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Isabella Nicácio de Freitas
Caracterização imuno-histoquímica e
molecular dos pacientes com suspeita
clínica de Síndrome de Lynch
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Programa de Ciências em Gastroenterologia Orientador: Prof. Dr. Ulysses Ribeiro Júnior
São Paulo
2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Freitas, Isabella Nicácio de
Caracterizaçõa imuno-histoquímica e molecular dos pacientes com suspeita
clínica de Síndrome de Lynch / Isabella Nicácio de Freitas. -- São Paulo, 2014.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Ciências em Gastroenterologia.
Orientador: Ulysses Ribeiro Júnior.
Descritores: 1.Neoplasias colorretais 2.Neoplasias colorretais hereditárias
sem polipose 3.Instabilidade de microssatélites 4.Imuno-histoquímica 5.Proteínas
proto-oncogênicas B-raf 6.Guias de prática clínica com assunto
USP/FM/DBD-332/14
Dedicatória
Dedico esta tese a meus amados pais, Raimundo
Euvaldo (in memorian) e Dijanete (in memorian), que
me inspiraram na ampliação dos meus conhecimentos
sobre esta síndrome e pelo exemplo de força, caráter,
honestidade e amor.
A minhas irmãs queridas, Filomena e Maria do Socorro
pelo apoio, companheirismo e entusiasmo.
Agradecimentos Primeiramente a Deus pela presença constante em minha vida.
Ao meu prezado orientador, Prof. Ulysses Ribeiro Júnior, que apoiou e abraçou
esta minha luta, proporcionando oportunidades únicas de crescimento
profissional, autoestima e aprendizado acadêmico.
Ao Prof. Venâncio Avancini Ferreira Alves pelo companheirismo e pela preciosa
contribuição nas análises histopatológicas e imuno-histoquímicas. Sem seu apoio,
não teria conseguido. Muito obrigada por tudo.
Aos Professores Ivan Cecconello e Luiz Augusto Carneiro D’Albuquerque pelo
carinho, amizade, estímulo e grande ajuda na concretização desta jornada.
Aos demais Profs. do Departamento de Gastroenterologia que muito me
ensinaram ao longo do tempo em que estive aqui. Em particular, agradeço aos
queridos Prof. Aytan Miranda Sipahi e Prof. Aderson O. M. C. Damião pelo
carinho e dedicação nos ensinamentos ao longo da minha formação como
gastroenterologista.
Ao Prof. Dr. Raul Cutait incentivador desde a minha chegada a São Paulo e a
sua amizade ao longo de toda minha carreira profissional.
Ao Dr. Luiz Câmara Lopes e a Dra. Kátia Leite, pela receptividade e primeiros
ensinamentos na área de Biologia Molecular.
Ao Prof. Bruno Zilberstein pela leitura do manuscrito, incentivo e apoio na
realização desta tese.
À Dra. Alina Quitanilha e Dr. Afonso Henrique da Silva e Souza Júnior pelo
apoio, carinho e correções valiosas.
Aos Profs. participantes da banca de qualificação: Dra. Renata de Almeida
Coudry, Dra. Maria Aparecida Azevedo Koike Folgueira e Dr. Afonso Henrique
da Silva e Souza Júnior pela leitura cuidadosa, críticas construtivas e pelas
importantes e enriquecedoras sugestões.
Aos queridos Dra. Juliana Magalhães, Dr. George Câmara Lopes, Dra. Clarissa
Maria Oliveira pela ajuda nas revisões e padronizações das lâminas, realização
do BRAF e convívio diário. Meus sinceros agradecimentos.
À Dra. Renata Moutinho pelo companheirismo e orientações na aula de
qualificação.
À D. Alda Wakamatsu pelo apoio na confecção das lâminas e realização dos
ensaios imuno-histoquímicos.
À bióloga Ligia Petrolini de Oliveira e Dra. Renata de Almeida Coudry pela
realização e leitura dos ensaios de instabilidade dos microssatélites.
Ao Dr. Márcio Augusto Diniz pela brilhante colaboração nas análises estatísticas.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo
apoio financeiro para realização desta pesquisa. (FAPESP Projeto Regular Nº
2010/06045-8).
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho.
Sumário
Lista de Abreviaturas
Lista de Quadros
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Summary
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 4
2.1 Epidemiologia do câncer colorretal ...................................................... 5
2.1.1 Epidemiologia no Brasil .......................................................... 7
2.2 Síndrome de Lynch (SL) ...................................................................... 9
2.2.1 Histórico .................................................................................. 9
2.2.2 Terminologia ......................................................................... 11
2.2.3 Carcinogênese ...................................................................... 13
2.2.4 Características clínicas ......................................................... 16
2.2.5 Modelos de Predição Genéticos ........................................... 20
2.2.6 Histopatologia ....................................................................... 23
2.2.7 Imuno-histoquímica ............................................................... 24
2.2.8 Instabiliade de microssatélites .............................................. 26
2.2.9 BRAF .................................................................................... 27
3 OBJETIVOS ............................................................................................... 29
4 MÉTODOS ................................................................................................. 31
4.1 Casuística e amostras ....................................................................... 32
4.2 Critérios de inclusão .......................................................................... 33
4.3 Critérios de exclusão ......................................................................... 33
4.4 Variáveis anatomopatológicas ........................................................... 34
4.5 Ensaios imuno-histoquímicos ............................................................ 35
4.5.1 Anticorpos primários utilizados e padronização dos ensaios ................................................................................. 35
4.5.2 Controles positivos e negativos usados durante os ensaios imuno-histoquímicos ................................................ 39
4.5.3 Interpretação dos resultados das reações imuno-histoquímicas ........................................................................ 39
4.6 Instabilidade de Microssatélites (MSI) ............................................... 40
4.6.1 Sistema de Análise MSI ........................................................ 40
4.6.2 Protocolo de extração ........................................................... 41
4.6.3 Amplificação.......................................................................... 43
4.6.4 Perfil da ciclagem .................................................................. 43
4.6.5 Preparação da amostra ........................................................ 44
4.7 Análise da mutação somática para o BRAF ...................................... 45
4.7.1 Técnica ................................................................................. 45
4.7.2 Interpretação ......................................................................... 45
4.8 Análise Estatística ............................................................................. 46
5 RESULTADOS .......................................................................................... 48
5.1 Critérios de Amsterdam I e Bethesda Revisados .............................. 49
5.2 Localização do tumor ........................................................................ 50
5.3 Histopatologia .................................................................................... 50
5.4 Imuno-histoquímica ........................................................................... 53
5.5 Instabilidade de Microssatélites ......................................................... 56
5.6 Análise da mutação somática para BRAF ......................................... 57
5.7 Associações entre as variáveis estudadas ........................................ 58
5.7.1 IHC ........................................................................................ 58
5.7.2 MSI ....................................................................................... 63
5.8 Critérios de Amsterdam ..................................................................... 66
5.9 Testes de associação, Regressão binária simples e Regressão
binária múltipla .................................................................................. 67
5.10 Escore ............................................................................................... 71
6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 74
6.1 Critérios de Amsterdam I e Bethesda Revisados .............................. 75
6.2 Localização do Tumor ....................................................................... 79
6.3 Histopatologia .................................................................................... 80
6.4 Imuno-histoquímica ........................................................................... 82
6.5 Instabilidade de Microssatélites ......................................................... 83
6.6 Perspectivas ...................................................................................... 85
7 CONCLUSÕES .......................................................................................... 88
8 ANEXOS .................................................................................................... 90
9 REFERÊNCIAS ....................................................................................... 105
Lista de Abreviaturas
CCR câncer colorretal
CIMP Fenótipo metilador de ilhotas CpG
CIN instabilidade cromossômica (chromossomal instability)
D.P. desvio padrão
DNA Ácido desoxirribonucleico
FCCTX câncer colorretal familial tipo X
H2O2 peróxido de hidrogênio
HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP
hMLH1 gene codificador para a proteína MLH1
hMSH2 gene codificador para a proteína MSH2
hMSH6 gene codificador para a proteína MSH6
HNPCC Síndrome do câncer colorretal hereditário não polipoide
hPMS2 gene codificador para a proteína PMS2
IHC imuno-histoquímica
INCA Instituto Nacional do Câncer
LIM-14 Laboratório de Investigação Médica 14
LOH perda de heterozigosidade (loss of heterozigosity)
M:F Proporção Masculino:Feminino
MLH1 proteína MLH1
MMR correção de erros de pareamento (mismatch repair)
MSH2 proteína MSH2
MSH6 proteína MSH6
MSI instabilidade de microssatélites (microsatellite instability)
MSI-H fenótipo microssatélite instável de alta frequência
MSI-L fenótipo microssatélite instável de baixa frequência
MSS fenótipo microssatélite estável
NCI Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (National
Cancer Institute)
PBS solução salina tamponada com fosfatos
PCR reação de cadeia da polymerase (polymerase chain reaction)
PH pólipos hiperplásicos
PS pólipos serrilhados
PMS2 proteína PMS2
RA recuperação antigênica
RER fenótipo portador de erros de replicação (replicação erro)
SL Síndrome de Lynch
SPS Síndromes de poliposes serrilhadas
USP Universidade de São Paulo
VM via mutadora
VS via supressora
Lista de Quadros
Quadro 1. Distribuição dos Anticorpos utilizados nas reações de IHC,
técnicas de recuperação antigênica, titulação e método de
revelação das reações .................................................................. 36
Quadro 2. Pesquisa da MSI ........................................................................... 40
Quadro 3. Avaliação dos critérios clínicos quanto à associação com as
variáveis clínico-patológica em 61 pacientes ................................ 68
Quadro 4. Escore para IHC ............................................................................ 72
Quadro 5. Escore para MSI ............................................................................ 73
Lista de Figuras
Figura 1. Representação da análise da mutação V600E (1799 T>A) do gene
BRAF. No eletroferograma do sequenciamento está destacado um
exemplo de selvagem (A) e de mutação em heterozigose (B). ..... 46
Figura 2. Carcinoma pouco diferenciado apresentando padrão medular.
Padrão expansivo de crescimento (HEX100) ................................ 51
Figura 3. Carcinoma sólido pouco diferenciado padrão medular (HEX400) . 52
Figura 4. Carcinoma sólido pouco diferenciado apresentando padrão
medular (HEX100) ......................................................................... 52
Figura 5. Folículo linfoide com exuberante centro germinativo (HEX100) .... 53
Figura 6. MLH1 alterado na neoplasia. Diversos linfócitos reativos servem
como controle positivo (Imuno-histoquímicaX200) ........................ 54
Figura 7. MLH1 alterado na neoplasia. Diversos linfócitos reativos servem
como controle positivo (ImunoperoxidaseX400) ............................ 54
Figura 8. PMS2 positivo. Negativo para células neoplásicas. Diversos
linfócitos com núcleos reativos servem como controle positivo
(X100) ........................................................................................... 55
Figura 9. MSH2 positivo nos núcleos das células neoplásicas e nas células
do estroma (X200) ......................................................................... 55
Figura 10. MSH6 positivo nas células neoplásicas e nas células do estroma
(X100) ........................................................................................... 56
Figura 11. Curva ROC para IHC .................................................................... 71
Figura 12. Curva ROC para MSI .................................................................... 72
Lista de Tabelas
Tabela 1. Frequência dos critérios clínicos para a Síndrome de Lynch ........ 49
Tabela 2. Localização dos tumores ............................................................... 50
Tabela 3. Histopatologia positiva e negativa ................................................. 50
Tabela 4. Componentes histopatológicos avaliados em 61 pacientes com
história familial e pelo menos um critério de Bethesda revisado ... 51
Tabela 5. Resultado da avaliação Imuno-histoquímica em 61 pacientes
com história familial e pelo menos um critério de Bethesda
revisado ......................................................................................... 53
Tabela 6. MSI positiva e negativa ................................................................. 56
Tabela 7. Distribuição dos resultados da IHC, MSI e BRAF nos 12
pacientes alterados ....................................................................... 57
Tabela 8. Histopatologia negativa e localização do tumor ............................ 58
Tabela 9. Associação entre a IHC e a localização dos tumores colorretais .. 59
Tabela 10. Critérios de Bethesda revisados e imuno-histoquímica alterada ... 59
Tabela 11. Dímeros positivos e Critérios de Bethesda revisados ................... 60
Tabela 12. Critérios histopatológicos na imuno-histoquímica alterada ........... 61
Tabela 13. Critérios histopatológicos na imuno-histoquímica não alterada .... 62
Tabela 14. Distribuição dos 61 pacientes de acordo com os achados
imuno-histoquímicos e as variáveis clínico-patológicas. ............... 63
Tabela 15. MSI positivo e critérios de Bethesda revisados ............................. 64
Tabela 16. MSI positivo e histopatologia ......................................................... 65
Tabela 17. Distribuição dos 61 pacientes de acordo com os achados de
MSI (confirmados pela análise do BRAF) e as variáveis clínico-
patológicas. ................................................................................... 65
Tabela 18. Amsterdam I positivo, histopatologia positiva e negativa, imuno-
histoquímica alterada e não alterada e MSI positiva e negativa .... 66
Tabela 19. Regressão Binária Simples (MSI) ................................................. 69
Tabela 20. Regressão Binária Simples (IHC) .................................................. 70
Tabela 21. Regressão Logística Binária Múltipla (MSI)................................... 70
RESUMO
Freitas IN. Caracterização imuno-histoquímica e molecular dos pacientes com
suspeita clínica de Síndrome de Lynch [tese]. São Paulo – Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo; 2014. 126p.
Suspeita-se da Síndrome de Lynch (SL) a partir da história pessoal e familial do
indivíduo. Posteriormente, os dados histopatológicos, imuno-histoquímicos e
moleculares podem ser utilizados para aprimorar o diagnóstico da doença.
Entretanto, um grande desafio no diagnóstico da Síndrome de Lynch é a baixa
acurácia dos critérios clínicos utilizados. OBJETIVOS: Avaliar a frequência de
SL em pacientes submetidos a tratamento cirúrgico por câncer colorretal e com
história familial de câncer. Avaliar quais dos critérios clínicos e/ou moleculares
seriam mais informativos no diagnóstico desta Síndrome na população brasileira.
PACIENTES E MÉTODOS: Estudaram-se 458 casos de câncer colorretal
(CCR), do Serviço de Coloproctologia do Departamento de Gastroenterologia do
Hospital das Clínicas – FMUSP, de janeiro de 2005 a dezembro de 2008.
História familial (HF) positiva para CCR ocorreu em 118 pacientes. Promoveu-se
a revisão das lâminas para critérios histopatológicos de MSI (diretrizes de
Bethesda), avaliação imuno-histoquímica (IHC) para as proteínas MLH1, MSH2,
MSH6, PMS2, através do complexo avidina-biotina-peroxidase e instabilidade de
microssatélites (MSI) (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27). Realizada a
análise da mutação somática para o BRAF em todos os casos com MSI positiva.
RESULTADOS: Dos 118 pacientes com HF, 61 (51,69%) preencheram pelo
menos um dos critérios de Bethesda revisados. 36 eram do sexo feminino (59%),
média de idade de 53,2 anos. Nove (14,7%) pacientes apresentaram todos os
critérios de Amsterdam I. Cinquenta e dois tumores localizaram-se no cólon
esquerdo. Os componentes histopatológicos de MSI incluíram: linfócitos
intratumoral (47,5%), característica expansiva do tumor (29,5%) e o componente
mucinoso (27,8%) (componentes histopatológicos de MSI instável) em 44 (72%).
A IHC estava alterada em oito (13%) e a MSI em 12 pacientes (20%). Houve
associação entre os critérios de Amsterdam I e MSI e na IHC com MLH1 e
PMS2. Houve associação entre os critérios de Bethesda revisados com o sexo,
na histopatologia com o componente mucinoso e a reação Crohn like; com a MSI
e na IHC com o MLH1 e PMS2. O BRAF foi realizado nos 12 casos com MSI
positiva e em todos os casos foram negativos. Os indivíduos que apresentaram o
critério 4 de Bethesda revisado (CCR ou câncer associado a SL, diagnosticado
em um ou mais parentes de primeiro grau, desde que uma das neoplasias tenha
ocorrido antes dos 50 anos de idade), tiveram uma chance 10,6 vezes maior de
apresentar MSI positiva. Propôs-se um escore para caracterizar pacientes com
SL baseado nas variáveis estudadas nesta pesquisa. CONCLUSÕES: A
frequência de Síndrome de Lynch nos pacientes submetidos a ressecção por
câncer e com história familial foi de 20%. O critério 4 de Bethesda revisado
associou-se mais fortemente à presença de instabilidade de microssatélites na
população estudada. O escore desenvolvido neste estudo contribui como uma
ferramenta prática na ampliação diagnóstica da Síndrome de Lynch.
