isolasi dan karakterisasi enzim protease dari tumbuhan

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI TUMBUHAN

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI TUMBUHANPraktikum BiokimiaTahun Akademik 2014/2015

Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Disusun oleh:Kelompok IVRahma Joni(1210412031)Prayoga Wibhawa Nu Tursedhi(1210412032)Amalya Ova(1210412043)Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

I. PENDAHULUAN1.1 LATAR BELAKANGMakhluk hidup termasuk tumbuhan membutuhkan reaksi biokimia seluler yang melibatkan enzim untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Salah satu enzim yang terlibat adalah protease. Pada tanaman protease tidak hanya diperlukan untuk degradasi protein, tetapi juga untuk pertahanan tubuh, perkembangan dan pematangan buah, aktivasi proenzim, penguraian simpanan protein dalam biji yang sedang berkecambah dan lain sebagainya.Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Beberapa enzim dari tumbuhan, mikroba dan binatang seperti lipase, karbohidrase dan protease sudah diisolasi, dimurnikan dan diaplikasikan pada berbagai industri. Menurut Aehle (2007) enzim banyak diaplikasikan untuk keperluan medis, industri pangan, industri kosmetik, industri farmasi dan lain sebagainya.Dalam industri pangan khususnya, enzim lipase, karbohidrase dan protease merupakan enzim yang banyak digunakan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju.Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

1.2 TUJUANMengetahui sumber dari enzimMampu mengisolasi enzim dari sumbernyaDapat mengklasifikasikan enzim dari substrat yang digunakanMelakukan pemurnian sederhana enzimJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 EnzimEnzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah:(1) dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi(2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah(3) bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu. Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, invertase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme (Boyer, 1971). Enzim juga masih mempunyai kemampuan transformasi kimia meskipun telah terpisah dari sel (Bakhtiar, A. 1991).

Perkembangan ilmu bioteknologi telah menempatkan penggunaan enzim sebagai salah satu alternatif untuk berbagai keperluan misalnya di bidang industri, pengobatan, dan analisis. Keuntungan penggunaan enzim antara lain:enzim merupakan bahan alami yang tidak beracunenzim dapat mempercepat reaksi tanpa menyebabkan terbentuknya hasil reaksi yang tidak diinginkanenzim aktif pada konsentrasi rendahkecepatan reaksi enzim dapat diatur dengan mengatur suhu, pH, dan jumlah enzim yang digunakanenzim dapat diinaktifkan jika reaksi yang diinginkan sudah diperolehenzim merupakan senyawa alamiah yang ramah lingkungan (Suhartono, 1993). Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

2.2 ProteaseProtease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi untuk kehidupan organisme pada tumbuhan, hewan maupun mikroorganisme (Rao et al., 1998). Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease dibatasi oleh tersedianya tanah untuk penanaman dan kondisi yang cocok untuk pertumbuhan. Di samping itu proses produksi protease dari tumbuhan sangat memakan waktu. Protease tumbuhan yang dikenal antara lain papain, bromelain, dan keratinase. Protease hewan yang paling dikenal adalah tripsin, kimotripsin, pepsin dan rennin. Enzim-enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni dengan jumlah besar (Boyer, 1971).Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Klasifikasi buah NenasKingdom : PlantaeDivisio : SpermatophytaSub divisio: AngiospermaeKelas: MonocotyledoneaeOrdo: FerinosaeFamily: BromeliaceaeGenus : AnanasSpesies: Ananas comosus (L) merr

Klasifikasi buah pepayaKingdom : PlantaeDivisio : SpermatophytaSub divisio: AngiospermaeKelas: DicotyledoneaeOrdo: CaricaceaGenus: CaricaSpesies: Carica papaya (L)

2.3 PapainPapain adalah suatu zat (enzim) yang dapat diperoleh dari getah tanaman pepaya dan buah pepaya muda. Getah pepaya tersebut terdapat hampir di semua bagian tanaman pepaya, kecuali bagian akar dan biji. Kandungan papain paling banyak terdapat dalam buah pepaya yang masih muda. Getah pepaya (papain) cukup banyak mengandung enzim yang bersifat proteolitik (pengurai protein). Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Papain mempunyai pH optimum 7,2 pada substrat BAEE (benzoil arginil etil ester), pH 6,5 pada substrat kasein. Suhu optimal papain sendiri adalah 50-60. Papain relatif tahan terhadap suhu, bila dibandingkan dengan enzim proteolitik lainnya seperti bromelin dan lisin.

