laboratorijska dijagnostika imunosnih trombocitopenija - interdisciplinarni... · trombocitopenija...
TRANSCRIPT
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
IMUNOSNIH TROMBOCITOPENIJA
prim. dr. sc. Maja Tomičić, dr. med.
spec. transfuzijske medicineznanstveni suradnik
Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinuPetrova 3, Zagreb
voditelj Odjela za trombocitnu i leukocitnu dijagnostiku i hemostazu
Zagreb, 11. studeni 2017.
1. TROMBOCITI
2.TROMBOCITOPENIJA
3. IMUNOSNE TROMBOCITOPENIJE; podjela,
pato mehanizam nastanka (trombocitni antigeni i
anti trombocitna protutijela)
4. METODE ZA DOKAZIVANJE
ANTITROMBOCITNIH PROTUTIJELA I
TROMBOCITNIH ANTIGENA
5. ALGORITAM ZA DIJAGNOSTIČKI-
POSTUPAK ZA IDIOPATSKU IMUNOSNU
TROMBOCITOPENIJU (ITP) I HEPARINOM
IZAZVANU TROMBOCITOPENIJU (HIT)
TROMBOCITOPENIJA
Normalan broj trombocita u odrasle osobe
iznosi od 150-450 x10/9/L
TROMBOCITOPENIJA-sniženi broj trombocita
Blaga (100-150 )
Umjerena (50-100)
Teška (<50)
TROMBOCITI
Trombociti su stanični fragmenti, bez jezgre
Nastaju u koštanoj srži iz megakariocita
Procjenjuje se da iz svakoga megakariocita nastane 1000-5000 trombocita
Dnevna proizvodnja trombocita je ~35-50 x10/9/L krvi
Ona može porasti 8 puta u slučaju pojačane razgradnje trombocita
www.UpToDate.com
VWF
VWF
VWF
VWF VWF VWF
kolagen
kolagen
kolagen
Krv-protok
Trombociti-
adhezija
Trombociti-
nakupljanje
Stabilna adhezija
Trombocti
aktivacija/agregacija
TROMBOCITI-FUNKCIJAsprječavanje krvarenja, održavanje hemostaze-PRIMARNE
adhezija, aktivacija, sekrecija, agregacija
formiranje ugruška
TROMBOCITOPENIJA-
KRVARENJE
Klinička slika:
asimptomatska
krvarenja u kožu
i sluznice
petehije
purpura
hematomi
Spontana krvarenja
ne nastaju ako je
broj trombocita viši
od 10-20 x10/9/L
Kirurško krvarenje
obično ne nastaje
ako je broj
trombocita viši od
50 x10/9/Lwww.UpToDate.com
TROMBOCITOPENIJA- UZROCI
SMANJENA PROIZVODNJA TROMBOCITA
POVEĆANA RAZGRADNJA TROMBOCITA
TROMBOCITOPENIJA ZBOG RAZRJEĐENJA
(dilucijska)
SPLENOMEGALIJA (sekvestracija T)
PSEUDOTROMBOCITOPENIJA (lažna)
SMANJENA PROIZVODNJA
TROMBOCITA
Supresija koštane srži
Virusne infekcije
HIV (direktno oštećenje megakariocita)
Kemo ili radijacijska terapija
Kongenitalna ili stečena aplazija ilihipoplazija koštane srži
Toksično oštećenje koštane srži
Nedostatak vitamina B12 ili folata
SPLENOMEGALIJA
(sekvestracija T)
Normalno, ~1/3 trombocita je sekvestrirano u slezeni
U ekstremnoj splenomegaliji, do 90%trombocita može biti zarobljeno u slezeni
Veličina trombocita i njihov životni vijek obično je normalan
Ciroza, portalna hipertenzija i splenomegalija također su obilježene trombocitopenijom ali ovi pacijenti obično nemaju povećani rizik krvarenja
POVEĆANA RAZGRADNJA TROMBOCITA
(imunosna, neimunosna)
Idiopatska imunosna trombocitopenija (ITP)
(Idiopatska Trombocitopenijska Purpura, do 2010.)