Descritores: 1.Neoplasias colorretais 2.Neoplasias colorretais hereditárias
sem polipose 3.Instabilidade de microssatélites 4.Imuno-histoquímica
5.Proteínas proto-oncogênicas B-raf 6.Guias de prática clínica como assunto
SUMMARY
Freitas IN. Immunohistochemical and molecular characterization of patients with clinical suspicion of Lynch Syndrome [thesis]. São Paulo – “Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo”; 2014. 126p. Lynch Syndrome is suspected due to the personal and familial history of the individual. Subsequently, histopathological, immunohistochemical and molecular data can be used to improve diagnosis of the disease. However, a major challenge in the diagnosis of Lynch Syndrome is the low accuracy of clinical criteria. OBJECTIVES: To assess the frequency of Lynch Syndrome in patients with familial cancer history submitted to colorectal cancer resection. To assess what clinical and / or molecular criteria would be the most informative in the diagnosis of this syndrome in Brazilian population. PATIENTS AND METHODS: 458 colorectal cancer (CRC) cases were studied, from the Coloproctology Unit of the Department of Gastroenterology, Hospital das Clinicas - USP, from January 2005 to December 2008. Positive family history (FH) for CRC occurred in 118 patients. The pathologic slides were reviewed for histological criteria for MSI (Bethesda guidelines), immunohistochemical analysis (IHC) for MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 proteins, through the avidin-biotin-peroxidase complex, and microsatellite instability (MSI) (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 and MONO-27). BRAF somatic mutation was analyzed in all cases with positive MSI. RESULTS: Of the 118 patients with HF, 61 (51.69%) met at least one of the revised Bethesda criteria. Thirty-six were female (59%), and the mean age was 53.2 years. Nine (14.7%) patients presented all Amsterdam criteria I. Fifty-two tumors were located in the left colon. MSI histopathological components included: intratumoral lymphocytes (47.5%), expansive characteristics of the tumor (29.5%) and mucinous component (27.8%) (Histological unstable components of MSI) in 44 (72%). IHC was abnormal in eight (13%) and MSI in 12 patients (20%). There was an association between the Amsterdam criteria I and MSI; and between IHC with MLH1 and PMS2. There was an association with the revised Bethesda criteria with: sex, mucinous histology and Crohn’s like reaction; with MSI and IHC with PMS2 and MLH1. BRAF was performed in 12 patients with MSI positive, and all were negative. Patients who presented the revised Bethesda criteria 4 (CRC or cancer associated with SL, diagnosed in one or more first-degree relatives, with one of the neoplasms occurred before 50 years of age), had a 10.6 increased chance to display positive MSI. Based on the studied variables, we proposed a score to characterize the Lynch Syndrome. CONCLUSIONS: The frequence of Lynch Syndrome in patients who were submitted to cancer resection, and had a cancer familial history was 20%. The criterion 4 Revised Bethesda was associated more strongly with the presence of microsatellite instability in the studied population. The developed score contributes as a practical tool in the diagnosis of Lynch Syndrome. Descriptors: 1.Colorectal neoplasms 2.Colorectal neoplasm hereditary nonpolyposis 3.Microsatellite instability 4.Immunohistochemistry 5.Proto-oncogene proteins B-raf 6.Practice guideline as topic
1 INTRODUÇÃO
Introdução 2
A Síndrome de Lynch, também chamada de câncer colorretal não
poliposo hereditário (HNPCC), é uma doença autossômica dominante, com
penetrância entre 80 e 90%, transmissão vertical e sem preferência por
sexo(1),acometendo aproximadamente 2 a 3% de todos os casos de câncer
colorretais(2-3). É determinada por mutação germinativa nos genes de reparo do
DNA, sendo mais comumente afetados os genes hMSH2 (human mutS
homolog 2; cromossomo 2p16) e o hMLH1 (human mutL homolog 1;
cromossomo 3p21), em cerca de 90% dos casos. Os restantes 10% são
causados por alterações nos genes MSH6 e PMS2(4-6).
A perda da função dos genes de reparo do DNA ocasiona acúmulo de
mutações no DNA deste indivíduo, processo denominado de instabilidade
genômica, envolvendo áreas de microssatélites(4-6).
As principais características clínicas da Síndrome de Lynch são: câncer
colorretal (CCR) em idade precoce (abaixo dos 45 anos), predomínio no cólon
direito (70%), maior incidência de tumores sincrônicos (3x) e metacrônicos (5 a
7x), rápido desenvolvimento do câncer, originado de adenomas, maior risco de
neoplasias malignas do endométrio, ovário, intestino delgado, trato renal
superior, estômago, trato biliar e pode estar associado com tumores de pele –
adenomas sebáceos, carcinomas sebáceos e ceratoacantomas (também
conhecido como Síndrome de Muir-Torre)(4-9).
Introdução 3
Para facilitar a identificação clínica desses doentes, foram propostos os
Critérios de Amsterdam(7). Posteriormente, foram propostos os critérios de
Bethesda para se indicar o “rastreamento” molecular do HNPCC (Teste de
Instabilidade Microssatélite (MSI) do tumor, e/ou Imuno-histoquímica).
Entretanto, um grande desafio no diagnóstico da Síndrome de Lynch é a baixa
acurácia diagnóstica dos critérios clínicos utilizados (12-13,34).
2 REVISÃO DA LITERATURA
Revisão da Literatura 5
2.1 Epidemiologia do câncer colorretal
O câncer colorretal (CCR) representa uma das neoplasias mais prevalentes
nos países ocidentais, sendo a terceira neoplasia mais comum em todo o
mundo(1,2,3). A incidência do câncer colorretal está aumentando em países onde o
risco era considerado baixo, como o Japão e outros países Asiáticos(141).
Nos países com alto risco para o desenvolvimento desse tipo de câncer, a
incidência apresenta uma estabilidade ou até mesmo declínio, como é o caso dos
países da Europa Ocidental, Norte Europeu, América do Norte e Austrália(108).
Sua epidemiologia tem despertado maior interesse nos últimos anos, em
decorrência de recentes avanços no campo da Genética e Biologia
Molecular(4).
Devido ao resultado da interação de fatores genéticos e ambientais, o
CCR pode ser dividido em três categorias de risco: esporádico, familial e
hereditário (67). O CCR esporádico acomete 70% de todos os CCR, origina-se
de mutações somáticas e está associado com idade mais avançada.
Aproximadamente 20-30% de todos os CCR são classificados como de origem
familial. Identificaram-se polimorfismos e susceptibilidade associada à loci de
baixa penetrância com risco aumentado de CCR por associações genéticas e
estudos populacionais nestes pacientes(68-70).
Revisão da Literatura 6
Acredita-se que a imensa maioria dos tumores colorretais seja
proveniente da malignização de pólipos colorretais, através da denominada
sequência adenoma-câncer, fato que justifica os esforços para sua detecção
precoce(6,7). Entretanto, reconhece-se que no desenvolvimento do CCR estão
envolvidos fatores de alto risco (idade avançada, doenças genéticas, doenças
inflamatórias), risco moderado (dieta rica em carnes vermelhas, adenoma prévio,
irradiação pélvica) e risco baixo (dieta rica em gorduras, álcool, tabagismo,
obesidade, estatura alta, colecistectomia, consumo elevado de sacarose).
Enquanto alguns desses fatores não são passíveis de modificação (idade e
história familial), outros (como os dietéticos) parecem exercer importante
influência, pois, justificam as variações geográficas observadas nessa doença(5).
A contribuição dos fatores genéticos baseia-se em duas observações
indicativas de maior risco de câncer: (a) maior incidência de CCR entre
pessoas com história familiar e (b) famílias nas quais muitos membros são
afetados pela doença, indicando padrão de herança autossômica dominante de
susceptibilidade(8).
As alterações genéticas que causam o CCR podem ser divididas em:
adquiridas, mutações somáticas que originam o câncer esporádico,
responsável por 75 a 85% dos casos, cujo desenvolvimento, está associado a
um fenômeno chamado instabilidade cromossomal (CNI), que indica número
variável de ganhos e perdas nos cromossomos(8). Da mesma forma, algumas
alterações genéticas específicas, hereditárias ou não, podem conferir risco
substancial para o desenvolvimento de CCR. Nesse contexto, a associação de
CCR a síndromes hereditárias com mutação germinativa reconhecida perfaz
Revisão da Literatura 7
pouco menos de 5% do total de casos diagnosticados. Este grupo de pacientes é
classificado de acordo com a ausência (Síndrome de Lynch ou HNPCC) ou
presença de polipose colorretal (8).
2.1.1 Epidemiologia no Brasil
No Brasil, excluídos os tumores de pele não melanoma, estimam-se
395.000 casos novos de câncer, 204.000 para o sexo masculino e 190.000
para o sexo feminino, em 2014. O câncer colorretal representa a terceira
neoplasia maligna mais incidente tanto em homens quanto em mulheres, com
estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA) para o ano de 2014(28)
apontando para 15.670 casos novos em homens (15,44 por 100.000 homens) e
17.530 casos novos em mulheres (17,24 por 100.000 mulheres).
Reproduzindo distribuição heterogênea observada em diferentes países
do mundo, as estimativas do INCA revelam importantes diferenças por regiões
do Brasil. No Sudeste é o segundo tumor mais frequente em homens
(22,67/100.000) e o terceiro nas regiões Sul (20,43/100.000) e Centro-Oeste
(12,22/100.000). Ocupa a quarta posição na região Norte (4,48/100.000) e a
quinta na região Nordeste (6,19/100.000). Nas mulheres, é o segundo mais
frequente nas regiões Sudeste (24,56/100.000) e Sul (21,85/100.000), o
terceiro nas regiões Centro-Oeste (14,82/100.000) e Nordeste (7,81/100.000),
e o quarto na região Norte (5,30/100.000)(28).
Rossi et al, pesquisaram mutações nos genes MLH1 e MSH2 em
famílias Brasileiras com suspeita de câncer colorretal não polipoide hereditário
Revisão da Literatura 8
(HNPCC). Os familiares foram agrupados de acordo com os critérios de
Amsterdam I ou II, dez mutações foram detectadas (10 de 25[40%]); de nove
mutações diferentes, sete eram novas. O gene MLH1 teve o maior número de
mutações do que o MSH2 (8 de 25[32%] vs. 2 de 25[8%]). Apenas três destas
dez famílias preencheram os critérios de Amsterdam(119).
Outro trabalho deste mesmo grupo, também mostrou a frequência de
tumores extracolônicos em 60 famílias brasileiras com síndrome de Lynch que
preenchiam os critérios de Amsterdam I e II. Um total de 2.095 indivíduos: CCR
foi o tumor mais frequente nas famílias (334 casos). Duzentos tumores
extracolônicos entre todos os indivíduos com maior frequência em mulheres (123
casos) do que em homens (77 casos). O câncer de mama (32 casos) foi o mais
frequente entre as mulheres, seguido pelo câncer de endométrio (20 casos) e
colo uterino (20 casos). Nos homens, o câncer de próstata (16 casos) e o de
estômago (12 casos) foram os tumores extracolônicos mais frequentes(120).
Valentin et al, caracterizaram mutações germinativas do MLH1 e MSH2
na América do Sul em 123 indivíduos com suspeita de síndrome de Lynch.
Mutações patogênicas foram encontradas em 28,45% (34/123) dos indivíduos,
onde 25/57 (43,85%) preencheram os critérios de Amsterdam I, II e 9/66
(13,63%) os critérios de Bethesda. Treze alterações (35,14%) foram descritas
como primeira vez. Os dados relatados neste estudo acrescentaram informações
novas sobre mutações nos genes MLH1 e MSH2 e contribuíram para
caracterizar melhor a síndrome de Lynch no Brasil, Uruguai e Argentina. A alta
incidência de novas mutações demonstra a importância de definir mutações nos
genes MLH1 e MSH2 em populações distintas com síndrome de Lynch(121).
Revisão da Literatura 9
2.2 Síndrome de Lynch (SL)
2.2.1 Histórico
Warthin, professor e diretor de Patologia da Universidade de Michigan,
fez um estudo sobre a natureza da hereditariedade do câncer, por meio da
análise de um detalhado pedigree e documentação patológica de cânceres
familiares em sua instituição(29-30). Em 1913, relatou o pedigree da família G
relacionada com outras associações cancerosas(31). Esta foi a primeira
documentação de uma família com a Síndrome de Lynch.
Estudos de duas grandes famílias ocidentais, publicados nos Archives
Internal Medicine.(35) chamaram a atenção de A. James French, diretor de
Patologia de Michigan, que encorajou Lynch a estudar o material de Warthin sobre
a família G. Após mais de 50 anos, Henry T. Lynch descreveu a doença que daria
seu nome(29-30). As análises do pedigree da família deste paciente formaram as
bases para a Síndrome de Lynch (“Fatores hereditários no câncer”), em 1966.
Lynch e Krush(29-30) atualizaram os dados da família e publicaram, em 1971,
dados coletados de mais de 650 membros da mesma família. Notaram-se muitos
aspectos ainda não relatados da síndrome, incluindo: 1) incidência aumentada
de adenocarcinomas, principalmente de cólon e endométrio; 2) risco aumentado
para múltiplos tumores; 3) herança autossômica dominante; 4) início precoce do
câncer (29-30).
As ideias de Lynch aos poucos ganharam força, particularmente nas
comunidades internacionais, culminando na organização do Grupo
Revisão da Literatura 10
Colaborativo Internacional em Câncer Colorretal Hereditário Não Polipoide.
O grupo composto por 30 líderes de oito países se reuniu em Amsterdam e
formulou uma série de critérios clínicos (hoje conhecidos como critérios de
Amsterdam) em 1990. Estes critérios serviram como ponto de partida para
outras investigações (Anexo I). Em 1998, os critérios de Amsterdam foram
reformulados, reconhecendo o significado de subtipos de tumores
extracolônicos (isto é, endométrio, intestino delgado, ureter e pélvis renal).
Estes critérios revisados de Amsterdam II estão apresentados no Anexo I(12,13).
A caracterização molecular da Síndrome ocorreu a partir do estudo de
Peltomaki et al.(21) que associaram a doença (a duas grandes famílias
encontrando os critérios de Amsterdam originais) a alteração em um locus no
cromossomo 2p. Em seguida, três grupos, independentemente, relataram
fenótipo molecular peculiar no CCR caracterizado por alterações frequentes na
longa série de sequências repetitivas simples, fenômeno no qual os grupos
chamaram erros replicativos (RERs), MSI, mutações somáticas em sequências
repetitivas simples que se encontravam em todos os lugares.
Aaltonen et al.(9), acharam o fenótipo de erros replicativos em 11/14
(79%) em tumores HNPCC e 6/46 (13%) dos CCR esporádicos. Os tumores
esporádicos RER+ têm predominância no cólon direito e são diploides
parecidos com os casos do HNPCC.
Thibodeau et al.(22) encontraram alguns graus de MSI em 25/90 (28%)
dos CCR, ligando este fenômeno à localização proximal e melhora da
sobrevida, demonstrando relação inversa com a perda da heterozigosidade.
Revisão da Literatura 11
O grupo de Ionov(32) também relatou mutações somáticas de sequências
repetitivas simples em 12% dos CCR, as quais foram relativamente mais
comuns em mulheres e estavam associadas com a localização do lado direito,
histopatologia pouco diferenciada, raras mutações KRAS e p53 e estágios
menos avançados do tumor. No final de 1993, identificou-se a participação do
MSH2, relevante gene localizado no 2p, cujas mutações ocorreram nas famílias
com a Síndrome de Lynch. Um segundo locus da doença estava ligado ao 3p e
no início de 1994, notaram-se mutações em famílias com Síndrome de Lynch.
A demonstração da doença causada por mutações em PMS2 e MSH6
ocorreram posteriormente(33-34).
Nos últimos 15 anos, as aplicações destes conhecimentos melhoraram o
entendimento da incidência e fenótipo da doença. O Instituto Nacional do Câncer
Americano (NCI) dedica-se a emissão de diretrizes (“Bethesda guidelines”) para
identificar pacientes que poderiam se beneficiar com testes clínicos para a SL.
Os critérios de Bethesda revisados são apresentados no Anexo II.
2.2.2 Terminologia
Lynch introduziu o termo HNPCC em 1985, enfatizando a natureza
hereditária da predisposição para o CCR na ausência de polipose comum; o
termo ganhou aceitação(12,20,37).
Boland e Troncale(37) fizeram a primeira referência para a Síndrome de
Lynch em um relato de caso em 1984. HNPCC e SL têm sido usados com
frequência como sinônimos(13,15).
Revisão da Literatura 12
O termo “HNPCC” é problemático por várias razões e nos encoraja o uso
do termo ”Síndrome de Lynch”, sendo uma opinião compartilhada por muitos(37-
38). Primeiro, o HNPCC é um descritor inexato e potencialmente equivocado do
fenótipo da doença. Ele significa ausência de pólipos colorretais, mas não é o
caso. Os pacientes com Lynch têm apresentado similar número de pólipos que a
população geral(39). Ele também falha em reconhecer o maior espectro de
neoplasias associadas, incluindo carcinomas de endométrio, estômago, intestino
delgado, ovário, ureter, pelve renal e pele. O mais importante é que o termo
HNPCC tem sido aplicado para dois grupos de sobreposição de pacientes:
aqueles que preenchem os critérios de Amsterdam e os que mostram aspectos
clínicos, histopatológicos e moleculares com mutação demonstrável em um dos
genes de reparo do DNA. Esta confusão é parcialmente atribuível à associação
do HNPCC com os critérios de Amsterdam antes da demonstração das bases
genéticas moleculares da doença.
Lindor et al.(37) demonstraram que para mais de 40% dos pacientes que
preenchem os critérios de Amsterdam I, falta evidência de deficiência
hereditária em MMR. Estudando 161 famílias com critérios de Amsterdam I,
classificaram estas famílias em dois grupos, baseados no estado MSI do tumor.
Neste estudo, o estado MSI-H (MSI-High) serviu como um substituto para o
gene MMR para aqueles que apresentavam história familial forte. A incidência
de CCR nos parentes de primeiro e segundo graus dos pacientes com tumores
MSI-H foi 6,1 vezes maior (intervalo de confiança de 95%, variando de 5,2 até
7,2) (p<0,01); estes membros da família foram também de risco
estatisticamente significante para a típica natureza de tumores extracolônicos
Revisão da Literatura 13
associados ao Lynch. O risco de CCR em famílias com baixa incidência de
tumores microssatélites instáveis, MSI-L (MSI-Low) ou microssatélites estáveis
foi significativamente menor (razão de chance de 2,3), e falharam em
demonstrar risco aumentado para tumores extracolônicos. Com bases nestes
resultados concluíram que a população que preenche aos critérios de
Amsterdam é composta por pelo menos dois grupos: 1. Famílias com evidência
de dMMR hereditário, exibindo aspectos clínicos da síndrome com
predisposição ao câncer descrita por Lynch e 2. Famílias sem evidência de
dMMR hereditário. Eles atribuíram o risco aumentado para o CCR neste
segundo grupo, por combinação de agrupamento familiar, meio ambiente e
alguns genes ainda não descobertos. Para o primeiro grupo, eles encorajaram
o uso do termo diagnóstico “Síndrome de Lynch” e para o segundo, eles
propuseram o descritor CCR familial tipo X. Estes achados têm sido validados
por outros autores(40).
