaką przekształcany jest drugi enancjomer. Analogiczna zależność występuje dla

nieprzereagowanego substratu. Wysoką czystość optyczną można uzyskać, kiedy konwersja

przekroczy 50%.

Bardzo istotne jest więc ustalenie czasu, kiedy rozdział osiąga maksimum tzn. kiedy

enancjomery posiadają najwyższą (w danym przypadku) czystość i wydajność. Bardzo dużo zależy

od enzymu, który został użyty, od jego stereospecyficzności w stosunku do substratu, a także od

warunków procesu (rozpuszczalnika, zawartości wody w medium, donora lub akceptora grupy

acylowej, temperatury, pH itd.).

Dąży się do tego, aby E wynosił co najmniej 15-20 – wtedy rozdział jest zadowalający,

otrzymujemy produkty z dobrymi wydajnościami i czystościami optycznymi. Gdy E>100 jest to

reakcja bardzo selektywna.

Optycznie czynne enancjomery alkoholi drugorzędowych można otrzymać także na drodze

redukcji grupy karbonylowej ketonów. Enzymami katalizującymi tą reakcje są dehydrogenazy

należące do klasy oksydoreduktaz. Niestety mechanizm działania tych enzymów wymaga udziału

kofaktorów, czyli niewielkich, w stosunku do enzymu, cząsteczek organicznych lub jonów metali.

Kofaktory niekowalencyjnie związane z enzymem nazywane są koenzymami. Dehydrogenazy

podczas redukcji grupy karbonylowej wymagają udziału dwunukleotydu nikotynoamido-

adeninowego (NADH) lub jego fosforanu (NADPH) (rys. 7). Obecność NADH lub NADPH

jest konieczna gdyż są one przenośnikami anionu wodorkowego, który atakuje węgiel grupy

karbonylowej związku związanego w centrum aktywnym dehydrogenazy. Ogólny mechanizm

reakcji katalizowanej przez dehydrogenzay jest następujący (rys. 8):


7

Rys. 7. Struktura koenzymów NAD i NADP i ich form zredukowanych

Rys. 8. Stereoselektywność reakcji katalizowanej przez ADH z drożdży piekarniczych

Jak wynika z powyższych rysunków mechanizm przeniesienia anionu wodorkowego

z kofaktora na substrat zapewnia stereoselektwność reakcji. Mechanizm ten został opisany przez

Preloga, który badał reakcje redukcji z zastosowaniem drożdży piekarniczych Saccharomyces

cerevisiae już w latach 60-tych ubiegłego wieku. Od jego nazwiska pochodzi nazwa reguły

określającej stereoselektywność większości dehydrogenaz (z drożdży, Thermoanaerobium brockii,

wątroby końskiej) – reguła Preloga – która mówi, że transfer anionu wodorkowego na atom

węgla grupy karbonylowej zachodzi od strony re z wytworzeniem alkoholu o konfiguracji (S),

oczywiście przy założeniu, że grupa „duża” jest starsza od „małej” zgodnie z zasadami określania

starszeństwa podstawników Cahna-Ingolda-Preloga. Jednak jak w każdej regule zdarzają się

wyjątki i otrzymujemy produkt o przeciwnej konfiguracji. Przykładem niespełniającym tej reguły

jest α-chloroacetofenon – redukcja tego związku prowadzi do otrzymania (R)-2-chloro-1-

fenyloetanolu. Reguła ta nie sprawdza się dla związków, w których różnica pomiędzy wielkością

podstawników po obu stronach grupy karbonylowej jest nieduża.

Wadą stosowania izolowanych dehydrogenaz w reakcjach redukcji jest to, że konieczne jest

dostarczenie zredukowanego kofaktora (NADH lub NADPH) w ilości równomolowej molowej

lub zapewnienie wydajnego systemu ich regeneracji. Mimo, że opracowano kilka świetnych

sposobów regeneracji kofaktorów, to metodą najwygodniejszą jest zastosowanie całych komórek

mikroorganizmów, które będą regenerowały NADH lub NADPH w procesach metabolicznych.