2.4 BromelinBromelin dapat diperoleh dari tanaman nanas baik dari tangkai, kulit, daun, buah, maupun batang dalam jumlah yang berbeda. Dilaporkan bahwa kandungan enzim bromelin lebih banyak terdapat pada batang yang selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelin pada batang nanas tidak merata dan tergantung pada umur tanaman. Kandungan bromelin pada jaringan yang umurnya belum tua terutama yang bergetah sangat sedikit sekali bahkan kadang-kadang tidak ada sama sekali. Sedangkan bagian tengah batang mengandung bromelin lebih banyak dibandingkan dengan bagian tepinya (Hartadi, 1980).

2.5 Metode AnsonUji aktivitas protease dilakukan dengan metode Anson yaitu mengukur absorbansi spektrofotometri reaksi hidrolisis kasein yang dikatalisis enzim bromelin hasil isolasi.Perbedaan hasil serapan antara enzim yang dimumikan dengan variasi jenis pengendap dan blanko merupakan derajat kemumiaan enzim tersebut yang diberikan dalam bentuk aktivitas enzim dalam satuan nanokatal/mg protein.

III. PROSEDUR PERCOBAAN3.1 ALAT DAN FUNGSI

No.AlatFungsi1.Gelas pialawadah larutan2.Blender untuk menghaluskan sampel3.Sentrifugeuntuk memisahkan endapan dengan supernatan4.Tabung reaksiwadah sampel5.Spektrofotometeruntuk mengukur absorban6.Pipet gondokuntuk mengambil larutan dengan volume tertentu7.Gelas ukuruntuk mengukur volume larutan


3.2 BAHAN DAN FUNGSI

No.BahanFungsi1.NaOHpemberi suasana basa dan pengkhelat2.Caseinsebagai substrat3.Buffer fosfat 0,05 M pH 7sebagai larutan penyangga4.Folin ciocalteusebagai pengompleks5.EDTA 0,1 Msebagai aktivator enzim6.TCA 0,1 Msebagai inhibitor


3.2 SKEMA KERJAIsolasi papainIsolasi bromelinPemurnian enzimJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Isolasi papain

Getah Ditambah buffer fosfat pH 7Simpan di kulkas Ambil 2 mL getah Ditambahkan 0,6 mL aseton dinginKoloid Ditambahkan TCA 2,5 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan kasein 2 mLDisentrifus 5 menitDitambahkan kasein 2 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan TCA 2,5 mLDisentrifus 5 menitDitambahkan 1 mL supernatanDitambahkan 2 mL NaOH Ditambahkan 1 mL perealsi folinDiukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm (interval 10 nm)Supernatan Supernatan Absorban - Disentrifus selama 5 menitBlanko Sampel Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Isolasi bromelinNenas Ditambahkan akuadesDiblender Disaring

FiltratEndapanDimasukkan masing masing 2 mL ke dua tabung reaksiDitambahkan 2 mL buffer fosfat PH 7Ditambahkan 0,5 mL EDTA 0,01 MDiinkubasi 5 menitDimasukkan masing masing 2 mL kedua tabung reaksiDitambahkan 2 mL buffer fosfat PH 7Ditambahkan 0,5 mL EDTA 0,01 MDiinkubasi 5 menitBlankoSampel Ditambahkan TCA 2,5 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan casein 2 mLDisentrifus 5 menit Ditambahkan casein 2 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan TCA 2,5 mLDisentrifus 5 menit Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Aktivitas pada blanko atau sampel = Amax x 1000 2 mL x 30 menit

Supernatan Supernatan Ditambahkan 1 mL supernatanDitambahkan 2 mL NaOH Ditambahkan 1 mL pereaksi folinDiukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm (interval 10 nm)Absorban Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Pemurnian enzim

GetahKoloid- ditambahkan buffer fosfat pH 7- disimpan dikulkas- diambil 2 mL getah- ditambah 0,6 mL aseton dingin- disentrifus 5 menit- ditambah aseton dingin 1 mL- ditunggu sampai terbentuk koloidFiltratEndapanFiltratEndapan- ditambah aseton dingin 1,4 mLFiltratEndapanJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

digabung dengan endapandimasukkan ke tabung reaksiditambahkan buffer fosfatEndapanEnzim- diambil 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi- ditambah EDTA 0,5 mL, diinkubasi 5 menitBlankoSampel Ditambahkan TCA 2,5 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan casein 2 mLDisentrifus 5 menit Ditambahkan casein 2 mLDiinkubasi 30 menitDitambahkan TCA 2,5 mLDisentrifus 5 menit Ditambahkan 1 mL supernatanDitambahkan 2 mL NaOH Ditambahkan 1 mL perealsi folinDiukur aktivitas dengan spektrofotometer 500 600 nm (interval 10 nm)Supernatan Supernatan Absorban Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 DATA DAN PERHITUNGAN4.2 PEMBAHASANJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