2.2.3 Carcinogênese
O desenvolvimento do CCR resulta do acúmulo de mutações em genes
cruciais para o controle do crescimento e diferenciação celulares(71). Até pouco
tempo, existiam duas vias principais de instabilidade genômica, aparentemente
independentes: a via supressora (VS), caracterizada por alteração sequencial
de genes supressores tumorais e proto-oncogenes, cujos tumores apresentam
instabilidade cromossômica, e a via mutadora (VM), caracterizada pela
presença de mutações em genes de reparo do DNA, cujos tumores
Revisão da Literatura 14
apresentam instabilidade de microssatélites(72). Recentemente, foi descrito uma
nova via de carcinogênese para o CCR através das Síndromes de poliposes
serrilhadas (SPS). Hoje, sabe-se que alguns pólipos hiperplásicos fazem parte
da Síndrome dos pólipos serrilhados (PS), que incluem diferentes tipos de
lesões com característica histológica comum, a aparência em “dentes de
serra”, com potencial de transformação para CCR através da chamada “via
serrilhada”(116,122-124). Durante a última década houve troca no paradigma que
considerava os adenomas como os únicos precursores de CCR. Os PS se
classificam em pólipos hiperplásicos (PH), adenoma ou pólipo serrilhado séssil
(ASS) e adenoma serrilhado tradicional (AST). Os PS considerados de risco
são os de localização proximal ao sigmoide, maiores ou igual a 10mm e os que
apresentam displasia associada (ASS com displasia ou AST) (116-118). A SPS é
uma entidade de descrição recente, para a qual existem múltiplas incógnitas,
principalmente em relação ao diagnóstico, sua possível causa genética, história
natural, fenótipo clínico e molecular.
Cerca de 90% dos CCR associados à Síndrome de Lynch seguem a VM da
carcinogênese, traduzida pela presença de instabilidade de microssatélites(73-74).
A Síndrome de Lynch é determinada por mutação germinativa nos genes
de reparo do DNA, sendo mais comumente afetados os genes hMSH2 (human
mutS homolog 2; cromossomo 2p16) e o hMLH1 (human mutL homolog 1;
cromossomo 3p21), em cerca de 90% dos casos. Os restantes 10% são
causados, na quase totalidade, por alterações nos genes MSH6 e PMS2(13,15,20).
Recentemente, descreveu-se uma alteração gênica que ocasiona a
Síndrome de Lynch envolvendo o gene das moléculas de adesão das células
Revisão da Literatura 15
epiteliais EPCAM ou deleção final 3’ constitucional dos exons do TACSTD1
(cromossomo 2p21) (125-6).
A principal característica genética é a perda da função dos genes
responsáveis pelo reparo do DNA, com consequente acúmulo de mutações no
DNA deste indivíduo, a qual irá desencadear o processo de carcinogênese(13,15,20).
Para entender os mecanismos envolvidos nesta síndrome, é necessário
explicar algumas definições. Microssatélites representam sequências de DNA
constituídas por repetições de dois ou três nucleotídeos que passam de uma
geração para outra de forma permanente. As repetições contidas nos
microssatélites variam entre indivíduos (por isso são considerados polimórficos),
mas essa quantidade se mantém estável em todas as células de uma pessoa
(germinativas ou somáticas).
No entanto, quando ocorre defeito no sistema que zela pela integridade
do mecanismo de replicação do DNA, o número de repetições dos
microssatélites se torna instável, com expansões e contrações da sequência do
DNA. Esse fenômeno, conhecido como Instabilidade de Microssatélites (MSI) é
particularmente evidente em certas neoplasias, como os tumores colorretais
provenientes de mutações herdadas nos genes de reparo do DNA. Assim,
quando defeituosos, os genes de reparo geram instabilidade genômica
caracterizada por numerosos erros de replicação (em relação ao pareamento
na sequência de nucleotídeos), resultando em alterações no emparelhamento
do DNA. Além dos tumores hereditários, a MSI é encontrada também em
aproximadamente 15% dos tumores esporádicos(9,10,11)
Revisão da Literatura 16
2.2.4 Características clínicas
O HNPCC é uma doença autossômica dominante, com penetrância entre
80 e 90%, transmissão vertical e sem preferência por sexo(52), acometendo
aproximadamente 2-3% de todos os casos de câncer colorretais(54-55).
Os indivíduos afetados podem desenvolver adenomas colônicos com maior
frequência do que a população geral, e a penetrância ao longo da vida para o
desenvolvimento do câncer colorretal é de 50 a 80%(56). Muto et al.(53), sugerem
que na população, a ocorrência da transformação do adenoma para carcinoma
demore entre 10 e 15 anos. Porém, em pacientes com HNPCC, esse processo é
mais acelerado pela falta de eficiência nos processos naturais da célula no reparo
do DNA, o que torna os adenomas mais agressivos. Apesar disso, relatos de
transformação maligna em intervalo menor que dois anos são raros.
As principais características clínicas da Síndrome de Lynch são: CCR
em idade precoce (abaixo dos 45 anos), com média de idade ao diagnóstico
entre 42 a 61 anos(17,56), quando comparado à idade de 71 anos na população
geral(76). A média de idade do diagnóstico do câncer endometrial é de 47 a 55
anos em alguns estudos, que é mais cedo do que na população geral(56,77,78).
Em contraste, outros estudos encontraram média de idade do diagnóstico de
câncer do endométrio de 62 anos, sendo a mesma da população geral(76,79).
Os pacientes com Síndrome de Lynch têm idade precoce ao diagnóstico
de CCR, e quando isto ocorre, a sobrevida destes pacientes quando
comparados ao do tipo esporádico é maior. Isto pode ser demonstrado em
estudo Finlandês, com 1/3 de mortalidade menor no CCR associado à
Revisão da Literatura 17
Síndrome de Lynch(80). Em concordância, sobrevida de cinco anos de CCR
associado à Síndrome de Lynch foi de 53% quando comparado a 35% para o
CCR do tipo esporádico(81), podendo ser atribuído às observações de que os
cânceres na Síndrome de Lynch têm menor risco para metástases. Predomínio
no cólon direito (70%), maior incidência de tumores sincrônicos (3x) e
metacrônicos (5 a 7x). A frequência de CCR sincrônicos para a SL é 18% e de
metacrônicos é 30% em 10 anos e 50% em 15 anos(82,84). Em comparação, o
risco de CCR sincrônicos e metacrônicos nos casos esporádicos é 2 a 4% e 2
a 3%, respectivamente(81,83). O rápido desenvolvimento do câncer, originado de
adenomas, maior risco de neoplasias malignas do endométrio, ovário, intestino
delgado, trato renal superior, estômago e trato biliar, associação com tumores
de pele – adenomas sebáceos, carcinomas sebáceos e ceratoacantomas
(também conhecido como Síndrome de Muir-Torre), faz a caracterização desta
Síndrome(12,13,15,17,20,35).
Câncer Colorretal Familial tipo X: Recentemente, foram descritas
famílias que preenchem os Critérios de Amsterdam, mas cujos CCR não
apresentam instabilidade de microssatélites, e em que não se identificam
mutações nos genes de reparo do DNA. Lindor et al.(75) sugeriram denominar
esta nova entidade como Carcinoma Colorretal Familial do tipo X, uma vez que
a sua base genética ainda não foi estabelecida.
Para facilitar a identificação clínica desses doentes, foram propostos os
Critérios de Amsterdam(12), que foram revisados em 1998, passando a incluir
os tumores extracolônicos (endométrio, ureter, pélvis renal, intestino delgado,
estômago), ficando conhecidos como Critérios de Amsterdam II(13).
Revisão da Literatura 18
Os Critérios de Amsterdam I reúnem três ou mais parentes com CCR,
mais todos os seguintes critérios: a) Um paciente acometido deve ser parente
de primeiro grau dos outros dois; b) CCR deve ser encontrado em pelo menos
duas gerações; c) Pelo menos um caso de CCR diagnosticado antes dos 50
anos de idade, excluindo-se o diagnóstico de Polipose Adenomatosa Familiar
(Anexo I).
A sensibilidade dos Critérios de Amsterdam I varia de 54 a 91% e a
especificidade de 62 a 84%, com grande heterogeneidade entre os estudos
(homogêneos quanto à sensibilidade e heterogêneos quanto à especificidade)(14).
Segundo meta-análise de 2004, os Critérios de Amsterdam II possuem maior
sensibilidade 78%, porém menor especificidade, variando de 46 a 68%,
destacando-se que na utilização destes critérios, 22% dos pacientes portadores
de mutação MLHI e MSH2 podem não ser diagnosticados(14).
Contudo, a identificação de alterações patogênicas nos genes
relacionados à Síndrome de Lynch é bastante trabalhosa e a indicação dessa
pesquisa tem que ser criteriosa. Assim, devido à baixa sensibilidade dos
Critérios de Amsterdam, em 1997 foram elaborados os critérios de Bethesda
(Anexo II) com o objetivo de selecionar os pacientes que devem ser
submetidos ao “rastreamento” para diagnóstico do HNPCC, através do Teste
de Instabilidade Microssatélite (MSI) do tumor ou Imuno-histoquímica. A
pesquisa de MSI requer a coleta de tecido tumoral para determinar a chance de
existir mutação patogênica em um dos genes que fazem o reparo do DNA.
Quando há instabilidade, essa probabilidade é grande.
Revisão da Literatura 19
Já a definição do gene responsável pode ser facilitada pelo uso da
imuno-histoquímica no tecido tumoral, voltada para a detecção de proteínas
codificadas por esses genes. Quando não ocorre reatividade para uma delas,
aumenta a chance de a mutação estar localizada no gene que codifica essa
proteína, razão pela qual seu sequenciamento deve ser priorizado.
Os critérios de Bethesda estão presentes em mais de 90% dos
pacientes com HNPCC, apresentando maior sensibilidade (89%) e
especificidade de 53%(14). Outros estudos indicam que eles apresentam maior
sensibilidade (94%), seguidos pelos Critérios de Amsterdam II (72%) e Critérios
de Amsterdam I (61%)(15).
Os critérios de Bethesda revisados incluem a presença de um ou mais
aspectos histopatológicos associados com a MSI, isto é, a presença de tumor
infiltrado por linfócitos, reação linfocítica semelhante à Doença de Crohn,
diferenciação mucinosa ou anel de sinete e um modelo de crescimento sólido,
indiferenciado ou medular. Os critérios revisados de Bethesda não
proporcionam detalhes no valor preditivo destes aspectos, ambos sozinhos ou
em combinação, mas recomenda teste de MSI e/ou imuno-histoquímica de
proteínas de reparo do DNA para tumores colorretais diagnosticados antes dos
50 anos e para pacientes entre 50 e 59 anos que apresentem um ou mais dos
aspectos histopatológicos citados.
Dessa forma, a histologia do tumor pode ser útil não só para a triagem de
tumores para teste de perda da função do gene de reparo, como também, para
facilitar o diagnóstico de alguns CCR de início tardio e que apresentem pouca ou
nenhuma história pessoal ou familiar sugestiva da Síndrome de Lynch (16).
Revisão da Literatura 20
Os critérios de Bethesda revisados foram propostos para melhorar a
precisão na identificação dos pacientes com Síndrome de Lynch (15). Hampel et
al. (18) chamaram a atenção para limitações destes critérios, observando que
em uma coorte populacional de 1066 pacientes com CCR, cinco de vinte e três
portadores da mutação não preencheram os critérios de Bethesda ou Bethesda
revisados e poderiam ao contrário, não teriam sido diagnosticados se a
avaliação genética fosse limitada a indivíduos que preenchem estes critérios.
Atualmente, duas abordagens principais estão disponíveis para
identificar indivíduos e famílias com risco para a Síndrome de Lynch: 1.
abordagem chamada de critério universal, testa todos os casos de CCR em
pacientes com menos de setenta anos; 2. abordagem alvo (baseada na idade
ou critérios de história familiar), seguidos pelo teste genético, para aqueles
considerados de risco aumentado(127).
Ainda que a estratégia universal seja custo-efetiva, ela poderá falhar em
identificar casos onde mutações nos genes de reparo interrompam a sua
função, mas não resulte em instabilidade de microssatélites, como visto nos
casos de mutações no MSH6 ou quando resultados da IHC são normais apesar
de uma proteína MMR não funcionante (alterações em outros genes)(127).
2.2.5 Modelos de Predição Genéticos
Modelos preditivos foram desenvolvidos para quantificar o risco de detectar
uma mutação baseado na história pessoal e familiar, ajudando a decidir quem
poderia ser encaminhado para mais avaliação e/ou teste genético.
Revisão da Literatura 21
O primeiro modelo preditivo foi desenvolvido em 1998 para a
identificação de mutações de pontos em MLH1 e MSH2 (128). Em 2004, um
modelo de predição chamado Amsterdam plus, foi desenvolvido a partir de uma
população com câncer familial que adicionou cinco variáveis para o critério de
Amsterdam para melhorar suas habilidades em predizer mutações nos genes
de reparo: número de CCR e câncer endometrial na família, número de
indivíduos com dois ou mais CCR ou endometrial, média de idade do
diagnóstico e número de indivíduos com cinco ou mais adenomas (129). Em
2006, três modelos foram propostos: MMRPredict, MMRPro e PREMM1,2
(“Prediction of Mismatch Repair Gene Mutations in MLH1 and MSH2”) (130-132).
Este último modelo foi ampliado para incluir mutações no gene MSH6 e
substituído por modelo PREMM1,2,6 (“Prediction of Mismatch Repair Gene
Mutations in MLH1, MSH2, and MSH6”) (133).
O modelo de Barnetson et al (130), o PREMM (132,134-135) e o MMRPro (131)
foram introduzidos para quantificar probabilidade individual de ter mutação nos
genes de reparo mais comumente associada com a Síndrome de Lynch.
Barnetson et al (130) analisaram uma coorte populacional de 870
pacientes diagnosticados com CCR antes dos 55 anos. Eles desenvolveram
modelo para prever mutações MLH1, MSH2 e MSH6 usando análise de
regressão multivariável. O modelo incluiu idade do paciente, sexo, localização
do tumor, presença de CCR sincrônicos e metacrônicos, história familiar de
câncer endometrial e CCR, resultados da instabilidade de microssatélites e
imuno-histoquímica no tumor. Foi validado em 155 pacientes com CCR
diagnosticado antes dos 45 anos, tem uma sensibilidade de 62%,
Revisão da Literatura 22
especificidade de 97% e valor preditivo positivo de 80%. Entretanto, este
modelo foi desenvolvido e validado em pacientes jovens com CCR e não inclui
outros cânceres associados à Síndrome de Lynch, somente o câncer
endometrial.
O modelo PREMM (previsão de mutações em MLH1 e MSH2) (134-135) foi
desenvolvido usando uma coorte de 1914 indivíduos com risco moderado para
Síndrome de Lynch (132). Dados clínicos de 898 probandos foram usados para
modelo de derivação. O modelo foi validado em uma grande coorte separados
dos probandos. O modelo de regressão logística multivariável final incluiu
diagnóstico de CCR, adenomas colônicos, cânceres extracolônicos associados
à Síndrome de Lynch e história familial de cânceres associados à Síndrome de
Lynch. Entretanto, o modelo PREMM(134-135) não considera o tamanho da
família ou membros da família não afetados.
O modelo MMRPro usa estimativas da prevalência e a penetrância de
mutações nos genes de reparo para estimar a probabilidade de carregar
mutação clinicamente significante nos genes de reparo. O modelo também
pode estimar a probabilidade de desenvolvimento de CCR ou endometrial em
parentes não afetados e incorpora dados da MSI. Para indivíduos com
resultados de testes genéticos indeterminados ou não informativos, o modelo
MMRPro pode fornecer probabilidade de detecção de mutação deletéria pós-
sequenciamento. Estas estimativas são particularmente valiosas dado que o
teste genético tem limitações na sensibilidade e pobre aderência na
recomendação de rastreio de câncer (136).
Revisão da Literatura 23
2.2.6 Histopatologia
As características histopatológicas do tumor associado à Síndrome de
Lynch incluem: cânceres mucinosos, compostos por mais do que 50% de
células produtoras de mucina e câncer com células em anel de sinete,
contendo mais do que 50% de células em anel de sinete(147,85); carcinomas com
crescimento expansivo(146,85) ; linfócitos infiltrando tumor, os quais são
consistentes com coexpressões citotóxicas de células T CD3/CD8 e linfócitos
peritumorais; lesões Crohn`s-like, que são agregados linfoides nodulares
infiltrando a superfície do tumor (43-46,85), tumores pouco diferenciados e/ou
heterogêneos (20,43-45,47-52).
Nas famílias com câncer colorretal familial tipo X (FCCTX), os aspectos
clínicos e histopatológicos diferem significantemente do câncer colorretal da
Síndrome de Lynch.
Os tumores colorretais do tipo X se desenvolvem em média de idade
maior, são predominantemente localizados no cólon distal e frequentemente
mostram arquitetura tubular, projeções serrilhadas, margem do tumor infiltrativa
e necrose suja, entretanto, reações linfocíticas são raras. A natureza molecular
dos tumores FCCTX permanece obscura, e a morfologia do tumor é
consistente com mecanismos genéticos diferentes dos defeitos dos genes de
reparo MMR que causam a Síndrome de Lynch(86).
Revisão da Literatura 24
2.2.7 Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica analisa a expressão das proteínas de reparo
proporcionando informações de qual gene está envolvido, para posterior
sequenciamento genético.
A perda de expressão das proteínas de reparo apresenta acurácia
elevada na identificação da deficiência dos genes de reparo. Empregam-se os
anticorpos para hMLH1, hMSH2, hMSH6 e hPMS2(41). Considera-se alterado
quando há ausência de marcação das células tumorais. Os controles internos
positivos são compostos por linfócitos, células do centro germinativo e
enterócitos(42).
Em tumores esporádicos MSI-H, devido a hipermetilação patológica do
“promoter” hMLH1 (CpG island. Methylator phenotype), existe perda
consistente da expressão do hMLH1(43), logo este aspecto, sozinho, pode não
diferenciar entre MSI-H esporádico e Síndrome de Lynch.
Na Síndrome de Lynch, a alternância nas mutações dos genes de reparo
é numerosa e variável. Enquanto muitas mutações irão resultar na perda total
da expressão de proteína, em alguns casos de mutações “missense” irão
resultar em perda da função das enzimas de reparo, mas a proteína irá ser
expressa e detectável pela imuno-histoquímica. Grandes deleções e mutações
truncadas (“non-sense”) usualmente ocasionam níveis indetectáveis de
proteínas de reparo nos ensaios imuno-histoquímicos, caracterizando
mutações nos genes MLH1 e MSH2 que acometem mais de 90% dos casos da
Revisão da Literatura 25
Síndrome de Lynch; 5 a 10% envolvem o MSH6 e raramente o PMS2.
O significado patogenético da perda presumida de função devido à mutação
“missense” com proteína MMR detectável, não é inteiramente clara e
recomenda-se cautela na interpretação de tais achados (48).
