kultura Ćelija i tkiva
DESCRIPTION
PrezentacijaTRANSCRIPT
KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA – održavanje celih organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima, uz očuvanje međućelijskih veza kakve postoje in vivo.
ŠTA JE ĆELIJSKA KULTURA ?
KULTURA ĆELIJA – održavanje određenog tipa ćelija izolovanih iz odgovarajućeg organa/tkiva u in vitro uslovima.
ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?
• Ispitivanje normalne ćelijske fiziologije i biohemije Npr. ispitivanje metaboličkih puteva praćenjem produkata razgradnje radioaktivno obeležene supstance
• Testiranje efekata različitih jedinjenja na određeni tip ćelija Npr. metaboliti, faktori rasta, hormoni, potencijalno toksične ili mutagene supstance, lekovi ...
• Produkcija veštačkog tkiva kombinovanjem specifičnih tipova ćelijaNpr. potencijalno značajan način za formiranje “veštačke kože” u tretmanu opekotina
• Sinteza korisnih, komercijalno značajnih bioloških produkataNpr. Proteini koji su in vivo u ćeliji prisutni u minimalnim količinama, mogu se gajenjem ćelija in vitro proizvesti u količinama koje se mere gramima, pa i kilogramima (primena u biotehnologiji)
ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
• STERILNI USLOVI
• LAMINAR (hood, biosafety flow cabinet)
• INKUBATOR - održavanje esencijalnih parametara na nivoima optimalnim za očuvanje ćelijske kulture i vijabilnost ćelijatemperatura - obično 37C za sisarske ćelijevlažnost vazduha – sprečava isparavanje medijumaCO2 – najčešće 5%, održavanje pH
medijuma
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
• POSUDE ZA GAJENJE ĆELIJA U KULTURI
Flaskovi – najčešće polistirenski, sa površinom adaptiranom za prijanjanje i rast ćelija
Petri ploče
Mikrotirar ploče (multi-well plates) – 96-, 48-, 12-, 6 – well ploče
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
Spinner bottles/flasks – staklene boce, sa centralnom teflonskom drškom sa magnetom; gajenje ćelija u suspenziji
Roller bottles – plastične boce; ćelije prijanjaju za celu unutrašnju površinu
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
Cell factory
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
• MIKROSKOPI Standardni
Inverzni
ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?
• CENTRIFUGE • KONTEJNERI SA TEČNIM AZOTOM
• PRIMARNA ĆELIJSKA KULTURA
ćelije se izoluju direktno iz životinje, i gaje u medijumu
mehanička izolacija – izvodi se presovanjem tkiva kroz filtere, procedura brza, ali visok stepen mehaničkog oštećenja ćelija
enzimatska disagregacija tkiva do pojedinačnih ćelija –
koriste se proteolitički enzimi, npr. tripsin ili kolagenaza
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
U zavisnosti od organa iz kog se ćelije izoluju, primenjuju se različite eksperimentalne procedure:
- perfuzija organa rastvorom enzima- inkubacija delova organa/tkiva u rastvoru enzima
VAŽNO! Obezbediti što kraći kontakt tkiva i proteolitičkog enzima!Tripsin – 10-20 min; duže izlaganje može da izazove oštećenje membraneKolagenaza – manje destruktivna na nivou ćelijske membrane, ali takođe zahteva brzo uklanjanje iz sistema
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
KRAJNJI CILJ: 1. dobijanje “što čistijeg” preparata, tj. sa što manjim brojem drugih ćelija koje su sastavni deo tkiva iz kog se vrši izolacija - tokom izolacije – centrifugiranjem na gradijentu, - selektivnim gajenjem – postiže se odgovarajućim sastavom medijuma2. zadovoljavajuća vijabilnost ćelija
Po završetku inkubacionog vremena/perfuzije, reakcija se prekida dodavanjem hladnog medijuma !
disagregacija tkiva i resuspendovanje ćelija praćeno uklanjanjem proteolitičkog enzima iz sistema brojnim ispiranjima i centrifugiranjem ćelija
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Nakon izolacije, određuje se broj ćelija u dobijenoj suspenziji, i pravi se suspenzija iz koje se ćelije sade u odgovarajuće ploče.
Potreban period za oporavak ćelija od izolacije i prijanjanje za podlogu, (2-24h) ! Tek nakon toga radi se tretman ćelija i sl...
Primarne ćelijske kulture imaju ograničen životni vek (meri se danima/nedeljama)
• KONTINUALNA ĆELIJSKA KULTURA
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Ćelije sa neograničenim kapacitetom proliferacije, tzv. “besmrtne ćelije” !
KAKO NASTAJU KONTINUALNE ĆELIJSKE LINIJE?
1. Transformacijom ćelija in vitro
Različite tehnike – tretman ćelija mutagenima, virusima ili onkogenima; infekcija retrovirusima
2. Od tumorskih ćelija – kancerogeneza in vivo
Npr. HeLa ćelije tumora grlića materice, Namalwa ćelije tumora limfnih žlezda i dr.
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
KOLEKCIJE ĆELIJSKIH KULTURA
“Banke ćelija” – veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija
Suspenzija željenih ćelija se doprema poručiocu u zamrznutom stanju (na suvom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i počinje kultivacija
Uz ćelije, dobija se i katalog sa svim potrebnim informacijama vezanim za uslove gajenja i “istoriju” date ćelijske linije
The American Type Culture Collection (ATCC), USAwww.atcc.org
The European Collection of Animal Cell Culture (EACC), UKwww.ecacc.org
KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?
