introduccion a la biologia molecular

Curso Introductorio de Biología Molecular

Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacteriófago lambda

para el aislamiento de clonos de genes

Patricia E. Vélez, Esperanza Rodríguez &

Pedro A. Moreno

P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno

Curso Introductorio de Biología Molecular

Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacteriófago lambda

para el aislamiento de clonos de genes

Patricia E. Vélez, Esperanza Rodríguez &

Pedro A. Moreno

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Curso Introductorio de Biología Molecular Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacteriófago lambda.

Primera edición

Carátula: Bacterias de E. coli y bacteriófago lambda

Biblioteca del Congreso de la República de Colombia

Incluye referencias bibliográficas e índice.ISBN 958-33-5178-0

Todos los derechos reservados.

Patricia E. Vélez es Licenciada en Biología de la Universidad del Cauca y Maestría en Genética Humana de la Universidad Nacional de Colombia. Profesora del Departamento de Biología de la Universidad del Cauca, Popayán, Colombia. [email protected]

Pedro A. Moreno es Biólogo de la Universidad Nacional de Colombia y Doctorante en Biología Celular y Molecular del Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Houston, Houston, TX. EE.UU. [email protected]

Ninguna parte de este libro puede ser reproducida por ningún proceso, mecánico, fotográfico o electrónico o en la forma de registro fonográfico ni puede ser almacenado en un sistema de recuperación, transmitido o de otra parte copiado para uso público o privado, sin el permiso del editor.

Editorial Universidad del Cauca

Distribuido por los Autores

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mailto:[email protected]


A nuestras hijas Ángela Patricia y Daniela Valentina, Por su apoyo paciente en estos tiempos difíciles de manejar.

P.E.V.V. & P.A.M.T.

A mi adorada FamiliaE. R.

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Prólogo

En los últimos 50 años la biología molecular ha revolucionado la investigación y la enseñanza de la biología. Muy pocos biólogos podrían estar exentos del entendimiento de la biología molecular como herramienta para estudiar y entender la célula viva y los organismos. Esto ha sido posible gracias a la tecnología del ADN-Recombinante. En efecto, este pequeño libro se ha escrito con el propósito de divulgar aspectos teóricos básicos y experimentales referentes a la manipulación de genes in vitro.

La construcción de bibliotecas de ADN-Recombinante o genotecas es un método práctico y general desarrollado por Paul Berg y Herbert Boyer en 1975, con el objeto de clonar fragmentos de ADN-Recombinante. Desde la reglamentación de este tipo de experimentos y el desarrollo de los primeros hospederos y vectores “seguros” esta estrategia ha permitido incrementar de manera exponencial el número de las secuencias de ADN en las bases de datos. De ahí que a partir de 1977 al presente, se han almacenado más de cuatro mil millones de pares de bases de diferentes especies biológicas para consulta de “toda” la comunidad científica.

Como resultado, la construcción de genotecas de las especies más “representativas” de los Filum que pueblan la Biosfera ha permitido dentro del marco de proyectos oficiales (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y privados (http://www.tigr.inc), (http://www.celeragenomics.inc) de secuenciación de genomas el secuenciamiento de más de 130 genomas bacterianos (0.5 - 7.0 Mpb) con más de 200 bacterias en progreso. Del mismo modo, se ha realizado el secuenciamiento de los primeros genomas eucarióticos, tales como el primer organismo unicelular Saccharomyces cereviciae (17 Mpb), el primer organismo multicelular, el nematodo Caenorhabditis elegans (99 Mpb), el primer insecto, la Drosophila melanogaster (137 Mpb) y para sorpresa de la comunidad científica, antes de lo previsto, la secuencia completa del genoma humano (≈3000 Mpb) y a la cual se han añadido recientemente, la de la rata, el ratón, el perro y próximamente la de la vaca, el pollo y el chimpancé.

Estos hallazgos demuestran que las técnicas de ADN-Recombinante acopladas a secuenciación y computación han producido una explosión de conocimiento de los procesos fundamentales de la vida orgánica sin precedentes, generado empresas biotecnológicas y toda una revolución científica y tecnológica en la biología y la sociedad. Adicionalmente, el descubrimiento de secuencias de ADN esta influyendo la manera de practicar la medicina, las ciencias forenses, la antropología, el medio ambiente, la agronomía, la industria alimentaria y el análisis computacional, entre otros campos.

A nivel doméstico, Colombia se ha caracterizado por ser unos de los países con mayor biodiversidad del planeta. La cantidad del recurso genético y de microorganismos envueltos en esta red ecológica es astronómica, con un potencial inmenso por explorar. Desafortunadamente, los países en vías de desarrollo han permanecido ajenos a este tipo de tecnologías por causa de costos, especialidad y desinterés político y científico, subestimando así el empleo y desarrollo que estas tecnologías moleculares podrían generar. Por otra parte, este tipo de información se encuentra reducida a textos especializados, tesis de grado, postgrado y manuales de poca difusión y consulta.

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Con todas estas razones, los autores hemos considerado hacer un modesto aporte para motivar a profesionales y estudiantes universitarios interesados, difundiendo a nivel introductorio un texto básico de clonaje molecular. Los protocolos detallados aquí han sido probados satisfactoriamente en trabajos rutinarios de investigación, trabajos de grado y postgrado y en cursos prácticos de biología molecular. Adicionalmente, el presente texto puede ser empleado como referencia o complemento para la docencia y/o la investigación de quienes deseen abordar la construcción de genotecas de microorganismos en vectores de clonaje tipo lambda.

El texto ha sido el producto de los resultados y experiencias de los autores a lo largo del ejercicio profesional y como recopilación del material de una obra más extensa (Moreno, Vélez y Burgos, 2003). En especial, y al parecer, como resultado de la “primera tesis de grado que se hizo en biología molecular en la Universidad Nacional de Colombia y creemos que en el país (Rodríguez y Moreno, 1987), por lo cual, a pesar del tiempo, se constituye en un documento histórico de la ciencia en Colombiana que no ha perdido su vigencia, pues muchos de estos principios y protocolos se siguen usando actualmente. Finalmente, tenemos la esperanza que este esfuerzo de difusión contribuya de manera importante en el beneficio de los futuros estudiosos, constructores y administradores de los recursos biológicos.

Agradecimientos

Queremos expresar nuestros agradecimientos a la lingüista Franci Hellen Vélez y al Ingeniero Germán Llanos por las generosas correcciones y recomendaciones sugeridas. A Carlos Andrés Prado y Diana Milena Muñoz y Adriana Arteaga por su colaboración en la ekaboraciòn de algunos graficos en este texto . Finalmente, queremos brindar un homenaje póstumo al Dr. Oscar Orozco (del Instituto de Cancerología, sección de Inmunología, Bogotá, D. C.) quien nos sugirió hace algún tiempo la publicación de este documento como manual y testimonio.

Igualmente agradecemos a las personas representadas en jefes, profesores, colegas, alumnos y/o pacientes quienes en su momento tuvieron que ver con el ejercicio de la docencia e investigación de los autores. Por esto damos también crédito al Instituto del Seguro Social de Bogotá, D. C.; al Departamento de Biología y a la Unidad de Genética Humana de la Universidad Nacional; al Instituto de Inmunología del Hospital San Juan de Dios; al Departamento de Biología de la Universidad Javeriana; al CIDEIM, Cali; a CORPOGEN; al Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Houston, Texas, USA y a COLCIENCIAS. Sin ellos y estas instituciones, nuestra experiencia no hubiera sido posible.

Finalmente, la presente obra ha sido preparada como complemento de un curso intensivo de biología molecular celebrado en la Universidad del Cauca, por lo que también agradecemos a las directivas, profesores y estudiantes de ésta institución por su generoso apoyo y entusiasmo mostrado durante el curso. Igualmente, al departamento de edición e impresión que hizo posible esta obra.

A todos, nuestros agradecimientos,

Patricia E. VélezEsperanza Rodriguez

Pedro A. Moreno Mayo, 2002

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Acerca de la Obra y Normas de Bioseguridad

La obra esta dividida en 6 capítulos. En el primero se da una introducción acerca de que es la biología molecular y algunos conceptos básicos de ADN-Recombinante, tales como la construcción de genotecas, los vectores lambda de amplio uso y los métodos de rastreos de clonos recombinantes dentro de las genotecas, con el objeto de familiarizar al lego con el ABC de esta disciplina. Los capítulos subsiguientes son cortos y de utilidad práctica. En el capítulo dos, dos genotecas de ADN genómico (gADN), una bacteriana y otra de eucariote inferior son introducidas a fin de ilustrar las diversas metodologías empleadas en la construcción de genotecas y en la identificación de secuencias de interés mediante el uso de vectores lambda en Escherichia coli. El tercer capítulo trata sobre la síntesis de oligonucleótidos. Si bien estos ya son comercializados por diversas compañías nacionales y extranjeras es importante conocer los fundamentos de su síntesis para su diseño y usos. El capítulo cuatro tiene que ver con la determinación de la calidad de la genoteca. El capítulo cinco ilustra la búsqueda de clonos de genes o rastreo (screening) mediante hibridización con sondas de ADN o mediante inmunoreactividad con sondas de anticuerpos. El capítulo seis muestra la expresión y purificación de las proteínas recombinantes clonadas, usando las ventajas de los plásmidos de expresión pBS y pMal. Finalmente, el anexo trae información relevante para el manejo apropiado de conceptos y protocolos. Dado que la biología molecular usa terminología anglosajona, nosotros vemos la necesidad de usar indistintamente la palabra en español o en inglés y las cuales ofrecemos también en el glosario y en el índice. Las Figuras y Diagramas son originales producto de los resultados obtenidos por los autores. La bibliografía es clásica (y al mismo tiempo actualizada en algunos puntos) la cual esperamos sirva de referencia para los lectores.

Por otra parte, debido a que muchos agentes que se manejan en un laboratorio de biología molecular son tóxicos, venenosos, carcinógenos e infecciosos, algunas recomendaciones especiales de bioseguridad deben ser hechas, tales como: 1) uso de los elementos de protección básica, como son la bata, los guantes, chalecos de plomo, pantallas de protección, campanas de extracción, cámaras de aire de flujo laminar, uso de gafas de protección y tapa bocas según los casos. 2) Aminorar el tiempo de exposición y manipulación de agentes químicos y físicos peligrosos (luz U.V., reactivos volátiles, cáusticos, radioisótopos, etc). 3) Abstenerse de consumir alimentos o bebidas en las áreas de laboratorios. 4) Disminuir los riesgos de contaminación cuando se manipulen agentes infecciosos. 5) Ubicar las fuentes de agua limpia, duchas, fregaderos, extinguidores de fuego, etc. 6) Leer las etiquetas y el manejo de reactivos nocivos y conocer el manejo de equipos. 7) Utilizar los contenedores de sustancias radiactivas, corrosivas, flamables y abstenerse de fumar. 8) Acatar las órdenes del personal con experiencia del laboratorio. Si no se sabe, preguntar es la solución! 9) Una exposición previa del proyecto o experimentos frente a un Comité o Consejo de Bioética debe ser efectuado para discutir los alcances y consecuencias de la manipulación de genes y genomas propuestos. Y 10) seguir las normas de bioseguridad internacional para laboratorios y manipulación genética (Asilomar Conference, guidelines for recombinant ADN research).

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ContenidoPrólogo 5Contenido del libro y normas de bioseguridad 7

Capítulo 1. Qué es la biología molecular? 11Hitos en la historia de la biología molecular 13Introducción al ADN-Recombinante 161.1. Construcción de una biblioteca de ADN-Recombinante 161.1.1. ADN blanco de interés para clonar 171.1.2. Vector de clonaje 171.1.3. Endonucleasa de restricción 181.1.4. ADN ligasa 191.1.5. Hospedero 201.2. Sistemas de rastreo e identificación de clonos de ADN-Recombinante

dentro de una genoteca 201.2.1. Síntesis química de oligonucleótidos o sondas 211.2.1.1. Soporte sólido 221.2.1.2. Nucleótidos protegidos 231.2.1.3. Hibridización de dos hebras de ácido nucleicos complementarias 241.2.1.4. Factores que afectan la hibridización en los filtros de nitrocelulosa 241.2.2. Rastreo de genes con oligonucleótidos sintéticos 261.2.3. Principios inmunológicos 261.2.4. Rastreo de genes con antisueros policlonales 271.3. Vectores 271.3.1. El bacteriófago lambda 281.3.2. Cascada lítica del fago lambda interconectada con el circuito para

Lisogenia 291.3.3. Sistema genético de λgt-10.......................................................................... 301.3.4. Sistema genético de λgt-11.......................................................................... 311.3.5 Caracteristicas generales del sistema........................................................... 311.3.6. Sistema genetico de λZAP II....................................................................... 331.3.7 Búsqueda de genes con anticuerpos............................................................. 331.3.8. Factores que afectan la estabilidad de las proteínas recombinantes............. 341.3.9. Sistema genético lactosa............................................................................... 341.3.10. Identificación de clonos recombinantes....................................................... 371.3.11. Sistema genético del plásmido Bluescript (pBS).......................................... 391.3.12. Sistema genético del plásmido pMal............................................................ 391.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).................................................. 39

Capítulo 2. Construcción de bibliotecas de ADN-Recombinante.................. 422.1. Preparación del ADN genómico................................................................. 432.2. Restricción, ligazón y empaquetamiento............................................... 462.3. Cultivo e infección del hospedero y plateo de la genoteca................... 472.4. Amplificación y titulación y almacenamiento de la biblioteca genómica... 49

Capítulo 3. Síntesis de sondas de oligonucleótidos................................................ 513.1. Evaluación de la eficiencia de acople......................................................... 533.2. Tratamiento post-síntesis.............................................................................. 543.3. Desanclaje y desprotección........................................................................... 543.4. Aislamiento de la sonda mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.. 553.5. Purificación por cromatografía de fase reserva............................................. 573.6. Radiomarcaje enzimático, mediación de la radiactividad y determinación de la actividad específica....................................................................................... 58

Capítulo 4. Calidad de la biblioteca e identificación del fragmento de

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ADN-Recombinante................................................................................................. 604.1. Extracción del ADN clonado del fago............................................................ 604.2. Restricción y electroforesis............................................................................. 614.3. Transferencia del ADN digerido al papel de nitrocelulosa

(Southern blotting)............................................................................................ 614.4. Hibridización “Southern” y “dot blotting”...................................................... 634.5. Autorradiografía............................................................................................. 64

Capítulo 5. Rastreo de clonos de proteínas recombinante mediante el uso de sueros policlonales...................................................................................................... 655.1. Antisuero policlonal y adsorción con extracto de E. coli............................ 655.2. Inducción de antígenos.................................................................................... 685.3. Exposición de los antígenos del microorganismo a los antisueros.................. 695.4. Revelado.......................................................................................................... 69

Capítulo 6. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes clonadas.... 716.1. Subclonaje en plásmidos pBlueScript............................................................... 716.2. Escisión in vivo usando el sistema ExAssist/SOLR.......................................... 716.3. Expresión y purificación de proteínas recombinantes en el vector pMal......... 72

Anexo: Información útil para el manejo de los protocolos..................................... 73- Algunas propiedades de los ácidos nucleicos............................................................. 73- Reactivos y preparación de soluciones........................................................................ 74- Fórmulas.................................................................................................................... 75- Características de los vectores y cepas....................................................................... 77- Fig.s....................................................................................................................... 10a- Glosario...................................................................................................................... 92

Corolario........................................................................................................................ 91Bibliografía.................................................................................................................... 96Índice.............................................................................................................................. 97

Índice de Diagramas de flujo

Diagrama 1. Ruptura de los bacilos: tratamiento enzimático......................................... 44Diagrama 2. Extracción y purificación del ADN del bacilo........................................... 45Diagrama 3. Restricción, ligazón y Empaquetamiento del ADN del bacilo................... 46Diagrama 4. Cultivo de las bacterias hospederas E. coli Y1090, Y1088....................... 47Diagrama 5. Infección del hospedero E. coli Y1090, Y1088......................................... 48Diagrama 6. Amplificación y titulación de la genoteca genómica.................................. 49Diagrama 7. Síntesis automática de las sondas............................................................... 53Diagrama 8. Tratamiento post-síntesis de las sondas..................................................... 54Diagrama 9. Tratamiento post-síntesis de purificación de las sondas............................. 57Diagrama 10. Radiomarcaje y medición de la radiactividad de las sondas..................... 58Diagrama 11. Aislamiento de fagos a partir de la genoteca y extracción de

ADN recombinado....................... ............................................................ 60Diagrama 12. Restricción de ADN recombinado y transferencia tipo Southern............. 63Diagrama 13. Rastreo del clon dentro de la genoteca con anticuerpos policlonales................................................................................................ 66Diagrama 14. Adsorción de sueros anti-bacilo................................................................ 69Diagrama 15. Rastreo del clon dentro de la genoteca. 71

Índice de Tablas

Tabla 1. Algunas enzimas de restricción 79Tabla 2. Principales marcadores geneticos del bacteriofago Lambda 80 Tabla 3. Principales marcadores del bacteriofago Lambda GT11 81Tabla 4. Principales marcadores geneticos comunes a los hospederos E. coli

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Y1088 y Y1090 81Tabla 5. Principales marcadores geneticos del hospedero E. coli Y1088 82Tabla 6. Principales marcadores geneticos del hospedero E. coli Y1090 82

Índice de Figuras

Fig. 1. Tipos de genotecas 16Fig. 2. Reacciones de la síntesis química de sondas de oligonucleotidos 22Fig. 3. Protección de nucleotidos mediante un enlace tipo eter 23 Fig.4. Bases AGC son protegidas por acilación 23 Fig.5. Grupos prtectores de grupos fosfatos 24Fig.6. Renaturacion de dos hebras de ácidos nucleicos 25Fig.7. Hibridización en fase solida de acidos nucleicos 25Fig.8. Mapa genético del fago lamda silvestre 28Fig.9. Estilos de vida del fago lambda 29Fig.10. Cascada lítica interconectada con el circuito para la lisogenia 31Fig.11. Mapas de restricción con Hindi de Lambda gt11 32Fig.12. Mapa genómico de E. coli 32Fig. 13. El operón Lac 35Fig.14. Región controladora del operón Lac 35Fig.15. Regulación de la síntesis proteica del operon Lac 36Fig.16. Identificación de recombinantes en Lambda ct11 38Fig.17. Sistema genético del plasmido Bluescript 39Fig.18. Sistema genético del plasmido pMal 39 Fig.19. Variaciones de las temperaturas a lo largo de una PCR estándar 40Fig.20. Forma esquematizada de una colección de fago Lambda 43Fig.21. Ciclo de acople de un nucleotido a una síntesis automatica de una sonda 52Fig.22. Tratamiento de post-sintesis de la sonda 56Fig.23. Evaluación de la calidad de la libreria 62Fig.24. Busqueda de genes con antisueros policlonales 66Fig.25. Mtuberculosis teñido con Zielh-Neelsen visto a microscopio optico 83Fig.26. Tejido pulmonar afectado por tuberculosis 83Fig.27. Electroforesis en gel de agarosa 1% 84Fig.28. Electroforesis del Mtuberculosis con ARN digerido con enzimas de restricción 84Fig.29. Librería cultivada en presencia de IPTG y X-GAL 85Fig.30. Titulo de 4.0x1010 ufp/mL de la librería amplificada 86Fig.31. Aislamiento de las ondas sintetizadas por electroforesis en poliacrilamida-urea 87Fig.32. Autorradiografia de geles de poliacrilamida-urea que muestra los oligonucleotidos marcados 88Fig.33.Gradiente en CsCl 89Fig.34. Análisis comparativo entre ADN genomico y ADNr cortados con enzimas de restricción 89Fig.35. Autorradiografias de ADN de vectores 90Fig.36. Análisis de electroforesis en agarosa al 1% 91Fig.37. Muestra del clon 40K puro de M. tuberculosis 91

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Capítulo 1__________________________

¿Qué es la Biología Molecular?

La Biología Molecular (BM) es la reducción a nivel molecular de las estructuras y procesos que caracterizan la vida orgánica. Esta ciencia surge de la aplicación de una serie de métodos interdisciplinarios encaminados a definir lo viviente. Para propósitos pedagógicos podemos agrupar dichos métodos en métodos estructurales, métodos informacionales y métodos computacionales. Los primeros se valen de la cristalografía, la resonancia nuclear magnética (RNM), la microscopía electrónica (MICE) y tunnel (MICTU), entre otros. Los segundos usan métodos derivados de la genética y la bioquímica y cuyos resultados se desprenden de geles y reacciones. Estos métodos dan fundamento a las tecnologías del ADN-recombinante. Los métodos computacionales son una consecuencia de los dos primeros. Estos métodos implican por una parte analizar bases de datos, diseñar algoritmos y programas con el propósito de descifrar las propiedades subyacentes que las secuencias de ADN almacenan y por otra, el diseño de biointegrados con múltiples propósitos.