Podczas reakcji redukcji mikroorganizmami do układu reakcyjnego dodaje się etanol lub


8

izopropanol, który powoduje regenerację kofaktora. Najczęściej stosowanymi i najtańszymi

mikroorganizmami są drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Ich dodatkową zaletą jest fakt,

że w formie preparatów np. liofilizowanych, mogą pracować w rozpuszczalnikach organicznych

zawierających tylko kilka procent wody niezbędnej do zachowania aktywności metabolicznej.

Oczywiście metody biotechnologiczne mają także wady, jedną z najważniejszych jest

wrażliwość biokatalizatorów na zmiany warunków reakcji. Związane jest to zazwyczaj

z niestabilnością preparatów enzymatycznych, niską produktywnością, wrażliwością na

rozpuszczalniki organiczne i ograniczeniem do prowadzenia reakcji w roztworach wodnych.

Czasami nawet niewielkie zmiany temperatury czy pH mogą znacznie zmniejszyć aktywność

enzymów. Problemy te mogą zostać rozwiązane przez stosowanie preparatów

immobilizowanych. Enzymy można osadzać na różnych nośnikach, zamykać wewnątrz

polimerów, sieciować. Dzięki procesowi immobilizacji rozpuszczalny, homogeniczny

biokatalizator przekształcony zostaje w katalizator heterogeniczny. Pozwala to na stosowanie

procesów ciągłych i ułatwia izolowanie produktów. Bardzo często rośnie także jego stabilność,

maleje wrażliwości na zmiany pH i temperatury (wysoka aktywność nawet w 80oC).

Immobilizacja powoduje też podwyższenie selektywności w porównaniu z enzymem natywnym.

Najczęstsze metody immobilizacji zostały przedstawione na rys.9.

Rys. 9. Metody immobilizacji enzymów

Pojęcia dodatkowe:

Nadmiar enancjomeryczny (ee, enantiomeric excess) – miara czystości optycznej związku

wyrażona w procentach. Wielkość określająca nadmiar (ilościowy) jednego enancjomeru w


9

stosunku do drugiego. Przyjmuje się, że ma zawsze wartość dodatnią i definiuje się jako stosunek

różnicy zawartości poszczególnych enancjomerów do ich sumy.

%100][][

][][

SR

SReeR %100

][][

][][

SR

RSeeS

Nadmiar enancjomeryczny może być wyznaczony następującymi metodami:

1) porównanie wartości skręcalności właściwych, jednak konieczna jest znajomość wartości

skręcalności właściwej dla czystych enancjomerów:

%100][

][

D

lit

D

badee

np. jeżeli []D

lit=-47o dla (S), a []Dbad=-41o, to %2,87%100

47

41

See

2) spektrometria 1HNMR z dodatkiem odczynnika przesunięcia chemicznego np. kompleksu

europu, który powoduje tworzenie diastereoizomerycznych kompleksów z enancjomerami,

a tym samym różnicowanie sygnałów protonów pochodzących od poszczególnych

izomerów.

3) chromatografia cieczowa HPLC lub gazowa na kolumnach z chiralnym wypełnieniem,

które różnie oddziaływuje z enancjomerami i powoduje różnicowanie ich czasów retencji.


10

Celem ćwiczenia będzie zapoznanie się z metodą kinetycznego rozdziału racemicznego

1-fenyloetanolu metodą katalizowanej enzymatycznie transestryfikacji octanem winylu. Jako

katalizatory zastosowane zostaną różne preparaty enzymatyczne np.: lipaza z Pseudomonas

fluorescens (Amano AK) i immobilizowana lipaza B z Candida antarctica (Novozym sp 435).

2. Część doświadczalna

a) Transestryfikacja octanem winylu

Odczynniki: 1-fenyloetanol; octan winylu; eter t-butylowo-metylowy (TBME); lipaza; żel

krzemionkowy 230-460 mesh; heksan; octan etylu, 2M NaOH, metanol, chlorek metylenu.