Najveće i najpoznatije kolekcije, sa preko 3000 dobro okarakterisanih ćelijskih linija:
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
• MEDIJUM
Kompleksan rastvor, sadrži različite komponente potrebne za normalan rast i metaboličku aktivnost ćelija.Vrsta medijuma koja se koristi – specifično za svaku ćelijsku liniju
Tečni medijumi – (kupuje se napravljen, sterilan rastvor i kao takav se koristi)
Medijumi u prahu - prema odgovarajućoj recepturi, pravi se rastvor, podešava pH, i obavezno se steriliše filtriranjem kroz filter sa porama veličine 0.22µm.
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
STANDARDNE KOMPONENTE MEDIJUMA
Ugljeni hidrati – najčešće glukoza kao osnovni izvor energije; riboza kao prekursor za sintezu nukleinskih kiselina; fruktoza Aminokiseline – 0.1-0.2mM, kao prekursori za sintezu proteina; Glutamin: 2-4mM, prekursor intermedijera u TCA ciklusu;
Soli – izotoničnost rastvora
Vitamini i hormoni – u malim koncentracijama (µmol), kao metabolički ko-faktori; udeo i vrsta izuzetno variraju u zavisnosti od vrste medijuma tako da odgovaraju zahtevima ćelijskih linija za koje se dati medijum koristi
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
Supstance za održavanje pH rastvora: Bikarbonati (NaHCO3) – u kombinaciji sa CO2 u atmosferi (5-
10%), omogućuje se održavanje pH na 6.9-7.4. Nedostatak: po vađenju iz inkubatora, pH može naglo da porasteHEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) – 10-20mM; može da spreči porast pH; ćelije mogu da se gaje i u
atmosferi bez CO2
Phenol red – indikator pH, osetljiv na vrlo male promene pH (okvirno: pH 6.5- žut, pH 7.0 – narandžast, pH 7.4 – crven, pH 7.8 – ljubičast medijum), postoje i formulacije bez ove komponente (takvi medijumi su bezbojni rastvori)
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
DODACI MEDIJUMU
Serum – sadrži faktore rasta, neophodne za bolji rast i proliferaciju ćelija u kulturi
Najčešće se koriste fetalni teleći (fetal calf/bovine serum – FCS, FBS) ili konjski serum (fetal horse serum), zbog vrlo visokog sadržaja embrionalnih faktora rasta, zatim teleći serum dobijen od životinje stare 10 dana (newborn calf serum), teleći serum dobijen od životinje stare manje od 8 meseci (donor calf serum). - Udeo u medijumu najčešće 10% ili 5%- kupuje se kao sterilan, testiran na prisustvo mikroorganizama i nekih hemijskih jedinjenja
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
Antibiotici – smanjuju rizik od kontaminacije
Penicilin (~ 100 IU/ml) – inhibira rast Gram+ bakterija
Streptomicin (~ 50-100 mg/l) – inhibira rast Gram+ i Gram-
bakterija
Amfotericin (~25 mg/l) – antifungalni agens
• PRAĆENJE ĆELIJSKE KULTURE
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA
U radu sa primarnim kulturama – određivanje broja izolovanih ćelija, određivanje vijabilnosti ćelija pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija,...U radu sa kontinualnim kulturama – praćenje rasta i proliferacije ćelija, “pasažiranje” ćelija, pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija, ...
Trypan Blue Exclusion Test – TBE Test
suspenzija ćelija
+ trypan blue (R)
Žive ćelije – neobojeneMrtve ćelije - obojene plavo
Brojanje ćelija u A-kvadratima Neuber-ove komore
Neuber-ova komora
Broj ćelija/ml =srednja vrednost broja ćelija u A-kvadratima
x Razblaženje x 10 000
% vijabilnosti =broj živih ćelijaukupan broj ćelija
x 100
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
KONTINUALNE LINIJE – PASAŽIRANJE ĆELIJA
U zavisnosti od dinamike rasta ćelija i broja ćelija koji se pasažira, pasažiranje se obično radi jednom nedeljno.
Obavezna zamena medijuma svežim, svaka 2-3 dana !
~24h
...
Medijum se odliva, ćelije se ispiraju rastvorom tripsina dok se ne odlepe, broje se, i određeni broj prebacuje se u novi flask u kome će nastaviti svoju proliferaciju
KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?
PROBLEM: KONTAMINACIJA Vreme za koje se udvostruči broj ćelija:
sisarske ćelije ~24h bakterijske ćelije ~ 30min
- prepoznaje se po promeni boje i/ili zamućenju medijuma
- bakterije, plesni, mikoplazma
ŠTA URADITI ?
- Kontaminirane kulture što pre ukloniti iz laboratorije, da kontaminacija ne zahvati zdrave linije
- U pojedinim slučajevima (npr. pri kontaminaciji mikoplazmom) moguće je “lečenje” kulture odgovarajućom kombinacijom antibiotika- Identifikacija i eliminacija izvora kontaminacije
VAŽNO!Ovo su bile neke osnovne informacije o radu sa ćelijskim kulturama.Potrebno je stalno imati na umu da je svaka ćelijska linija priča za sebe, sa svojim posebnim zahtevima i specifičnostima, koje je potrebno dobro upoznati i proučiti kako bi gajenje u kulturi bilo uspešno.