Algumas perdas de função de mutações hMLH1 com proteína imuno-
histoquimicamente detectável, entretanto, poderia ainda ser detectada pela
imuno-histoquímica como perda de expressão da proteína hPMS2(47).
A proteína PMS2 forma heterodímeros com a proteína MLH1, instabilidade
funcional (mutação “missense”) do MLH1 e pode levar a perda de PMS2
(“abrogation” do complexo) detectável na imuno-histoquímica. Enquanto a
marcação negativa para PMS2 é aparentemente secundária e indica presença
possível de mutações “missense” no gene MLH1 (48). A identificação de mutações
em PMS2 é um tanto difícil devido a presença de uma grande família pseudogenes
PMS2 homólogos(49-50).
A imuno-histoquímica pode detectar casos com genes de reparo
deficientes que podem ser potencialmente não detectados pelo teste de
instabilidade microssatélites. As mutações em MSH6 tendem a resultar em
coloração fraca ou ausência de instabilidade microssatélites nos tumores,
fenômeno também bem demonstrado ambos por estudos de linhagem celular e
por estudos com MSH6-mutante em ratos. Estes casos de MSH6 podem ser
não incluídos no teste de instabilidade microssatélites, mas podem ser
detectável pelo MSH6 na IHC.
Revisão da Literatura 26
2.2.8 Instabiliade de microssatélites
Fenótipo molecular inicialmente identificado em neoplasias colorretais
hereditárias não associadas à polipose (síndrome de Lynch) e posteriormente,
relacionado a subgrupo de neoplasias esporádicas de características clínico-
patológicas próprias(9,21-22). É caracterizada por alterações esparsas ao longo
do genoma envolvendo o comprimento de sequências repetitivas mono, di, tri
ou tetranucleotídica e designadas microssatélites. Atribui-se a origem de tais
alterações a perda de fidelidade do processo de replicação do DNA, decorrente
do não reparo dos erros de pareamento que normalmente ocorrem na fase S
do ciclo celular (23-24).
Bocker et al.(25) chamaram atenção para a falta de padronização na
interpretação de resultados em diferentes centros por eles estudados na
Alemanha. O mesmo foi simultaneamente apontado por Diemaier et al.(26)
com relação a ausência de critérios diagnósticos e quais marcadores
microssatélites investigar na triagem de pacientes para estudos subsequentes
de sequenciamento. Em decorrência disto, realizou-se a padronização dos
critérios para identificação molecular do fenótipo MSI no encontro no NCI em
1997 (27). Neste encontro foi formalmente adotado o termo instabilidade de
microssatélites para se referir ao fenótipo molecular caracterizado por
alterações em sequências genômicas repetitivas, sendo recomendada
investigação de painel de cinco marcadores para definição deste fenótipo.
Foram ainda definidos os tipos microssatélite estáveis (MSS), microssatélite
instáveis de baixa frequência (MSI-L) e microssatélites instáveis de alta
Revisão da Literatura 27
frequência (MSI-H) a depender se nenhum, apenas um ou dois ou mais
marcadores avaliados estivessem alterados(27).
2.2.9 BRAF
O gene BRAF é um proto-oncogene, localizado no braço longo (q) do
cromossomo 7, na posição 34, (7q34). Este gene produz a proteína chamada
B-Raf, conhecida como uma das proteínas quinase serina/treonina. (109-110).
Está envolvida no envio de sinais para o interior das células, que estão
diretamente relacionados ao crescimento celular.
Esta proteína faz parte da via de sinalização conhecida como
RAS/MAPK, ajudando no controle de várias funções celulares importantes.
Especificamente, a via RAS/MAPK regula o crescimento e divisão (proliferação)
de células, processo pelo qual células maduras cuidam de funções específicas
(diferenciação), movimento celular (migração) e destruição celular própria
(apoptose). Ademais, a sinalização química através desta via é essencial para
o desenvolvimento normal antes do nascimento (109-110).
Mutações somáticas no gene BRAF são comuns em vários tipos de
câncer. Normalmente, a proteína B-Raf é ativada e desativada em resposta aos
sinais que controlam o crescimento e desenvolvimento celular. Mutações
somáticas fazem com que a proteína B-Raf seja continuamente ativada e
transmita mensagens para os núcleos das células. A proteína superativada
pode contribuir para o crescimento de cânceres através do crescimento
anormal das células e divisão descontrolada.
Revisão da Literatura 28
Mutações ativando o BRAF são encontradas em 5 a 25% dos casos de
CCR, com vasta maioria no BRAFV600E. A mutação no BRAFV600E ocorre
em dois terços dos CCR com MLH1 silencioso devido à hipermetilação
somática, mas nunca virtualmente em CCR com MSI devido à Síndrome de
Lynch (SL) (95). Entretanto, a mutação BRAFV600E é usada como marcador
para hipermetilação em tumores MLH1 com imuno-histoquímica negativa.
Ademais, o teste para SL é comumente oferecido nos casos com MLH1
negativos, apenas se eles são BRAF do tipo selvagem (92).
Mutação BRAFV600E também ocorre em tumores microssatélites
estáveis (MSS). Este grupo tem aparecido com fenótipo clínico e molecular
distinto e prognóstico ruim (111-113). A mutação do BRAFV600E é mutuamente
exclusiva com a mutação KRAS(114-115).
3 OBJETIVOS
Objetivos 30
A partir da caracterização clínica com história familial, imuno-
histoquímica, instabilidade de microssatélites e pesquisa da mutação para
BRAF, os objetivos desta pesquisa incluíram:
1. Avaliar a frequência de SL em pacientes submetidos a tratamento
cirúrgico por câncer colorretal e com história familial de câncer.
2. Avaliar quais dos critérios clínicos, histopatológicos, imuno-
histoquímico, e/ou de instabilidade de microssatélites seriam mais
informativos no diagnóstico desta síndrome na população brasileira.
4 MÉTODOS
Métodos 32
4.1 Casuística e amostras
Inicialmente, foi realizada uma análise de todos os casos de câncer
colorretal diagnosticados no período de janeiro de 2005 até dezembro de 2008, e
que foram atendidos no ambulatório de Coloproctologia do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP).
Foram operados 477 pacientes com câncer colorretal durante este período, e
destes, 19 pacientes apresentavam outras doenças associadas como Polipose
Adenomatosa Familiar, Doença Inflamatória Intestinal, GIST, Linfoma e Sarcoma
Intestinal, ou tinham realizado radioterapia pré-operatória sendo retirados do
estudo. Dos 458 casos restantes, 118 apresentavam histórico familial de câncer,
por meio de informações contidas no prontuário médico. Estes pacientes foram
então selecionados para entrevista e aplicação da ficha padronizada com os
Critérios de Amsterdam I, II e Bethesda revisados (Anexo IV). Após a aplicação
do questionário para estes pacientes ou familiares mais próximos, quando o
paciente havia falecido, foram selecionados sessenta e um casos de pacientes
com adenocarcinomas, em diversos graus de estágio, por satisfazerem os
critérios de inclusão conforme abaixo relacionados.
Todos os pacientes estudados eram de famílias distintas. Foram
realizados pedigree até a terceira geração dos familiares.
Métodos 33
Os tumores que apresentavam localização distal a flexura esplênica,
foram considerados como do cólon esquerdo e os com localização proximal a
flexura esplênica, como do cólon direito.
Seleção dos pacientes
4.2 Critérios de inclusão
a) Pacientes com diagnóstico de câncer colorretal e que tinham história
familial de câncer, e que tinham pelo menos um critério de Bethesda
revisado.
b) Pacientes que assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.
4.3 Critérios de exclusão
a) Doentes com Retocolite Ulcerativa.
b) Doença de Crohn.
c) Quimioterapia e radioterapia pré-operatória.
d) Polipose Familiar de qualquer tipo.
e) Aqueles que não assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE).
Métodos 34
4.4 Variáveis anatomopatológicas
Procedeu-se a revisão das lâminas para obtenção de informes
anatomopatológicos relacionados à Síndrome de Lynch, nos arquivos do
Departamento de Patologia do Hospital das Clínicas – HCFMUSP, utilizando a
classificação para tumor colorretal da Organização Mundial da Saúde (36). Foram
incluídos os seguintes aspectos histopatológicos: adenocarcinoma, carcinoma
mucinoso, carcinoma com células em anel de sinete ou carcinoma medular.
Grau de diferenciação: relatados em escala de três graus (bem diferenciado,
moderadamente diferenciado, pouco diferenciado/indiferenciado) (36,141-2).
Componente Mucinoso: definido quando no mínimo 50% da área do
tumor apresentavam-se compostas de mucina secretória.
Componente Anel de Sinete: definido quando no mínimo 50% do tumor
contivessem células em anel de sinete.
Componente Medular: definido como carcinomas de tipo “medular”, que
são aqueles tumores sólidos formados por blocos, ninhos ou trabéculas de
células tumorais com alto grau nuclear, numerosas figuras de mitose, escasso
citoplasma e denso infiltrado inflamatório na periferia da lesão. As bordas da
lesão são bem definidas em relação ao parênquima de tecido normal adjacente
(geralmente tumores com bordas arredondadas ou lobuladas).
Linfócitos Intratumor: foram pontuados como presentes, quando
existiam no mínimo cinco linfócitos em um campo de (x40) entre dez campos
examinados.
Reação Crohn-like: definido como agregados linfoides com ou sem
formação de centros germinativos na periferia do tumor e não associados a
linfonodo.
Métodos 35
Expansivo: definido como bordas do tumor expansivas, ou seja,
empurram o tecido normal adjacente ao invés de infiltrá-lo (36,141-2).
4.5 Ensaios imuno-histoquímicos
Os procedimentos imuno-histoquímicos foram realizados em conjunto
pelas equipes do LIM-14 |Patologia hepática| FMUSP, e Laboratório de Imuno-
histoquímica da Divisão de Patologia do Instituto Adolfo Lutz.
4.5.1 Anticorpos primários utilizados e padronização dos ensaios
Para o presente estudo foram utilizados anticorpos primários monoclonais
gerados em camundongos e dirigidos contra os antígenos, produtos dos genes
codificadores das enzimas de reparo dos erros de pareamento do DNA: anti-
MLH1 hum purif, clone G168-15, Becton Dickinson, cod. 550838 (RR-002-12155),
lote 83115; anti-MSH2 hum purif, clone G2019-1129, Becton Dickinson,
cod.556349 (RR-002-05885), lote 23665; anti-MSH6 (GTBP) 150ug, Becton
Dickinson, clone 44/MSH6, cod. 610919 (RR-002-17297), lote 64559; anti-PMS2
hum/cam purif, clone A16-4, Becton Dickinson, cod. 556415 (RR-002-13805), lote
76080. As condições ideais do ensaio para cada um dos antígenos pesquisados
foram determinadas mediante avaliação das diversas variáveis envolvidas na
execução das reações imuno-histoquímicas, referentes às condições de
recuperação antigênica em calor úmido, título do anticorpo primário e sistema de
revelação, conforme descritos a seguir:
Métodos 36
a) Recuperação antigênica (RA): testada em pH=6,0 e pH=3,0 (tampão
citrato de sódio 10mM) e pH=9,0 (tampão Tris-EDTA 1mM),
executadas tanto em panela de pressão por 3 minutos, quanto
panela a vapor por 40 minutos;
b) Título do anticorpo primário: para os quatro antígenos pesquisados,
os respectivos anticorpos primários foram testados em diferentes
títulos conforme a seguir:
anti-MLH1: 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 e 1/800;
anti-MSH2: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800 e 1/1600;
anti-MSH6: 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 e 1/800;
anti-PMS2: 1/50, 1/100, 1/250, 1/500 e 1/1000.
c) Sistema de revelação: foi utilizado o sistema de revelação baseado
em polímeros curtos: (Novocastra, Newcastle, Reino Unido).
Apresentam-se a seguir as condições ótimas padronizadas para os
quatro anticorpos alvos do presente estudo (Quadro 1).
Quadro 1. Distribuição dos Anticorpos utilizados nas reações de IHC, técnicas de
recuperação antigênica, titulação e método de revelação das reações
Anticorpo Clone RA Título Revelação
anti-MLH1 G168-15 -panela vapor
-pH=6,0 1:100 NovoLink
anti-MSH2 G2019-1129 -panela vapor
-pH=6,0 1:800 NovoLink
anti-MSH6 44\MSH6 -panela vapor
-pH=6,0 1:100 NovoLink
anti-PMS2 A16-4 -panela vapor
-pH=6,0 1:1000 NovoLink
Métodos 37
Procedeu-se, dessa forma, aos ensaios imuno-histoquímicos conforme
etapas discriminadas a seguir:
1. Desparafinização dos cortes de 3µ de espessura, do material
incluído em parafina: incubação com xilol a 60o C por 15 minutos,
seguido por outra incubação com xilol à temperatura ambiente por
15 minutos;
2. Hidratação dos cortes em concentrações de Etanol a 100% com três
banhos de 30 segundos cada, Etanol a 95%, 80% e 70% por 30
segundos, lavagem em água corrente e água destilada;
3. Recuperação antigênica mediante incubação das lâminas em
solução de TRIS 10 mM e EDTA 1 mM, pH 9,0 em panela a vapor;
após a fervura da água da panela, colocado a cuba com as lâminas
em solução de recuperação, por 40 minutos. Deixado esfriar por 20
minutos à temperatura ambiente. Lavagens em água corrente e
água destilada;
4. Bloqueio da peroxidase endógena com água oxigenada (H2O2) a 6%
diluída v/v em metanol, em três banhos de 10 minutos cada.
Lavagens em água corrente e água destilada.
Lavagem com solução salina tamponada com fosfatos (PBS) 10 mM
pH 7,4 por 5 minutos.
5. Bloqueio de proteínas com Cas Block (Zymed) por 10 minutos a 37o
C. Escorrido e incubado com o anticorpo primário.
6. Incubação das lâminas com anticorpo primário (específico para o
antígeno) diluído em solução de albumina bovina (BSA) (SIGMA,
Métodos 38
E.U.A.) a 1,0% e azida sódica NaN3 (Inlab, São Paulo) 0,1% em
PBS, em câmara úmida: 30 min. a 37oC e, em seguida, 18 horas
(overnight) a 4oC.
Lavagens em tampão PBS com três trocas de 5 minutos cada.
7. Incubação com o bloqueador pós-primário (Post Primary Block,
NovoLink Max Polymer Detection System, Newcastle, Reino Unido),
por 30 minutos a 37oC.
Lavagens com tampão PBS com três trocas de 3 a 5 minutos cada.
8. Incubação com NovoLink (Polímero) do mesmo kit por 30 minutos
a 37oC.
9. Revelação com solução de substrato cromogênico contendo
diaminobenzidina (Sigma, E.U.A.) a 0,10%, peróxido de hidrogênio a
0,06%, dimetil sulfóxido (Labsynth) a 1% em PBS, em banho de 5
minutos, a 37oC.
Lavagens em água corrente e água destilada.
10. Contracoloração com Hematoxilina de Harris por 1 minuto, lavagens
em água corrente e água destilada. Imersão rápida em água
amoniacal (solução de hidróxido de amônia 0,5%) seguido de
lavagens em água corrente e água destilada.
11. Desidratação dos cortes em banhos de etanol a 50%, 80%, 95% e
etanol absoluto (três trocas de 1 minuto cada), diafanização em
banhos de xilol (quatro trocas de 1 minuto cada) e montagem em
meio permanente (Entellan Merck) com lamínula.
Métodos 39
4.5.2 Controles positivos e negativos usados durante os ensaios
imuno-histoquímicos
Os controles utilizados na reação imuno-histoquímica compreenderam,
um controle positivo, caracterizado por adenocarcinoma colorretal, previamente
corado e sabidamente positivo para o anticorpo em estudo, e um controle
negativo com incubação em PBS e eliminação do anticorpo primário.
4.5.3 Interpretação dos resultados das reações imuno-histoquímicas
As reações imuno-histoquímicas foram qualitativamente interpretadas
como positivas ou negativas nas amostras dos tumores primários
representados nos cortes histológicos obtidas dos blocos de parafina.
Resultado positivo (não alterado) foi assinalado para as amostras em
que foi identificada real positividade nuclear nas células tumorais, interpretada
de acordo com os controles internos positivos, correspondentes a linfócitos,
células estromais ou células epiteliais glandulares colônicas não neoplásicas.
É importante salientar que até mesmo fraca reatividade nuclear nas células
tumorais, tendo em vista, também, fraca reatividade nos controles internos
anteriormente mencionados, foi considerada positiva.
O resultado negativo (alterado) foi assinalado para as amostras em que
foi identificada real negatividade nuclear nas células tumorais, interpretada de
acordo com os controles internos positivos, correspondentes a linfócitos,
células estromais ou células epiteliais glandulares colônicas não neoplásicas.
Métodos 40
É importante mencionar que a negatividade somente foi considerada nos
casos sem qualquer marcação nuclear, com controles internos, previamente
listados, positivos.
4.6 Instabilidade de Microssatélites (MSI)
Os procedimentos de MSI foram realizados, no Hospital A. C. Camargo
(Laboratório de Patologia Molecular Diagnóstica, Laboratório de Genômica e
Biologia Molecular).
Quadro 2. Pesquisa da MSI
MATERIAL TÉCNICAS INTERPRETAÇÃO
Amostra de tecido tumoral (em formol ou parafina) e tecido normal
Determinação no número de repetições dos microssatélites BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27, PENTA C, PENTA D
O número de repetições dos microssatélites no tecido tumoral deve ser igual ao tecido normal
4.6.1 Sistema de Análise MSI
Foram utilizadas sondas (primers) marcadas com fluorescência para
amplificação de sete marcadores, incluindo cinco marcadores
mononucleotídeos repetidos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27) e
dois marcadores pentanucleotídeos repetidos (Penta C e Penta D). Os
marcadores mononucleotídeos foram usados para a determinação da MSI e os
marcadores pentanucleotídeos foram usados para controle da reação. Os
produtos da PCR foram separados por eletroforese capilar.
Métodos 41
4.6.2 Protocolo de extração
Cortaram-se um a dois cilindros do material parafinado direto no tubo de
1,5 ml.
Desparafinização
1. Adicionou-se 1ml de xilol. Agitou-se por inversão. Incubou-se por 5
minutos a 57⁰C.
2. Removeu-se o sobrenadante com a pipeta. Descartou-se o xilol em
lixo apropriado.