Lijekovi-heparin (HIT), kinidin, antihipertenzivi, antibiotici…
Aloimunosna razgradnja-poslijetransfuzijska,
poslijetransplantacijska, neonatalna (PTP,
refraktornost, NATP)
Trombotička Trombocitopenijska Purpura (TTP)
Hemolitičko uremijski sindrom (HUS)
Antifosfolipidni sindrom (AFS)
Gestacijska
Diseminirana intravaskularna koagulacija (DIK)
U IMUNOLOŠKI UZROKOVANIM BOLESTIMA
TROMBOCITA-TROMBOCITOPENIJAMA,
TROMBOCITNI ANTIGENI I ANTITROMBOCITNA
PROTUTIJELA IMAJU ZNAČAJNU ULOGU
- klinička opažanja upućivala su na postojanje
antitrombocitnih protutijela već ranih 1950-tih godina
- prvi trombocitni aloantigen Zwa ili Pl A1 otkrio je
Longhem 1959. godine, a neovisno o njemu Shulman I
sur. 1960. godine (ITP)
IMUNOSNE TP POSLJEDICA SU REAKCIJE
ANTIGEN-PROTUTIJELO
trombocitni antigen-GP-receptor
NA TROMBOCITNOJ MEMBRANI NALAZE SE:
* specifični trombocitni antigeni, koji se nalaze
“uglavnom” na trombocitima (HPA 1-16)
(trombociti, megakariociti, receptorne molekule
staničnog matriksa )
* zajednički krvnim stanicama i tkivima (ABH,Le,
I, P, HLA klasa I A,B, C slabo)
ANTITROMBOCITNA PROTUTIJELA
Antitrombocitna autoprotutijela, usmjerena na
antigene na vlastitim stanicama bolesnika
Antitrombocitna aloprotutijela nastaju nakon
izloženosti trombocitnim
aloantigenima tijekom :
* trudnoće
* transfuzija krvi
* nakon transplantacije (rijetko)
ANTITROMBOCITNA AUTOPROTUTIJELA
ITP (idiopatska trombocitopenija)
* akutna (dječja dob)
* kronična
AITP - sekundarna
* autoimune bolesti (SLE, topla AIHA,
kolagenoze)
* maligne bolesti (limfoproliferativne)
* HIV- infekcija
• uzrokovana lijekovima (antibiotici, heparin:HIT-II)
• panreaktivna pt ili usmjerena na GP komplekse
ANTITROMBOCITNA ALOPROTUTIJELA
Imunološki odgovor na specifične trombocitne
antigene vrlo je rijetka pojava.
U populaciji bijelaca najčešće se opaža anti-HPA-1a
protutijelo; 80-90% slučajeva, a zatim anti-HPA-5b u
10-15% slučajeva, dok su ostala protutijela vrlo rijetka.
Najčešće se javljaju anti-HLA klase I
ANTITROMBOCITNA ALOPROTUTIJELA
• PTP (poslijetransfuzijska purpura)
- HPA
• REFRAKTORNOST (na trombocitne
transfuzije)
- HLA I, HPA
• FNATP (fetalna i neonatalna aloimuna
trombocitopenija)
- HPA
METODE ZA ODREĐIVANJE
ANTITROMBOCITNIH PROTUTIJELA
I SKUPINA: tromboaglutinacija (po Dusset-u )
inhibicija vezanja komplementa, promjene trombocitne funkcije (više se ne primijenjuju zbog slabe osjetljivosti i specifičnosti)
II SKUPINA:
- imunoblot
- radio-imuno-esej (RIA)
- enzim-imuno-esej (EIA)
- imunofluorescencija (IF) –ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI ATA (AUTO PT, vezanih na trombocite i slobodnih u plazmi)
III SKUPINA:
testovi “čvrste podloge” (solid phase); MAIPA (test imobilizacije trombocitnih antigena pomoću monoklonskih protutijela)-
ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI ATA (AUTO PT, vezanih na trombocite i slobodnih u plazmi)
ODREĐIVANJE SPECIFIČNOSTI ATA (ALO PT)
LUMINEX metoda IF (kuglice obložene HPA antigenima, AHG obilježen bojom, detekcija laserom)
Nove metode:
SA SPA (simultaneous analysis of platelet spec. ab. (cytometric bead array)
SRP (SURFACE PLASMON RESONANCE-bio-molekularna metoda, refleksija polariziranog svjetla)
MICROARRAY
PCR
IF
Test imunofluorescencije po
van dem Borne-u
direktni, indirektni
• prilagođeni antiglobulinski test
• AHG obilježen FITC-om
• čitanje rezultata :
fluorescentni mikroskop
protočni citometar,
• eluat daje bolje rezultate zbog male količine vezanih autoprotutijela i slabog afiniteta vezanja
• za IT treba koristiti klorokinom
obrađene trombocite-razlikovanje
HLA od spec. tr. pt.