Biología Molecular

Métodos estructurales Métodos informacionales Métodos computacionalesCristalografía (Ingeniería genética, ADN- Bases de datosRNM Recombinante y PCR) ProgramasMICE, MICTU Algoritmos

Biointegrados

Estrategias

Familia Gen Proteína (Genoma) (Proteoma)

El clonaje ocupa un lugar central

Gen Proteína Gen (Célula) (Célula)

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Adicional a esto, tres estrategias metodológicas pueden ser planeadas a fin de atacar los problemas biológicos a nivel molecular: 1) de la proteína al gen; 2) del gen a la proteína y 3) de la familia al gen. En cualquier caso, el clonaje de ácidos nucleicos ocupa un lugar central para proveer material puro y específico para múltiples propósitos.

La experimentación combinada de estos métodos esta redundando en el estudio de estructuras y funciones de genes, proteínas, genomas y proteomas. Definiendo con estos los procesos fundamentales que caracterizan la célula viva, como son el conjunto de reacciones del metabolismo celular, el ciclo celular, el crecimiento y la diferenciación celular, el movimiento y la comunicación celular, el envejecimiento y la muerte celular, entre otros.

Todos estos procesos se encuentran enraizados en el núcleo central del flujo de la información genética intracelular o dogma central de la BM, dados por la replicación del ADN, la reparación, la recombinación, la transcripción, la traducción, la regulación génica, el transporte intracelular, entre otras propiedades de los ácidos nucleicos. Igualmente, los métodos de la BM han generado poderosas biotecnologías o herramientas moleculares las cuales están contribuyendo a la investigación de diferentes disciplinas cuyos objetos de estudio tienen que ver con lo biológico.

En un sentido estricto, la BM es una subdisciplina de la biología. Por ello, nosotros no podemos esperar entender la estructura y la función de los genes si nosotros no estamos preparados para entender la biología y la ecología de los organismos en los cuales esos genes y organismos se expresan. En el corazón de la BM se encuentra la Ingeniería Genética, la cual permite la manipulación de genes de procesos complejos de la célula viva. Así, el entendimiento de la estructura, función y regulación de los genes y sus productos es esencial para una apreciación de los sistemas biológicos, lo que implica el conocimiento de la organización de los ácidos nucleicos de los organismos.

Para analizar la estructura genética y los eventos en ésta situación compleja, se necesita de la capacidad para aislar y estudiar un grupo de genes o un simple gen en una forma pura. La Ingeniería Genética permite hacer esto, a través de una manipulación deliberada de genes dentro o entre especies, ya sea con propósitos de análisis genético, mejoramiento de cepas, reparación de genes defectuosos, entre otras. Las herramientas que utiliza la ingeniería genética son la tecnología del ADN-Recombinante y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (o PCR por sus siglas en Inglés). Con estas es posible efectuar el reordenamiento in vitro de material genético y la amplificación específica de fragmentos de ADN por manipulación enzimática.

Con estas herramientas la cacería de genes científica y económicamente importantes se ha convertido en el principal objetivo de las ciencias biológicas. Así, la biología ha sido transformada por la capacidad de replicar y expresar genes in vitro. La biología del desarrollo busca primero un gen para especificar una forma en el embrión. La biología celular busca un gen que especifique un elemento estructural. La medicina busca genes para producir proteínas del cuerpo o trazar las causas de las enfermedades. Las cuestiones evolutivas, desde el origen de la vida hasta el origen de las especies son -controversialmente- todas trazadas por patrones de moléculas de ADN. La ecología caracteriza las poblaciones naturales por amplificación de ADN: los hábitats sociales de los animales y los patrones de migraciones de las poblaciones humanas se conducen sobre patrones de ADN. Las cuestiones legales de vida o muerte pueden abordarse sobre patrones de restricción de ADN o “fingerprinting” (Gilbert, W. 1991). Y ahora, el proyecto genoma ha comenzado a descifrar las secuencias de ADN completas y listar cada uno de los genes que caracterizan todas las especies modelo que pueblan la tierra, incluida la nuestra.

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Como consecuencia de todo esto, alrededor de los genes se mueve una poderosa biotecnología cuyos beneficios se están aplicando a todos los campos de la salud, industrial, agrícola, energético, ecológico, analítico y social. Sin lugar a dudas, en Colombia existen muchas necesidades las cuales esta moderna biotecnología permitiría buscar soluciones a problemas domésticos y universales.

Según Walter Gilbert la BM ha contribuido a resolver tres grandes interrogantes: 1) resolvió como la información hereditaria es transmite de generación en generación; 2) como dicha información es traducida a estructuras proteicas (obreros del metabolismo) y por consiguiente, a la definición básica y especializada de las células; y 3) que todos los organismos compartimos el mismo tipo de información y que todos provenimos por “evolución” (las comillas son nuestras) de las secuencias de ADN (Ver Nota).

Otro reciente hecho de trascendencia universal ha sido el dado por el consorcio Celera Genomics liderado por Craig Venter. Ellos lograron secuenciar por completo el genoma humano. Según James Watson se requerirán por lo menos 1000 años más para entender todos los 3000 millones de pares de bases que constituyen el patrimonio genético humano. Algunos científicos opinan que durante éste milenio se espera que los biólogos moleculares descifren por que somos como somos, derrotemos las enfermedades y las taras genéticas que nos afligen y lleguemos a ser menos seniles.______Nota: Los evolucionistas suelen afirmar que quien no entiende la teoría de la evolución es por que no tiene la fundamentación matemática y poblacional (Mainard-Smith, 1989) para digerirla. Habiendo considerado este hecho los autores también han observado que algunos evolucionistas son conscientes de las limitaciones e inconsistencias internas en la aplicación del análisis matemático a los procesos de selección natural y mutación de las especies. Igualmente, a nivel molecular existe una gran controversia con la teoría del reloj molecular, dada la dificultad en reconciliar los cambios en los nucleótidos con el tiempo y las evidencias contradictorias con los registros paleontológicos. Finalmente, a nivel del origen de la vida hay más especulación que respuestas finales. Parafraseando a Delbrück podríamos decir: "ya no leeré ningún artículo sobre la evolución prebiótica hasta que alguien se presente con una receta que diga: haga esto y aquello, y en tres meses verá cosas arrastrándose allí" (Luria, 1986). Ver epílogo.

Hitos en la historia de la biología molecular

La era de la BM nació con la visión del físico Erwin Schrödinger (Lewin, 2000) quien en su famoso librito “what is life?”, predijo las propiedades esperadas para el gen (Shrödinger, 1944). Su obra influyó sobre algunos físicos de la época, como Wilkins, Crick, Staudinger, Luria a incursionar en la biología, y sobre otros, como el bioquímico Chargafs y el biólogo Watson ha focalizar sus estudios sobre la estructura del cromosoma y la herencia. Ellos rememoraron el impacto que dicha obra causó en sus vidas (Gribbin, 1986). De ahí que la BM surge de la colaboración entre biólogos y físicos (Haynes & Hanawalt, 1968; Watson, 1968; Luria, 1986; Moreno & Vélez, 2000).

Ya que los grandes logros de la ciencia nacen en ambientes académicos, científicos y personales altamente competitivos, una apreciación humana vale tener en cuenta. Al igual que cualquier otra actividad humana, la BM esta atada a los avatares del poder, la psíquis y los sueños personales de quienes trabajan en ciencias. Al recorrer la historia de esta fascinante disciplina es fácil encontrar todo tipo de personalidades, desde aquellos que encarnan la modestia y sabiduría de los hombres de ciencia, cada vez más escasa, hasta aquellos quienes rinden tributo al glamour, la arrogancia y la ambición personal como únicos medios para materializar sus sueños de fama. Ambos estilos producen resultados y la historia se encarga de juzgar el impacto universal de sus descubrimientos.

La siguiente cronología histórica pretende motivar a los estudiosos a investigar que hay detrás de cada uno de estos personajes y a medir el real impacto de sus hallazgos sobre el conocimiento y la sociedad. Son ellos quienes con sus contribuciones han

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fundamentado gran parte de la biología moderna y han permitido descifrar los principios y aplicaciones que sustentan la vida orgánica.

• 1865. Gregorio Mendel descubre la naturaleza estadística de la transmisión de los caracteres de la herencia o genes. Nace la genética y Mendel es considerado el padre de ésta.

• 1865. Mischer descubre la nucleína y posteriormente esta es caracterizada por Altman como ácido nucleico.

• 1920. Thomas Morgan establece los primeros mapas de ligamiento cromosómico mediante uso de formas alternas o alelos producidos en el laboratorio por rayos X.

• 1940. Delbrück, Luria y Hershey crean el grupo del fago para estudiar las propiedades de “la molécula de la herencia”.

• 1944. Erwin Shrödinger publica “what is life?”. Obra que influyó sobre muchos físicos atómicos a efectuar alianzas con biólogos y químicos contemporáneos para estudiar la naturaleza del gen. Nace la era de la biología molecular.

• 1944. Avery, McCleod y M. Carthy descubren el “principio transformante” del pneumococo.

• 1950. Erwin Chargaff determina las proporciones de las bases nitrogenadas en el ADN.

• 1950. Linus Pauling deduce la estructura del enlace peptídico y la hélice α de las proteínas.

• 1950. George Beadle, Edward Tatum y Joshua Lederberg descubrieron que los genes actúan regulando eventos químicos definidos y que la célula bacteriana experimenta reordenamientos y transferencia de la información genética a otras células.

• 1953. Watson, Crick, Wilkins y Rosalind descubren la estructura molecular del ADN. • 1956. Francis Crick propone el dogma central de la biología molecular.• 1958. Perutz y Kendrew descifran la estructura tridimensional de la lisozima y la

mioglobina.• 1958. Arthur Kornberg aísla la ADN polimerasa I, la primera enzima que hace ADN

en el tubo de ensayo.• 1960. Descubrimiento del RNA mensajero y demostración que éste lleva la

información que ordena los aminoácidos en la proteína.• 1965. Jacques Monod, André Lwoff y François Jacob fueron galardonados con el

premio Nobel por sus descubrimientos acerca del control genético de la síntesis de virus y enzimas.

• 1966. Niremberg y Khorana determinan el código genético completo.• 1966. Holley descifra la estructura tridimensional del tRNA.• 1970. Aldber, Natans y Smith descubren las primeras enzimas de restricción, enzimas

que cortan ADN en sitios específicos.• 1972. Las primeras moléculas de ADN-recombinantes son generadas mediante la

enzima ADN ligasa.• 1973. Paul Berg y Herbert Boyer toman fragmentos de ADN extraño los cuales son

insertados en un plásmido de ADN para crear los primeros plásmidos quiméricos. Se encontró que estos pueden ser funcionalmente reinsertados en la bacteria E. coli. El potencial ahora existe para clonar en las bacterias cualquier gen. Nace la ingeniería genética.

• 1975. Renato Dulbecco, Howard Temin y David Baltimore ponen en reversa el dogma central de la biología molecular mediante la transcriptasa reversa.

• 1977. Sanger, Maxam y Gilbert desarrollan los métodos de secuenciación del ADN.

14


• 1977. Creación de las primeras moléculas de ADN recombinante conteniendo ADN de mamífero y descubrimiento de los genes interrumpidos por Phillips and Richards.

• 1978. La somatostatina llega a ser la primera hormona humana clonada producida mediante el ADN-Recombinante.

• 1984. César Milstein es galardonado con el premio Nobel por desarrollar un método para la producción de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales.

• 1986. Kary Mullis desarrolla la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.• Década de los 80. Primeras plantas y animales transgénicos diseñados y patentados e

inicios de la terapia génica.• 1990. Arranca oficialmente el proyecto genoma.• 1995. Primer genoma bacteriano secuenciado.• 1999. Secuenciamiento del primer organismo multicelular eucariótico (el C. elegans).• 2000. Craig Venter y su compañía privada Celera Genomics secuencian por completo

el genoma humano, adelantándose así por tres años al proyecto genoma oficial.• Nuevas avenidas parecen dirigir los análisis de genes y genomas hacia la geometría

fractal (Moreno et al. 2000), las matemáticas, la física óptica y cuántica, la química combinatoria y el manejo computacional que encriptan las secuencias o mensajes unidimensionales de genes y genomas. La gran complejidad de los diferentes niveles de resolución en los cuales se autocontiene lo viviente seguramente requerirá de un enfoque más holístico que de cuenta de las estructuras tridimensionales complejas que forman los organismos vivos, tales como proteínas, células y organismos multicelulares. De alcanzar esta meta, se cumpliría otra de las máximas predichas por Schrödinger quien señaló: “...las estructuras cromosómicas son al mismo tiempo los instrumentos que realizan el desarrollo que ellos mismos pronostican. Es decir, ....llevan una clave elaborada (o encriptada) que contiene todo el desarrollo futuro del organismo” (Schrödinger, 1944).

Para un transfondo más completo de los pioneros, principios y tecnologías de la biología molecular sugerimos otra obra de los autores llamada: Biología Molecular, Genómica y Post-Genómica, 2002 (Moreno et al., 2002).

15


_______________________________ Introducción al ADN-Recombinante

1.1. Construcción de una biblioteca de ADN-RecombinanteEn el proceso de clonaje las moléculas de ADN blanco, objeto de estudio, se ligan a

ADN autónomos como plásmidos o virus y posteriormente se introducen dentro de células hospederas. Después de su replicación, las moléculas híbridas son seleccionadas y amplificadas para producir suficiente cantidad de un segmento determinado (53). Estos fragmentos de ADN específicos pueden ser caracterizados por técnicas tales como mapeo de restricción, inducción de expresión y secuencia de nucleótidos entre otros. Un experimento típico de clonaje requiere de dos procedimientos combinados: la construcción de una genoteca de ADN recombinante y un sistema de detección de clonos que lleven secuencias de un gen especifico o fragmentos de este (42, 43, 46, 53).

Una genoteca es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo distribuidos en el vector, cuya unión representa el genoma total del organismo. En la práctica, una genoteca contiene algunos o todos los genes de una especie dada. Esta genoteca esta constituidas de una población de clonos bacteriales o de fagos, cada uno teniendo pequeños segmentos de información genética a partir de la especie en cuestión (Ver Tabla pagina siguiente) Una vez la genoteca ha sido construida el próximo paso -y usualmente el reto más grande- es rastrearla (screening) a fin de seleccionar el clon o los clonos los cuales contienen el gen de interés (ver capítulo 5).

Existen dos principales tipos de genotecas, a partir de las cuales los genes pueden ser aislados: 1) las genómicas, las cuales se construyen a partir del ADN genómico del organismo y 2) las de ADN complementario o ADNc, construidas a partir de ARNm, Fig. 1. Tejido Vectores (2)

(elección de un vector)ARNm (1) ADN

ADNc ADN completa o parcialmente digerido

ADNdb Separación pormetilado tamaño

ADN clonable

Restricción (3)

ADN ligado al vector (4)

Introducción del ADN blanco o vector ligado en E. coli (empaquetamiento

in vitro o transformación)(5)

Título y caracterización de la genoteca

Rastreo para el Amplificación clon deseado para almacenaje

por largo término

16


Fig. 1. Pasos implicados en la construcción de una genoteca de gADN o ADNc. La construcción de una genoteca implica la conjugación de cinco aspectos importantes: 1) un ADN blanco o clonar; 2) un vector de clonaje; 3) endonucleasas de restricción; 4) una enzima ADN-ligasa y 5) un hospedero procariote o eucariote, donde se propague el vector (53).

Para las especies eucariotas es usual comenzar con una genoteca de ADNc. Esta es hecha a partir del aislamiento del ARNm a partir de células que expresan el (los) gen(es) de interés, convirtiendo el ARNm a ADNc y clonando el ADNc. Una ventaja importante de este enfoque es que esta reduce el número de clonos los cuales se necesitan ser rastreados ya que la genoteca sólo contiene ADNcs correspondientes a los genes que están siendo expresados y lo cual puede constituir el 1% o menos del total de información genética presente en la célula.

1.1.1. ADN blanco de interés para clonarPuede ser el de cualquier organismo, por ejemplo el de M. tuberculosis. Este ADN

es aislado del resto de componentes de la célula por diferentes métodos, dependiendo de las características intrínsecas del organismo. Estos métodos básicamente se agrupan en: métodos de ruptura mecánica, métodos enzimáticos o combinados.1. Rompimiento mecánico de la célula. Puede hacerse utilizando una cámara de presión celular, en la cual se colocan las células en suspensión y se congelan, luego se aplica presión para estallar las células. 2. Sonicado, mediante el cual las células se someten a ultrasonido, provocando la ruptura celular. 3. Con perlas de vidrio. Las células en suspensión se homogenizan ocasionando su rompimiento total mediante cambios bruscos de congelamiento y descongelamiento. No obstante, estos métodos son inadecuados para el aislamiento de ácidos nucleicos, pues causan fracturas indeseables en el ADN. 4. Método enzimático, el cual efectúa la lisis celular mediante enzimas que atacan la pared celular.

Organismo Tamaño Tipo de No. de cromosomas pb Mpb ADN (haploide) FX174 5X103 0.005 ADNmc 1 Fago l 5X105 0.05 ADNbl 1 E. coli 4X106 4 ADNbc 1 Levadura 2X107 20 ADNbl 17 Mosca 3X107 30 " 4 Ratón 2X108 200 " 21 Planta 1X1077-10 100-10000 " 20-1000 Humano 3X109 3000 " 23 cro.1 2.6X108 263 " 1 cro.Y 5X107 59 " 1 Saurio 1X1010 10000 " ?

Tabla 1. Tamaño del genoma de diferentes organismos. Como referencia se dan las dimensiones del cromosoma 1 humano, el más grande y el cromosoma Y, el más pequeño. m: monocatenario, b:bicatenario, l: lineal, c: circular.

1.1.2. Vector de clonajeComo su nombre lo indica, es el vehículo que transporta el ADN blanco de interés

para clonar. El vector es un ADN que se replica autónomamente. La elección del vector adecuado depende de los objetivos trazados; varias consideraciones influyen en esta elección: las enzimas de restricción que han de emplearse, el tamaño de los fragmentos de ADN blanco a ser insertados (40), y el método de selección de genes a usar. Comercialmente se dispone de una colección de vectores bien caracterizados (9), los

17


cuales, en su gran mayoría, tienen un marcador seleccionable que permite distinguir las células transformadas, es decir, permite diferenciar los fagos recombinantes; finalmente, el hospedero debe estar bien caracterizado y ser compatible con el vector (18, 53).

Existen vectores para células procariotas y vectores para células eucariotas. Entre los primeros tenemos vectores para E. coli, los más numerosos, vectores para bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, vectores para streptomyces y levaduras y para mycobacterias (31), entre otros. Finalmente, hay vectores para células vegetales y para células animales. Dentro de cada uno de estos grupos hay vectores de clonaje para propósitos generales y para propósitos especializados. Los vectores mas utilizados pertenecen al grupo de los plásmidos, los bacteriófagos M-13 y lambda (9).

Dentro de los bacteriófagos lambda existen vectores de inserción y de substitución. Los vectores de inserción son aquellos que tienen un sitio único de restricción en el cual el ADN blanco es insertado, por ejemplo, el bacteriófago lambda gt-11. Aquellos vectores en los que se reemplaza parte de material genético del vector no fundamental por parte del ADN blanco se conocen como vectores de substitución, por ejemplo, el bacteriófago EMBL-3. De otra parte, los vectores de expresión llevan elementos de control que favorecen la expresión del ácido nucleico heterólogo insertado, por ejemplo, el fago lambda gt-11 (16, 40) (ver numeral 1.3.).

1.1.3. Endonucleasa de restricciónEstas son enzimas aisladas principalmente de procariotes, que reconocen secuencias

específicas dentro del ADN de doble hélice para cortar y/o modificar la molécula. Estas pueden clasificarse dentro de tres grupos: las enzimas tipo I, tipo II y tipo III (Tabla 2).

Las enzimas tipo I y tipo III producen una modificación (metilación) y al tiempo tienen actividad de restricción (clivaje) dependiente del ATP. Ambos tipos de enzimas reconocen secuencias especificas no metiladas en el ADN sustrato; sin embargo, las enzimas tipo I clivan aleatoriamente, mientras que las enzimas tipo III cortan el ADN en sitios específicos.

El sistema de modificación restricción tipo II esta constituido por endonucleasas de restricción y metilasas de modificación separadas. Se han aislado más de 200 endonucleasas de restricción, muchas de las cuales son valiosas en el clonaje molecular. Estas enzimas cortan el ADN dentro o cerca de sus secuencias particulares de reconocimiento, las cuales típicamente son de 4 a 6 nucleótidos de longitud; estas secuencias son palindrómicas y poseen un eje doble de simetría (20, 81). Ver Tabla página siguiente.

Algunas de estas enzimas, como Eco RI, no clivan exactamente en el eje de simetría, sino en posiciones separadas de 4 nucleótidos en las dos bandas de ADN, generando fragmentos de ADN con extremos 5' salientes y cohesivos.

5’ .G AATT C.3’ Eco RI 5´ G 3’ 5’ AATTC.3’ ||| || || || || ||| ---------> ||||| || || || + || || |||| |||3’ .C TTAA G.5’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G.5’

18


Cualquiera de estos extremos cohesivos puede formar apareamiento de bases con cualquier otro fragmento de ADN que tenga extremos cohesivos complementarios, originándose así una molécula de ADN-recombinante. También hay enzimas que generan fragmentos cohesivos 3' salientes, y enzimas que cortan ambas cadenas de ADN en el mismo sitio generando extremos romos (43).