3. Adicionou-se 1ml de xilol. Agitou-se por inversão. Removeu-se bem o
sobrenadante com a pipeta.
4. Adicionou-se 1ml ETOH (etanol) 100% à amostra. Homogeneizou-se
por inversão.
5. Removeu-se o sobrenadante com a pipeta. Repetiu-se o
procedimento com ETOH 100% mais 2x.
6. Removeu-se o excesso de etanol com a pipeta e secou-se na estufa
a 42⁰C por, aproximadamente, 2min ou até perceber-se que
evaporou todo etanol.
Digestão e Purificação do DNA
1. Adicionou-se 600µl de Cell Lysis Solution (Gentra Puregene Blood
Kit-Qiagen-Cat n⁰1589080) no pellet gerado no passo 6.
2. Incubou-se a 55⁰C em agitação (300 rpm) por 18 horas.
Métodos 42
3. Adicionou-se mais 10-15µl de Proteinase K, caso o tecido não tenha
dissolvido por completo.
4. Centrifugou-se o tubo Phase Lock Gel (PGL) por 1 min a 13.200 rpm.
5. Transferiu-se a amostra para o tubo PLG. Adicionou-se 500µl de
fenol-clorofórmio-álcool isoamílico.
6. Homogeneizou-se por inversão por 1 min. Centrifugou-se por 10 min.
a 13.200 rpm.
7. Transferiu-se a fase aquosa (acima da resina do tubo) para um novo
tubo PLG. Adicionou-se 500 µl de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico
(25:24:1). Homogeneizou-se. Centrifugou-se por 10 min. a 13.200.
8. Adicionou-se 400 µl de clorofórmio direto no tubo PLG (sem trocar
de tubo).
9. Homogeneizou-se por inversão por 1 min.
10. Centrifugou-se por 10 min. a 13.200 rpm.
11. Transferiu-se a fase aquosa para um novo tubo (2,0 ml) e adicionou-
se 0,5 µl de glicogênio (20µg/µl) e 800µl de ETOH 100% gelado.
Homogeneizou-se bem por inversão.
12. Incubou-se por 1 hora a -20⁰C (se a nuvem de DNA estivesse
evidente pulou-se esse passo).
13. Centrifugou-se por 30 min. a 14.000 rpm a 4⁰C. Removeu-se o
sobrenadante.
Métodos 43
14. Lavou-se o pellet 3x com 1ml de ETOH 70% gelado. Descolou-se o
pellet do fundo do tubo na primeira lavagem. Centrifugou-se por 2
min. a 14.000 rpm a 4⁰C.
15. Removeu-se o etanol (retirou-se o excesso com a pipeta). Secou-se
o pellet a 42⁰C ou na bancada.
16. Ressuspendeu-se em -20µl de H2O
17. Incubou-se a 55⁰C por 10 minutos.
18. Deixou-se overnight a 4⁰C.
20. Armazenou-se em freezer -20⁰C.
4.6.3 Amplificação
Componente volume por amostra
Água livre de nuclease: 5,85µl
Tampão Gold Star 10x: 1,00µl
Sistema de Análise MSI mistura de pares de primers 10x: 1,00µl
AmpiTaq Gold DNA polymerase (5u/µl): 0,15µl
Foram utilizados 100ng de DNA ciclagem.
4.6.4 Perfil da ciclagem
95⁰C por 11 minutos, depois:
96⁰C por 1 minutos, depois:
Métodos 44
Rampa 100% a 94⁰C por 30 segundos
Rampa 29% a 58⁰C por 30 segundos
Rampa 23% a 70⁰C por 1 minuto, por 10 ciclos, depois:
Rampa 100% a 90⁰C por 30 segundos,
Rampa 29% a 58⁰C por 30 segundos,
Rampa 23% a 70⁰C por 1 minuto,
Por 20 ciclos, em seguida:
60⁰C por 30 minutos
4⁰C embeber
4.6.5 Preparação da amostra
As amostras foram analisadas no sequenciador ABI 3500 (oito capilares
de Applied Biosystems).
O padrão Size Standard 600 foi incluído em cada experimento para
padronização das amostras de análise de amplificação e utilizou-se da quarta cor.
1. Preparou-se um coquetel pesado pela combinação e mistura do
padrão 600 (ILS 600) e formamida deionizado como segue: [(1,0µl
ILS 600) + (24µl formamido deionizado) x (# injeções)].
2. Combinou-se 25µl do coquetel preparado e 1µl da amostra amplificada.
3. Desnaturaram-se as amostras a 95⁰C por 3 minutos e banho de gelo
triturado por 3 minutos.
Métodos 45
4.7 Análise da mutação somática para o BRAF
4.7.1 Técnica
Pesquisa da mutação 1799 T>A (V600E) no exon 15 do gene BRAF.
O DNA genômico foi extraído do tecido emblocado em parafina com kits
apropriados e recuperado em solução tampão adequada. A PCR, para
posterior sequenciamento, foi realizada utilizando par de oligonucleotídeos
específicos para a região de interesse. Antes do sequenciamento, os produtos
da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose para verificação do
sucesso da amplificação.
4.7.2 Interpretação
(1) Positivo: O caso considerado POSITIVO apresenta o nucleotídeo A
na posição 1799;
(2) Negativo: O caso considerado NEGATIVO apresenta o nucleotídeo T
na posição 1799.
Sequenciamento do DNA (método de Sanger) (Figura 1)
O sequenciamento de DNA (método de Sanger) foi realizado no
aparelho ABI PRISMTM 3130 (Applied Biosystems) utilizando Big dye terminator
v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biossystems), conforme recomendações do
fabricante (107).
Métodos 46
A
B
Figura 1. Representação da análise da mutação V600E (1799 T>A) do gene BRAF.
No eletroferograma do sequenciamento está destacado um exemplo de selvagem (A)
e de mutação em heterozigose (B).
4.8 Análise Estatística
1. ANÁLISE DESCRITIVA
Realizada através de percentuais para variáveis qualitativas e para
as variáveis numéricas utilizamos média ± desvio padrão (DP).
2. TESTES ESTATÍSTICOS
Teste Exato de Fisher- Para verificar a associação entre as variáveis.
Métodos 47
Teste t de Student (quantitativo) / Mann-Whitney- Para comparar as
médias/medianas de idade entre os grupos.
Regressão Logística Binária Simples- Para avaliar quais fatores
foram preditores da positividade das variáveis de interesse (MSH2,
MLH1, MSH6, PMS2 e MSI), dando a razão de chance e os
respectivos intervalos de confiança de 95%.
Regressão Logística Binária Múltipla- Dentre todos os fatores, quais
mais se associam com a imuno-histoquímica e a instabilidade de
microssatélites.
3. ESCORE
Realizou-se regressão logística simples. Fatores que tiveram p valores
<0,20 foram escolhidos para serem avaliados na regressão logística
múltipla e em que as variáveis mais importantes foram escolhidas pelo
critério AIC (Akaike Information Criterion)145. Definiu-se o escore a partir
do preditor linear e os coeficientes foram reescalonados de forma que o
escore estivesse entre 0 e 100. Encontrou-se o ponto de corte (43,63) a
partir da curva ROC (Receiver Operateing Characteristic), através da
maximização do índice de Youden(144). Calcularam-se: sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Por fim,
avaliou-se o otimismo da validação interna através de amostras
bootstrap(143).
5 RESULTADOS
Resultados 49
5.1 Critérios de Amsterdam I e Bethesda Revisados
Após a aplicação do questionário de avaliação da história familial, 61 dos
118 pacientes estudados (52%), preencheram pelo menos um dos critérios de
Bethesda revisados para Síndrome de Lynch (SL). Destes 61 casos estudados,
36 eram do sexo feminino (59%) e 25 do sexo masculino (41%), com idade
variando de 22 a 87 anos (média: 53,18, DP= 16,5). Nove pacientes
apresentaram todos os critérios de Amsterdam I presentes. Todos pacientes
apresentaram pelo menos um critério de Bethesda revisado. O critério 5 de
Bethesda revisado foi o mais encontrado nesta casuística, seguidos pelos
critérios 1, 3, 4 e 2 (Anexo IV). Pelo menos um critério de Bethesda revisado
estava presente em 26 pacientes e dois ou mais critérios em 35 pacientes,
como visto na tabela 1.
Tabela 1. Frequência dos critérios clínicos para a Síndrome de Lynch
Critérios Número de casos
Amsterdam I 9 (14,7)
Bethesda revisado 1 29 (47,5)
Bethesda revisado 2 2 (4,92)
Bethesda revisado 3 24 (39,3)
Bethesda revisado 4 14 (22,9)
Bethesda revisado 5 43 (70,5)
Pelo menos um critério de Bethesda revisado 26 (42,6)
Dois ou mais critérios de Bethesda revisados 35 (57,4)
Bethesda revisados 61
Resultados 50
5.2 Localização do tumor
Dez tumores estavam localizados no cólon direito (16%) e 52 no cólon
esquerdo (84%). Um paciente apresentou tumores sincrônicos, um no cólon
direito e o outro no cólon esquerdo. Neste caso, apenas o tumor do cólon
esquerdo foi avaliado na histologia, imuno-histoquímica e MSI, por falta de
material disponível.
Tabela 2. Localização dos tumores
Localização do tumor Número/%
Cólon direito 10 (16%)
Cólon esquerdo 52 (84%)
5.3 Histopatologia
A histopatologia foi considerada positiva quando presente pelo menos
uma das características histopatológicas da Síndrome de Lynch (72%).
Tabela 3. Histopatologia positiva e negativa
Histopatologia Número/%
Histopatologia positiva 44 (72%)
Histopatologia negativa 17 (28%)
Total 61 (100%)
Resultados 51
Os linfócitos intratumor, a característica expansiva do tumor e o
componente mucinoso foram os achados histopatológicos mais encontrados na
avaliação destes tumores, como mostrado na Tabela 4.
Tabela 4. Componentes histopatológicos avaliados em 61 pacientes com história
familial e pelo menos um critério de Bethesda revisado
Componentes Histopatológicos Número
Componente mucinoso 17
Componente sinete 8
Componente medular 1
Linfócitos intratumor 29
Reação crohn-like 9
Expansivo 18
Figura 2. Carcinoma pouco diferenciado apresentando padrão medular. Padrão
expansivo de crescimento (HEX100)
Resultados 52
Figura 3. Carcinoma sólido pouco diferenciado padrão medular (HEX400)
Figura 4. Carcinoma sólido pouco diferenciado apresentando padrão medular
(HEX100)
Resultados 53
Figura 5. Folículo linfoide com exuberante centro germinativo (HEX100)
5.4 Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica estava alterada (não expressão das proteínas de
reparo) em oito casos (13%) e não alterada em 53 casos (87%).
Tabela 5. Resultado da avaliação Imuno-histoquímica em 61 pacientes com história
familial e pelo menos um critério de Bethesda revisado
Imuno-histoquímica Número/%
Alterada 8 (13%)
Não alterada 53 (87%)
Total 61 (100%)
Resultados 54
Destes, cinco casos apresentaram positividade para os dímeros
MSH2/MSH6. A positividade para os dímeros MLH1/PMS2 ocorreu em três casos.
Figura 6. MLH1 alterado na neoplasia. Diversos linfócitos reativos servem como
controle positivo (Imuno-histoquímicaX200)
Figura 7. MLH1 alterado na neoplasia. Diversos linfócitos reativos servem como
controle positivo (ImunoperoxidaseX400)
Resultados 55
I
Figura 8. PMS2 positivo. Negativo para células neoplásicas. Diversos linfócitos com
núcleos reativos servem como controle positivo (X100)
Figura 9. MSH2 positivo nos núcleos das células neoplásicas e nas células do
estroma (X200)
Resultados 56
Figura 10. MSH6 positivo nas células neoplásicas e nas células do estroma (X100)
5.5 Instabilidade de Microssatélites
A instabilidade dos microssatélites (MSI) foi testada nos 61 casos,
destes, 12 casos (20%) apresentaram testes positivos e 49 negativos (80%).
Dos 12 casos positivos, 11 foram classificados como MSI-H (dois ou mais
marcadores instáveis) e um MSI-L (um marcador instável).
Tabela 6. MSI positiva e negativa
MSI Número
MSI positiva 12 (20%)
MSI negativa 49 (80%)
Total 61
Resultados 57
5.6 Análise da mutação somática para BRAF
O sequenciamento do gene BRAF não demonstrou mutação nos 12
casos positivos para MSI. Afastou-se, portanto, a hipermetilação na região
promotora do gene MLH1.
Tabela 7. Distribuição dos resultados da IHC, MSI e BRAF nos 12 pacientes alterados
Casos BAT25 BAT26 NR21 NR24 Mono27 Penta C Penta D IHC BRAF
14 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Alterada Neg
15 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Alterada Neg
22 Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim Alterada Neg
31 Sim Não Sim Sim Sim Sim Sim Alterada Neg
33 Sim Não Sim Sim Sim Sim Não Alterada Neg
42 Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim Alterada Neg
50 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Alterada Neg
58 Sim Sim Sim Sim Sim Não Não Alterada Neg
26 Sim Sim Sim Sim Sim Não Não Não alt. Neg
32 Não Não Não Não Não Sim Não Não alt. Neg
40 Não Não Inc. Não Não Sim Sim Não alt. Neg
60 Inc. Inc. Sim Sim Inc. Inc. Sim Não alt. Neg
SIM = Marcador instável, NÃO = Marcador estável, Inconclusivo = Não foi possível definir. Classificação: MSI-L = 1 marcador instável, MSI-H = 2 ou mais marcadores instáveis (segundo classificação de Bethesda: MSI-H ≥ 30% marcadores instáveis), BRAF: POSITIVO apresenta o nucleotídeo A na posição 1799; NEGATIVO apresenta o nucleotídeo T na posição 1799.
Resultados 58
5.7 Associações entre as variáveis estudadas
5.7.1 IHC
Localização tumoral
Em 10/44 casos com critérios histopatológicos de Síndrome de Lynch os
tumores ocorreram no cólon direito. Todos os casos que não tinham estes
critérios estavam localizados no cólon esquerdo, (p=0,051).
Nos 17 casos com histopatologia negativas, em 100% dos casos as
lesões estavam localizadas no cólon esquerdo. Em apenas um paciente que
apresentou lesões sincrônicas, este mostrou uma lesão no cólon direito e outra
no cólon esquerdo. A lesão do cólon direito não foi avaliada por falta de
material disponível para análise.
Tabela 8. Histopatologia negativa e localização do tumor
Histopatologia Localização Número Valor P
Negativa 17 Cólon esquerdo 17 0,05
Cólon direito 0
Positiva 44 Cólon esquerdo 34
Cólon direito 10
Teste Exato de Fisher
Resultados 59
Três dos oito (37,5%) pacientes com imuno-histoquímica alterada tinham
localização tumoral no cólon direito e seis dos 53 (12,8%) pacientes com
imuno-histoquímica não alterada também apresentaram localização tumoral à
direita, (p=0,013).
Tabela 9. Associação entre a IHC e a localização dos tumores colorretais
IHC Cólon direito Cólon esquerdo Total Valor P
Alterada 3 5 8 0,013
Não alterada 6 47 53
Teste Exato de Fisher
Critérios Clínicos
Houve uma variação de dois (50%) até quatro (12,5%) critérios de
Bethesda revisados presentes, quando a imuno-histoquímica apresentava
resultado alterado. Em nenhum caso, foi encontrado apenas um critério de
Bethesda revisado, quando a imuno-histoquímica era alterada.
Tabela 10. Critérios de Bethesda revisados e imuno-histoquímica alterada
Critérios de Bethesda revisados Imuno-histoquímica alterada
Pelo menos um 0 (0%)
Dois 4 (50%)
Três 3 (37,5%)
Quatro 1 (12,5%)
Total 8 (13%)
Resultados 60
Dois critérios de Bethesda revisados ocorreram em três casos (60%),
três em um (20%) e quatro em um caso (20%), nos pacientes com dímeros
MSH2/MSH6 positivos. Nos pacientes com dímeros MLH1/PMS2 positivos,
dois apresentaram três critérios de Bethesda revisados (67%) e um (33%), dois
critérios de Bethesda revisados presentes.
Tabela 11. Dímeros positivos e Critérios de Bethesda revisados
Critérios de Bethesda revisados MSH2/MSH6
Pelo menos um 0 (0%)
Dois 3 (60%)
Três 1 (20%)
Quatro 1 (20%)
Total 5 (62,5%)
Critérios de Bethesda revisados MLH1/PMS2
Pelo menos um 0 (0%)
Dois 1 (33%)
Três 2 (67%)
Total 3 (37,5%)
Dentre os pacientes com somente um critério de Bethesda revisado,
nenhum teve alteração na imuno-histoquímica, enquanto os pacientes com
mais de um critério de Bethesda revisado, 22,86%, apresentavam alterações
na imuno-histoquímica (p=0,016).
Resultados 61
Histopatologia
Quando comparamos os dados histopatológicos dos pacientes com
imuno-histoquímica alterada (13%), três pacientes apresentaram quatro
critérios histopatológicos para a Síndrome de Lynch (37,5%), um com três
critérios histopatológicos para a Síndrome de Lynch (12,5%), dois com dois
critérios histopatológicos para a Síndrome de Lynch (25%), um com um critério
histopatológico para a Síndrome de Lynch (12,5%). Apenas um paciente,
apresentou histopatologia negativa (12,5%), quando a imuno-histoquímica
estava alterada. As Tabelas 12 e 13 mostram a disposição dos critérios
histopatológicos na imuno-histoquímica alterada e não alterada.