20
MAIPATROMBOCITNI GLIKOPROTEINSKI KOMPLEKSI-CD (Mo. At.)
HPA specifični trombociti-antigeni
Antigeni
sistem-
HPA
Glikoprotein
Drugi naziv CD
HPA-5a/b
GPIa/IIa
21, VLA-2,
ECMRI
CD49b/29
GPIc/IIa
51, VLA-5,
FNR
CD49e/29
GPIc/IIa
61, VLA-6
LMR
CD49f/29
v/IIIa
v3, VNR CD51/61
HPA-1a/b
HPA-3a/b
GPIIb/IIIa IIb3 CD41/61
GPIb CD42b
GPIb CD42c
HPA-2a/b GPIX CD42a
GPV CD42d
HPA-15a/b Gova/b CD109
21
MAIPA
(monoclonal immobilization of
platelet antigens)
EIA test “čvrste podloge”
AHG- obilježen enzimom
(peroksidazom)
koristi mišja monokl. pt. specifična za GP komplekse trombocitne membrane
prednosti:
osjetljiv i specifičan test
razlučivanje između HLA i specifičnih trombocitnih pt.
kvantitativan rezultat
moguće dulje čuvanje testnih trombocita
nedostaci:
dugotrajna i složena izvedba testa
neka se monoklonska pt. mogu natjecati za isti epitop kao humana (lažno negativan rezultat)
TROMBOCITNI ANTIGENI:
METODE
SEROLOŠKE: MAIPA (rijetko)
MOLEKULARNE: (polimorfizam HPA alela, poznat slijed AK)
Izolacija stanične DNA (iz pune krvi, limfocita, amniocita)
Amplifikacija (dobivanje dovoljne količine dijela DNA koji sadrži
odgovarajući alel)
Određivanje HPA genotipa; uporaba oligonukleotidnih proba
specifičnih za slijed baza-PCR-SSP (sequence specific primers),
restrikcijskih enzima specifičnih za mjesto mutacije-ASO (allele
specific oligonukleotide)
HPA genotipizacija: potvrda seroloških nalaza, HPA genotip DDK
HPA antigen negativnih koncentrata trombocita za transfuzijsko
liječenje aloimuniziranih bolesnika, epidemiološke studije
(učestalost aloimunizacije na HPA, povezanost s bolestima)
TROMBOCITOPENIJA
-STACIONARNI BOLESNICI
Sekundarna (uz drugu osnovnu HEMATOLOŠKU ili multisistemsku bolest)
ITP
Lijekovi (heparinom inducirana trombocitopenija-HIT)
Bolesti jetre
Sepsa s diseminiranom intravaskularnom koagulacijom-DIK
Maligne bolesti s DIK-om
Trudnoća- preeklampsija, HELLP sindrom, abrupcija placente s DIK-om
rjeđe TTP, HUS
ITP
SEROLOŠKA DIJAGNOSTIKA ITP I
Imunofluoroescentni test za antitrombocitna protutijela (IF- manualni ili protočna citometrija), pregledno ispitivanje
- direktni test (Pt vezana na T ispitanika
- indirektni test (Pt slobodna u serumu ispitanika)
Enzimsko-imunološki test vezanja trombocitnih GP pomoću Moab (MAIPA):
- direktni test (Pt vezana na T ispitanika
- indirektni test (Pt slobodna u seumu ispitanika)
indirektni (određivanje specifičnosti Pt u plazmi: GP kompleksni. HPA specifičnost; EIA, LUMINEX
HPA GENOTIPIZACIJA-potvrda serološkog ispitivanja ALOPROTUTIJELA, antigen negativne transfuzije
SEROLOŠKA DIJAGNOSTIKA ITP II
TUMAČENJE REZULTATA TESTA-MAIPA (IF)