Tabla 2. Características de las endonucleasas de restricción ------------------------------------------------------------------- Tipo I Tipo II Tipo III-------------------------------------------------------------------Actividad de Enzima Metilasa y enzimas separa-restricción y multifuncional endonucleasa das con una ac-modificación simple separada tividad en común

Estructura 3 subunidades Simple 2 subunidades proteica de diferentes diferentesla ER.

Requerimientos ATP, Mg2+, Mg+2 ATP, Mg+2,para la S-adenosilMet S-adenosilmetio-restricción nina

Secuencia de Eco B: TGAN8TGCT Usualmente sime- Eco P1: AGACC los sitios Eco K: AACN6GTGC tría rotacional Eco P15: CAGCAGespecíficos del hospedero

Sitios de Posiblemente En o cerca al 24-26 pb haciaclivaje aleatorios, al sitio específico el extremo 3' menos 1000 pb del sitio espe- desde el sitio cífico específico

Activación de No Si Sila enzima

Translocación Si No No del ADN

Sitio de Sitio Sitio Sitio metilación específico específico específico -------------------------------------------------------------------N = Cualquier nucleótido.

1.1.4. ADN ligasaUna vez apareados los sitios cohesivos (o extremos romos) presentes en el vector

con los extremos del ADN blanco, la estabilidad de estas moléculas recombinantes depende de la capacidad de sellar covalentemente las rupturas en cada banda o muescas (nicks) en el ADN. Este proceso es llevado a cabo tanto in vivo como in vitro por las enzimas de ADN polinucleótido ligasa. Esta enzima es un simple polipéptido de 68 kDa de peso molecular, que cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre el grupo hidroxilo 3 y el fosfato 5 de los dos nucleótidos adyacentes de la muesca, reestableciéndose así la continuidad estructural de las bandas de ADN (40, 53).

Para llevar a cabo la reacción de ligazón se consideran dos parámetros: la relación entre los brazos del bacteriófago y los insertos, y la concentración de las dos clases de

19


ADN a ligar. Cada brazo del fago lleva dos clases de extremos cohesivos como se observa en el esquema: uno es el extremo Cos, que es compatible solamente con la secuencia complementaria Cos del otro brazo; y el otro es el extremo Ct generado por el corte de una endonucleasa de restricción y es compatible tanto con los extremos del inserto como con el otro extremo Ct del vector.

Cos ---------- Ct Ct ---------- Ct Ct ---------- Cos

El sustrato optimo de ADN para ser empaquetado en el fago es la molécula concatamérica [(brazo derecho-inserto-brazo izquierdo)n]. Para obtener el mayor número de estas moléculas, la reacción de ligazón debe contener concentraciones equimoleculares de extremos Ct en cada una de las tres clases de ADN (brazos izquierdos, insertos y brazos derechos). Puesto que cada brazo contiene solamente un extremo Ct, mientras que cada inserto contiene dos, entonces la relación de moléculas en la reacción debe ser 2:1:2 (brazo izquierdo-inserto-brazo derecho). La concentración de ADN a clonar debe ser suficientemente alta para asegurar la ligazón intermolecular, que conduce a la formación de concatámeros y no a la formación de círculos monoméricos, los cuales no se empacan dentro de las cápsides virales (40).

1.1.5. HospederoUna vez ligadas las moléculas de ADN-recombinante, son introducidas dentro de la

célula hospedera por transformación si son plásmidos. Si son fagos, los ADN-recombinantes junto con las proteínas de la cápside y la cola son autoensambladas in vitro como partículas virales infecciosas, para que inyecten las moléculas de ADN dentro de la célula hospedera. Los hospederos pueden ser procariotes o eucariotes; debe existir una compatibilidad genética entre el ADN vector y el ADN del hospedero. Por esto, el genotipo y el fenotipo de ambos deben estar bien definidos.

Además de los sistemas de regulación del gen, dos sistemas principales deben conocerse bien: el sistema de modificación-restricción y el sistema de recombinación (20, 30). Todos los hospederos de E. coli son derivados de la cepa salvaje E. coli K-12, la cual normalmente produce enzimas de restricción que clivan el ADN. Naturalmente, la E. coli produce metilasas de modificación que protegen su propio ADN del clivaje. Por lo tanto, los fagos no modificados que infecten E. coli son destruidos. Esto puede evitarse propagando los fagos recombinantes en un hospedero deficiente de restricción (r-). Las cepas hsdR- son deficientes en restricción pero no en modificación (r-, m+), mientras que las cepas hsdS- son deficientes en ambas funciones (r-, m-).

Por otro lado, E. coli K-12 tiene la capacidad de experimentar más o menos recombinación homóloga eficiente mediante un número de vías diferentes. Por lo tanto, deben elegirse hospederos Rec-, adecuados para amplificar o buscar genes en una genoteca (16). Una vez construida la genoteca debe determinarse el porcentaje de recombinantes, amplificar y conocer el título, y en lo posible, evaluar la calidad de la genoteca para efectuar con mayor seguridad la búsqueda de clonos recombinantes específicos.

1.2. Sistemas de rastreo e identificación de clonos de ADN-Recombinante dentro de una genoteca

Existen dos estrategias para la búsqueda in situ de clonos portadores de genes específicos dentro de una genoteca: Con sondas de ácidos nucleicos sintéticas o naturales marcadas con isótopos o enzimas, ya sea por hibridización o mediante la PCR. Y con anticuerpos policlonales y/o anticuerpos monoclonales, utilizados como sondas, marcados con isótopos radiactivos o con enzimas (70), entre otros métodos.

20


Diagrama de flujo general para el rastreo de genotecas

Genotecas en plásmidos, fagos, cósmidos

YACs

Sembrado de la genoteca(considerar genoteca base y tamaño de inserto)

Rastreo de la genoteca mediante:1) hibridización a sondas largas de ADN u oligonucleótidos,

2) inmunoreactividad 3) selección de híbridos de ARNm y traducción o

4) PCRs con iniciadores específicos

5) Purificación de placas o colonias.

1.2.1. Síntesis química de oligonucleótidos o sondasLos dos métodos más ampliamente usados para sintetizar químicamente

oligonucleótidos son: el método fosfito-triester y el fosfodiester. El método fosfito-triester usa fósforo trivalente más reactivo, tiene una alta eficiencia de síntesis, del 98%, cortos periodos de tiempo por ciclo de acople y dos pasos de reacción para efectuar el puente fosfodiester (acople y oxidación) (26, 47). El método fosfotriester utiliza un solo paso para efectuar el puente fosfodiester (acople), fósforo pentavalente menos reactivo, tiene eficiencias de acople del 95% y periodos de tiempos largos (19, 26). Cada acople de un nucleótido durante la síntesis de la sonda, según el método fosfito-triester, implica la ejecución de un ciclo de cuatro pasos de reacción (ver Fig. 1.4).

Desbloqueo: consiste en remover el grupo protector DMTr del último nucleótido acoplado, con Ac. dicloroacético en diclorometano, para dejar libre el grupo 5’OH.

Acople: es la adición de un nuevo nucleótido protegido a la cadena creciente mediante una reacción de esterificación entre el grupo 3’ fosfato del nucleótido entrante y el grupo 5’OH del nucleótido desbloqueado. Esta reacción es catalizada por el tetrazol en acetonitrilo o piridina.

Bloqueo de nucleótidos no elongados: el soporte es tratado con una mezcla de anhídrido acético (AC20), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 2,4,6-colidina (Coll.), en acetonitrilo. Esta reacción acetila los grupos 5’OH del azúcar que no han reaccionado durante el acople. La reacción asegura que solamente las cadenas con secuencias correctas puedan crecer en los pasos siguientes.

Oxidación: el grupo fosfito-triester es luego oxidado a un fosfato-triester más estable. La oxidación se ejecuta por tratamiento del fosfito con una mezcla de yodo, colidina y agua en acetonitrilo.

21


Para efectuar la síntesis química de ONS en fase sólida son importantes el soporte sólido sobre el cual va anclada las cadenas de nucleótidos que se están sintetizando, y los nucleótidos debidamente protegidos para evitar reacciones laterales e inespecíficas.

Fig. 2. Reacciones de la síntesis química de sondas de oligonucleótidos por el método fosfito triester (7, 26).

1.2.1.1. Soporte sólidoEs la matriz donde va unido el primer nucleótido por el extremo 3’OH y a partir del

cual se elonga la síntesis de la cadena del oligonucleótido. Se han elaborado diferentes tipos de soportes; sobre éste viene unido cualquiera de los cuatro nucleótidos protegidos. El soporte sólido puede ser de sílica, perlas de vidrio, plástico o papel de celulosa, y se caracteriza por: ser insoluble e inerte en todos los solventes y reactivos usados durante la síntesis. Ser bastante rígido para resistir la presión del solvente aplicado. Poseer gran área de superficie y poros para dar acceso rápido a reactivos y solventes. Para mayor accesibilidad de los solventes y los reactivos y evitar impedimentos estéricos durante la reacción, sobre el soporte derivado con una alquilamina, se une el primer nucleótido por el extremo 3’ mediante un grupo succinato.

S NH / \ / \ / \ / \ / \ / \ NH2 S: perlas de plástico de 10 µm con \ / macroporos de 4x10³ Da (800Å) | O B N

22


| O ___ODMTr O |/ \ S NH / \ / \ / \ / \ / \ / \ NH | \ __ / \ / \ / \ / \ / \ / | | | O O O

1.2.1.2. Nucleótidos protegidosEl paso clave en la síntesis de ADN es la formación específica y secuencial del

enlace fosfato internucleótido. Para lograr esto, grupos funcionales como los OH 3’ y 5’, y grupos amino exocíclicos, deben ser protegidos. Así, durante la síntesis se tienen dos clases de grupos protegidos:

Los temporales, se colocan para obtener especificidad de una reacción simple y son removidos después de ésta. Los permanentes, que se quedan unidos al oligonucleótido durante toda la síntesis y son removidos al final durante el desanclaje de la sonda del soporte. Dentro del primer grupo tenemos: el grupo hidroxilo en la posición 5’ del nucleótido, se protege mediante un enlace tipo éter con el catión dimetoxitritil (DMTr), para evitar que los hidroxilos del nucleótido entrante compita con los hidroxilos de la cadena en crecimiento.

Fig.3 B N OH

P

Los grupos amino primarios exocíclicos de las bases nitrogenadas A,G,C son generalmente protegidos por acilación. Estos grupos protectivos son estables en todos los pasos de la reacción y los comúnmente utilizados son el benzoil para A y C y el isobutirilo para G.

Fig.4 NH C

GUANINA N N NH2

NH2

ADENINA N N

El grupo fosfato: la naturaleza del grupo protector depende del método de acople elegido. Los grupos protectores del grupo fosfato son el clorofenil desarrollado con la química del fosfotriester y con el β−cianoetil en la química del fosfitotriester. Este grupo puede ser fácilmente removido por tratamiento con amonio concentrado (19). (Fig.5)

23

c OCH3O

OO

N

N

N

NO

NH C

BENZOYLAMIDA

N O

NH2

NCITOCINA

ISOBUTIRILAMIDA

O


Fig.5

1.2.1.3. Hibridización de dos hebras de ácido nucleicos complementarias

El ADN es una molécula de dos cadenas antiparalelas cuya hélice es mantenida principalmente mediante enlaces de H entre los pares A-T y G-C (81). Cuando la doble cadena de ADN es sometida a condiciones extremas de temperatura o pH, los puentes de H en la doble hebra se rompen y el ADN se separa en dos cadenas sencillas, o sea, se desnaturaliza.

Si se usa el calor como desnaturalizante, la temperatura a la cual se separa el 50% de las cadenas de ADN es conocida como Tm o temperatura de fusión. Si las dos hebras son retornadas desde estas condiciones extremas a su estado original (normal), ellas pueden reasociarse para formar la doble hebra. Esta reasociación específica se denomina renaturalización molecular, la cual puede tener lugar entre bandas complementarias de ADN o RNA o entre hebras de RNA y ADN (13).

La proporción de renaturalización de dos hebras de ácido nucleico depende de la frecuencia de colisiones y posterior nucleación (inicio de la formación de la doble hélice) de las regiones complementarias; así, el grado de renaturalización va a estar determinado por la naturaleza de la muestra, tamaño de los fragmentos del ADN, y condiciones de renaturalización tales como: temperatura, fuerza iónica, concentración del ADN y temperatura permitida para la reasociación (45). (Fig. 6)

Existen varios métodos para detectar complementariedad de ácidos nucleicos; uno de estos es la inmovilización de un ácido nucleico en una fase sólida, como el papel de nitrocelulosa. Luego el ADN se desnaturaliza y se pone en contacto con la sonda marcada, posteriormente se detectan las secuencias complementarias y el sitio al cual se ha unido la sonda (13, 70). Este principio es sumamente útil para la biología molecular y con base en éste se han desarrollado técnicas como southern blot, northern blot e hibridización in situ, etc. (Fig. 7)

1.2.1.4. Factores que afectan la hibridización en los filtros de nitrocelulosaMuchos son los factores que afectan la rata de hibridización y la estabilidad de los

híbridos. La temperatura de fusión de un híbrido (Tm) es afectada por la fuerza iónica, pH, la longitud de la sonda y su composición de bases, así como por la concentración de agentes desestabilizantes de la hélice, como formamida.

24

OOH

BN

O

P

X

P

O

CN

B-CIANOETIL


Fig: 6. Renaturación de dos hebras de ácido nucleico

Fig: 7. Hibridización en fase sólida de ácidos nucleicos inmovilizados con ONS radiomarcados

1.2.1.5. Sondas menores de 50 nucleótidosLos efectos de composición de bases sobre el Tm son mayores cuando las sondas

son menores de 50 bases de longitud. Para las sondas de oligonucleótidos de 20 nucleótidos de longitud puede calcularse un valor aproximado para el Tm, usando la siguiente fórmula, cuando la hibridización se lleva a cabo bajo condiciones estándar (aproximadamente 0.9 M NaCl):

25

A

T

G

T

C

C

T

A

A

C

G

G

T

T

TA

A

A

C

C

C

G

G

G

A

B C

A. colisiones aleatorias de pares de bases aleatoriasB. nucleaciónC. reasociación de bandas


Tm (ºC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Donde G, C, A, T son los números de bases respectivas en el oligonucleótido. En la hibridización en filtros, usando sondas de ONS, debe emplearse una temperatura de 5ºC bajo el Tm, para una secuencia perfectamente complementaria. Por cada par de bases erradas, debe reducirse la temperatura de hibridización en 5ºC (2). Para más detalles del cálculo de las temperaturas de hibridización para diferentes tipos de sondas consultar el anexo.

1.2.2. Rastreo de genes con oligonucleótidos sintéticosLos oligonucleótidos sintéticos (ONS) son fragmentos de ADN o RNA de cadena

sencilla o doble que pueden construirse químicamente, manual o automáticamente en el laboratorio. La secuencia del ONS puede derivarse bien sea a partir de una parte de la secuencia de un ADN o de un RNAm ya conocido o puede ser deducida a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés. En la primera aproximación se genera un ONS de secuencia única, mientras que en la segunda aproximación, debido a la degeneración del código genético, se genera una sonda redundante o mezcla de sondas, que integra todas las combinaciones posibles de tripletes para cada aminoácido. Esta sonda es poco práctica cuando su redundancia es elevada (45). Para obviar esta dificultad, se puede deducir a partir de la secuencia de aminoácidos, una sonda única larga a través del análisis del codón preferencia, o sea los codones más frecuentemente utilizados en cada organismo para buscar y seleccionar genes dentro de una genoteca.

1.2.3. Principios inmunológicosEl sistema inmune es uno de una serie de mecanismos protectivos que los

vertebrados han desarrollado para defenderse contra otros organismos, especialmente microscópicos. El término inmune significa que un animal frente a un agente infeccioso permanece libre de infección por ese agente (13). La base del sistema inmune de un organismo es el reconocimiento, el poder discernir entre lo propio y lo extraño (14). Cuando un agente extraño entra en el organismo, contra éste se desencadena una respuesta mediada por una red de interacciones cooperativas entre poblaciones o repertorios de células especializadas que conlleva a la destrucción o neutralización del agente extraño. Esta interacción sucede entre tres tipos fundamentales diferentes de células: las células T (timo-dependientes), las células B (Bursa-dependientes) y los macrófagos. Las primeras son responsables de la inmunidad celular, la cual se basa en la reacción de reconocimiento del agente extraño por parte de moléculas unidas covalentemente a la superficie de la célula. Las células B son las responsables de la inmunidad humoral, causada por moléculas llamadas anticuerpos producidas por las células B, ya no unidas a estas sino en solución.

Los anticuerpos son proteínas colectivamente denominadas inmunoglobulinas, de forma similar a una V. Constituyen el 20% de las proteínas en la sangre. Una simple molécula de estas se denomina anticuerpo. Este tipo de moléculas va a reaccionar con partes específicas del agente extraño (11).

El antígeno es el agente extraño estimulador de la producción de anticuerpos o células inmunes, cuando es inyectado dentro de un animal, y reacciona específicamente con los anticuerpos o las células inmunes. Estudios con antígenos hidrolizados demostraron que solamente ciertas porciones restringidas de las macromoléculas están implicadas en la reacción antígeno-anticuerpo y/o antígeno-célula inmune. En otras palabras, un antígeno lleva parte o regiones específicas que determinan la especificidad de la reacción inmunoquímica, denominadas determinantes antigénicos o epítopes. Cada antígeno puede tener muchos epítopes diferentes y producir una respuesta inmune especifica, por ejemplo: un clon de células B produce anticuerpos de solamente una

26


especificidad, es decir, un clon de células B dirigido contra un mismo epítope. Un animal inmunizado produce generalmente un número aleatorio de clonos, y su antisuero es policlonal. Aproximadamente uno de cada mil clonos reconocen un determinado epítope. En contraste, los anticuerpos monoclonales son producidos por un simple clon de células B, y consecuentemente tienen la misma afinidad y especificidad (32). Un antisuero es policlonal poliespecífico si es producido contra el organismo total, por ejemplo el M. tuberculosis; o puede ser policlonal monoespecífico si es producido contra un antígeno determinado, por ejemplo la proteína MTP-40K de M. tuberculosis.

1.2.4. Rastreo de genes con antisueros policlonalesLa búsqueda de genes dentro de una genoteca con antisueros (o anticuerpos) sólo es

posible si el gen buscado es transcrito y traducido en proteína. La proteína expresada es así reconocida por una reacción antígeno-anticuerpo. Este primer anticuerpo puede estar radiomarcado o ser reconocido por un segundo anticuerpo generalmente conjugado a una enzima. Tras la autorradiografía o el revelado de color por medio de un sustrato cromogénico se identifican los clonos (16).

1.3. VectoresComo observó en el Numeral 1.1.2. existen varios tipos de vectores de acuerdo a los

propósitos de clonaje. No obstante, solo unas pocas categorías son usadas en proyectos de secuenciación a gran escala, como los observados en la Tabla siguiente

Vector Hospedero Tamaño del inserto____________________________________(kb)_________Plásmido E. coli 0- 10Fago λ E. coli 0- 25Cósmido E. coli 20- 45Fago P1 E. coli 70- 100PACs E. coli 100- 300BACs E. coli ≤ 300HAECc Células de mamíferos ≤ 300YACs S. Cerevisiae 200 - 2000_________________________________________________Tabla 3. PACSs: cromosomas artificiales derivados de P1. BACs: cromosoma artificial bacteria HAECs: cromosoma episómico artificial huma YACs: cromosoma artificial de levadura.

En este texto, sólo los vectores tipo lambda son utilizados en la construcción de genotecas y los plásmidos en el subclonaje de insertos y la expresión de proteínas. Por lo cual, a continuación se considerará algunos aspectos relevantes de la biología del bacteriófago lambda.

1.3.1. El bacteriófago lambdaEl genoma del bacteriófago está formado por un ADN lineal de doble cadena de 50

kpb de longitud, el cual está empaquetado en una cápside icosaédrica de naturaleza proteica. Este ADN está en forma de una molécula duplex lineal, cuyos extremos cohesivos (Cos) están formados por 12 nucleótidos de cadena sencilla.

Las partículas de fagos se adsorben por el extremo de la cola a receptores en la membrana más externa de la célula. Esta adsorción es más eficiente si está presente la maltosa en el medio de cultivo, ya que ésta induce la expresión del operón de la maltosa, el cual contiene el gen Lamb que codifica para el receptor de lambda.

27


Después de entrar en la célula, el genoma de lambda se circulariza a través de sus extremos Cos y la molécula se une covalentemente. De esta manera el ADN sustrato queda listo para la replicación y la transcripción del ADN de lambda.

Siendo un fago temperado, puede seguir ya sea por vía productiva (lítica) o por vía temperada (lisogénica). En cualquier caso, la transcripción es iniciada a partir de dos promotores “tempranos”, PL y PR. Fig. 8. En una infección productiva (lítica) se logra la transición de la transcripción temprana; se sintetizan las proteínas del virus, los genomas virales se empaquetan y la lisis de la célula libera aproximadamente 100 partículas infectivas.