Tabela 12. Critérios histopatológicos na imuno-histoquímica alterada
Critérios Histopatológicos Imuno-histoquímica alterada
Histopatologia negativa 1 (12,5%)
Um critério histopatológico 1 (12,5%)
Dois critérios histopatológicos 2 (25%)
Três critérios histopatológicos 1 (12,5%)
Quatro critérios histopatológicos 3 (37,5%)
Total 8 (13%)
Critérios Histopatológicos MSH2/MSH6
Histopatologia negativa 1 (20%)
Um critério histopatológico 0 (0%)
Dois critérios histopatológicos 2 (40%)
Três critérios histopatológicos 1 (20%)
Quatro critérios histopatológicos 1 (20%)
Total 5 (62,5%)
Critérios Histopatológicos MLH1/PMS2
Histopatologia negativa 0 (0%)
Um critério histopatológico 1 (33%)
Dois critérios histopatológicos 0 (0%)
Três critérios histopatológicos 0 (0%)
Quatro critérios histopatológicos 2 (67%)
Total 3 (37,5%)
Resultados 62
Tabela 13. Critérios histopatológicos na imuno-histoquímica não alterada
Critérios histopatológicos Imuno-histoquímica não alterada
Histopatologia negativa 16 (30%)
Um critério histopatológico 21 (40%)
Dois critérios histopatológicos 8 (15%)
Três critérios histopatológicos 7 (13%)
Quatro critérios histopatológicos 1 (2%)
Total 53 (87%)
A concordância entre histopatologia positiva e imuno-histoquímica
alterada ocorreu em sete casos. A histopatologia foi negativa em apenas um
caso com imuno-histoquímica alterada.
A imuno-histoquímica não alterada ocorreu em 53 casos, destes, 16
(30%) tinham histopatologia negativa para a Síndrome de Lynch, 21 pacientes
(40%) apresentaram apenas um critério histopatológico para a Síndrome de
Lynch, oito apresentaram dois critérios histopatológicos para a Síndrome de
Lynch, sete (13%) apresentaram três critérios histopatológicos para a Síndrome
de Lynch e um (2%) apresentou quatro critérios histopatológicos para a
Síndrome de Lynch.
Resultados 63
Tabela 14. Distribuição dos 61 pacientes de acordo com os achados imuno-
histoquímicos e as variáveis clínico-patológicas.
Imuno-histoquímica
Não Alterada Alterada valor de p
Componente Histopatológico: Presente 37 (69,81) 7 (87,5) 0,423
Número de Componentes Histopatológico: 0 16 (30,19) 1 (12,5) 0,01
1 21 (39,62) 1 (12,5)
2 8 (15,09) 2 (25)
3 7 (13,21) 1 (12,5)
4 1 (1,89) 3 (37,5)
Componente Mucinoso 12 (22,64) 5 (62,5) 0,032
Componente Sinete 6 (11,32) 2 (25) 0,28
Componente Medular 1 (1,89) 0 (0) 1
Linfócitos Intratumor 22 (41,51) 7 (87,5) 0,022
Reação Crohn-Like 6 (11,32) 3 (37,5) 0,087
Expansivo 15 (28,3) 3 (37,5) 0,683
Localização: cólon direito 4 (8,16) 5 (41,67) 0,013
Bethesda revisado 1 24 (45,28) 5 (62,5) 0,46
Bethesda revisado 2 2 (3,77) 1 (12,5) 0,349
Bethesda revisado 3 18 (33,96) 6 (75) 0,048
Bethesda revisado 4 9 (16,98) 5 (62,5) 0,012
Bethesda revisado 5 38 (71,7) 5 (62,5) 0,683
Bethesda revisado > 1 27 (50,94) 8 (100) 0,016
Amsterdam I 4 (7,55) 5 (62,5) 0,001
Teste Exato de Fisher
5.7.2 MSI
Localização do tumor
A MSI estava presente em doze casos (20%), nos oito casos com
imuno-histoquímica alterada e MSI presente, quatro estavam localizados no
cólon direito e quatro casos no cólon esquerdo.
Resultados 64
Nos quatro casos com MSI presente e imuno-histoquímica não alterada,
todos os pacientes apresentaram idade superior aos 60 anos (63, 64, 69 e 70
anos), três com tumores localizados no cólon esquerdo e um no cólon direito.
Em apenas um caso, a MSI era MSI-L, nas três restantes a MSI era MSI-H.
Critérios Clínicos
Quando a MSI foi positiva, dois pacientes apresentaram pelo menos um
critério de Bethesda revisado, seis com dois critérios, três com três critérios e
um com quatro.
Tabela 15. MSI positivo e critérios de Bethesda revisados
Critérios de Bethesda revisados MSI Positivo
Pelo menos um critério 2 (17%)
Dois critérios 6 (50%)
Três critérios 3 (25%)
Quatro critérios 1 (8%)
Total 12 (20%)
Histopatologia
Nos 12 casos positivos para MSI, três pacientes apresentaram quatro
critérios histopatológicos presentes para a Síndrome de Lynch (25%), dois com
três critérios histopatológicos para a Síndrome de Lynch (16,7%), três com dois
critérios histopatológicos presentes para a Síndrome de Lynch (25%), dois com
um critério histopatológico presente para a Síndrome de Lynch (16,7%) e dois
Resultados 65
com histopatologia negativa (16,7%). A histopatologia foi positiva em dez
pacientes (83%), com MSI presente, e negativa em dois casos (17%).
Tabela 16. MSI positivo e histopatologia
Critérios histopatológicos MSI positivo
Histopatologia negativa 2 (16,7%)
Pelo menos um critério 2 (16,7%)
Dois critérios 3 (25%)
Três critérios 2 (16,7%)
Quatro critérios 3 (25%)
Total 12 (20%)
Tabela 17. Distribuição dos 61 pacientes de acordo com os achados de MSI
(confirmados pela análise do BRAF) e as variáveis clínico-patológicas.
MSI
Não Alterado Alterado valor de p
Componente Histopatológico: Presente 34 (69,39) 10 (83,33) 0,481
Número de Componentes Histopatológico: 0 15 (30,61) 2 (16,67) 0,034
1 20 (40,82) 2 (16,67)
2 7 (14,29) 3 (25)
3 6 (12,24) 2 (16,67)
4 1 (2,04) 3 (25)
Componente Mucinoso 12 (24,49) 5 (41,67) 0,287
Componente Sinete 6 (12,24) 2 (16,67) 0,65
Componente Medular 0 (0) 1 (8,33) 0,197
Linfócitos Intratumor 19 (38,78) 10 (83,33) 0,009
Reação Crohn-Like 6 (12,24) 3 (25) 0,361
Expansivo 13 (26,53) 5 (41,67) 0,313
Localização: cólon direito 5 (9,43) 4 (50) 0,011
Bethesda revisado 1 24 (48,98) 5 (41,67) 0,753
Bethesda revisado 2 2 (4,08) 1 (8,33) 0,488
Bethesda revisado 3 18 (36,73) 6 (50) 0,513
Bethesda revisado 4 7 (14,29) 7 (58,33) 0,003
Bethesda revisado 5 34 (69,39) 9 (75) 1
Bethesda revisado > 1 25 (51,02) 10 (83,33) 0,001
Amsterdam I 3 (6,12) 6 (50) 0,055
Teste Exato de Fisher
Resultados 66
5.8 Critérios de Amsterdam
A concordância entre histopatologia positiva e Amsterdam I presente
ocorreu em sete casos estudados. A histopatologia foi negativa em dois casos,
que apresentaram critérios de Amsterdam I positivos.
Tabela 18. Amsterdam I positivo, histopatologia positiva e negativa, imuno-histoquímica
alterada e não alterada e MSI positiva e negativa
Amsterdam I positivo
Histopatologia positiva
MSI positiva Imuno-histoquímica
alterada
9 7 5 5
14,75% TOTAL 77,77% 55,55% 55,55%
Amsterdam I positivo
Histopatologia negativa
MSI negativa Imuno-histoquímica não
alterada
9 2 4 4
14,75% TOTAL 22,22% 44,44% 44,44%
A imuno-histoquímica (IHC) estava alterada em cinco casos (55,55%) e
não alterada em quatro, nos casos com Amsterdam I presente. A instabilidade
de microssatélites (MSI) estava presente em cinco casos e ausente em quatro
casos com Amsterdam I presente. Houve associação com os resultados da IHC
e da MSI quando os critérios de Amsterdam I estavam presentes.
Resultados 67
5.9 Testes de associação, Regressão binária simples e
Regressão binária múltipla
Testes de Associação
Os testes de associação mostraram associação dos Critérios de
Amsterdam I com a instabilidade dos microssatélites e com o MLH1 e PMS2,
na imuno-histoquímica. Já com os critérios de Bethesda revisados, houve
associação com o sexo masculino, componente mucinoso, linfócitos intratumor
e reação Crohn´s like na histopatologia. Houve também, associação destes
critérios com o MLH1 e PMS2, na imuno-histoquímica e entre a instabilidade
dos microssatélites.
Resultados 68
Quadro 3. Avaliação dos critérios clínicos quanto à associação com as variáveis
clínico-patológica em 61 pacientes
Critério clínico Variável clínico-patológica Valor p
Amsterdam I Sexo 0,467
Amsterdam I Componente Mucinoso 0,699
Amsterdam I Componente Sinete 0,591
Amsterdam I Componente Medular 1
Amsterdam I Linfócitos Intratumor 0,287
Amsterdam I Reação Crohn´s-Like 0,12
Amsterdam I Expansivo 0,108
Amsterdam I MSI (presente) 0
Amsterdam I MSH2 0,154
Amsterdam I MLH1(alterado) 0,002
Amsterdam I MSH6 0,154
Amsterdam I PMS2 (alterado) 0,002
Amsterdam I Localização 0,609
Bethesda revisados Sexo (masculino) 0,007
Bethesda revisados Componente Mucinoso 0,009
Bethesda revisados Componente Sinete 0,4
Bethesda revisados Componente Medular 0,574
Bethesda revisados Linfócitos Intratumor 0,08
Bethesda revisados Reação Crohn’s-Like 0,001
Bethesda revisados Expansivo 0,771
Bethesda revisados MSI (presente) 0,051
Bethesda revisados MSH2 0,091
Bethesda revisados MLH1(alterado) 0,016
Bethesda revisados MSH6 0,091
Bethesda revisados PMS2 (alterado) 0,016
Bethesda revisados Localização 0,123
Teste Exato de Fisher
Resultados 69
REGRESSÃO BINÁRIA SIMPLES E MÚLTIPLA
Na regressão binária simples com a instabilidade de microssatélites
(MSI), se o indivíduo tiver o critério de Bethesda revisado quatro (B4), então a
chance dele apresentar MSI positiva na população estudada é de 8,4.
A regressão binária múltipla mostrou que dentre todos os critérios de Bethesda
revisado, o mais informativo sobre a MSI é o B4, com uma chance de 10,59 do
indivíduo que apresenta este critério ter MSI presente.
Tabela 19. Regressão Binária Simples (MSI)
Fatores Grupo RC IC 95% Valor de p
Sexo Masculino 2,41 0,67 8,72 0,18
Bethesda.1 Presente 0,74 0,21 2,67 0,65
Bethesda.2 Presente 2,14 0,18 25,74 0,55
Bethesda.3 Presente 1,72 0,48 6,15 0,402
Bethesda.4 Presente 8,4 2,07 34,04 0,003
Bethesda.5 Presente 1,32 0,31 5,59 0,703
Componente Mucinoso Presente 2,2 0,59 8,24 0,241
Componente Sinete Presente 1,43 0,25 8,19 0,685
Componente Medular Presente - - - 0,197
Linfócitos Intratumor Presente 7,89 1,56 40 0,013
Reação Crohn-Like Presente 2,39 0,5 11,37 0,274
Expansivo Presente 1,98 0,53 7,34 0,308
Localização Colón Direito 8,33 1,72 33,33 0,008
Amsterdam I Presente 15,33 3,01 78,01 0,001
Bethesda revisados > 1 4,8 0,95 24,24 0,057
Componente.Histopatológico Positivo 2,21 0,43 11,31 0,343
N.Componente.Histopatológico 1 0,75 0,09 5,95 0,785
N.Componente.Histopatológico > 1 4,28 0,77 23,76 0,096
Resultados 70
Tabela 20. Regressão Binária Simples (IHC)
Fatores Grupo RC IC 95% Valor de p
Sexo M 5,37 0,99 29,27 0,052
Bethesda.1 Presente 2,01 0,44 9,31 0,37
Bethesda.2 Presente 3,64 0,29 45,58 0,316
Bethesda.3 Presente 5,84 1,07 31,86 0,042
Bethesda.4 Presente 8,15 1,64 40,42 0,01
Bethesda.5 Presente 0,66 0,14 3,1 0,597
Componente Mucinoso Presente 5,69 1,18 27,36 0,03
Componente Sinete Presente 2,61 0,43 15,98 0,299
Componente Medular Presente 0 0 Inf 0,995
Linfócitos Intratumor Presente 9,87 1,13 86,04 0,038
Reação Crohn-Like Presente 4,7 0,89 24,83 0,068
Expansivo Presente 1,52 0,32 7,17 0,597
Localização Cólon Direito 10 1,81 50 0,008
Amsterdam I Presente 20,41 3,52 118,41 0,001
Bethesda revisados > 1 - - - 0,016
Componente.Histopatológico Positivo 3,03 0,34 26,67 0,318
N.Componente.Histopatológico 1 0,76 0,04 13,14 0,851
N.Componente.Histopatológico > 1 6 0,65 55,73 0,115
Tabela 21. Regressão Logística Binária Múltipla (MSI)
Variável RC IC 95% Valor de p
Bethesda.1Presente 0,68 0,05 8,65 0,764
Bethesda.2Presente 1,03 0,06 18,38 0,984
Bethesda.3Presente 4,31 0,42 44,36 0,221
Bethesda.4Presente 10,59 2,04 54,95 0,005
Bethesda.5Presente 1,67 0,26 10,72 0,588
Resultados 71
5.10 Escore
Baseado nos dados obtidos com a realização desta pesquisa (através da
regressão logística binária múltipla, segundo AIC), foi proposto um escore para
caracterizar pacientes com Síndrome de Lynch.
ESCORE PARA IHC
Figura 11. Curva ROC para IHC
Se o escore for > 49,4%
Sensibilidade (Se): foi 88% (47% até 100%)
Especificidade (Sp): foi 89% (77% até 96%)
Valor preditivo positivo (PPV): 54% (33% até 98%)
Valor preditivo negativo (NPV): 98% (86 até 99%)
Resultados 72
Quadro 4. Escore para IHC
Escore
Estimativa IC 95%
Ponto de corte 49.4 NA NA Otimismo Estimativa
Se 0,88 0,47 1 -0,057 0,823
Sp 0,89 0,77 0,96 -0,073 0,817
PPV 0,54 0,33 0,98 -0,166 0,374
NPV 0,98 0,86 0,99 -0,009 0,971
DLR.Positive 7.73 3.48 17.16
DLR.Negative 0.14 0.02 0.88
Escore = 17,69 + 14,75 Bethesda 4 Presente + 22,41 Componente mucinoso Presente + 15,25 Linfócitos
Intratumor Presente + 17,69 Localização Cólon Direito + 29,88 Amsterdam I Presente
ESCORE PARA MSI
Figura 12. Curva ROC para MSI
Resultados 73
Se o escore for > 43,63%
Sensibilidade (Se): foi 83% (52% até 98%)
Especificidade (Sp): foi 88% (75% até 95%)
Valor preditivo positivo (VPP): 62% (41% até 94%)
Valor preditivo negativo (VPN): 96% (82% até 98%)
Quadro 5. Escore para MSI
Escore
Estimativa IC 95%
Ponto de corte 43.63
Otimismo Estimativa
Se 0,83 0,52 0,98 -0,03 0,80
Sp 0,88 0,75 0,95 -0,04 0,84
PPV 0,62 0,41 0,94 -0,11 0,51
NPV 0,96 0,82 0,98 -0,01 0,95
DLR.Positive 6.81 3.09 15.01
DLR.Negative 0.19 0.05 0.68
Escore = 26,72 + 20,95 Bethesda 4 Presente + 22,68 Linfócitos Intratumor Presente + 26,72 Localização
Cólon Direito + 29,64 Amsterdam I Presente
6 DISCUSSÃO
Discussão 75
Dos 458 casos de CCR, 26% apresentaram histórico familiar, 13%
preencheram os critérios de Bethesda revisados e 2,62% apresentaram MSI
presente. A frequência de Síndrome de Lynch nos pacientes submetidos à
ressecção por câncer e com história familial foi de 20%. Estes resultados são
compatíveis aos da Literatura(54-55,99).
Os resultados deste estudo mostraram associação entre os achados
clínicos, histopatológicos, de instabilidade microssatélites e imuno-histoquímicos.
Em 13% dos pacientes, houve ausência de imunoexpressão das proteínas de
reparo do DNA, e em 20% presença de instabilidade dos microssatélites. Nos
doze casos com MSI presente, foi realizado pesquisa da mutação somática
para o BRAF, para afastar os casos com hipermetilação na região promotora
dos genes MLH1, encontrada em aproximadamente 15% dos casos de
cânceres do tipo esporádicos. Em todos os casos o resultado foi negativo,
confirmando tratar-se de Síndrome de Lynch.
6.1 Critérios de Amsterdam I e Bethesda Revisados
A Síndrome de Lynch é a forma mais comum de câncer colorretal
familial. A seleção destes pacientes para teste genético ainda é um grande
problema. Os critérios, atualmente, utilizados são falhos na detecção destes
casos, deixando sem diagnóstico até 50% dos pacientes com idade ≤ 50anos.
Discussão 76
Poucos estudos têm avaliado os critérios revisados de Bethesda(19,96-97).
Dois estudos avaliaram estes critérios em subgrupos de pacientes com alto
risco, ao invés, da população geral(19,97). Um grupo avaliou os critérios
revisados de Bethesda em série de pacientes não consecutivos com
diagnóstico de câncer colorretal(96,98). Naquele estudo, o percentual de
pacientes com mutação no gene foi de 0,9% (11/1,222) (96,98). Julié et al (100),
mostraram um percentual de positividade de 3,7% (8/214), superior ao relatado
na literatura(17,96,99,101). Noventa pacientes preencheram os critérios revisados
de Bethesda (42,1%) e vinte e um pacientes (9,8%) tiveram tumores MSI-
positivos. Os critérios revisados de Bethesda falharam em identificar dois de
oito probandos.
Neste estudo, todos os casos estudados apresentavam pelo menos um
critério revisado de Bethesda e a imuno-histoquímica foi positiva em oito casos
(13%). Dois critérios revisados de Bethesda ocorreram em três casos (60%),
três em um (20%) e quatro em um caso (20%), nos pacientes com dímeros
MSH2/MSH6 positivos. Nos pacientes com dímeros MLH1/PMS2 positivos,
dois apresentaram três critérios revisados de Bethesda (67%) e um (33%), dois
critérios revisados de Bethesda presentes, mostrando uma grande associação
nos pacientes com suspeita da Síndrome de Lynch.