No. (nm)PapainBromelinblankosampelblankosampel15000,116-0,0200,0240,09625100,117-0,0050,0440,10335200,119-0,0010,0480,10545300,1230,0020,0490,10655400,1240,0020,0460,10765500,1230,0040,0450,10575600,1240,0050,0440,10085700,1260,0030,0400,10195800,1250,0050,0380,096105900,1180,0030,0310,086116000,1200,0060,0280,089

A. Data4.1 DATA DAN PERHITUNGANJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Data percobaan pemurnian enzim bromelinNo. (nm)Absorban

blanko15000,11625100,11735200,11945300,12355400,12465500,12375600,12485700,12695800,125105900,118116000,120

Absorban blankosampel0,1160,4430,1170,4660,1190,4860,1230,5680,1240,5240,1230,5420,1240,5700,1260,5800,1250,5920,1180,6220,1200,643


B. Perhitungan Menghitung aktivitas enzim bromelinAktivitas blanko

= 0,082 U/menit



Menghitung aktivitas enzim papainAktivitas blanko

= 0,21 U/menitJurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014


Menghitung aktivitas enzim bromelin hasil pemurnianAktivitas blanko

= 0,21 U/menit

4.2 PembahasanPada percobaan isolasi dan karakterisasi enzim protease dari tumbuhan, sampel tumbuhan yang digunakan adalah nenas dan pepaya. Pada buah nenas terdapat enzim bromelin sedangkan pada getah pepaya terdapat enzim papain. Pada kedua tumbuhan ini dilakukan 2 penentuan yang berbeda yaitu untuk sampel dan untuk blanko.Pada isolasi papain, getah pepaya yang telah dikumpulkan ditambahkan buffer fosfat secukupnya yang berfungsi untuk menetralkan getah pepaya pada pH 7, pada pH ini aktivitas enzim papain dan bromelin berada pada kondisi optimum. Pada keadaan terlalu basa atau asam enzim akan mengalami denaturasi karena stabilitasnya terganggu.Ditambahkan EDTA yang berfungsi sebagai aktivator enzim. Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

Ditambahkan TCA yang berfungsi sebagai degradator substrat. Substrat akan didegradasi oleh TCA (Pada tahap sampel) membentuk molekul-molekul yang lebih sederhana, sedangkan pada tabung blanko ditambahkan casein sebagai substrat yang akan didegradasi oleh enzim.Sentrifus dilakukan selama 5 menit agar endapan dan larutan terpisah baik. Ditambahkan NaOH berfungsi untuk mempertajam warna kompleksDitambahkan pereaski folin sebagai pengompleks. Jika folin ditambahkan dengan NaOH akan terbentuk khelat. Hal yang sama dilakukan pada penentuan aktivitas enzim bromelin.Pada permurnian enzim papain dilakukan dengan menggunakan aseton . Fungsi dari aseton adalah untuk mengendapkan enzim. digunakan aseton karena dibandingkan pelarut organik lainnya aseton tidak akan merusak aktivitas enzim. Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

V. KESIMPULAN DAN SARAN5.1 KESIMPULANEnzim yang diisolasi pada percobaan ini adalah enzim bromelin dari buah nenas dan enzim papain dari getah pepaya.Dari data percobaan diperoleh :Nilai aktivitas enzim papain = 0,096 U/menitNilai aktivitas enzim bromelin = 0,2 U/menitNilai aktivitas enzim bromelin hasil pemurnian = 0,862 U/menitNilai serapan berbanding lurus dengan aktivitas emzim dimana semakin besar nilai absorban maka semakin besar juga nilai aktivitas enzim yang didapatkan


5.2 SARANTeliti dalam pengukuran menggunakan spektrofotometer.Gunakan masker ketika menambahkan aseton pada proses pemurnian.Pahami prinsip dan cara kerja.Jurusan Kimia Universitas Andalas Padang - 2014

DAFTAR PUSTAKALehninger . 1982. Dasar-dasar Biokimia . Jakarta : ErlanggaPoedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.Wuryanti. 2004. Isolasi dan penentuan aktivitas enzim bromelin dari buah nanas (Ananas comosus L). Semarang : FMIPA UNDIP


isolasi dan karakterisasi enzim protease dari tumbuhan

Documents