En la respuesta temperada, la mayoría de funciones del fago lambda son represadas, ya sea directa o indirectamente, mediante moléculas represoras del fago unidas a las regiones operadas asociadas con PL y PR. Si la represión ocurre antes de que se activen los genes tardíos, la lisis se evita y la lisogenia queda asegurada.

Para que la lisogenia sea estable y no abortiva requiere la integración del genoma de lambda dentro del cromosoma hospedero mediante recombinación sitio específico; de esta manera el genoma del fago (el profago) será replicado como parte del cromosoma de E. coli. Si el lisogeno (la bacteria) es sensibilizado con calor o luz UV, el profago entra en vía lítica (16, 33). Fig. 9.

Fig. 1.7. Mapa genético de lambda mostrando el agrupamiento de las funciones reguladoras.

Fig. 8. Mapa genético del fago lambda silvestre mostrando el agrupamiento de las funciones reguladoras.

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Regulador Antiterminador Represor Antirepresor Regulador positivo negativo

CIII N nut CI Cro CII

OL P

LP

R O

RP

EP

M


Fig. 9. Estilos de vida del fago lambda.

1.3.2. Cascada lítica del fago lambda interconectada con el circuito para lisogeniaTanto la vía lítica como lisogénica requieren la expresión de genes inmediatamente

tempranos y genes inmediatamente tardíos. Pero luego estos divergen; el desarrollo lítico continúa si se promueve la síntesis de un represor. Lambda tiene únicamente dos genes inmediatamente tempranos, el gen cro y el gen N transcritos independientemente por la RNA polimerasa. El gen cro tiene una función dual: impide la síntesis del represor lisogénico (una acción necesaria si el ciclo lítico se inicia), y apaga la expresión de los genes “inmediatamente tempranos” (los cuales ya no son necesarios si entra en ciclo lítico). El gen N codifica un factor antiterminador cuya acción en los sitios nut permite que la transcripción prosiga hacia los genes inmediatamente tardíos.

Los genes “inmediatamente tardíos” incluyen genes de replicación (O y P) necesarios para la infección lítica y genes de recombinación, algunos implicados durante la infección lítica o durante la lisogenia; también están incluidos los genes que codifican los reguladores cII y cIII necesarios para iniciar la síntesis del represor lisogénico. El factor de antiterminación Q permite que la RNA polimerasa prosiga a través de los genes tardíos. Fig. 1.9. Así, los genes inmediatamente tardíos sirven para controlar dos estilos de vida: algunos son necesarios para que el fago entre en lisogenia; los otros aseguran que el ciclo lítico siga su curso (20, 33, 40). Fig. 8 y 10.

La transición lisis-lisogenia depende de un intrincado balance entre un número de factores del hospedero y del fago presentes en la célula infectada.

29


1.3.3. Sistema genético de λgt-10

El lambda gt10 es una versión de fagos, producto de la ingeniería genética del virus lambda tipo silvestre. El vector lambda gt10 tiene 43.8 Kb y posee un sitio para reconocimiento de la enzima EcoRI en el gen cI (gen represor de lambda) y puede aceptar un fragmento de 7.6 Kb antes de empaquetarse en partículas virales (4).

Este ha tenido dos cambios importantes para hacerlo más útil en las manipulaciones biológicas moleculares. Primero, se le removió una gran pieza de DNA innecesario. Esto crea un sistema apropiado en el genoma de éste para clonar un fragmento de DNA extraño (un inserto) dentro del virus, el cual será luego replicado junto con el genoma viral. Esto significa que puede usarse al lambda gt10 para amplificar fragmentos de DNA clonados y obtener muchas copias del mismo. Segundo, el lambda gt10 ha sido modificado para utilizarse solo en su ciclo lítico, cuando crece en huésped apropiado. Por esta razón cuando se hace crecer el fago en una cepa apropiada de E. coli, el fago lisará la bacteria, podrá verse una mancha clara en la película (film) del medio de análisis de E. coli.

Los fagos se guardan generalmente a concentraciones muy altas. Es importante tener una determinación correcta del número de fagos/ml en el contenedor de depósito para su uso posterior. Para determinar el número, se debe diluir los fagos del contenedor de depósito. Si hay muchos fagos en el plato de petri, las placas de sobrelaparan y no se podrán contra los fagos correctamente. Para obtener una adecuada determinación de estos se necesita hacer diluciones seriadas del depósito de fagos. Hay una serie de diferente tipos de diluciones.

La primera dilución se hace tomando 10 ul de la solución de depósito y se diluye 100 veces colocándola en 0.999 ml de Buffer SM. Debido a que se hace una dilución en 100, ésta se marca como 10-2 (concentración 1/100 de la solución original de depósito)- Posteriormente se diluyen 10 ul de esta solución en 1000 ml y se marca como 10-4. Posteriormente, 10 ml se esta solución se diluye 100 veces, y al final obtenemos una solución de 10-6.

Note que la primera y segunda dilución se hacen a partir de la primera dilución. Esto significa que cualquier error en la primera dilución será crítico par las subsecuentes diluciones. Por esta razón, se debe pipetear cuidadosamente para obtener resultados correctos. Después de diluir el depósito de fagos en buffer SM, se incuba una muestra con ER. Coli. Se adiciona agar suave a 45oC y la mezcla se plaquea en platos de agar LB. Al día siguiente se puede calcular el número de fagos del depósito original contando el número de placas del plato y multiplicar este número por la dilución usada para hacer la placa.

30


1.3.4. Sistema genético de λgt-11

El sistema λgt-11 es útil para la construcción de genotecas de ADNc y /o genómicas, al igual que para el aislamiento de proteínas de fusión a β-galactosidasa usando anticuerpos contra β-galactosidasa.

El cromosoma del bacteriófago lambda es una molécula lineal de ADN de 48.6 Kb de longitud, con el 40% del genoma no esencial para la propagación del fago. Los ingenieros genéticos, al retirar estas partes e introducir otras, han construido una gama de vectores para diferentes propósitos de clonaje. Uno de estos es el vector de inserción y expresión lambda gt-11, un fago temperado que contiene el promotor Lac y el gen estructural Z para la β−galactosidasa, tomados a partir del operón Lac de E. coli (16, 51, 73, 74).

Fig. 1.0. Cascada lítica interconectada con el circuito para la lisogenia (20). Ver tabla 2.

1.3.5. Características generales del sistema

Lambda gt-11:Genotipo: lac5, cI857, nin5, sam100. Tabla 3.Capacidad de clonaje: 0 – 7.0 Kb.Sitio de clonaje: Eco RI. Fig. 11.Promotor: P Lac.Reconocimiento de recombinantes: fenotipo Lac- sobre hospedero LacZ-.Reconocimiento de no recombinantes: fenotipo Lac+ sobre hospedero LacZ-.Propiedades de los fagos recombinantes: cI ts, Int+, red+.

Hospedero: cepas: ver Fig. 12 y Tablas Nos.4, 5, 6.Yl088: (supE, supF, metB, trpR, hsdR-kM-k, tonA21, srtA, lacU169, proC: : tn10 (pMC9)).Y1090: (lacU169, lon, araD139, strA, supF, trpC22: : tn10, (pMC9)).

El sitio usado para la inserción del ADN blanco es un lugar único de clivaje Eco RI localizado dentro del gen Lac Z, 53 pb corriente arriba del codón de terminación de la

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Inmediatamentetardio CII-CIII = reguladores

7 genes de recombinación2 genes de replicaciónQ = antiterminador

Tardio 10 genes de la cabeza11 genes de la cola2 genes de lísis

Inhibe la expresión

CI = Represor

Promueve laexpresión

Inmediatamentetemprano Cro = antirepresor

N = antiterminador


transcripción de la β−galactosidasa. El clivaje de lambda gt-11 con Eco RI genera dos brazos de aproximadamente 19 y 24 Kb de longitud, los cuales flanquearán los ADN blancos para clonar (9). Fig. 11.

Lac Z cI 857

nin 5 EcoRI

-----Brazo izquierdo-----------------Brazo derecho-------------------

Fig. 11. Mapa de restricción con Hind III de lambda gt-11.

Fig. 12. Mapa genómico de E. coli, mostrando la localización de los marcadores genéticos implicados en el funcionamiento del sistema lambda gt-11.

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Q S R NexoInt

10 20 30 40 50 Kb

Hind III Hind III

Hind III

Hind III Hind III

P Lac.

4000 Kb

100/0min

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Ara D

Ton A

la Pro C:: Tn5

str

400 Kb Sup E

Att landa

800 Kb

tr t:: Tn10

1200 Kb

1600 Kb

2000 Kb

2400 Kb

2800 Kb

3200 Kb

3600 Kbmal/la

rec

maldan

met B

hfl landa

hsdRM

ADN de Escherichia coli


1.3.6. Sistema genético de λZAP II: escisión in vivo del fagémido pBluescript SK(-) a partir del vector lambda ZAP II

El vector λZAP II ha sido diseñado para permitir la escisión in vivo y la recircularización de cualquier inserto clonado contenido dentro del vector lambda para formar un fagémido que contiene el inserto clonado. Esta escisión in vivo es dependiente de las secuencias de ADN que StratageneTM ha colocado en el genoma del fago lambda y sobre la presencia de una variedad de proteínas, incluyendo proteínas derivadas del bacteriófago f1. Las proteínas del fago f1 reconocen una región del ADN, el cual normalmente sirve como el “origen de replicación” del bacteriófago f1 para la síntesis de la banda positiva. Sin embargo, el origen de la replicación de la banda (+) puede ser dividido en dos partes traslapadas: 1) el sitio de iniciación y 2) el sitio de terminación para la síntesis del ADN. Estas dos regiones del origen de la banda positiva han sido subclonados separadamente en el vector lambda ZAP II. El fago lambda (blanco) es accesible a las proteínas derivadas de f1 mediante infección simultánea de una cepa E. coli, tanto con el vector lambda y el bacteriófago f1. Dentro de E. coli, las proteínas ayudadoras (es decir, las proteínas del fago M13 y f1) reconocen el ADN iniciador que esta dentro del vector lambda. Estas proteínas luego hacen una muesca (nick) en una de las dos bandas del ADN. En el sitio de esta muesca, comienza la síntesis del ADN nuevo y duplica cualquier ADN que exista en el vector lambda curso abajo del sitio de la muesca. La síntesis de ADN de una banda simple nueva de ADN continúa a través del inserto clonado hasta una señal de terminación posicionada en 3´ de la señal iniciadora, la cual se encuentra dentro del vector lambda construido. Las moléculas de ADN de banda simple son circularizadas por el producto del gen II del fago f1 formando una molécula de ADN circular, la cual contiene cada cosa entre el iniciador y el terminador. En el caso del vector lambda ZAP II, este incluye todas las secuencias del fagémido, pBluescript SK(-) y el inserto, si alguno esta presente. Esta conversión es el paso de “subclonaje”, ya que todas las secuencias asociadas con los vectores lambda normales están posicionadas fuera de las señales terminadoras e iniciadoras y no están contenida dentro del ADN circularizado. Además, la circularización del ADN automáticamente recrea un origen f1 funcional como el encontrado en el bacteriófago f1 o los fagémidos.

Las señales para el “empaquetamiento” de los fagémidos creados nuevamente están contenidas dentro de la secuencia ADN origen-terminador de f1. Estas permiten que la circularización del ADN sea “empacada” y secretada a partir de E. coli. Una vez el fagémido es secretado, las células de E. coli usadas para la escisión in vivo del ADN clonado puede ser removido a partir del sobrenadante por calentamiento a 70ºC. El calentamiento mata todas las células E. coli, mientras que los fagémidos permanecen resistentes al tratamiento por calor. Para la producción del ADN de doble banda, el ADN del pBS “empacado” es mezclado con células frescas de E. coli y son esparcidas sobre platos de LB-ampicilina para producir colonias. ADN a partir de minipreparaciones de estas colonias pueden ser usadas para el análisis de insertos de ADN que incluyen secuenciamiento de ADN, subclonaje, mapeo y expresión. Las colonias del pBS pueden también ser usadas para la producción subsecuente de ADN de banda simple adecuado para secuenciamiento dideoxy y mutagénesis en sitio específico.

1.3.7. Rastreo de genes con anticuerposDebido a que el sitio de inserción del ADN blanco en lambda gt-11 está dentro del

gen estructural para la β−galactosidasa, la secuencia del ADN blanco en este vector tiene el potencial de expresarse a partir del promotor Lac, como proteína de fusión con la β−galactosidasa. Por lo tanto, en genotecas de ADN recombinantes construidas en lambda gt-11, se puede efectuar la búsqueda de genes con anticuerpos contra antígenos producidos por clonos recombinantes específicos.

33


1.3.8. Factores que afectan la estabilidad de las proteínas recombinantesDebe tenerse en cuenta tres aspectos principales en la producción de proteínas

extrañas en E. coli:Obtención de un adecuado nivel de expresión de las secuencias de ADN blanco.

Teniendo la secuencia de ADN blanco fusionada a la secuencia del gen de la β-galactosidasa se asegura que el ADN extraño se exprese eficientemente en el hospedero, bajo el control del operón Lac.

Control de la producción de proteínas codificadas por la secuencia de ADN blanco. Esto es importante cuando la proteína es tóxica para la célula hospedera. Este problema se ha minimizado usando células hospederas que producen grandes cantidades del represor del operón Lac (el producto del gen I) para impedir la expresión dirigida por Lac Z de la proteína durante las horas iniciales de crecimiento. Cuando el número de células es suficiente, la expresión dirigida por Lac Z es inducida inactivando el represor con IPTG. De este modo, puede producirse cantidades detectables de antígeno extraño, aún si el antígeno es tóxico para las células.

La estabilidad del antígeno producido se incrementa por su expresión como una proteína de fusión β-galactosidasa-antígeno y por la utilización de células Lon proteasa deficientes. La Lon proteasa es una de varias proteasas responsables de generar una baja estabilidad de las proteínas anormales o extrañas en E. coli. Esta proteasa frecuentemente hace difícil acumular cantidades detectables de antígeno en células de tipo salvaje. Por esta razón se usa un hospedero mutante Lon para incrementar la estabilidad de estas proteínas de fusión durante el proceso de la búsqueda de genes. Además, la estabilidad de las proteínas de fusión permite el aislamiento de cantidades preparativas de proteína a partir de un lisógeno particular de lambda gt-11 recombinado (16).

1.3.9. Sistema genético lactosaLa síntesis de enzimas inducibles es puesta en marcha si ocurren cambios en el

medio ambiente que inducen el requerimiento de esta vía metabólica. Por ejemplo, la sustitución de la lactosa por glucosa en el medio de cultivo, permite que el metabolismo de la lactosa se active, en consecuencia, la transcripción del operón será encendida, el RNAm será sintetizado y la enzima sintetizada (63).

Todo operón tiene: genes estructurales, implicados en una vía metabólica y una región de control que regula la expresión de los genes estructurales. Para el metabolismo de la lactosa se requiere la síntesis de tres enzimas: el gen Z para la β−galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa; el gen Y para la galactopermeasa, la proteína estructural de la membrana que induce la lactosa a la celulosa, y la transacetilasa, codificada por el gen A, que detoxifica la célula por acetilación de análogos de lactosa no metabolizables, como el isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) (20). Además el operón tiene una región de control de

aproximadamente 120 pares de bases (pb) de longitud. Fig.13.

34

ADN

Pi lac I lac P lac Z lac Y lac A lac O

OperadorPromotor

ARNm

Sitio unión al activador CAP Sitio de unión de la ARN pol Sitio de unión del represor ATG

-84 -72 -52 -35 -10 -1 +1

Polipéptido


Polipéptido 36038.000

1021116.000

26030.000

27530.000

Aács.Da.

Proteína activada

Tetrámero

152.000

Tetrámero

500.000

Componentede membrana

30.000

Dímero

60.000

Estr.

Da.Función Represor β-galactosidasa Permeasa Trans-

acetilasa

Fig. 13. El operón Lac, ocupa aproximadamente 6.000 pb (20).

Esta comprende el operador, el cual ejerce control sobre todo el operón; el promotor traslapado con el operador; y un gen estructural I el cual codifica para la proteína represora (63). Fig.14.

Fig. 14. Región controladora del operón lac.

35

ADN

ARNm

Región de Control Genes Estructurales

Pi lac I lac P lac Z lac Y lac A lac O

1040 82 3510 780 825 pb


En ausencia de lactosa, el operón no es transcrito, porque la proteína represora se une al operador en una región altamente simétrica. El promotor se encuentra adyacente corriente arriba del operador y parcialmente traslapado con éste; por lo tanto, esta región es también bloqueada cuando el represor se une al operador. De esta forma, la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y la transcripción no tiene lugar: el operón es represado.

Si un inductor está presente, como la lactosa, o un inductor artificial de estructura similar como el IPTG, éste se une al represor y lo inactiva para unirse al operador; así, el sitio es accesible a la RNA polimerasa. La enzima, unida al sitio promotor transcribe el mensaje para todas las tres enzimas. Fig.15. Mientras que el represor ejerce control negativo, la transcripción del operón Lac también es sometida a control positivo por otra proteína reguladora: proteína activador del catabolito, CAP; el CAP en unión con el inductor cAMP activa la transcripción del operón.

Fig. 15. Regulación de la síntesis proteica del operón lac. A) Operón reprimido o apagado. B) Operón inducido o encendido: la ARN pol transcribe una molécula de ARNm que es traducida por los ribosomas en tres cadenas polipeptícas que dan origen a los tres tipos de enzimas.

36

ADN

ARNm

Pi lac I lac P lac O lac Z lac Y lac A

ADN

Pi lac I lac P lac O lac Z lac Y lac A

Represor monomérico

Represor tetraméricoactivo

ARN

pol pol

Represorinactivo

Inductor

β-Galactosidasa Permeasa Trans- acetilasa

A

B


La interacción del complejo CAP-cAMP con el promotor, produce la transcripción; esto es llevado a cabo porque el sitio para la RNA polimerasa queda accesible a la unión con la enzima. Si la glucosa, una fuente más efectiva de carbono, está presente en el medio, no hay necesidad del metabolismo de la lactosa. Bajo estas condiciones, se evita la represión por catabolito, pues los niveles de cAMP decrecen (63).

1.3.10. Identificación de clonos recombinantesLa distinción entre fagos no recombinantes y fagos recombinantes en el sistema

lambda gt-11, reside en la formación de placas azules y placas incoloras. Cuando los fagos no recombinantes son cosechados en hospederos Lac- en presencia del sustrato cromogénico 5Br,4Cl,3Indolil-β−D-Galactósido, (X-gal), se producen placas azules. La razón es que se induce por control negativo la expresión de una β−galactosidasa activa que hidroliza el sustrato X-gal y libera un compuesto cromogénico insoluble (índigo). Por el contrario, si el fago porta un ADN recombinado se induce la expresión de proteínas fusionadas a la β−galactosidasa. En esta situación quimérica, la enzima no forma un tetrámero activo y por ende es incapaz de hidrolizar el X-gal, produciendo placas incoloras en el medio.

El sistema de inducción del operón Lac está gobernado desde un plásmido (pMC9), el cual porta el promotor I para expresar el gen regulador I. Por complementariedad genética del producto difusible (el represor) se une a los operadores Lac el ADN de E. coli y al promotor Lac Z del fago lambda gt-11. La presencia del inductor IPTG dispara la expresión de los operones. Este plásmido a la vez confiere resistencia a su hospedero contra los antibióticos ampicilina y tetraciclina (16, 51). Fig.16.

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Lac Z lacZ

A. Represión

Lambda-gt-11E. coli Y1090 lacZ

Represor activo

Transcripción


Fig. 16. Identificación de recombinantes en el sistema lambda gt-11

38

lacZlacYlacA

B. Inducción con fago no recombinado

C. Inducción con fago recombinado

PMC9

IPTG (Inductor)

Repressor inactivo

β-galactosidasa

Permeasa

Transacetilasa

X-Gal

Color azul (X-Galhidrolizado)

β-Galactosidasa


1.3.11. Sistema genético del plásmido Bluescript

Fig. 17.

1.3.12. Sistema genético del plásmido pMal

Fig. 18.

1.4. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)La PCR es una herramienta desarrollada por el bioquímico Kary Mullis en 1986 con

el objeto de amplificar de manera específica un fragmento de ADN. Esta técnica se fundamenta en el principio de la replicación permitiendo la generación de fragmentos generalmente menores de 1500 pb mediante el uso de dos iniciadores de secuencia específica y una ADN polimerasa.

Para montar una PCR necesitamos básicamente de 7 cosas: 1) el ADN blanco a amplificar; 2) una ADN polimerasa termoestable (o Taq polimerasa); 3) los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dGTP y dCTP); 4) dos iniciadores secuencia específica por lo

39


general entre 18 y 25 nucleótidos de longitud; 5) una solución tampón apropiada con Mg+2; 6) agua estéril y 7) un baño María sofisticado o termociclador. En modelos antiguos de termocicladores se requiere usar aceite mineral sobre toda esta mezcla de reacción para evitar la evaporación.