Os critérios revisados de Bethesda são os mais frequentemente
utilizados, com maior indicação para testar partes do tumor com diagnóstico de
câncer colorretal antes dos 50 anos (58). Entretanto, dados recentes têm
mostrado que o uso apenas dos Critérios de Bethesda não é suficiente para
caracterizar muitos indivíduos com a Síndrome de Lynch (59).
Discussão 77
Nos casos em que os pacientes preencham os critérios de Amsterdam, o
teste de sequenciamento pode ser justificado se nem a imuno-histoquímica e
nem a instabilidade de microssatélites forem informativos(137-140).
Em nossa série, nove pacientes apresentaram os critérios de
Amsterdam I, destes, cinco apresentaram IHC alterada e MSI positiva. Em
quatro casos, a IHC era não alterada e a MSI foi negativa. Nestes casos, seria
indicado o sequenciamento para confirmação de Síndrome de Lynch.
Estudos têm mostrado que a qualidade da história familial falha no
diagnóstico de SL(137-140). Isto pode ser causado pela falta de conhecimento do
paciente sobre sua história médica familial, famílias pequenas e negligência
sobre a história familial de câncer colorretal por médicos clínicos. Com isso, a
história familial pode ser mal feita e pode influenciar os resultados do estudo,
ocorrendo uma subestimação da sensibilidade dos critérios utilizados(137-140).
Entretanto, neste estudo, procuramos ter muita cautela no momento da
entrevista com os pacientes e familiares mais próximos anotando todos os
dados da história familial dos doentes.
Um estudo recente (57) comparando a investigação dos pacientes com
câncer colorretal utilizando-se testes moleculares para o diagnóstico da
Síndrome de Lynch e os Critérios de Bethesda revisados, demonstrou que a
rotina de investigação molecular em pacientes com CCR usando imuno-
histoquímica ou MSI tem melhor sensibilidade para detectar portadores de
mutações do que os Critérios de Bethesda. Dos 486 (23,2%) pacientes que
tinham algum dos critérios de Bethesda revisados, apenas 180 pacientes
(8,6%) mostraram perda de expressão de alguma das proteínas dos genes de
Discussão 78
reparo e/ou MSI. O sequenciamento gênico revelou que 14 pacientes (0,7%)
tiveram mutação nos genes de reparo, sendo que 12 preenchiam pelo menos
um dos critérios de Bethesda revisados e dois (14,3%) não preenchiam.
Serrano et al (106) avaliaram e compararam os critérios de Bethesda com
os critérios de Bethesda revisados na detecção do MSI-H e subsequente
identificação de mutações nos genes de reparo. Dos 174 casos de câncer
colorretal com indicação para a análise da MSI de acordo com os critérios de
Bethesda e Bethesda revisados, 114 (65,5%) preencheram os critérios de
Bethesda e todos os 174 os critérios de Bethesda revisados. MSI-H foram
detectados em 37/114 (32,5%) e a análise mutacional em 14/37 (37,8%) dos
pacientes com os critérios de Bethesda e nos casos com Bethesda revisados em
49/174 (28,2%) e a presença de mutações nos genes de reparo em 16/49
(32,7%) dos pacientes. Concluíram que o critério de Bethesda apresentou similar
percentagem total para detecção da MSI-H e mutações quando comparado com
os critérios de Bethesda revisados. Os critérios de Bethesda revisados
implicaram em análises de mais pacientes, entretanto, eles contribuíram com
aumento de detecção de dois casos de síndrome de Lynch. Esta diferença tem
um impacto significante no estabelecimento de medidas preventivas e em todos
os portadores de mutações que pertencem a estas famílias.
Nesta casuística, o critério 4 de Bethesda revisado foi o mais
informativo quanto à presença de MSI. Similarmente, Serrano et al (106)
encontraram no critério 1 de Bethesda (indivíduos com câncer em famílias que
preenchem os critérios de Amsterdam) e no critério 4 de Bethesda revisado
(câncer colorretal ou tumor associado à síndrome de Lynch, diagnosticado em
Discussão 79
um ou mais parentes de primeiro grau, com um dos cânceres diagnosticados
abaixo dos 50 anos), e que foram os mais frequentemente associados com a
identificação de tumores MSI-H.
6.2 Localização do Tumor
Um aspecto típico do câncer colorretal associado à Síndrome de Lynch é a
predominância dos cânceres proximais à flexura cólica esquerda em 56-62%(103-104).
Uma análise de 1,381 tumores em famílias com a Síndrome de Lynch
revelou CCR como a malignidade mais frequente e com 78% dos portadores
com mutação em MLH1 e 65% em MSH2. Houve grande número de CCR no
cólon direito (60%) e o número de câncer retal foi 21% nos portadores de
mutação no MLH1 e 20% no MSH2(105).
Na nossa casuística, 16% dos tumores localizaram-se no cólon direito e
84% no cólon esquerdo. Dos oito casos que apresentaram perda da
imunoexpressão das proteínas de reparo, ou seja, imuno-histoquímica positiva
e MSI presente, quatro estavam localizados no cólon direito e quatro no cólon
esquerdo.
Nos quatro casos em que a MSI era positiva e a imunoexpressão presente,
ou seja, imuno-histoquímica negativa, três estavam localizados no cólon esquerdo
e um no cólon direito.
Nossos resultados também mostraram predomínio do cólon direito,
quando a expressão das proteínas de reparo era perdida.
Discussão 80
A pesquisa de mutações somáticas para o BRAF foi de grande valia para
afastar os casos de hipermetilação no promoter do gene MLH1, que ocorre em
15% dos casos de câncer colorretal do tipo esporádico. Nessa casuística, todos
os casos pesquisados com MSI presente, foram negativos para a pesquisa desta
mutação, enfatizando a possível presença da Síndrome de Lynch. Realizou-se a
pesquisa em todos os casos MSI-H, incluindo os MLH2/MSH6 para efeito
comparativo e de acurácia dos resultados.
6.3 Histopatologia
Diferentes estudos mostram que o CCR na Síndrome de Lynch difere na
localização, histologia e história natural daqueles do tipo esporádico.
Usualmente, mostram características clínico-patológicas que são sugestivas de
instabilidade de microssatélites, incluindo infiltrados linfocíticos intensos,
extensas áreas com tumores pouco diferenciados e componente mucinoso na
histopatologia(60,141-142). Neste estudo, a histopatologia foi considerada positiva
quando presente pelo menos uma ou mais das características histopatológicas
de MSI-H que ocorreu em 72% dos casos, sendo estes achados maiores que
os mostrados em estudos anteriores(61-62).
Nos últimos anos, tem sido sugerido que a histopatologia poderia ser útil
em selecionar pacientes com CCR para testes moleculares em pacientes com a
Síndrome de Lynch(63-66). A histopatologia limitaria os testes moleculares em
pacientes com aspectos histopatológicos de MSI-H, reduzindo desta forma, a
Discussão 81
sobrecarga do teste molecular em 60%, quando comparado em testar todos os
pacientes que preenchem os critérios de Bethesda revisados. O mais importante
é que a histopatologia poderia ajudar a identificar a Síndrome de Lynch entre
pacientes com início tardio e nenhuma história familiar de câncer(61).
Neste trabalho, apenas um paciente, apresentou histopatologia negativa
(12,5%), quando a imuno-histoquímica foi positiva. A imuno-histoquímica
estava inalterada em 53 casos, destes, 16 (30%) tinham histopatologia
negativa para a Síndrome de Lynch, 21 pacientes (40%) apresentaram apenas
um critério histopatológico para a Síndrome de Lynch, oito pacientes
apresentaram dois critérios histopatológicos para a Síndrome de Lynch, sete
pacientes (13%) apresentaram três critérios histopatológicos para a Síndrome
de Lynch e um paciente (2%) apresentou quatro critérios histopatológicos para
a Síndrome de Lynch, mostrando que quanto maior o número de critérios
histopatológicos em um tumor, maior a chance do paciente de apresentar o
diagnóstico de SL.
O trabalho de Jenkins et al.(60) mostrou que a histopatologia pode
identificar quase todos os casos de câncer colorretal diagnosticados antes dos
60 anos. Alguns dos aspectos no modelo MsPath, tais como a diferenciação
mucinosa, são mais específicas do MSI-H, enquanto outros, como a presença
de tumor infiltrado por linfócitos e sub sítios anatômicos, são mais sensíveis.
Este modelo provou ser instrumento de investigação da Síndrome de Lynch em
indivíduos entre 50-60 anos sem história familiar sugestiva.
Por outro lado, o estudo de Urso et. al.(18) revelou que a histopatologia
pode não ser um elemento tão importante na caracterização do fenótipo
Discussão 82
relacionado à MSI. Estes autores mostraram que sete de oito casos MSI-H
poderiam não ter sido diagnosticados, se os aspectos histopatológicos
associados à MSI fossem usados para a investigação dos pacientes com
tumores MSI e idade entre 51 a 60 anos.
6.4 Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica tem a vantagem de identificar o gene envolvido no
defeito do gene de reparo e a análise do gene pode ser o alvo para aquele gene
de reparo específico. Entretanto, a imuno-histoquímica pode identificar apenas a
perda de proteínas devido a mutações nos genes de reparo conhecidas, todavia, a
análise da MSI pode indicar outros genes de reparo potencialmente
patogênicos(17,88-90).
Nesse estudo, dos casos com imuno-histoquímica não alterada, quatro
casos com pacientes apresentando idade ≥ 50 anos, foram positivos para a
instabilidade dos microssatélites. Destes quatro casos, todos os pacientes
apresentaram idade superior aos 60 anos (63, 64, 69 e 70 anos).
Um ponto negativo deste trabalho seria o não estudo do sequenciamento
dos genes de reparo, por não estar disponível em nosso Serviço. Por outro lado,
existe controvérsias na realização e interpretação das análises desses
genes(55,91) e a existência de outros genes ainda não detectados, que não
poderíamos excluir como causas genéticas para SL.
Discussão 83
A limitação dos testes para o tumor nos pacientes com câncer colorretal
antes dos 50 anos faz com que 50% dos pacientes com a Síndrome de Lynch
não sejam diagnosticados(59,101-102).
A sensibilidade da imuno-histoquímica para as proteínas de reparo varia
de 77% a 83%. A sensibilidade relatada de MSI é de 89% para MLH1/MSH2 e
77% para MSH6(95). A especificidade do teste da MSI e IHQ diminui de 90%
para 87% para 83% para pacientes com CCR diagnosticado com 50, 60 e 70
anos de idade, respectivamente (dados não publicados)(92). Isto é resultado do
aumento na prevalência de hipermetilação somática do MLH1 que correlaciona
com mutações BRAF no DNA do tumor, e a vasta maioria dos pacientes com
mais de 70 anos não precisam de testes preditivos.
Para este estudo, a sensibilidade da IHC foi de 66,67% (variando de
38,78% até 86,22%); a especificidade foi 100% (variando de 91,1% até 100%);
o valor preditivo positivo foi 100% (variando de 62,25% até 100%) e o valor
preditivo negativo 92,45% (variando de 81,51% até 97,44%).
Se os testes de MSI/IHQ deveriam ser realizados em todos os pacientes
com CCR ou apenas baseados na história pessoal ou familiar, continua sendo
um tema em debate(93-94).
6.5 Instabilidade de Microssatélites
Em 1996, as Diretrizes de Bethesda foram desenvolvidas para ajudar a
determinar quais tumores poderiam ser testados para MSI e foram baseados
Discussão 84
em critérios clínicos, tais como, CCR diagnosticado em idade ≤ 50 anos ou
certos aspectos de história familiar de câncer.
Ferreira et al.(87) detectaram CCR com MSI-H em 33/41 famílias (80%),
sendo os restantes MSI-S. Nas famílias com suspeita de Síndrome X registrou-
se menor número de casos de CCR e uma menor frequência de tumores
extracolônicos do espectro da Síndrome de Lynch. Os tumores MSI-S
predominaram no cólon distal/reto e apresentaram numa menor porcentagem,
a produção de muco e infiltrado linfocitário peri-tumoral. Em 70% das famílias
com CCR MSI-H, identificaram-se mutações nos genes de reparo do DNA e em
nenhuma das MSI-S. A via supressora foi seguida em dois casos e uma via
alternativa em outros dois. Os restantes quatro casos não foram informativos;
contudo 5/8 (63%) apresentaram perdas alélicas no gene APC. Concluíram que
as famílias com critérios de Amsterdam estáveis apresentaram características
particulares, reforçando a existência de uma entidade diferente da SL.
Neste estudo, encontramos MSI presente em doze casos (20%). Nos
quatro casos com MSI presente e imuno-histoquímica não alterada, todos os
pacientes apresentaram idade superior aos 60 anos (63, 64, 69 e 70 anos),
enfatizando, talvez, a queda de especificidade da IHC com o aumento da
idade, conforme relatado por Kastrinos et al. (92)
Nos nove casos (15%) em que Amsterdam I estava presente, em quatro
a MSI foi negativa e a IHC não alterada.
No caso número seis: temos uma Síndrome X, pois observamos clínica
presente com IHC e MSI ausente.
Discussão 85
Seis casos (14, 15, 31, 33, 40 e 58) com Amsterdam I presente e MSI
presente, cinco também apresentaram IHC alterada. Em apenas um caso (caso
40), a MSI estava presente e a IHC não alterou. Este caso poderia reforçar a
hipótese da existência de outro gene, ainda, não descoberto e que estaria
envolvido na carcinogênese da Síndrome de Lynch.
O caso 32, foi o único que apresentou MSI-L, chamando atenção para o
fato de que a localização do tumor era no cólon esquerdo, idade da paciente >
60 anos, histopatologia negativa e IHC negativa. Neste caso, poderíamos
especular uma nova entidade para SL nos casos com MSI-L.
6.6 Perspectivas
As perspectivas para a sequência deste estudo seriam a confirmação dos
12 casos com imuno-histoquímica e instabilidade microssatélites presentes, com o
sequenciamento genético que não foi possível durante esta pesquisa.
Esperamos, em curto prazo, darmos continuidade na confirmação destes
casos suspeitos para melhores conclusões sobre as características genéticas
dos nossos pacientes.
Este estudo mostra, ainda, que os portadores de câncer colorretal com
fenótipo MSI precisam ser melhores caracterizados quanto à presença de
outros genes alvos ainda não descobertos e que possam estar envolvidos na
via molecular que determina esta Síndrome. Ou a existência de outras vias ou
subgrupos de tumores esporádicos com características clínicas, histopatológicas
e fenotípicas semelhantes aos da Síndrome de Lynch, mas que não compartilham
a mesma via na carcinogênese.
Discussão 86
Atualmente, várias abordagens estão disponíveis para identificar
indivíduos e famílias com risco para a Síndrome de Lynch, como a seleção de
indivíduos baseados no preenchimento dos critérios clínicos e testes
moleculares dos tumores para evidência de instabilidade de microssatélites
(MSI), chamada de universal, por testar todos os casos de CCR em pacientes
com idade menor ou igual a setenta anos ou abordagem alvo (baseada na
idade ou critérios de história familiar), seguidos pelo teste genético, para
aqueles considerados de risco aumentado (127).
Ainda que a estratégia universal seja custo-efetiva, ela poderá falhar em
identificar casos onde mutações nos genes de reparo interrompam a sua
função, mas não resulte em instabilidade de microssatélites, como visto nos
casos de mutações no MSH6 ou quando resultados da IHC são normais apesar
de uma proteína MMR não funcionante (127).
Modelos preditivos foram desenvolvidos para quantificar o risco de
detectar uma mutação baseado na história pessoal e familial, ajudando a decidir
quem poderia ser encaminhado para mais avaliação e/ou teste genético(133).
A quantificação de risco baseado em modelos preditivos oferece meios
adicionais para identificar indivíduos com maior risco de ser portador de
mutações, se afetado ou não afetado pelo câncer.
Se a estratificação de risco baseada nos modelos preditivos fosse
utilizada nos nossos casos com suspeita de SL, poderia apresentar acréscimos
com novos casos não encontrados com os critérios baseados na história clínica
pessoal e familiar? É uma questão hipotética para uma nova pesquisa.
Discussão 87
Através da criação deste escore que incorporou as principais variáveis
clínico-patológicas, imuno-histoquímica e de instabilidade de microssatélite,
este estudo auxilia na detecção da SL, convidando a ser validado em outros
Serviços e/ou através da ampliação da casuística deste estudo e que somado
ao sequenciamento, será de grande valia no diagnóstico e seguimento destes
pacientes e seus familiares. Este escore também mostrou ser um bom preditor
para identificar os casos negativos da Síndrome.
Ademais, testes genéticos mais baratos e com acurácia elevada e de
fácil execução serão incorporados na prática diária, em curto tempo. A
identificação de novos genes alterados ou outras alterações epigenéticas
promoverão melhor entendimento da evolução clínica dos nossos pacientes e
uma orientação terapêutica adequada.
7 CONCLUSÕES
Conclusões 89
Dentre as condições de realização desta pesquisa, pode-se concluir que:
1. A frequência de Síndrome de Lynch nos pacientes submetidos à
ressecção por câncer e com história familial foi de 20%, concordante
com a literatura.
2. O critério 4 de Bethesda Modificado (câncer colorretal ou tumor
associado à Síndrome de Lynch, diagnosticado em um ou mais
parentes de primeiro grau, com um dos cânceres diagnosticados
abaixo dos 50 anos) associou-se mais fortemente à presença de
instabilidade de microssatélites na população estudada.
3. O escore desenvolvido neste estudo contribui como uma ferramenta
prática na ampliação diagnóstica da SL.
8 ANEXOS
Anexos 91
Anexo I – Critérios de Amsterdam
HISTÓRICO FAMILIAR
Amsterdam I
1. três parentes com câncer de cólon, sendo dois deles parentes de primeiro grau do terceiro.
2. duas gerações acometidas por câncer de cólon.
3. um paciente com câncer de cólon com diagnóstico antes dos 50 anos.
4. exclusão de polipose adenomatosa familiar.
Amsterdam II
1. três parentes com um câncer associado ao HNPCC (cólon, útero, célula transicional, ovário, intestino delgado).
2. dois são parentes de primeiro grau do terceiro.
3. duas gerações acometidas por câncer de cólon.
4. um paciente com câncer de cólon com diagnóstico antes dos 50 anos.
5. exclusão de polipose adenomatosa familiar.