OH

OH

OH

O

H

OHO

O

O

O

H2O/MeOH

(S)

+TBME

(R)

Amano AK

+ +

(R)

NaOH

Wykonanie: Do kolby stożkowej o poj. 100 ml odważyć 1,22g (10 mmol) racemicznego

1-fenyloetanolu i dodać 10 ml eteru t-butylowo-metylowego (TBME), następnie dodać 1,80g (21

mmol) octanu winylu i 0,20g lipazy natywnej lub 0,10g lipazy immobilizowanej, a ścianki opłukać

15 ml TBME. Kolbę umieścić na wytrząsarce (amplituda 3; 180obr/min; temp. pokojowa) na 7

dni. Odsączyć enzym na sączku karbowanym i przemyć go 10 ml TBME. Pobrać próbkę (1ml),

która posłuży do oszacowania stopnia konwersji. Pozostały przesącz odparować pod

zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany olej nanieść na kolumnę chromatograficzną napełnioną

żelem krzemionkowym zawieszonym w heksanie. Rozdział prowadzić stosując jako eluent

mieszaninę heksan:octan etylu 10:1 (dla estru), następnie zmienić na heksan:octan etylu 5:1(dla

alkoholu). Poszczególne frakcje połączyć i zatężyć na wyparce.

Ester rozpuścić w 10 ml metanolu i dodać 10 ml 2M NaOH. Ogrzewać w 45oC przez ok.

1 godz. Otrzymany w wyniku hydrolizy alkohol ekstrahować chlorkiem metylenu (3x15 ml)


11

połączone fazy organiczne wysuszyć siarczanem (VI) sodu, po odsączeniu środka suszącego

odparować rozpuszczalnik.

b) Estryfikacja bezwodnikiem bursztynowym

O

O

OH

OOH OH

OH

O

O

O

NaOH/H2O

(R)

+ +Amano AK

TBME

(S)

(R) Odczynniki: 1-fenyloetanol; bezwodnik bursztynowy; eter t-butylowo-metylowy (TBME);

lipaza; nasycony roztwór wodorowęglanu sodu; eter dietylowy; chlorek metylenu; wodorotlenek

sodu.

Wykonanie: Do kolby stożkowej o poj. 100 ml odważyć 1,22g (10 mmol) racemicznego

1-fenyloetanolu i dodać 10 ml eteru t-butylowo-metylowego. Osobno odważyć 1,20g (12 mmol)

roztartego w moździerzu bezwodnika bursztynowego i 0,20g lipazy i dodać do kolby, a następnie

ścianki opłukać 15 ml TBME. Kolbę umieścić na wytrząsarce (amplituda 3; 180obr/min; temp.

pokojowa) na 24h. Odsączyć enzym na sączku karbowanym i przemyć go 10 ml TBME. Pobrać

próbkę (2ml), która posłuży do oszacowania stopnia konwersji za pomocą 1HNMR. Otrzymany

przesącz ekstrahować trzykrotnie 100 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Fazę

wodną przemyć 25ml TBME, a następnie połączone fazy organiczne przemyć dodatkowo 20ml

wody. Fazę eterową wysuszyć bezwodnym siarczanem sodu i odparować na wyparce otrzymując

nieprzereagowany enancjomer (S). Fazę wodną przenieść do kolby zaopatrzonej w mieszadło

magnetyczne, dodać 20g wodorotlenku sodu i mieszać przez 3h w temperaturze pokojowej.

Następnie roztwór przenieść do rozdzielacza i ekstrahować trzykrotnie 30 ml chlorku metylenu.

Fazę organiczną zawierającą enancjomer (R) wysuszyć siarczanem sodu i odparować

rozpuszczalnik.

3. Opracowanie wyników

1. Na podstawie widm 1HNMR i chromatogramu GC obliczyć stopnie przereagowania

poszczególnych mieszanin.

2. Zmierzyć skręcalność właściwą otrzymanych związków i wyznaczyć ich nadmiary

enancjomeryczne w odniesieniu do danych literaturowych.

3. Wyznaczyć nadmiary enancjomeryczne produktów za pomocą HPLC.

4. Wyznaczyć stosunek enancjomeryczny (E).

5. Przedstawić wady i zalety obu metod rozdziału.

laboratorium - biotransformacje vi sem. technologia chemiczna

Documents