La amplificación del ADN se logra tras 25 a 45 ciclos de replicación obteniéndose así 2(n-2) copias del fragmento amplificado siendo n el número de ciclos necesarios. Un ciclo de amplificación esta dado por tres fases sucesivas de reacción hechas por lo general a diferentes temperaturas. La primera fase de cada ciclo es la denaturación del ADN en la cual las bandas de ADN son separadas generando ADN de banda simple (ADNbs), esto se hace a más de 92oC generalmente con un minuto de duración. La siguiente fase es el “anneling” o hibridización de iniciadores al ADN. Aquí es importante conocer la temperatura de fusión o Tm de los iniciadores, la cual generalmente se da por debajo de 65oC. La tercera fase es la polimerización o extensión de los iniciadores, donde la ADN polimerasa sintetiza las cadenas de ADN nacientes en la dirección 5´--> 3´ a partir de los extremos 3´OH de los iniciadores. Esta se lleva a cabo a 72oC por uno a dos minutos. Cumplido el primer ciclo, estas 3 fases se repiten n veces a fin de completar el número de ciclos de amplificación programados en el termociclador. Flanqueando estos n ciclos el ADN debe ser previamente denaturado (Di) por 5 minutos a fin de abrir todo el ADN blanco y finalmente debe extenderse a 72oC por 7 a 10 min para sellar todos los fragmentos amplificados (Ef). Para terminar debe también programarse una fase a 4oC para almacenar en refrigerador los productos amplificados para su posterior detección por electroforesis.

Temp.(oC)

95 A72 C B 65

4

Tiempo (min)

Di ciclo 1 ciclo 2 ciclo n-1 ciclo n Ef

Fig. 19. Variaciones de la temperatura a lo largo de una PCR estándar de n ciclos de amplificación. Cada fase del ciclo tiene una duración de un minuto. A) denaturación. B) “anneling” y C) extensión.

Por ejemplo, a partir de una sola molécula de ADN blanco y durante 30 ciclos de amplificación se producirán 2(n-2) fragmentos de ADN., es decir, 2.68 X 108 moléculas de ADN. (Fig. 19)

Dado este potencial de amplificar específicamente el ADN, la tecnología de la PCR se ha convertido en una poderosa herramienta en biología molecular con una gama de aplicaciones cada vez más numerosas. Entre algunas tenemos: 1) la amplificación especie específica de productos mediante iniciadores diseñados apropiadamente permite detectar genes y sus polimorfismos en una variedad de especies. 2) La PCR permite el clonaje de productos de amplificación a partir de fuentes que contienen ADNc, ADN genómico, YAC, fagos, cósmidos y plásmidos. 3) La amplificación de ADN flanqueante desconocido mediante iniciadores simples y específicos. 4) La PCR también es útil para

40


la producción de sondas de ADN isotópicas y no isotópicas. 5) Para el rastreo directo de genotecas lambda y cósmidos. 6) Con la PCR podemos generar múltiples mutaciones dirigidas simples in vitro. 7) Hacer mutagénesis múltiple. 8) Dirigir el secuenciamiento de ADN automatizado de productos de PCR de banda simple o banda doble. 9) También es posible la distinción entre secuencias de ADN casi idénticas y la detección de mutaciones. 10) La generación de polimorfismos en fragmentos amplificados, entre otras múltiples aplicaciones. Para una revisión detallada y extensa de aplicaciones, recomendamos el libro PCR Technology: current innovations. En el capítulo 7 haremos aplicación de la PCR para la identificación de insertos recombinantes dentro de una genoteca.

Adicionalmente, existen varios tipos de PCR, entre estos: PCR simétrico para la amplificación estándar de fragmentos de ADN. PCR asimétrico para secuencia. PCR invertido para amplificar segmentos de ADN que flanquean una región de secuencia conocida. Útil para caminar por el gen. PCR anclado para extremos 5' o 3' desconocidos. Alteración de secuencias y mutagénesis para introducir mutaciones puntuales y PCR-RNA para amplificar ARNm, esta última es mejor conocida como RT-PCR.

Como en toda PCR el diseño de los primers es un factor crítico para la obtención de un producto específico. La mayoría de las reglas para el diseño de los iniciadores son empíricas. Sin embargo algunas consideraciones pueden seguirse a fin de reducir errores. La siguiente Tabla muestra algunos parámetros a observar.

Parámetro Valor óptimo

1. Secuencia única del oligonucleótido2. “Grapa” GC en el extremo 3´ 1-2 G/C nucleótidos3. Ninguna autocomplementaridad ≤ 3 bases contiguas4. Ninguna autocomplementaridad a la contraparte antisentido ≤ 3 bases contiguas5. Composición y distribución aleatoria de bases 45-55% del contenido de GC6. Longitud del cebador 18 - 25 pb7. Tm del cebador8. Distancia y composición de la secuencia intraprimers 100 - 600 bases aparte

Tabla 4. Reglas generales para el diseño de iniciadores para la PCR. Adaptado de PCR Technology, 1994.

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Capítulo 2 ____________________________________________Construcción de bibliotecas de ADN-Recombinante

Bibliotecas de ADN Recombinante

De modo general, posdemos decir, que las bibliotecas de ADN son colecciones de vectores recombinantes, que representan secuencias de ADN extrañas o insertadas. Cuando la biblioteca es cromosomal, la biblioteca genómica puede ser utilizada para clonar genes; cuando la biblioteca insertada es el ADNc producto de la transcripción reversa del ARN mensajero, la biblioteca de ADNc puede ser utilizada para clonar el ADN de ADNc. La figura 20 muestra en forma esquematizada, la construcción de una biblioteca de ADNc en el vector lambda gt10. La biblioteca de ADNc es una colección de fagos lambda recombinantes que contienen millones de copias de ARN mensajero.ç¡,11

En la figura 20 se puede observar como, mediante ADN transcriptasas, polimerasas o ligasas se construye un fragmento de ADN (el de interés) y se inserta en el fago a utilizar (parte A de la figura 20; una vez obtenido el fago se procede a infectar una colonia de E. coli en una caja de Petri. Cada infección producirá una placa característica en la caja de Petri (50 mil placas pueden caber en una caja de Petri de 150 mm). Una vez que las placas se han formado se coloca un filtro de nitrocelulosa en contacto con las colonias de la caja de Petri. El ADN transferido al filtro es desnaturalizado y fijado en el filtro mediante el uso de luz ultravioleta. De esta forma el filtro puede ser hibridizado con una sonda radiactiva de ADNc de interés y sometido a autorradiografia; una mancha en la autorradiografia permitirá identificar la placa de la caja de Petri que contiene el fago con el ADN de interés. El fago puede entonces ser extraído del agar de la caja de Petri y reinfectar a E. coli. La repetición de este proceso de separación de un fago recombinante, permite clonar el ADN del fago. Este proceso ha permitido desarrollar bibliotecas de ADN de diferentes tejidos

Los pasos seguidos en la construcción de una genoteca a partir de bacilos son: el aislamiento y purificación de ADN bacilar; la evaluación de su calidad; la construcción de una genoteca genómica del bacilo en un vector lambda; amplificación y evaluación de la calidad de la genoteca genómica; la síntesis química de oligonucleótidos sintéticos redundantes, mediante el método del fosfito-triester; la determinación de las mejores condiciones de hibridización de sondas redundantes mediante análisis dot-blot y la búsqueda de los clonos para las proteínas bacilares específicas, utilizando anticuerpos policlonales monoespecíficos como sondas.

42


El proceso general de la construcción de la genoteca puede verse en la Fig.20. El primer paso en el estudio de genes que codifican las proteínas de la bacteria fue el aislamiento y purificación del ADN.

2.1. Preparación del ADN genómicoSi deseamos construir una genoteca de un microorganismo bacteriano, cultivado in

vitro, por ejemplo de una mycobacteria, el ADN puede aislarse a partir de un gramo de bacilo (peso húmedo), según se describe en el Diagrama 1. Cada tipo bacteriano tendrá sus requerimientos enzimáticos y solubles para su rompimiento.

La primera fase de rompimiento de la pared celular se hizo mediante tratamiento enzimático, según el método de Thole (64) el cual consiste en tratar las células con lisozima y un agente quelante, el etilen diamino tetracético (EDTA). La función de la lisozima es hidrolizar los enlaces glucosídicos B(1-->4) presentes en el péptido glucano de la pared microbacterial. Una vez escindida la pared celular, la célula se hincha, se rompe la membrana celular y se libera el contenido celular. La lisis se completa con la adición de un detergente, el dodecilsulfato de sodio (SDS) para solubilizar los lípidos de la pared, y la enzima proteinasa K que hidroliza los enlaces peptídicos de todo el sistema de entramado de la pared celular (53). Durante todo el proceso debe evitarse la excesiva agitación puesto que las moléculas de ADN son extremadamente susceptibles a fuerzas mecánicas (46, 32).

Aislado el ADN, se extraen los residuos proteicos con fenol saturado y/o una mezcla de fenol saturado y cloroformo. La mayor parte de las proteínas desnaturalizadas entran en la fase orgánica o precipitan en la interfase orgánica acuosa, y el ADN permanece en la fase acuosa. La remoción del RNA se hace por tratamiento de la muestra con RNasa libre de DNasa. Finalmente, el ADN es precipitado adicionando acetato de sodio y etanol al medio (40). Diagrama 2.

La evaluación de la concentración del ADN se efectúa midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro entre 200 y 300 nm de longitud de onda. Los ácidos nucleicos absorben luz UV a 260 nm (ver anexo para considerar pureza). Finalmente, la calidad del ADN se analiza por electroforesis.

43


DIAGRAMA No. 1

RUPTURA DE LOS BACILOS: tratamiento enzimático

Lavar 1 gramo de bacterias en buffer TE(TRIS 1mM EDTA 10mM) pH 8.0

resuspender en 15 ml de TE

Centrifugar a 2500 g/10 min

Precipitado(bacterias)

Sobrenadante (descartar)

Resuspender en TE

Adicionar lisozima (2 mg/ml)Agitar a 37ºC/2h

Adicionar proteinasa K250 mg/ml, 65ºC/1h y SDS 1%

Centrifugar (2500 rpm/10 min)

Sobrenadante Precipitado (descartar)

Hacer alicuotas de 400 µl

Guardar a 4ºC

44


DIAGRAMA No. 2

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN DEL M. tuberculosis

Tomar una alicuota de muestra resuspendida en TE (pH 8.0)y adicionar en proporción 1:1 cloroformo-fenol saturado

Centrifugar (2500 rpm/5 min)

Fase acuosa(ac. nucleico)

Interfase (descartar) Fase orgánica (descartar)

Extraer con éter 3 a 4 veces

Adicionar acetato de Na 3M 1/10 vol y 2.5 vol de

etanol frío

Precipitar a –20ºC(Toda la noche: T. N.)

Sobrenadante (descartar)

Precipitado: ácidos nucleicos Resuspender enTE

Agregar RNasa 1mg/ml. Incubar a 37ºC/1h

Retirar RNasa con extracción fenólica y éter

Reprecipitar con etanol puroResuspender ADN puro en TE pH 8.0

Guardar a 4ºC y leer absorbancias

45


2.2. Restricción, ligazón y empaquetamiento

Restricción: el ADN del bacilo ya purificado se hidroliza con la endonucleasa Eco RI (Tabla 1). La digestión se lleva a cabo en las condiciones recomendadas por el fabricante (58). Numeral 1.3.1.3 y Diagrama 3A.

La digestión del ADN se monitorea mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1%, la cual se basa en el hecho de que moléculas cargadas, como el ADN, son capaces de migrar cuando se colocan en un campo eléctrico (11). La electroforesis hecha en gel de agarosa se usa para resolver moléculas desde pocos cientos de pares de bases hasta aproximadamente 20.000 pb. La velocidad de migración de una muestra colocada en un gel de agarosa, está determinada por su peso molecular, la concentración de la agarosa, la conformación del ADN y la concentración del bromuro de etidio (40).

Ligazón: los fragmentos de ADN del bacilo obtenidos en el proceso anterior se ligan a los brazos del ADN vector de expresión lambda gt-11 (9), en presencia de la enzima T4 ligasa, en proporción 1:2 y 1:4 (40). La reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente, durante toda una noche; los reactivos utilizados en ella y sus volúmenes aparecen en el Diagrama 3B.

Empaquetamiento: una vez ligados los brazos del vector el fago lambda gt-11, con los insertos de ADN del bacilo, se efectúa el empaquetamiento, mediante autoensamblaje in vitro, según el método Thole (64), Diagrama 3C. Para el empaquetamiento se mezcla el ADN recombinado con un extracto de proteínas de la cabeza y uno de proteínas de la cola, en las concentraciones recomendadas por la casa distribuidora. Estos extractos de empaquetamiento vienen ya listos para ser usados, y son preparados a partir de células de E. coli mutadas, que contienen el fago lambda lisogenizado y mutado (40, 43).

DIAGRAMA No. 3

RESTRICCIÓN LIGAZÓN Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADNMycobacterium tuberculosis

A. RESTRICCIÓN

Agregar 1U.E./ml de Eco RI a l mg de ADN de M. tuberculosis

Incubar a 37ºC/1h

Electroforesis en gel de agarosa al 1%

Retirar la enzima con extracciónFenólica y éter

B. LIGAZÓN

46


Tratamientos (µl)

Muestras

Agua Tampón de ligazón

10X

ATP10mM

Brazos ADNTBC

T4 ADNLigasa

Inserto

CONTROL 5.5 0.5 1.0 1.0 -- 1.0 1.0ENSAYO (1:4) 3.6 1.0 1.0 1.0 2.5 1.0 --ENSAYO (1:2) 3.6 1.0 1.0 1.0 2.5 1.0 --Nota: Concentración de ADN de TBC: 0.2 mg/ml. Concentración de brazos del vector: 1µg/ml

A. EMPAQUETAMIENTO

Adicionar al extracto de cabezas el ADN ligado

Adicionar el extracto de colas y dejar en reposo por 2h

2.3. Cultivo e infección del hospedero y plateo de la genotecaSe utiliza como hospedero bacterias de E. coli cepas Y1088 y Y1090 (Promega

Biotec) (51), cuyos principales marcadores genéticos aparecen en las Tablas 4, 5 y 6 (74, 16). Los cultivos se realizan en condiciones de esterilidad, siguiendo el protocolo descrito en el Diagrama 4.

DIAGRAMA No. 4

CULTIVO DE LAS BACTERIAS HOSPEDERASE. coli Y1088, Y1090

Sembrar una colonia de bacterias en 100 ml de LB-agar-Amp (50mg/ml), MgSO4 1mM, maltosa 0.2%

Incubar a 37 ºC. T.N.Recuperar por centrifugación a 3000 rpm/10min

y resuspender 1/10 vol. MgSO4 10mM

Guardar a 4ºC

47


En la construcción de la genoteca, la infección se realiza adicionando 150 µl de solución de bacterias E. coli Y1090 (DO. = 0.6), de fagos obtenidos en la reacción de empaquetamiento; se deja en reposo 15 a 20 minutos, tiempo en el que los virus se adsorben a la pared celular de las bacterias. A la mezcla de fagos y de bacterias se añaden 50 µl del sustrato cromogénico X-gal y 20 µl del inductor IPTG, en 3 ml del medio Top-agarosa al 0.7%. La mezcla anterior se siembra en 20 cajas de petri de Lβ−agar-Ampicilina 50 µg/ml, con un control de bacterias E. coli Y1090. A partir de las placas de lisis formadas se halla el porcentaje de recombinantes, y se determina el número de unidades formadoras de placa por ml (ufp/ml), utilizando la siguiente ecuación:

ufp/ml = Número de placas de lisis X dilución X 1/vol sembrado.(40)

Consultar anexo para detalles adicionales. Para cosechar los fagos, cuyo conjunto debe contener el genoma del bacilo, se añaden a cada caja 5 ml del tampón TMG (Tris-Magnesio-Gelatina), se deja en reposo por cinco horas y se recolectan adicionando 100 µl de cloroformo puro por ml. con el fin de evitar la presencia de contaminantes. El Diagrama 5 presenta el protocolo descrito.

DIAGRAMA No. 5

INFECCIÓN DEL HOSPEDERO E. coli Y1090Y COSECHA DE LOS FAGOS RECOMBINADOS

Cultivar E. coli Y1090 en LB-ampicilina

Mezclar las bacterias, los fagos, el X-gal, el IPTGy el “top” agarosa

Sembrar en cajas con LB-agar-Amp la mezcla anterior e incubara 37ºC T.N.

Hallar porcentaje de recombinantes y ufp/ml

Resuspender los fagos en TMG + cloroformo

Guardar a 4ºC

48


La probabilidad de tener una secuencia de interés representada en la genoteca se determina aplicando la siguiente fórmula:

N = 1n(1-p)/1n(1-f)

Donde p es la probabilidad, f es la proporción fraccional de ADN de interés en un simple recombinante, y N es el número necesario de recombinantes para encontrar el inserto (40, 16). Ver el anexo para una aplicación práctica del uso de N.

2.4. Amplificación y titulación y almacenamiento de la biblioteca genómicaPara amplificar la genoteca, es decir, aumentar el número de fagos recombinantes, se

cultiva la cepa E. coli Y1088, Diagrama 4. Se infectan 150 µl de bacterias con 5, 10 y 50 µl de solución de fagos recombinados de la genoteca original, en 6 cajas de Lβ−agar-Ampicilina, para determinar la concentración a la cual hay confluencia de placas de lisis. Luego se siembran en 20 cajas de Lβ−agar-Ampicilina, utilizando 10 µl de la solución de fagos recombinados, siguiendo el procedimiento del Diagrama 5. Una vez formadas las placas de lisis se cosechan los fagos en TMG y cloroformo. Para titular la genoteca, es decir, determinar la concentración óptima de fagos que producen un número adecuado de placas de lisis en cada caja, se toman 10 µl de fagos y se hace una dilución 10-2 en TMG, a partir de la cual se hacen diluciones seriadas. Cada dilución se siembra en una caja de Lβ−agar-Ampicilina, se incuba 12 horas a 37ºC y se calcula las ufp/ml. Diagrama 6.

DIAGRAMA No. 6

AMPLIFICACIÓN Y TITULACIÓN DE LA GENOTECA

Cultivar el hospedero E. coli Y1088

Infectar 150 ml de bacterias con 10 ml de fagos.Sembrar 20 cajas de LB-Agar-Amp

Recolectar los fagos en TMG + cloroformo

Tomar 990 µl de TMG y añadir 10µl de fagos (dilución 10-2)

A partir de la dilución 10-2 hacer diluciones de 10-4, 10-6, 10-8, 10-10 en TMG

Sembrar cada dilución en un plato de LB-agar-Amp e incubar a 37ºC T.N.

Contar las placas de lisis y determinar ufp/ml.

49


Es de anotar que si el objetivo de la construcción de la genoteca es buscar un gen específico, no es aconsejable amplificar la genoteca, ya que en el proceso de amplificación pueden perderse algunos insertos; no obstante, la amplificación en el hospedero Y1088 reduce estos problemas puesto que su sistema Rec está mutado. Las genotecas amplificadas pueden mantener un alto título por varios años, como fuente para la búsqueda de genes (43, 53).

50


Capítulo 3________________________________Síntesis de sondas de oligonucleótidos

A partir de las secuencias de aminoácidos, correspondientes a la parte aminoterminal de las proteínas MTP-14K y MTP-40K, se proponen secuencias de oligodeoxinucleótidos del tipo redundante, con preferencia en la tercera posición por CG (dado el codón preferencia del organismo), las cuelas son utilizadas para buscar la secuencia de interés dentro de la genoteca, Numeral 1.3.2.1.1. La síntesis automática se realiza en un sintetizador de oligos. Para la síntesis se emplea el método químico en fase sólida de fosfito-triester, según Itakura y Khorana (26).

Las siguientes son algunos ejemplos de secuencias de oligonucleótidos sintetizadas en el laboratorio:

Sonda MTP-14K:NH2-Ala-Lys-Val-Asn-Ile-Lys-Pro-...3’ –CGG-TTC-CAG-TTG-TAG-TTC-GG. C CNúmero de bases GC: 13 (55% de la secuencia).Número de bases AT: 10 (45% de la secuencia).Redundancia: 4.Longitud: 20 mer.

Sonda MTP-40K:NH2-Pro-Trp-Ile-Leu-Lys-Gly-Lys-Ala-Lys-...3’ –GGC-ACC-TAG-GAG-TTC-CCG-TTC-GCT-T. G C CNúmero de bases GC: 15 (65%).Número de bases AT: 10 (35%).Redundancia: 8.Longitud: 25 mer.

Durante la síntesis automática de sondas, cada acople de un nucleótido implica la ejecución de un ciclo que envuelve los pasos de desbloqueo, acople, bloqueo de nucleótidos no elongados y oxidación (47). Fig. 21. Diagrama 7. Este proceso se repite hasta que las secuencias totales requeridas sean sintetizadas.