Anexos 92
Anexo II – Critérios de Bethesda (revisados) para indicação de pesquisa
de instabilidade de microssatélites
1. CCR diagnosticado antes dos 50 anos.
2. CCR múltiplo ou câncer associado ao HNPCC*.
3. CCR com histologia MSI-H diagnosticado em indivíduo com menos de 60 anos de idade.
4. CCR ou câncer associado ao HNPCC diagnosticado em um ou mais parentes de primeiro grau, desde que uma das neoplasias tenha ocorrido antes dos 50 anos de idade.
5. CCR ou câncer associado ao HNPCC diagnosticado em dois ou mais parentes de primeiro ou segundo grau, em qualquer idade.
*Tumores associados ao HNPCC incluem: além do CCR, carcinoma de endométrio,
ovário, estômago, intestino delgado, pelve renal, ureter, trato biliar, pâncreas, ou
cérebro (principalmente o glioblastoma multiforme).
Anexo III Critérios Histológicos na Síndrome de Lynch
1. Tumor infiltrado por linfócitos
2. Reação linfocítica semelhente à Doença de Crohn
3. Diferenciação mucinosa ou anel de sinete
4. Modelo de crescimento sólido, indiferenciado ou medular.
Anexos 93
Anexo IV – Ficha padronizada para interrogatório pessoal dos pacientes
DADOS PESSOAIS
Número do paciente
Data
Registro
Nome
Hospital
Idade
Sexo
Raça
Local de nascimento
Endereço
Telefone
Médico
HISTÓRICO FAMILIAR
Amsterdam I:
1. três parentes com câncer de cólon, sendo dois deles parentes de
primeiro grau do terceiro;
2. duas gerações acometidas por câncer de cólon;
3. um paciente com câncer de cólon com diagnóstico antes dos 50 anos;
4. excluindo-se poliposes.
Amsterdam II:
1. três parentes com um câncer associado ao HNPCC (cólon, útero,
célula transicional, ovário, intestino delgado);
2. dois são parentes de primeiro grau do terceiro;
3. duas gerações acometidas por câncer de cólon;
4. um paciente com câncer de cólon com diagnóstico antes dos 50 anos;
5. excluindo-se poliposes.
Bethesda revisados:
1. CCR diagnosticado antes dos 50 anos;
2. CCR múltiplo ou câncer associado ao HNPCC (Ca de endométrio,
intestino delgado, pelve urinária, trato biliar, estômago, ovário,
pâncreas, ou cérebro (principalmente o glioblastoma multiforme);
3. CCR com histologia MSI associada com diagnóstico antes dos 60 anos;
4. CCR ou câncer associado ao HNPCC diagnosticado em até um
parente de primeiro grau antes dos 50 anos;
5. CCR ou câncer associado ao HNPCC diagnosticado em até dois
parentes de primeiro ou segundo grau em qualquer idade.
Anexos 94
PRODUTO DE COLECTOMIA
Câncer – número
Tamanho
Localização (cólon direto ou cólon esquerdo)
Característica (ulcerado, vegetante, estenosante, úlcero-vegetante)
ANÁTOMO PATOLÓGICO
Grau de diferenciação: bem, moderadamente e pobremente diferenciados
Componente mucinoso: presente ou ausente
Componente sinete: presente ou ausente
Componente medular: presente ou ausente
Reação crohn-like: presente ou ausente
Linfócitos intratumor: presente ou ausente
Expansivo: sim ou não
Estadio TNM
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Alterada
Não alterada
INSTABILIDADE MICROSSATÉLITE
MSI-H
MSI-L
MSI-S
Anexos 95
ANEXO V- Casos com imuno-histoquímica positiva e negativa DÍMEROS Bethesda revisados Histopatologia MSI
Imuno-histoquímica alterada
MLH1/PMS2 B1, B4, B3 CM, LIT, RCL, EXP Positiva MLH1/PMS2 B4, B5 LIT Positiva MLH1/PMS2 B1, B5, B3 CM, LIT, RCL, EXP Positiva MSH2/MSH6 B1, B4, B5, B3 LIT, EXP Positiva MSH2/MSH6 B2, B4, B5 CM, CS, LIT, RCL Positiva MSH2/MSH6 B4, B5 Negativa Positiva MSH2/MSH6 B1, B3 CM, CS, LIT Positiva MSH2/MSH6 B1, B3 CM, LIT Positiva
Imuno-histoquímica não alterada Bethesda revisados Histopatologia MSI
1 B5 Negativa Negativa 2 B1, B3 CS, LIT Negativa 3 B5 EXP Negativa 4 B5 LIT Negativa 5 B5 CS, LIT Negativa 6 B5, B3 LIT, RCL, EXP Negativa 7 B1, B5, B3 LIT Negativa 8 B5 LIT, EXP Negativa 9 B5 Negativa Negativa 10 B5 LIT, RCL, EXP Negativa 11 B5 LIT Negativa 12 B1, B5, B3 CM, LIT, RCL Negativa 13 B1 Negativa Negativa 14 B1, B5, B3 CM Negativa 15 B1, B5, B3 CM, CS, LIT, RCL Negativa 16 B1 Negativa Negativa 17 B5 CM, EXP Negativa 18 B1 Negativa Negativa 19 B1, B3 CM, CS, LIT Negativa 20 B5 EXP Negativa 21 B1 Negativa Negativa 22 B2, B5 Negativa Negativa 23 B4, B5 CMED, LIT, EXP Positiva 24 B1, B3 EXP Negativa 25 B5 LIT Negativa 26 B4, B5 Negativa Negativa 27 B5 CM Negativa 28 B5 Negativa Positiva 29 B5 CM, CS Negativa 30 B4, B5 Negativa Negativa 31 B1, B3 CM, CS, LIT Negativa 32 B5, B3 LIT Negativa 33 B5 Negativa Negativa 34 B4 EXP Negativa 35 B4, B5 LIT, EXP Positiva 36 B1, B4, B3 LIT Negativa 37 B1, B5, B3 CM Negativa 38 B1, B5, B3 LIT Negativa 39 B1, B5 Negativa Negativa 40 B1, B5, B3 RCL Negativa 41 B1, B5 Negativa Negativa 42 B1, B5, B3 EXP Negativa 43 B1, B5, B3 CM, RCL, EXP Negativa 44 B4, B5 CM, LIT Negativa 45 B5 LIT Negativa 46 B1, B3 LIT Negativa 47 B1, B3 EXP Negativa 48 B2, B4, B5 CM, EXP Negativa 49 B1 Negativa Negativa 50 B1 Negativa Negativa 51 B4 Negativa Negativa 52 B5 LIT Positiva 53 B5 EXP Negativa
LIT- linfócitos intratumor, EXP- expansivo, CM- componente mucinoso, CS- componente sinete, CMED- componente medular, RCL- reação Crohn-Like. Imuno-histoquímica considerada Positiva- quando não houve imunoexpressão das proteínas de reparo e Negativa- quando houver imunoexpressão das proteínas de reparo.
Anexos 96
ANEXO VI - Casos com MSI positiva
Casos BAT25 BAT26 NR21 NR24 Mono27 Penta C Penta D MSI
14 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não MSI-H
15 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim MSI-H
22 Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim MSI-H
31 Sim Não Sim Sim Sim Sim Sim MSI-H
33 Sim Não Sim Sim Sim Sim Não MSI-H
42 Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim MSI-H
50 Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não MSI-H
58 Sim Sim Sim Sim Sim Não Não MSI-H
26 Sim Sim Sim Sim Sim Não Não MSI-H
32 Não Não Não Não Não Sim Não MSI-L
40 Não Não Inc. Não Não Sim Sim MSI-H
60 Inc. Inc. Sim Sim Inc. Inc. Sim MSI-H
SIM = Marcador instável, NÃO = Marcador estável, Inc.=Inconclusivo = Não foi possível definir.
Classificação: MSI-L = 1 marcador instável, MSI-H = 2 ou mais marcadores instáveis (segundo
classificação de Bethesda: MSI-H ≥ 30% marcadores instáveis).
ANEXO VII
Casos com Amsterdam I presentes
Casos HISTOPATOLOGIA MSI DÍMEROS
6 Positiva Negativo Negativo
14 Positiva Positivo MSH2/MSH6
15 Positiva Positivo MLH1/PMS2
16 Positiva Negativo Negativo
31 Negativa Positivo MSH2/MSH6
33 Positiva Positivo MLH1/PMS2
35 Negativa Negativo Negativo
40 Positiva Positivo Negativo
58 Positiva Positivo MLH1/PMS2
Anexos 97
ANEXO VIII
Tabela – Localização dos tumores no cólon
Casos Sexo Idade Localização
1 M 56 Cólon esquerdo
2 F 28 Cólon esquerdo
3 F 70 Cólon esquerdo
4 F 65 Cólon esquerdo
5 F 60 Cólon esquerdo
6 M 50 Cólon esquerdo
7 M 46 Cólon esquerdo
8 M 80 Cólon direito
9 F 77 Cólon esquerdo
10 F 65 Cólon esquerdo
11 F 76 Cólon esquerdo
12 M 28 Cólon esquerdo
13 F 35 Cólon esquerdo
14 M 44 Cólon direito
15 M 34 Cólon direito
16 M 48 Cólon esquerdo
17 M 36 Cólon direito
18 F 49 Cólon esquerdo
19 M 63 Cólon esquerdo
20 F 45 Cólon esquerdo
21 F 31 Cólon esquerdo
22 M 63 Cólon direito
23 F 70 Cólon esquerdo
24 M 49 Cólon esquerdo
25 F 85 Cólon esquerdo
26 F 64 Cólon esquerdo
27 F 26 Cólon esquerdo
28 M 70 Cólon esquerdo
29 M 73 Cólon direito/cólon esquerdo
30 F 87 Cólon esquerdo
31 F 61 Cólon esquerdo
Continua...
Anexos 98
Conclusão da Tabela - Localização dos tumores no cólon
Casos Sexo Idade Localização
32 F 69 Cólon esquerdo
33 M 53 Cólon esquerdo
34 F 71 Cólon esquerdo
35 F 22 Cólon esquerdo
36 F 45 Cólon esquerdo
37 F 54 Cólon esquerdo
38 F 55 Cólon esquerdo
39 F 60 Cólon esquerdo
40 F 70 Cólon esquerdo
41 M 43 Cólon esquerdo
42 M 27 Cólon esquerdo
43 M 38 Cólon esquerdo
44 M 44 Cólon esquerdo
45 F 30 Cólon esquerdo
46 F 48 Cólon esquerdo
47 M 47 Cólon esquerdo
48 F 48 Cólon esquerdo
49 M 47 Cólon direito
50 M 46 Cólon direito
51 F 61 Cólon esquerdo
52 F 75 Cólon esquerdo
53 F 44 Cólon esquerdo
54 F 45 Cólon esquerdo
55 F 67 Cólon esquerdo
56 F 25 Cólon esquerdo
57 F 40 Cólon esquerdo
58 F 37 Cólon esquerdo
59 M 57 Cólon esquerdo
60 M 63 Cólon direito
61 M 79 Cólon direito
Anexos 99
ANEXO IX
Tabela- Imuno-histoquímica
Casos Sexo Idade MSH2 MLH1 MSH6 PMS2
1 M
56
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
2 F
28
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
3 F
70
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
4 F
65
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
5 F
60
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
6 M
50
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
7 M
46
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
8 M
80
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
9 F
77
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
10 F
65
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
11 F
76
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
12 M
28
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
13 F
35
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
14 M 44 Alterada Não alterada Alterada Não alterada
15 M 34 Não alterada Alterada Não alterada Alterada
16 M 48 Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
17 M
36
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
18 F
49
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
19 M
63
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
20 F
45
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
21 F
31
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
22 M 63 Alterada Não alterada Alterada Não alterada
23 F
70
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
24 M
49
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
25 F
85
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
26 F
64
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
27 F
26
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
28 M
70
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
29 M
73
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
30 F
87
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
31 F 61 Alterada Não alterada Positivo Negativo
Continua...
Anexos 100
Conclusão da Tabela – Imuno-histoquímica
Casos Sexo Idade MSH2 MLH1 MSH6 PMS2
32 F
69
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
33 M 53 Nâo alterada Alterada Não alterada Alterada
34 F
71
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
35 F
22
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
36 F
45
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
37 F
54
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
38 F
55
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
39 F
60
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
40 F
70
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
41 M
43
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
42 M 27 Alterada Não alterada Alterada Não alterada
43 M
38
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
44 M
44
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
45 F
30
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
46 F
48
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
47 M
47
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
48 F
48
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
49 M
47
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
50 M 46 Alterada Não alterada Alterada Não alterada
51 F
61
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
52 F
75
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
53 F
44
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
54 F
45
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
55 F
67
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
56 F
25
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
57 F
40
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
58 F 37 Não alterada Alterada Não alterada Alterada
59 M
57
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
60 M
63
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
61 M
79
Não alterada Não alterada Não alterada Não alterada
Anexos 101
ANEXO X
Tabela- Aspectos Histopatológicos
Casos Sexo Idade Componente
mucinoso Componente
sinete Componente
medular Linfocitos Intratumor
Reação Crohn-like Expansivo
1 M 56 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
2 F 28 Ausente Presente Ausente Presente Ausente Ausente
3 F 70 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
4 F 65 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
5 F 60 Ausente Presente Ausente Presente Ausente Ausente
6 M 50 Ausente Ausente Ausente Presente Presente Presente
7 M 46 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
8 M 80 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente
9 F 77 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
10 F 65 Ausente Ausente Ausente Presente Presente Presente
11 F 76 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
12 M 28 Presente Ausente Ausente Presente Presente Ausente
13 F 35 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
14 M 44 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente
15 M 34 Presente Ausente Ausente Presente Presente Presente
16 M 48 Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
17 M 36 Presente Presente Ausente Presente Presente Ausente
18 F 49 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
19 M 63 Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
20 F 45 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
21 F 31 Presente Presente Ausente Presente Ausente Ausente
22 M 63 Presente Presente Ausente Presente Presente Ausente
23 F 70 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
24 M 49 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
25 F 85 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
26 F 64 Ausente Ausente Presente Presente Ausente Presente
27 F 26 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
28 M 70 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
29 M 73 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
30 F 87 Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
31 F 61 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
Continua...
Anexos 102
Conclusão da Tabela – Aspectos Hispatológicos
Casos Sexo Idade Componente
mucinoso Componente
sinete Componente
medular Linfocitos Intratumor
Reação Crohn-like Expansivo
32 F 69 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
33 M 53 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
34 F 71 Presente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
35 F 22 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
36 F 45 Presente Presente Ausente Presente Ausente Ausente
37 F 54 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
38 F 55 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
39 F 60 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
40 F 70 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente
41 M 43 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
42 M 27 Presente Presente Ausente Presente Ausente Ausente
43 M 38 Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
44 M 44 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
45 F 30 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
46 F 48 Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente
47 M 47 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
48 F 48 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
49 M 47 Presente Ausente Ausente Ausente Presente Presente
50 M 46 Presente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
51 F 61 Presente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
52 F 75 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
53 F 44 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
54 F 45 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
55 F 67 Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
56 F 25 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
57 F 40 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
58 F 37 Presente Ausente Ausente Presente Presente Presente
59 M 57 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
60 M 63 Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente
61 M 79 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
Anexos 103
ANEXO XI
Tabela- Critérios de Amsterdam I e Bethesda revisados
Amsterdam I Bethesda revisados
Casos Sexo Idade
1 2 3 4 5
1 M 56 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
2 F 28 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
3 F 70 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
4 F 65 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
5 F 60 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
6 M 50 Presente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
7 M 46 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
8 M 80 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
9 F 77 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
10 F 65 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
11 F 76 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
12 M 28 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
13 F 35 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
14 M 44 Presente
Presente Ausente Ausente Presente Presente
15 M 34 Presente Presente Ausente Ausente Presente Ausente
16 M 48 Presente Presente Ausente Ausente Ausente Presente
17 M 36 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Presente
18 F 49 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
19 M 63 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
20 F 45 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
21 F 31 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
22 M 63 Ausente Ausente Presente Ausente Presente Presente
23 F 70 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
24 M 49 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
25 F 85 Ausente Ausente Presente Ausente Ausente Presente
26 F 64 Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Presente
27 F 26 Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
28 M 70 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
29 M 73 Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Presente
30 F 87 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
31 F 61 Presente Ausente Ausente Ausente Presente Presente
Continua...
Anexos 104
Conclusão da Tabela- Critérios de Amsterdam I e Bethesda revisados
Amsterdam I Bethesda revisados
Casos Sexo Idade
1 2 3 4 5
32 F 69 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
33 M 53 Presente
Ausente Ausente Ausente Presente Presente
34 F 71 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
35 F 22 Presente
Ausente Ausente Ausente Presente Presente
36 F 45 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
37 F 54 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
38 F 55 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
39 F 60 Ausente
Ausente Ausente Ausente Presente Ausente
40 F 70 Presente
Ausente Ausente Ausente Presente Presente
41 M 43 Ausente
Presente Ausente Ausente Presente Ausente
42 M 27 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
43 M 38 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
44 M 44 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
45 F 30 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
46 F 48 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
47 M 47 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
48 F 48 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
49 M 47 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
50 M 46 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
51 F 61 Ausente
Ausente Ausente Ausente Presente Presente
52 F 75 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
53 F 44 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
54 F 45 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
55 F 67 Ausente
Ausente Presente Ausente Presente Presente
56 F 25 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
57 F 40 Ausente
Presente Ausente Ausente Ausente Ausente
58 F 37 Presente
Presente Ausente Ausente Ausente Presente
59 M 57 Ausente
Ausente Ausente Ausente Presente Ausente
M 63 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
61 M 79 Ausente
Ausente Ausente Ausente Ausente Presente
9 REFERÊNCIAS
Referências 106
1. American Cancer Society. Cancer prevention and early detection: facts and
figures 2001. Atlanta, Ga; 2001.
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Bapat B, Aronson M, Hopper J, Jass J, LeMarchand L, Grove J, Potter J,
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Edmonston TB, Boland CR, Sutter C, Jass JR, Lindblom A, Lubinski J,
MacDermot K, Sanders DS, Morreau H, Müller A, Oliani C, Orntoft T, Ponz
De Leon M, Rosty C, Rodriguez-Bigas M, Rüschoff J, Ruszkiewicz A,
Sabourin J, Salovaara R, Möslein G; ICG-HNPCC (International
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