- direktni TEST (PAIg)-protutijela vezana na trombocite bolesnika
osjetljivost-zadovoljavajuća
- prosječna količina PAIgG koja se može dokazati na trombocitu prema raznim autorima, kreće se od 100 do 40 000 molekula IgG po trombocitu
specifičnost- niska
- povišena količina PAIgG-a nije specifična za AITP nego je opažena i u bolesnika s neimunološkim trombocitopenijama
cirkulirajući imuni kompleksi nemaju utjecaja na patogenezu u kroničnoj ITP
- indirektni TEST (autoprotutijela u serumu/plazmibolesnika)
Serološka dijagnostika
HEPARINOM IZAZVANE
TROMBOCITOPENIJE (HIT)
Definicija HIT- II
HIT je reakcija (nuspojava) tijekom liječenja heparinom
SNIŽENI BROJ TROMBOCITA=TROMBOCITOPENIJA
HIT je kliničko-patološki sindrom čija se dijagnoza postavlja temeljem kliničkih opažanja i dokazivanja specifičnih protutijela
dva oblika HIT-a; tip I i tip II
HIT II –autoprotutijela usmjerena na kompleks HEPARINA i TROMBOCITNOG FAKTORA 4 (PF4)
Sumnja na HIT II:
4T ZBIR ZA KLINIČKU PROSUDBU HIT-a
KONTROLA BROJA TROMBOCITA
LABORATORIJSKO ISPITIVANJE: PROBIRNI
TESTOVI ZA HPF4 PROTUTIJELA IgG (GEL I EIA
TEST)
FUNKCIJSKI TEST
ZAMJENSKI LIJEK ZA HEPARIN
Testovi za anti-heparinska protutijela
- dokazivanje protutijela na kompleks heparina i
PF4
PaGIA (PF4-H, Ag-Pt, latex
particle-gel, MK-IgG AHG),
gel test
LF ID (lateralna
imunodifuzija)
EIA (PF4-H, Ag-Pt, enzym
immuno assay, IgG AHG
(ili IgG/M/A), enzimsko-
imunološki test
Testovi za anti-heparinska protutijela
- funkcijski
PAA ( platelet aggregation assay)-agregacija T
HIPA (heparin induced platelet
activation/aggregation–
aktivacija/agregacija T)
SRA (serotonin release assay–
test oslobađanja serotonina iz T)
Tumačenje rezultata: LF ID, GEL TEST, EIA TEST
Ovi testovi imaju podjednaku osjetljivost (80-90%) i
specifičnost (89-97%).
Za LF ID (IgG) i gel test (IgG/M/A); brzi probirni
testovi najznačajnija je prednost visoka negativna
prediktivna vrijednost (>95%) u isključivanju HIT-a
II.
EIA IgG) test dulje traje (složena izvedba),
prednost, kvantitativan rezultat, procjena titra
protutijela putem OD vrijednosti.
Tumačenje rezultata
LFIA, GEL TEST, EIA TEST
• Negativan test za PF4/H protutijela uz klinički 4T
score ima visoku negativnu prediktivnu vrijednost
(>90%) u isključivanju HIT-a.
• Pozitivan rezultat imunoloških testova za PF4/H
protutijela čini dijagnozu HIT-a vjerojatnom.
• OD >0,800 (1,000) u EIA testu, uz 4T>5 velika
vjerojatnost HIT II
• dodatno ispitivanje funkcijskim testom (potreba za
procjenom trombogenosti anti-heparinskih
protutijela, negativni probirni testovi i visoki 4T,
subklinički HIT)
HVALA NA PAŽNJI!