51


Fig. 21. CICLO DE ACOPLE DE UN NUCLEOTIDO EN UNA SINTESIS AUTOMATICA DE UNA SONDA

52

xB1- DMTr

S

Desbloqueo

Acople

Oxidación

Bloqueo

S

xB1- Ac20

Ciclo pornucleótido

S

xB1 xB2 xB3 xB4 xB5 xB6 xB7 xB8 xB9 - DMTr

Convenciones: Bn nucleótido x grupo que protege la base grupo que protege el fosfato soporte con espaciador

-DMTr, grupo DMTr - Ac20, grupo acetato

S


DIAGRAMA No. 7

SÍNTESIS AUTOMÁTICA DE LAS SONDAS

Adicionar 1ml de ADC, 2%/1min DESBLOQUEO

Lavar con 1ml CH2C12 + 1ml Anhídrido acético LAVADO

Adicionar 200µl de nucleótido y 200µl tetrazol/10minACOPLE

Lavar con 1ml de acetonitrilo LAVADO

Adicionar 1ml de CAP/2min BLOQUEO

Lavar con 1ml de acetonitrilo LAVADO

Adicionar 1ml de Yodo/1min OXIDACIÓN

Lavar con anhídrido acético 4-6 veces LAVADO

DESBLOQUEO Y DESANCLAJE DE LA SONDA

3.1. Evaluación de la eficiencia de acople

Durante la síntesis, y una vez finalizada ésta, se evalúa la eficiencia de acople, mediante un método indirecto, por el cual se determina la cantidad del catión 4,4’-dimetoxitritil que se libera durante el tratamiento con ADC en cada ciclo.

La cantidad de catión DMTr liberado durante la detritilación es directamente proporcional al área bajo la curva dada por la unidad de control del aparato, después de cada detritilación. El aparato monitorea la absorbancia de la solución anaranjada de detritilación a una longitud de onda de 436 nm (19).

Las eficiencias de acople se estiman por comparación de las áreas bajo la curva de la detritilación de los mismos nucleótidos y no de diferentes nucleótidos, debido a que las formas de las curvas (estrechas o amplias) difieren entre A, T, G y C. Las pendientes de estas líneas se comparan con las pendientes de cuatro líneas patrón, cada una de las cuales corresponde a una base con su porcentaje de eficiencia. Otra manera de hacer el cálculo es aplicando las siguientes fórmulas:

53


Eficiencia de ensamble = 10-log Eficiencia de acople = 10-log/n pasos = 10pendiente (19).

3.2. Tratamiento post-síntesisCada sonda sintetizada se desancla del soporte, luego se purifica primero por

electroforesis en gel de poliacrilamida, y luego por cromatografía en fase reversa; después de esto se concentra, resuspende y finalmente se evalúa su concentración. El proceso general puede verse en la Fig.22.

3.3. Desanclaje y desprotecciónPuesto que el oligonucleótido sintetizado queda unido al soporte sólido mediante un

puente succinato al grupo 3’OH del primer nucleósido, éste debe romperse para liberar la sonda mediante una hidrólisis con amoníaco concentrado. Simultáneamente, en esta reacción se remueven los grupos amido de los grupos amino de las bases que pueden reaccionar, y los grupos protectores del fósforo (β−cianoetil) (19, 47). El protocolo a seguir en esta etapa se describe en el Diagrama 8.

DIAGRAMA No. 8

TRATAMIENTO POST-SÍNTESIS DE LAS SONDAS,DESANCLAJE Y DESPROTECCIÓN

Colocar la columna en un ependorff y centrifugar a 2000 rpm/1min

lavar columna con 400µl amoniaco conc. a 2000 rpm/1min

Llevar la columna a 65ºC/16h

Centrifugar a 2000 rpm/1minTomar sobrenadante (amoniaco + sonda)

Agregar 400ml amoniaco a la columna.Centrifugar a 2000 rpm/1min

Concentrar la sonda y resuspenderla en 50 µl formamida

Diluir la sonda 1:1000 con TRIS 50mM

Medir concentración (260nm)

54


3.4. Aislamiento de la sonda mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Se usa un gel de poliacrilamida para separar las sondas, con la siguiente composición: acrilamida (30%), bisacrilamida (0.8%), urea (12.6 gr), TBE 1X, persulfato de amonio (0.3%) y TEMED (15 µl), para un volumen final de 30 ml.

Se siembran las sondas MTP-14K y MTP-40K (D.0. = 5.0), con un volumen igual a 3 DO/cm de longitud del diente de siembra, es decir, 5.0 µl de sonda MTP-40K. Luego se corre a 200 voltios durante cuatro horas.

Para visualizar las bandas de las secuencias, colocar el gel sobre una lámina delgada de cromatografía de sílica impregnada con fluoresceína y aplicar luz UV; las bandas aparecen como sombras oscuras contra el fondo fluorescente de la lámina; estas áreas se aíslan cortando el gel y se dividen en pequeños trozos, los cuales se eluyen en tampón TE (pH 8.0) y se incuban toda la noche en agitación continua. Las sondas se recuperan con centrifugaciones a 3,000 rpm/10 min. Se mide la concentración y luego se someter a purificación mediante cromatografía en fase reversa (46). Diagrama 9.

55


Fig. 22. TRATAMIENTO POST-SINTESIS DE LA SONDA

56

B BB B BB

S DMTr

Desbloqueo DCA

B BB B BB

S

DMTr

Desanclaje y desprotección con NH4OH

B BB B BB

S

Aislamiento por PAGE

Purificación por cromatografía

Evaluación de concentración


DIAGRAMA No. 9

TRATAMIENTO POST-SÍNTESIS DE PURIFICACIÓN DE LAS SONDAS

Sembrar la sonda en gel de policrilamida

Correr electroforesis a 200 v/2h

Aislamiento por PAGE

Retirar la sonda del gelResuspender en TE (pH 8.0)

Leer absorbancia a 260nm

Lavar columna de SEP-PAK con acetonitrilo. Activarla con metanol puro y agua

Filtrar la mezcla de sonda y Pasarla por la columna

Cromatografía en Fase reversa

Recoger tres fraccionescon metanol 60%

Concentrar y resuspender en TE (pH 8.0)Medir concentración

3.5. Purificación por cromatografía de fase reversaLa purificación de los ONS se efectúa haciendo pasar la mezcla resultado del

proceso anterior a través de una columna de SEP-PAK, la cual es un pequeño cilindro que contiene una sílica gel C18 Fig. 22 (11). Cuando el oligonucleótido sintético, el cual se encuentra en una mezcla electrolítica acuosa, pasa a través de la columna, el oligonucleótido es retenido mientras las sales acuosas pasan a través de ella (32). Cuando se usan solventes polares, los componentes menos polares de la mezcla se retienen por absorción sobre la matriz de la columna mientras que los componentes más polares son eluídos (42). El Diagrama 9 muestra el protocolo seguido en esta fase.

3.6. Radiomarcaje enzimático, medición de la radiactividad y determinación de la actividad específica de las sondas

57


Radiomarcaje enzimático: una vez purificadas las sondas, estas son marcadas utilizando [γ32P] ATP y la enzima T4 polinucleótido kinasa (T4-PNK), que cataliza la transferencia del fósforo 32P del ATP al grupo 5’OH del ADN o RNA. La reacción general es:T4-PNK ADN 5’OH ---------------------------> ADN 5’- 32P + ADP [32P] ATP, Mg++

DTTPor ejemplo:... pC-pG-pC-5’OH + App32p ----------->... pC-pG-pC-32p + App + pi (40).

Para la reacción de radiomarcaje se toman 100 ng de sonda por cada 200 µCi de ATP 32, los cuales se agregan a 7 µl de tampón kinasa, 2 µl de la enzima T4 kinasa, 10X y 40 µl de agua. La reacción se lleva a cabo durante una hora a 37ºC.

Medición de la radiactividad de las sondas: la radiactividad de las sondas se determina con un contador de centelleo líquido (por ejemplo: un Bekman modelo LS 7000), el cual mide el número de partículas Beta detectadas por minuto (cpm) (11). Esta medición se determina por diferencia entre las cpm obtenidas a partir de una muestra de la sonda y las cpm obtenidas después de precipitarla con ácido tricloroacético (TCA) (40). El protocolo puede verse en el Diagrama 10.

DIAGRAMA No. 10

RADIOMARCAJE Y MEDICIÓN DE LA RADIACTIVIDAD DE LAS SONDAS

Adicionar sonda, tampón Kinasa,T4 Kinasa 10X, ATP32 y agua

Incubar a 37ºC/1h

Diluir sonda marcada en agua 1:1000

Tomar 20ml sonda diluida + 3ml biofluor

Tomar 20ml sonda diluida + 3ml TCAPrecipitar en papel de nitrocelulosa

Medir cpm en contador de centelleo

Concentrar la sonda; resuspender en TE (pH 8.0)

Medir concentración 260nm

58


Determinación de la actividad específica de las sondas: la actividad específica de las sondas, definida como la cantidad de radiactividad por mol de compuesto.

59


Capítulo 4 ____________________________________Calidad de la genoteca e identificación del

fragmento de ADN-Recombinante

Para evaluar la calidad de la genoteca genómica se aísla el ADN clonado del vector y se trata con varias enzimas de restricción, según el método de Stephen L. (60). El ADN ahora digerido se analiza en un gel de agarosa, se denatura y se transfiere a papel de nitrocelulosa con el fin de hibridizarlo con las sondas de ONS, previamente radiomarcadas; finalmente, la identificación de fragmentos complementarios con las sondas se hace con la técnica de autorradiografía (40). Fig.23.

4.1. Extracción del ADN clonado del fagoLa extracción del ADN clonado de los fagos recombinantes se efectúa mediante un

lisado a gran escala de E. coli cepa Y1090. Este método consiste en hacer un cultivo de las bacterias hospedero, infectarlas con los fagos de la genoteca, y una vez multiplicado el número de ellos, extraerlos mediante sedimentación por gradiente en cloruro de cesio; el ADN de los fagos se extrae por tratamiento con formamida. Diagrama 11.

DIAGRAMA No. 11

AISLAMIENTO DE FAGOS A PARTIR DE LA GENOTECA Y EXTRACCIÓN DEL ADN RECOMBINANTE

Cultivar E. coli Y1090 en 750ml de LB-amp. Infectar las células con fagos de la genoteca en proporción 100:1 (de células y fagos)

Agregar cloroformo v/v y NaCl 0.5M T.N./4ºC

Agregar PEG-6000. Incubar T.N./4ºC. Centrifugar a 5000 rpm/15 min.

Resuspender fagos en TMG Descartar sobrenadante

Hacer extracción cloroformo v/v

Hacer gradiente discontinuo de colchones de CsCl(densidad 1.3, 1.5, 1.7 g/ml)

Centrifugar a 35000 rpm/2.5h/4ºC (rotor SW51)

Extraer banda de fago y hacer gradiente continuo 1.5g/ml 12h/4ºC

60


Retirar la banda de fagos y agregar 1/10 de formamida 2h/T ambiente

Agregar 1 volumen de agua y 6 volúmenes de etanol.Sedimentar el ADN en microcentrífuga durante 2min.

Lavar el pellet con etanol al 70%

Resuspender el precipitado en TE pH 8.0.Guardar el ADN recombinado a 4ºC.

4.2. Restricción y electroforesisEl ADN recombinado se hidroliza con las enzimas de restricción Eco RI, Hind III y

Pst I, utilizando las condiciones de reacción observadas en la Tabla 1 (57). La digestión se monitorea por medio de una electroforesis en gel de agarosa. El ADN aparece separado a lo largo del gel de agarosa de acuerdo con su peso molecular, lo cual nos permite analizar el comportamiento del ADN de M. tuberculosis clonado frente a cada enzima y determinar si la genoteca está bien representada.

4.3. Transferencia del ADN digerido al papel de nitrocelulosa (“Southern blotting”)Para identificar el fragmento de interés en la genoteca se usa la técnica "Southern

blot", llamada así por Edward Southern, quien la desarrolló en 1975. La técnica consiste en desnaturalizar el ADN en el gel y transferirlo del gel a papel de nitrocelulosa, conservando las posiciones relativas de los fragmentos por acción de capilaridad (13, 59). El proceso se realiza sometiendo el gel a una solución desnaturalizante (NaOH 0.5M, NaCl 0.6M) una hora a temperatura ambiente; luego, el gel se pasa a una solución neutralizante (Tris 1M, NaCl 0.6M) una hora a temperatura ambiente; después se coloca sobre un vidrio revestido con papel absorbente humedecido con solución salina de citrato SSC 20X; el conjunto se coloca sobre una cubeta con SSC 20X (2). Sobre el gel se coloca un papel de nitrocelulosa, papel absorbente y peso; la transferencia dura entre 16 a 24 horas, después de la cual se fija el ADN al filtro con incubación a 80ºC, dos horas al vacío. Diagrama 12.

61


Fig. 23. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LA LIBRERIA

62

SondaRadiomarcada

Bacterias Librería

Lisado de la librería

Gradiente en CsCl

Fagos recambiantes deLa librería

Extracción de ADN Y restricción

Análisis por electroforesisY desnaturalización del DNA

Transferencia de ADN a papel N.C. “tipo southern”

Fijación del DNA al papel de N.C.

Hibridización

Lavados y autorradiografia


DIAGRAMA No. 12

RESTRICCIÓN DEL ADN RECOMBINADO Y TRANSFERENCIA “tipo Southern”

Digerir el ADN recombinado con Eco RI, Hind III, Bam HI y Pst I

Separar fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa

Desnaturalizar el ADN (0.5M, NaCl 0.6M) T. A./1h

Neutralizar el ADN (TRIS 1M, NaCl 0.6M) T. A./1h

Hacer el montaje del gel para transferencia “tipo Southern”

Transferir/24h. Dejar el filtro de nitrocelulosa a 80ºC/2h

Colocar el filtro en solución prehibridizadora 42ºC/1h

Colocar el filtro en solución hibridizadora en un rango de temperatura de 42 a 65ºC/12 a 16h

Lavar en las condiciones descritas

Hacer montaje de autorradiografía.Colocar película en casete a –20ºC/4-48h

4.4. Hibridización “Southern” y “dot blotting”El filtro de nitrocelulosa con el ADN monocatenario fijo a él, se expone al

oligonucleótido sintético radiomarcado en solución.En esta etapa los fragmentos del ADN de interés, complementarios con el

oligonucleótido sintético colisionan y se aparean formando un fragmento bicatenario híbrido. Numeral 1.3.2.1.2. Para llevar a cabo la hibridización, el filtro se coloca en una solución prehibridizadora (SSC 6X, pirofosfato de sodio 0.05%, solución Denhart's 5X, solución ADN esperma de salmón 0.1%, y SDS 5%) a 42ºC durante una hora. Después, se lleva el filtro a solución hibridizadora (SSC 6X, pirofosfato de sodio 0.05%, solución Denhart's 10X, y una concentración de 2 ng de sonda/ml de solución hibridizadora); se ensayan condiciones de temperatura y duración de hibridización, tomando primero una temperatura de 42ºC y 12 horas de duración de reacción; luego se toma un rango de temperatura entre 42 y 65ºC durante 12 a 16 horas (45), Diagrama 12. Para remover la sonda unida inespecíficamente y otros artefactos, se somete el filtro a lavados cuyas condiciones serán ensayadas variando temperatura y astringencia; para determinar las

63


mejores condiciones de lavado se observa el efecto de las concentraciones de la SSC y la temperatura haciendo cinco lavados de mayor a menor astringencia (disminuyendo la concentración de sal) durante 15 minutos cada uno y al 0.1% de SDS. Las concentraciones de la solución SSC y las temperaturas ensayadas pueden variar dependiendo del Tm de la sonda utilizada.:SSC 2X a 15ºCSSC 1X a 15ºCSSC 1X a 37ºCSSC 1X a 37ºCSSC 0.5X a (Tm - 5ºC)

Para el “dot blot” se siembran “gotas” de los ADN a diferentes concentraciones directamente sobre papel de nitrocelulosa, y se efectúa el tratamiento de prehibridización e hibridización con las sondas radiomarcadas, siguiendo la misma metodología citada en el numeral anterior. Se hacen dos tipos de tratamiento: en uno se toma 2.0 µg, 1.0 µg y 0.5 µg de ADN de los plásmidos pUC-18, pGEM3 y pBR322; y las mismas concentraciones para ADN de lambda gt-11, genómico y de ADN control. En el otro tratamiento se toma ADN genómico del bacilo usando las siguientes concentraciones en µgs: 3.0, 1.5, 0.7, 0.3, 0.1 y 0.07.

4.5. AutorradiografíaFinalmente, para detectar las señales positivas de los fragmentos complementarios

con las sondas de ONS, se hace la autorradiografía, la cual se basa en que una emisión radiactiva es detectada por una molécula sensible, dando una señal de plata precipitada. Para este procedimiento se sigue el método de Maniatis (40) y se usan tiempos de exposición entre 4 y 48 horas según el caso.

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Capítulo 5 _______________________________________Rastreo de clonos de proteínas recombinantes

mediante el uso de sueros policlonales

Con el objeto de encontrar el clon de interés es necesario contar con un suero rico en sondas de anticuerpos policlonales dirigidas contra la proteína de interés. Estos sueros son producidos en conejos previo aislamiento de la proteína mediante métodos electroforéticos o cromatográficos. Una vez construida la genoteca en un vector de expresión, la proteína o antígeno de interés debe ser inducida en la genoteca genómica o de ADNc para luego efectuar la selección con los sueros de conejo Anti proteína X kDa, preparados en conejos. Numeral 1.3.2.2 y Fig. 24.

5.1. Antisuero policlonal y adsorción con extracto de E. coliLos anticuerpos policlonales se han utilizado para aislar genes usando genotecas con

ADNc o ADN genómico de organismos con genomas que van en complejidad desde bacterias a mamíferos. Los anticuerpos policlonales pueden tener una ventaja sobre los anticuerpos monoclonales cuando son usados como sondas, debido a que la población multiclonal es raramente restringida al reconocimiento de una simple epítope (72). Como es de esperar, altos títulos de anticuerpos producen mejores señales que bajos títulos de anticuerpos. Es razonable asumir que anticuerpos que producen buenas señales en una transferencia tipo “Western” (o Western blot) producirán buenas señales en los procedimientos de búsqueda de genes en lambda gt-11. Los anticuerpos policlonales contienen a menudo componentes los cuales se unen a antígenos producidos por E. coli. A fin de evitar el alto ruido de fondo (o background) de señales inespecíficas producidas por la actividad de unión, deben absorberse los sueros para remover los anticuerpos inespecíficos. Esto se lleva a cabo incubando el suero con extractos o roncados de E. coli; así, los anticuerpos anti-E. coli son removidos (16).

Se cultiva el hospedero E. coli Y1090 en 100 ml de Lβ−ampicilina, bajo las condiciones consideradas anteriormente (ver Diagrama 13). Las células crecidas (OD. 0.6) se llevan a 10 litros de Lβ−ampicilina y se crecen toda la noche; se recuperan por centrifugación a 5000 rpm durante 40 min.

El precipitado de células obtenidas del cultivo se resuspende en 100 ml de agua; la mezcla se hierve según las condiciones que se muestran en el Diagrama 12. La solución de extracto de proteínas de E. coli obtenida se alicuota en volúmenes de 2 ml y se guardó a –20ºC. A cada uno de los sueros de conejo Anti-MTP 14K. Anti-MTP 34k, Anti-MTP 40K y Anti-MTP 178K se adiciona una solución concentrada de proteínas de E. coli, con el fin de remover anticuerpos específicos Anti-E. coli. Diagrama 13.

Fig. 24.

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DIAGRAMA No. 12

RESTRICCIÓN DEL ADN RECOMBINADO Y TRANSFERENCIA “tipo Southern”

Digerir el ADN recombinado con Eco RI, Hind III, Bam HI y Pst I

Separar fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa

Desnaturalizar el ADN (0.5M, NaCl 0.6M) T. A./1h

Neutralizar el ADN (TRIS 1M, NaCl 0.6M) T. A./1h

Hacer el montaje del gel para transferencia “tipo Southern”

Transferir/24h. Dejar el filtro de nitrocelulosa a 80ºC/2h

Colocar el filtro en solución prehibridizadora 42ºC/1h

Colocar el filtro en solución hibridizadora en un rango de temperatura de 42 a 65ºC/12 a 16h

Lavar en las condiciones descritas

Hacer montaje de autorradiografía.Colocar película en casete a –20ºC/4-48h

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DIAGRAMA No. 13

RASTREO DEL CLON DENTRO DE LA GENOTECA CON ANTICUERPOS POLICLONALES. ADSORCIÓN DE SUEROS ANTI-Mycobacterium sp.

Cultivar el hospedero E. coli Y1090 en 100 ml de LB amp. 50 mg/ml. Maltosa 0.2% y MgSO4 1mM. 37ºC T.N.

Agregar células crecidas a 10 L de LB. Cultivar a 37ºC T. N. y cosechar células con centrifugación a 5000 rpm/40 min.

Resuspender el pellet en 100 ml de agua. Hervir /30 min.Alicuotar en volúmenes de 2 ml. Guardar a –20ºC.

Tomar cada alicuota de proteínas de E. coli + 2 ml suero anti-MTP (dilución 1:50) + 98 mL buffer BSA

(TRIS-HC1 50mM. pH 7.5, NaCl 150 mM + BSA 3% p/v)

Exponer suero + 2 ml de proteína E. coli 1h/4ºC

Centrifugar 5000 rpm/20 min.

Sobrenadante Pelletdescartar

Llevar el suero a 4ºC

5.2. Inducción de antígenosLa producción de antígenos de los fagos recombinantes se induce mediante la acción

del Isopropil β−D tiogalactopiranósido (IPTG), para lo cual se infecta el hospedero E. coli Y1090 en placas de agar utilizando 500 placas de lisis por caja. Se incuban las placas a 42ºC con el fin de mantener inactivo el represor termosensible CI 857 del vector y acelerar la fase lítica. Numeral 2.4.2.

A las cuatro horas aproximadamente, cada placa de cultivo se cubre con un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido con IPTG y se incuba a 37ºC, con el fin de inducir la producción de los antígenos que nos interesan y activar el represor CI 857 para retardar la fase lítica, con lo que se prolonga la reproducción del antígeno que nos interesa. Diagrama 14. No obstante para la inducción de proteínas se recomienda subclonar el fragmento en un plásmido de expresión para inducir la síntesis de proteína (ver anexo).

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DIAGRAMA No. 14

RASTREO DEL CLON DENTRO DE LA GENOTECA CON ANTICUERPOS POLICLONALES. INDUCCIÓN DE EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS

Sembrar el hospedero E. coli Y1090 en 500 placas/caja de LB-agar-amp. aprox. Incubar a 42ºC/4h

Colocar sobre cada plato un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido con IPTG (10 mM). Incubar a 37ºC/5h

Retirar los filtros del plato, lavar (TBS-Tween 0.05%)/15 min.

Exponer cada filtro a solución bloqueadora: TBS-gelatina 1%(TBS: TRIS 20 mM, NaCl 0.57 M)

Exponer cada filtro a cada suero adsorbido 1h/4ºC.Lavar en cada paso con TBST 0.05%

Exponer cada filtro a IgG-fosfatasa alcalina de conejo (dil. 1:1000) 2h T. A.

Lavar con TBST 4 veces/15 min.

Exponer a solución reveladora pH 9.4/37ºC/5 min.

Detectar y aislar posibles clonos. Repetir el proceso, sometiendo cada clon a un suero por separado

5.3. Exposición de los antígenos del microorganismo a los antisuerosCada uno de los filtros se lava con TBST al 0.05% y se bloquea con gelatina para

evitar reacciones inespecíficas. Los filtros ya bloqueados se tratan con cada antisuero durante una horas para favorecer la reacción antígeno-anticuerpo. Posteriormente, los filtros se exponen al conjugado Anti-IgG fosfatasa alcalina en una dilución de 1:1000 en TBST al 0.05% durante una hora y a temperatura ambiente. Diagrama 14.

5.4. ReveladoFinalmente, los filtros se exponen a un buffer de revelado (Tris 0.02 M, NaCl 0.02

M, MgCl2 5 mM) pH de 9.4 y a 37ºC. Obtenidas las señales, se aislan las posibles positivas del plato de agar y se repite el ciclo, hasta encontrar el clon verdadero y puro. Diagrama 14.

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Capítulo 6 ___________________________________Expresión y purificación de las proteínas

recombinantes clonadas

6.1. Subclonaje en plásmidos pBlueScriptEl plásmido pBS es un vector de expresión, útil para transcripción, expresión y

secuenciación de fragmentos de ADN subclonados.

6.2. Escisión in vivo usando el sistema ExAssist/SOLREl sistema ExAssist/SOLR esta diseñado para permitir la escisión eficiente del

fagémido pBS SK(-) a partir del vector lambda ZAP II, evitando los problemas asociados con la co-infección del fago ayudador. El fago ayudador ExAssist contiene una mutación ámbar que impide la replicación del genoma del fago en una cepa E. coli no supresora tal como las células SOLR. Esto permite sólo la escisión del fagémido para replicarse en el hospedero, removiendo la posibilidad de coinfección del fago ayudador ExAssist. El fago ayudador ExAssist no puede replicarse en la cepa SOLR y no es recomendado para el procedimiento de recuperación de banda simple. Diagrama 15.

DIAGRAMA No. 15

A partir de una genoteca amplificada, pique una placa de interés.Transferir a 500 µl de tampón SM + 20 µl de cloroformo.

Vortex e incubar 1 - 2 h / T. A. o T. N./4ºC(Este stock de fagos es estable por un año a 4ºC)

Combinar en un tubo cónico de 50 ml:200 µl de células XL1-Blue MRF´a OD600 = 1.0

100 µl del stock de fagos (conteniendo > 105 partículas de fagos)1 µl de fago ayudador ExAssist (>1X106 pfu/ml)

Incubar esta mezcla a 37ºC/15min.

Adicionar 3 ml de medio 2X YT e incubar/2-2.5 h/37ºC/agitación

Calentar el tubo a 70ºC/20 min, luego agitarlo/15 min/4000 x g

Decantar el sobrenadante en un tubo estéril. Este stock contiene el plásmido empacado como una partícula de fago filamentosa

y puede ser almacenado/4ºC/1-2 meses.

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Sembrar el fagémido rescatado. Adicionar 200µl de células SORL (OD600 = 1.0) a dos tubos de 1.5 µl.

Adicionar 1.0 µl de stock de fagos del paso 5 sobre un tubo y 50µl del stock de fagos a otro tubo. Incubar los tubos a 37ºC/15min.

Sembrar 100 µl de cada tubo en platos de LB-amp (50µg/ml)e incubar a 37ºC T. N.

Las colonias aparecen sobre los platos que contienen el fagémido de doble banda pBS SK(-) con el inserto de ADN clonado. Las bacterias infectadas con fago ayudador sólo no crecerán por causa de que estos no contienen genes de resistencia a ampicilina.

6.3. Expresión y purificación de proteínas recombinantes en el vector pMal Los fragmentos clonados en pBS pueden ser escindidos con enzimas de restricción y

religados en el plásmido pMAL-c2. Las células transformadas de E. coli con los fagémidos transformados son incubadas con IPTG para expresar proteínas de fusión conteniendo los antígeno del organismo clonado fusionado a un péptido de 4kDa a partir del N-terminal del fragmento α de la β−galactosidasa.

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Anexo__________________________________________Información útil para el manejo de los protocolos

- Algunas propiedades útiles de los ácidos nucleicos

• Peso molecular de un oligonucleótido((A X 312.2) + (G X 328.2) + (T X 302.2) + (C X 288.2))

• Factores de conversión 1 densidad óptica (OD) a 260 nm = 50 µg de ADN genómico 1 OD a 260 nm = 40 µg de RNA 1 OD a 260 nm = 30 µg de oligonucleótido 1 nmol de oligonucleótido = OD a 2 60 nm X 90 longitud del oligonucleótido

• Condiciones de almacenamiento para oligonucleótidos: Liofilizados a -20oC: seis meses a varios años. Liofilizados a +25oC: dos meses a un año. Disueltos en agua a -20oC: un mes a seis meses. Disueltos en agua a +20oC: una semana a tres meses.

• Condiciones de almacenamiento para el gADN: Disuelto en alicuotas con TE 1X a -20oC: varios años.

• Características de la movilidad del ADN durante la electroforesis en el gel de agarosa

Agarosa Rango de separación Xilencianol Azul de bromofenol% p/v (pb) (pb) (pb)______________________________________________________________________0.5 1000 - 30000 9000 15001.0 350 - 7000 6500 10001.5 200 - 4000 3000 4502.0 100 - 2000 1500 240______________________________________________________________________

• Características de la movilidad del ADN durante la electroforesis en el gel de acrilamida

Acrilamida Rango de separación Xilencianol Azul de bromofenol% p/v (pb) (pb) (pb)______________________________________________________________________ 3.5 1000 - 2000 460 100 5.0 80 - 500 260 65 8.0 60 - 400 160 4512.0 50 - 200 70 2015.0 25 - 150 60 1520.0 5 - 100 45 12______________________________________________________________________

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- Reactivos y preparación de soluciones

• Preparación de ADN genómico

Tampón TE 10X

Tampón TES 50 mM Tris pH 8.0100 mM NaCl 1 mM EDTA

Fenol, pH 8.0Equilibrado en 0.1 Tris HCl y Cloroformo.

RNAsa (libre de ADNsa) 10 mM Tris HCl pH 7.0 5 mM CaCl2

50% Glycerol

Fenol: CloroformoMezcla 1:1 de fenol cloroformo

CloroformoMezcla 24:1 de Cloroformo: Alcohol isoamílico

NaOAc 3M, pH 7.0Ajustar pH a 8.0 con ácido acético

EtanolEtanol absoluto (100%)

Etanol al 70%70% Etanol30% agua estéril

Proteinasa Kstock 20 mg/ml

Lisozimastock 10 mg/ml

Isopropanol

Agua estéril

• Digestión Eco RI

Enzima Eco RI y tampón 10 X Eco RI

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• Electroforesis en gel de agarosa

Tampón TAE 50X (por litro)242 g Tris Base (2M final) 57 ml Ácido acético glacial (1M final)100 ml de 0.5 M EDTA (50 mM final)

Bromuro de etidiostock de 10 mg/ml en agua estéril

Tampón de carga 6X para gel0.25% de azul de bromofenol

Marcadores de peso molecularADN de ΦX174 con Hae III y ADN de λ digerido con Hind IIIPreparar un stock de ADN como sigue:100 µg ADN100 µl de tampón de enzima de restricción (cualquier tampón que contiene 50 mM de NaCl)200 µl Tampón de carga 6 X para gel800 µl agua estérilAlmacenar alícuotas a -20oC. La solución de trabajo puede guardarse a 4oC. Usar 6 µl/0.5 µg de ADN, 12 µl para 1 µg o 18 µl para 1.5 µg dependiendo del tamaño del peine.

• Ligazón del inserto de ADN al vector λZAP II

• Mezclas recomendadas para sembrar bibliotecas de fagos_____________________________________________________________________

Tamaño del platoPlato LB ________________________________________________________Ingrediente 82 mm 150 mm 245 X 245 mm_______________________________________________________________Bacteria (ml) 0.2 0.5 2Fago, pfu 5000 20000 - 30000 150000Top agarosa, ml 3 7 30_____________________________________________________________________

- Fórmulas

• Pureza del ADNPara determinar la concentración y producción de ADN, tomar una alicuota de la

muestra y diluirla 1:5 en tampón de almacenamiento. Calibrar el espectrofotómetro usando la muestra tampón y medir la proporción de absorbancia A260/A280 o escanear la muestra de 220 a 320nm.

Para un ADN puro,

• Cálculo del Tm para sondas de oligonucleótidos menores de 50 nucleótidos

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Tm = 2(A + T) + 4 (G + C)

• Cuantificación del gADN y ligazón a lambda ZAP II digerido con Eco RIEl genoma de λZAP II es de 40820 pb de longitud. El tamaño promedio de inserto

después de digestión con Eco RI es de aprox. 4000 pb de longitud. Por lo tanto, si

Mi = masa del ADN inserto.Mλ = masa del ADN lambda.PMi = promedio del peso molecular del inserto.PMλ = PM del λZAP II

y nosotros tenemos: (Mi/PMi) = (Mλ/PMλ),

entonces Mλ = Mi X PMλ/PMi = Mi X 10

para 1.0 µg de ADN de lambda necesitamos 0.1 µg de inserto de ADN.

• Determinación del porcentaje de recombinantesLos vectores lambda y los plásmidos de expresión permiten discriminar los

recombinantes de los no recombinantes sobre la base del color claro o azul respectivamente. Una vez sembrada la genoteca, se debe determinar el porcentaje de recombinantes en la genoteca. Para su efecto se debe calcular la proporción del número de placas o colonias recombinantes dividido por el número total de placas o colonias (recombinantes y no recombinantes) multiplicado por 100. Así, una genoteca con más del 80% de recombinantes significa que es útil para la búsqueda de clonas de genes de interés.

• Título de una genotecaEl título de una genoteca da la concentración de fagos o bacterias en la solución de

la genoteca cosechada. Este se mide en unidades formadoras de placa (pfu: plate formed unit) para los fagos o en cfu para las colonias bacterianas mediante la relación: n = y / vx, donde n es el título en pfu / ml, y el número de placas producidas por el sembrado de un volumen v de una dilución x.

El título permite además conocer la dilución óptima a la cual se debe sembrar la genoteca de manera semiconfluente para efectuar el tamizaje. Esto se logra mediante diluciones seriadas de 10 en 10 o 100 en 100. Por ejemplo, 0.1 ml de una dilución 1:105

da un promedio de 1500 placas por plato; el título es 1500 / (0.1 X 10-5) = 1.5 X 109

pfu/ml. Un título mayor de 107 o de 1010 son óptimos para genotecas primarias bien construidas o genotecas bien amplificadas, respectivamente.

• Proporción de clonos recombinantes a rastrearA fin de encontrar un clon determinado de un gen deseado a una probabilidad

determinada, es importante calcular el número de recombinantes (N). Para esto hacemos uso de la siguiente ecuación:

N = ln(1-p) / ln(1-(x/y)),

donde p es la probabilidad de hallar un fragmento particular, digamos con un 99% de “certeza”. x es el tamaño de insertos promedio clonados en la genoteca o la distancia promedio a la cual la enzima de restricción utilizada corta. Por ejemplo, para un genoma

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con 50% GC una genoteca Eco RI dará fragmentos de aprox. 4000 pb. y es el tamaño del genoma clonado. Por ejemplo, para el Mycobacterium leprae los valores serán:

N = ln(1- 0.99) / ln(1-(5000 pb / 2.6X106 pb))

N = 2.397.

Esto significa que deberíamos tamizar por hibridización aprox. 3000 placas o colonias para tener el chance de encontrar el clon deseado. Ya que una caja de Petri estándar puede alojar cerca de 2000 placas o colonias semiconfluentes, entonces necesitaremos de dos cajas de Petri para efectuar el tamizaje. No obstante, para este caso, se recomienda tamizar más de 5 a 10 cajas de Petri, a fin de aumentar la probabilidad de hallar varias copias del mismo clon.

Para un genoma eucariote como Leishmania los parámetros serían:

N = ln(1- 0.99) / ln(1-(5000 pb / 3.7X107 pb))

N = 34.081.

En este caso se tamizarían al menos 18 cajas de Petri. No obstante, en bibliotecas de expresión tamizadas con anticuerpos policlonales o monoclonales, la probabilidad que un clon sea expresado es p/6. Por lo que se deben tamizar más platos de Petri o alternativamente construir una genoteca más grande.

- Plásmidos o fagos ?Para genotecas de ADNc: La eficiencia de empaquetamiento del ADN del fago es

hasta el 10%. La eficiencia en la formación de placas de fagos empaquetados: 100%. La eficiencia de la transformación de las células E. coli: 1-5 X 108 tranf./µg = 0.1 - 0.5 %. Por lo tanto, los vectores fagos son eficientes para las bibliotecas ADNc.

Para alcanzar sobrexpresión y producción comparable a los plásmidos se recomienda crecer lisogénicamente los fagos. Además, los lisógenos son inestables por razones desconocidas. Como conclusión, los plásmidos vector son eficientes para sobreexpresión y purificación.

- Características de los vectores y cepas

- Bacteriófago λ silvestre• El fago lambda silvestre tiene cinco grupo de genes principales: 1) grupo

morfogenético el cual codifica para las proteínas de la cabeza, la cola y el cuello; 2) el grupo de inmunidad y recombinación los cuales median la protección del fago frente a otros fagos competidores y la recombinación sitio específico durante la lisogenia; 3) el grupo regulador o controlador, con 7 genes implicados en el control del estilo de vida del fago; 4) los genes de replicación del ADN viral y 5) los genes codificante para enzimas líticas (lisozimas) para efecto de romper la pared celular bacteriana durante la fase lítica. Además, el genoma del fago contiene ADN conector, el cual una vez retirado parece no afectar el estilo de vida del fago.

− λgt-10• Los brazos Eco RI del vector están defosforilados para obtener un bajo trasfondo

(background) de los no recombinantes.

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• Una alta eficiencia de clonaje mayor de 5 X 106 pfu/µg de brazos con inserto control. • La identificación de fagos recombinantes de los no recombinantes es posible usando

la cepa hospedera C600hfl; los fagos recombinantes son líticos, produciendo placas claras y los fagos parentales son lisogénicos, produciendo placas turbias.

• La cepa C600hfl represa el crecimiento del fago parental.• Capacidad de clonaje hasta 7.6 kb.

- λgt-11• Los brazos Eco RI del vector están defosforilados para obtener un bajo trasfondo

(background) de los no recombinantes.• Una alta eficiencia de clonaje mayor de 5 X 106 pfu/µg de brazos con inserto control. • Las placas del fago recombinante son claras y las placas de los fagos no

recombinantes son azules sobre hospederos lac- en presencia de IPTG y X-gal.• Los insertos de ADN pueden ser expresados como proteínas de fusión bajo el control

del promotor lacZ.• Las placas pueden ser rastreadas con anticuerpos contra las proteínas clonadas y

expresadas.• La expresión de grandes cantidades de proteínas de fusión para el estudio de análisis

de proteínas o producción de anticuerpos mediante inducción con IPTG.• Las genotecas pueden ser rastreadas con sondas de ácidos nucleicos o anticuerpos.• Capacidad de clonaje hasta 7.2 kb (Promega, 1994).

- λZAP II• Un polilinker con seis sitios de clonaje (SacI, NotI, XbaI, SpeI, EcoRI y XhoI) que

deberá acomodar insertos de hasta 10 kb de longitud.• Los clonos en el vector λZAP II pueden ser tamizados con sondas de ADN o sondas

de anticuerpos.• El sitio polilinker es parte de la porción amino terminal (fragmento α del gen lacZ.

El gen lacZ completo, constituido por la sección N-terminal que codifica para el fragmento α más la sección C-terminal que lo hace para el fragmento Ω, que codifica para la enzima β-galactosidasa.

• El hospedero E. coli usado con λZAP II, llamado XL1-Blue MRF´, contiene el episoma F´, el cual codifica para el fragmento Ω necesario para complementar el fragmento α y generar la β-galactosidasa funcional. Este también contiene el gen lacIq, el cual codifica para el represor del gen lac.

• Cuando un inserto esta presente dentro del polilinker, la expresión del fragmento α es interrumpida y las células XL1-Blue MRF´ infectadas con el fago recombinante no es capaz de hidrolizar el substrato X-gal. X-gal se torna azul después de la hidrólisis con β-galactosidasa, de ahí que, las placas debidas a fagos recombinantes son blancas, mientras que las placas debidas a fagos tipo silvestre son azules.

• La expresión de proteínas recombinantes pueden ser tóxicas para la célula hospedera o disminuir la replicación del fago. De ahí que, es posible crecer el fago λZAP II bajo condiciones donde la expresión de la proteína recombinante es suprimida. Esta es la razón por la que el gene lacIq es incluido en el vector (así como también en muchos otros vectores inducibles). La expresión a partir del promotor lacZ es inducida por el IPTG el cual, cuando se une al represor lac, bloquea su unión al operador lac.

- Mapas

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- Plásmido pBS SK (+/-): Escisión in vivo de insertos de ADN del organismo en cuestión clonados en el fago lambda ZAP II y el plásmido de rescate pBS

• Las células hospederas de E. coli, (XL1-Blue) son infectadas simultáneamente con el fago recombinante λ ZAP II y el fago filamentosos f1 (fago ayudador o helper). El fago f1 comienza a replicar y las proteínas F1 implicadas en el proceso de replicación también unidas a el iniciador f1 en el λ ZAP II.

• Como consecuencia, todas las secuencias contenidas en el fragmento I y T son replicados y empaquetados como un “fago” de banda simple (+), un fagémido, el cual es secretado a partir de las células XL1-Blue y acumula en el sobrenadante.

• Esta mezcla es precalentada (70ºC) para matar las células XL1-Blue. Los fagémidos sobreviven al tratamiento del calor.

- Plásmido pMal- Figs

Tabla No.1Algunas enzimas de Restricción

Enzima Fuente Concentración Temp. De SecuenciaReacción que reconoce

______________________________________________________________________Eco RI E. coli RY13 25 37ºC 5´GAATTC3´

3ĆTTAAG5´______________________________________________________________________Bam HI Bacillus amyloly 10-20 37ºC 5´GGATCC3´quefaciens 3ĆCTAGG5´______________________________________________________________________Hind III Haemophilus 10-20 37ºC 5ÁAGCTT3´

influenzae Rd 3´TTCGAA5´______________________________________________________________________Pst I Providencia 37ºC 5ĆTGCAG3´

stuartii 3´GACGTC3´

Tabla No.2Principales marcadores genéticos del bacteriófago lambda

Genes FunciónCos Extremo cohesivo de cadena sencilla de 12 nucleótidos

Nu, A Intervienen en el empaquetamiento: componentes de la terminasa que cliva los sitios Cos.

W Completa la cabezaB Primer intermediario en la iniciación del ensamble de cabeza.C Interviene en la iniciación del ensamble de la cabeza

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Nu 3 Proteína de armazón que forma core, procabeza.D Proteína estructural que da estabilidad a la cabeza.E Proteína estructural de la cabeza.

F I Interviene en el empaquetamiento y en la iniciación de la cabeza.F II Completa la cabeza; necesario en la unión cabeza-cola.Z Completa la formación de la cola.U Completa la formación de la cola e interviene en la formación

cabeza-cola.V Proteína estructural de la cola más importante.T Papel en el ensamblaje de la cola desconocido.H Determina la longitud de la cola.

G, M, L, K, I Participan en la iniciación de la síntesis de la cola.J Determina el rango de especificidad del hospedero.

Presumiblemente codifica para la fibra de la cola.“REGIÓN NO ESENCIAL DE 4 kpb”

att Sitio de recombinación específica con el ADN de E. coli.int, xis Componentes del sistema de recombinación sitio-específico, para la

integración o escisión del profago.exo, bet Pertenecen al sistema de recombinación general (sistema red).

exo: exonucleasa. bet: promueve la recombinación y renaturalización

gam Inhibe la acción de la enzima Rec BC del hospedero, uniéndose a ella.

C III Establece la lisogenia, regula la actividad de la proteína CII.ral Inhibe la restricción. Protege al fago del sistema Eco B y Eco K del

hospedero.

N Antiterminador de transcripción, permite que continúe la transcripción iniciada en PR y en PL.

Rex BRex A

Sistema de exclusión del profago Lambda.

C I “Represor Lambda”. Mantiene el estado de profago reprimiendo la transcripción desde Pl y PR, y activando la transcripción desde PM.

Cro Represor que actúa durante el crecimiento lítico para apagar la transcripción desde PL, PR, PM.

C II Establece la lisogenia; regula la estabilidad de la proteína IIIO, P Inicia la replicación del ADN a partir del sitio Ori.

Región nin Parte no esencial del fago Lambda, corresponde a 3 kpb de longitud.Q Antiterminador de la transcripción; permite que la transcripción

iniciada en PR continúe dentro de los genes tardíos.S Interviene en la lisis celular, rompiendo la membrana interna de la

célula.R, Rz Producen endolicinas que degradan la pared celular.Cos Extremo cohesivo de cadena sencilla.

78


Tabla No.3Principales marcadores genéticos del bacteriófago lambda gt-11

Genes FunciónLac 5 Substitución en el fago Lambda por la región no esencial entre el gen J

y el sitio att. Gen que codifica para la B-galactosidasa, con sitio de clonaje Eco RI hacia el extremo COOH para producir una proteína de fusión.

C I 857 Mutación que convierte el producto del gen CI termolábil. Es un represor sensible a la temperatura, inactivo a 42ºC en la fase lítica, permitiendo una selección contra el crecimiento lisogénico.

nin 5 Deleción de la región nin5 del fago Lambda que remueve el sitio de terminación de la transcripción tRZ, y por lo tanto convierte la transcripción temprana independiente del gen N, acelerando la fase lítica.

S 100 Mutación en el gen S que produce lisis defectiva del fago.

Tabla No.4Principales marcadores genéticos comunes a los hospederos E. coli Y1088 y Y1090

Genes min FunciónSup F Supresor de la mutación ámbar en el gen S100 del fago lambda gt-11

para producir lisis no defectiva.Str A 5 Gen de resistencia que modifica el antibiótico estreptomicina e

inhibe su enlace al ribosoma; el producto de este gen es un agente bacteriano que se une a la subunidad 30S del ribosoma causando lecturas erróneas del ARNm.

LacU169 8 Deleción en el operón Lac que reduce la recombinación entre el fago y el hospedero. Necesario para distinguir los fagos recombinantes de los no recombinantes.

PMC 9 Plásmido pBR-322 que lleva el gen Lac I que reprime la expresión de genes foráneos, los cuales disminuyen el crecimiento del hospedero y del fago. El pBR-322 lleva el gen Bla, que confiere resistencia a la ampicilina, y el gen Tcr, que da resistencia a la tetraciclina.

Tabla No.5Principales marcadores genéticos del hospedero E. coli Y1088

Genes min FunciónSup E 15 Supresor de la mutación ámbar del fago lambda gt-1Met B 89 Codifica para la enzima cystationina sintetasaTrp R 100 Gen regulador para el operón del Trp

Hsd R- 98 Evita la restricción del ADN clonadoHsd M+ 98 Necesario para realizar modificación por metilación de la secuencia

clonadaTon A 21 3 Resistencia y sensibilidad a los fagos T1 y T2 respectivamente

ProC: :Tn5 9 Transposón que lleva el gen para la prolina.

79


Tabla No.6Principales marcadores genéticos del hospedero E. coli Y1090

Genes min FunciónPro A+ 6 Gen que codifica para la producción de L-glutamato semialdehído

Lon 10 Deleción en el gen Lon proteasa. Permite la estabilidad de las proteínas expresadas

Ara D139 1 Parte del Ara D que codifica para la L-arabinosa isomerasa.

Fig. 25. M. tuberculosis teñido con Zielh-Neelsen visto al microscopio óptico.

80


Fig 26. Tejido pulmonar afectado por tuberculosis

Fig 27. Electroforesis en gel de agarosa al 1% que muestra: A: Patrones de Lambda silvestre cortados con HndIII. B y C: ADN de M. tuberculosis después del tratamiento con RNAasa a diferentes concentraciones. D y E: ADN del bacilo antes de RNAasa a diferentes concentraciones

81


Fig 28. Electroforesis del ADN del M. tuberculosis, con ARN, digerido con endonucleasas de restricción. A: Patrones de Lambda silvestre cortados con BamHI. B: ADN del bacilo sin digerir. C: ADN del bacilo digerido con Hindi. D: ADN digerido con BamHI. E: ADN digerido con EcoRI. F: ADN digerido con Pst-I.

Figura 29. A: Librería cultivada en presencia de IPTG y X-GAL y B: Control de ligación del sistema Lambda gt -11

82


Fig 30. Titulo de 4.0 x 1010 ufp/ml de la librería amplificada. A: Dilución 10-2, totalmente confluente. B: Dilución 10-4, confluente. C: Dilución 10-6, no confluente. Obsérvese el alto porcentaje de recombinantes . D: Dilución 10-8

83


Fig 31. Aislamiento de las sondas sintetizadass por electroforesis en poliacrilamida-urea. A: Patrones, VXC: verde-xileno-cianol, ABF: azul de bromofenol. B: Sonda 14K. C: Sonda 40K.

84


Fig. 32. Autorradiografía de geles de poliacrilamida-urea que muestra los oligonucleótidos radimarcados.

85


Fig 33. Gradiente en CsCl, después de 2 horas de ultracentrifugación a 42.000 r.p.m. A: ADN bacteriano de E. coli. B: Fagos de la librería.

Fig 34. Análisis comparativo entre ADN genómico y ADN recombinante cortados con tres endonucleasas de restricción diferentes. A: ΦX174 cortado con HaeIII. B: ADN genómico cortado con EcoRI. C: ADN recombinado cortado con EcoRI. D: ADN genómico cortado con HndIII. E: ADN recombinado cortado con Hindi. F: Patrón de Lambda gt-11 cortado con Hindi. G: ADN genómico cortado con Pst-I y H: ADN recombinado cortado con Pst-1

86


I IIFig. 35:I: Autorradiografías de ADN de vectores de diferentes concentraciones. Plásmidos: A: puC-18. B: pGEM3. C: pBR322. Fagos: D: EMBL3. E:Lambda gt11. Genómicos: F: TBC. G: P falciparum. Hibridización con una sonda de 14Kb.

II: ADN genómico de Micobacterium tuberculosis a diferentes concentraciones. Hibridizado con una sonda de 14Kb.

87


Fig. 36. Análisis de la electroforésis en agarosa al 1% que muestra: A: Patrones de Lambda silvestre cortado con HindIII. B: ADN genómico de M. tuberculosis C: ADN recombinado cortado con EcoRI del clon para la 40K..

Fig. 37. Muestra el clon 40K puro de M. tuberculosis

88


Glosario

Amplificación: se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia cromosomal, encontrada tanto en ADN cromosomal como en extracromosomal.Anticuerpo: es una proteína (inmunoglobulina) producida por los linfocitos B, que reconoce un antígeno particular foráneo y al cual se dirige la respuesta inmune.Antígeno: es cualquier molécula cuya entrada a un organismo provoca la síntesis de un anticuerpo.Autorradiografía: detecta moléculas radiactivamente marcadas, por su efecto de crear una imagen fotográfica.Bacteriófagos: son virus que infectan las bacterias; pueden replicarse a sí mismos dentro de ellas y pueden ser modificados para que tengan un único sitio de inserto de ADN blanco; frecuentemente se abrevian como fagos.Biblioteca de ADN o genoteca: es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo, distribuidos en vectores, cuya unión representa el genoma entero del organismo.Cápside: es la proteína externa que recubre una partícula viral.Clon: describe un gran número de células o moléculas idénticas con un único módulo o célula ancestral.Codón: es un triplete de nucleótidos que representa un aminoácido o un signo de terminación.Codón de terminación: es uno de tres secuencias tripletes: UAG (ámbar), UAA (ocre) o UGA (ópalo), que causan terminación de síntesis proteica; también se llama codón sin sentido.Concatámero de ADN: es una cantidad de unidades genómicas que se repiten en tándem de múltiples copias de la misma secuencia.Degeneración del código genético: se refiere al efecto de los cambios en la tercera base del codón sobre el aminoácido que éste representa.Desnaturalización: referida al ADN o al RNA; describe su conversión de doble banda al estado de simple banda; la separación de las bandas está a menudo acompañada de calentamiento y álcali.Determinante antigénico o epítope: región específica de una proteína que interactúa con el anticuerpo humoral, determinando la especificidad de la reacción inmunogénica.ADN blanco: es el ADN que se extrae de un organismo para ser cortado en fragmentos y clonado dentro de un vector.Endonucleasas o enzimas de restricción: reconocen y clivan secuencias cortas específicas de ADN, usualmente no metiladas. Pueden ser específicas para ADN o ARN mono o bicatenario.Esferoplasto: es una célula bacteriana o levadura cuya pared ha sido total o parcialmente removida.Genoma: es el patrimonio genético de una célula o un organismo. Este se encuentra constituido por toda la colección de genes y las secuencias conectoras no codificantes, reguladoras y repetidas.Genoteca: Véase biblioteca de ADN.Hibridización in situ: es un método que consiste en desnaturalizar el ADN a partir de células homogenizadas, sobre un papel de nitrocelulosa, donde ocurre una reacción de apareamiento de bases complementarias, cuando se añade una cadena simple de ADN o RNA marcadas radiactivamente o por métodos fríos; la hibridización es seguida de autorradiografía.

89


Inmunidad en fagos: se refiere a la habilidad de un profago para prevenir que otro fago del mismo tipo infecte una célula. Ésta resulta de la síntesis de un represor del fago en el genoma del profago.Integración de una secuencia de ADN viral u otra secuencia: es la inserción de una de estas secuencias dentro de un genoma hospedero como una región covalentemente ligada por ambos lados de la secuencia hospedera.Ligazón: es la formación de un enlace fosfodiester que une dos bases adyacentes separadas por una muesca o nick en una hebra de doble hélice de ADN.Ligadores: son fragmentos cortos de oligonucleótidos sintéticos de doble hélice que contienen un sitio blanco para una endonucleasa de restricción; pueden ser adicionados a los extremos de un fragmento de ADN.Linfocitos B: son las células responsables de la síntesis de anticuerpos.Lisogeno: es una bacteria que posee un profago represado como parte de su genoma.Mapa de restricción: es un arreglo linear de sitios sobre el ADN clivado por varias enzimas de restricción.Modificación del ADN: incluye todos los cambios hechos en los nucleótidos después de su incorporación inicial dentro de una cadena polinucleotídica.Operón: es una unidad completa de genes bacteriales estructurales, de expresión y de regulación de ADN, reconocidos por el control de un gen regulador.Palíndrome: es una secuencia de ADN que es la misma cuando una hebra es leída de izquierda a derecha y la otra es leída de derecha a izquierda.Pares de bases (pb): es el apareamiento entre las bases nitrogenadas: A con T y C con G, en el ADN de doble hélice.Plásmidos: son moléculas bicatenarias de ADN circular, las cuales pueden replicarse dentro de una célula bacterial.Profago: es un genoma de fago covalentemente integrado como una parte linear del cromosoma bacterial.Proteínas antiterminadoras: permiten que la ARN polimerasa transcriba a través de ciertos sitios terminadores.Proteoma: la colección de todas las proteínas predichas teóricamente a partir de la secuencia del genoma y las confirmadas fisiológicamente bajo diferentes condiciones de crecimiento celular.Reasociación de ADN: describe el apareamiento de cadenas simples complementarias para formar una doble hélice.Redundancia: degeneramiento del código genético en el sentido de que varios tripletes pueden codificar para un aminoácido.Secuencia Shine-Dalgarno: es parte o toda una secuencia polipurínica aggagg localizada en el ARNm bacterial justo antes de un codón de iniciación AUG; es complementaria a la secuencia de 16S ARNm en el extremo 3’; además está implicada en la unión del ribosoma al ARNm.Sitios silentes de un gene: describen aquellas posiciones en las cuales las mutaciones no alteran el producto.Sonda: oligonucleótido sintético de una banda radiomarcada, o anticuerpo monoclonal o policlonal, que sirve para buscar genes deseados dentro de una biblioteca.Southern “blot”: técnica que describe el proceso de transferencia de ADN desnaturalizado desde un gel de agarosa hacia un filtro de nitrocelulosa, donde éste puede hibridizarse con un ácido nucleico complementario.Temperatura de fusión (Tm): es el punto medio de un rango de temperatura sobre la cual el ADN se desnaturaliza.Terminador: es una secuencia de ADN, representada en el extremo del transcrito, que causa la terminación de la transcripción de la RNA polimerasa.Transducción: se refiere a la transferencia de un gene bacterial, de una bacteria a otra, por un fago; el fago que lleva los genes del hospedero como también sus propios genes,

90


se llama fago transductante. También describe la adquisición y la transferencia de secuencias de células eucariotas por medio de un retrovirus.Transfección de una bacteria: es la adquisición de nuevos marcadores genéticos por incorporación de un ADN adicionado.Vector: es una molécula de ADN, la cual puede replicarse como una unidad autónoma. Tiene sitios dentro de los cuales el ADN blanco puede insertarse. Existen tres tipos de vectores: fagos, plásmidos y cósmidos.

Corolario

El conocimiento de todas estas estrategias de clonación y de ADN recombinante pone a un estudioso de las ciencias naturales y en especial de la biología en una nueva autopista del saber, ya que hoy por hoy los científicos a lo largo y ancho del mundo se encuentran a la caza de nuevos genes de diferentes organismos incluido el hombre, permitiéndole con esto abrir la compuerta de nuevos conocimientos para el entendimiento de los procesos de la vida y de las relaciones que se tejen entre los organismos vivientes. El apropiamiento y manejo profesional de estas estrategias de investigación generan hoy en día los reconocidos altos niveles en los países desarrollados, ya que estos generan mayor producción y deasarrollo biotecnológico para la industria farmacéutica, cosmética, alimentaria, por supuesto, generando una mejor alternativa de salud (caso de la producción biotecnológica de la insulina) y del bienestar humano en general.

Este libro ha pretendido poner a disposición de los interesados numerosas experiencias en este interesante campo de la clonación de genes, con resultados originales del trabajo de investigación de los autores. Esperamos que esta intención sea fecunda y que permita a los estudiosos en estos campos poder poner en práctica las estrategias de trabajo de investigación aquí planteadas.

Patricia Eugenia Vélez V. Esperanza Rodriguez

Pedro Antonio Moreno T. Mayo 2002

91


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Índice

A

Acrilamida, 55Actividad específica, 56,58Adsorción, 28Agarosa, 46Almacenaje de genotecas, 16Ampicilina, 33,37,48,49,62,68,78Amplificación de genotecas, 12,16,39Antibiótico, 37Anticuerpo, 7,15,21,69γdATP 58Astringencia, 64Autorradiografía, 27,60,63,64Azul de bromofenol 73

B

Bacteriófago lambda, 18,27,28,31Beta-galatosidasa, 32,33,37Biblioteca de ADN-Recombinante (ver genoteca),16Bioseguridad (normas), 7Brazos del vector (arms), 46,47Bromuro de etidio, 46,75Buffer (ver Tampón), 30

C

Cápsides (cabezas), 21ADNc, genoteca (ver genotecas) 17,18,32,42,43,66Cebador (ver iniciador o primer), 42

cfu, 77Clon, 37Clonaje,6,12,13,17,18, 19,28,32Cloruro de Ca+2, xxColas (tails), 47Consejo de Bioética, 7Cos, sitio, 20,28,78,79Cósmido, 21,28,42,95cpm, 59 Crecimiento lisogénico, 82Cro (represor), 30,31,35,36,79,80,81,82,94Cromatografía, 55,56,58CsCl, 61,90

DDenhart, 64Densidad óptica, 74Desanclaje de oligos, 23,53-54,98Diluciones seriadas, 31,50,77ADN genómico (gADN), aislamiento, 7,17,65,66,90,91ADN complementario (ADNc), 17,18,43,66,78ADN ligasa, 15,20ADN polimerasa I, 15Dot blotting, 42,63

E

Electroforesis, 46,57Empaquetamiento, 46,57Enzimas de restricción, 14,18,19-21,60,71,78,92Episoma F´, 77Etanol, 74Extractos de empaquetamiento, 46,47

Extremos romos, 20Extremos cohesivos, 20,21,29

F

f1 (fago), 17,18,21,22,28-32,34,38,43,47,49,51,61,62,69,73,76-82,91Fagémido, 34,72,73Fago (ver bacteriófago) 28Fenol, 44,46,74-76,88Filtro (ver membrana)Formamida, 55Fragmento α, 71,77Fragmento Ω, 77

G

Gen CI, 30,80 CII, 30,80 CIII, 30,80 Cro, 29 N, 29,80Genomas, 5,7,12,15,28,65,98Genotecas,16,21 genómicas o de ADN, 76 de ADNc, 5,16-17

H

hfl, 77Hibridización, 24,40Historia de la BM, 12-13Hospedero (host), 47“hot start” (ver PCR),hsdR (genotipo), 20,31hsdS, 20

I

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Inducción, 16,37,67-68,77Iniciadores, 21,39-41Inmunodetección, 65Inmunología, 26Inmunoreactividad, 7,21Inserto, 27IPTG,36,68

K

kilobase (kb), 27,77

L

lacA, 35,36lacI, 35,36,37lacO. 38,80lacY, 38,80lacZ, 32,34,37-38,80Lavados post hibridización, 36

lambda (ver bacteriófagos),3,8,18,2729,34,37,38,41,42,46,64,65,70,74-76,78,80,95 silvestre (características), 20,94 gt-10, 30,32,44 gt-11, 31,37 ZAP II, 33LB (medio), 72Leishmania, 76Ligazón, 19,20,46,47,75Lísis, 29Lisogenia, 29Lisógeno, 34,76Lisozima, 14,43-44,73,76

M

M13 (fago), 30-33Maltosa, 28,47,67Mapa λgt-10, 78

λgt.11, 78 λZAP II, 78Mapa de restricción, 32Marcador seleccionable, 18Membranas para transferencia nitrocelulosa, 24,61,63-68,92 Método fosfíto triester, 21,22,42,51Movilidad del ADN, 72ARNm, 16,17,21,36,41,80,93Muesca , 19,33,92Mycobacterium leprae, 75

N

“nick” (ver muesca)Nitrocelulosa (ver membranas), Northern blot, 24

O

O. D. ( densidad óptica)Oligonucleótido, 21,26,51Operador, 35-37,77Operón lac, 31-37,80

P

P32, P33 (ver 32ATP)PAGE (ver electroforesis), 55,57PCR, 11-15,20-21,39-41,97pfu, 74-75Pirofosfato de Na, 63Pl (promotor), 28,79Placa de lísis (ver pfu)Plásmido pBS, 7,33,70-71,78 pMal, 7,72“Polilinker”, 77

Porcentaje de recombinantes, 20,48,75,85Profago, 28,79,92Promotor, 28,31,33,35-37,77Proteína de fusión, 33-34,80Proteinasa K, 43,44,74

Q

Q (antiterminador), 29,79,92

R

Radioisótopo, 7Radiomarcaje de sondas, 51-53Rastreo (ver tamizaje), 75-76Recombinantes, 7,10,14,18-20,31,33,34,37-38,41-42,48,49,60,65,67,71,75-76,80Represor, 30,37Restricción,18,46 Modificación, 18-20,80,92RNA (análisis), 14,24,26,41,43,58,72,91,92RNA polimerasa,29,36-37,93RNasa, 45

SSchrödinger, E. 13,15Screening (ver tamizaje), 97Secuencia palindrómica, 18SDS, 43,44,63,64Solución hibridizadora, 63,66Sondas, 21,26,51Soporte sólido, 22

96


Southern blotting, 63,63SSC (solución salina citrato), 61,63,64 Subclonaje, 7,90

T

T4 polinucleótido kinasa, 58Tampón de carga, 48,74,75TE, (tampón o buffer), 30,57,54,74Título de una genoteca, 75Tm, 24,26,40-41,64,74,93TMG (tampón), 60Transcriptasa reversa, 14Transferencia tipo Southern, 63

U

UV, (ver luz UV), 44

V

Vector, 17,27 inserción, 18 expresión, 18

W

Western blotting, 65

X

X-gal (ver 5Bromo-...), 37,48XL1-Blue MRF´ (cepa E. coli), 70,77-78

Y

Y1090, 31,47-48,60,65,67-68,80-82YACs (ver vector), 21,27

97

introduccion a la biologia molecular

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