INTRODUÇÃO

Micobactérias de Crescimento Rápido (MCR) são microrganismos que estão

amplamente distribuídos no meio ambiente, particularmente no solo e na água,

incluindo água potável, tubulações de sistemas de distribuição de água, piscina, esgoto e

superfícies, mesmo em condições supostamente adversas, como baixo pH, pouca carga

orgânica e temperaturas variadas (MACEDO et al, 2009). Capazes de formarem

colônias visíveis a olho nu em um período máximo de sete dias quando incubadas em

meio sólido, as espécies de MCR são classificadas basicamente em três complexos,

Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegmatis e Mycobacterium chelonae-

abscessus. Apesar de ser amplamente distribuídas na natureza, a partir da década de

1950 admitiu-se a importância das MCR na patologia humana, como causadoras de

inúmeros surtos hospitalares, como o que aconteceu em 1975, em um hospital da

Carolina do Norte, nos Estados Unidos. Neste surto foi isolado do esterno de 19

pacientes submetidos à cirurgia cardíaca a cepa de M. abscessus. Destes pacientes cinco

foram à óbito em decorrência da infecção pelo bacilo (WALLACE et al, 1998;

PITOMBO et al, 2009).

No Brasil, apesar dos relatos de surtos de infecções nosocomiais por MCR

envolvendo procedimentos médicos serem esporádicos, a partir de 2004 o quadro

assumiu grandes proporções colocando as entidades responsáveis em sinal de alerta.

Foram registrados no período entre 2004 a 2007 diversos surtos no Brasil, como o

ocorrido no município de Goiânia, no qual foi isolado 18 cepas micobacterianas de

crescimento rápido em indivíduos que passaram por procedimentos cirúrgicos como

laparoscopia e artroscopia. Estas micobactérias, de uma maneira geral, causaram a

formação de eritema e edema associados à formação de abscessos localizados, restritos

à região do joelho ou do abdômen (CARDOSO et al, 2008). Todos os isolados de

micobactérias foram identificados por PCR-PRA e pelo sequenciamento parcial do gene

rpoB como Mycobacterium massiliense. Embora os isolados tenham sido obtidos de

pacientes de hospitais diferentes, todos foram geneticamente idênticos (CARDOSO et

al, 2008).

A patogênese das infecções micobacterianas envolve vários aspectos inerentes

tanto ao microrganismo quanto ao hospedeiro que afetam diretamente a eliminação do

parasita. O entendimento destes aspectos é importante na caracterização dos

mecanismos tanto de defesa quanto de ataque. Normalmente, quando bactérias

ambientais são passivamente introduzidas no hospedeiro ocorre uma rápida eliminação

do patógeno devido a uma eficiente resposta imune inata (LEE et al, 2009). No entanto,

infecções causadas por M. massiliense tem sido descritas como tendo uma evolução

crônica, e em alguns casos, a doença é disseminada independente do estado imune do

indivíduo (LE BOURGEOIS et al, 2005)

Ainda não foi claramente elucidado os mecanismos de infecção usados por

algumas micobactérias de crescimento rápido contra o hospedeiro, porém acredita-se

que o mecanismo de defesa seja semelhante ao estabelecido para Mycobacterium

tuberculosis. Visando analisar tais mecanismos, Sousa e colaboradores (2010)

realizaram um estudo com camundongos das linhagens C57BL/6 e BALB/c. No estudo

em questão os camundongos foram infectados com 106 UFC/mL de M. massiliense

GO06 por via intravenosa e em diferentes dias de infecção a carga bacteriana do

pulmão, baço e fígado de cada animal foi determinada para avaliar a patogenicidade e

virulência do isolado em camundongos. Após determinação carga bacilar nos três

órgãos, foi observado nas duas linhagens C57BL/6 e BALB/c um aumento da carga

bacteriana durante os primeiros dias de infecção. Contudo, após 14 dias de infecção foi

notado que a linhagem BALB/c apresentava maior carga bacilar quando comparada

com à linhagem C57BL/6 (DE SOUSA et al, 2010). Nesse estudo de Sousa e

colaboradores (2010) demonstraram que a cepa de M. Massiliense GO06 isolada do

surto em Goiânia era patogênica e de alta virulência nas duas linhagens de

camundongos, sendo os camundongos BALB/c mais susceptíveis que os C57BL/6.

A diferença no controle da infecção observada neste trabalho pode estar

correlacionada ao fato que camundongos de linhagens diferentes, possuem mecanismos

de resposta imune díspares. A linhagem C57BL/6 exibe uma resposta imune com

padrão mais Th1, caracterizada como ideal no controle da infecção por micobactérias.

Essa resposta é induzida principalmente pelas citocinas IL-12 (Interleucina 12) e IFN-γ

(Interferon Gamma) após estímulo de microrganismos que ativam as células dendríticas,

macrófagos e células Natural Killer (FLYNN & CHAN 2001; ANNUNZIATO &

ROMAGNANI 2009). Após a fagocitose da micobactéria por macrófagos ou células

dendríticas ocorre a produção de IL-12. Essa citocina apresenta um importante papel no

controle da infecção, uma vez que favorece a resposta imune celular contra esses

patógenos, desempenhando funções essenciais, dentre as quais podemos citar: induzem

a produção de IFN-γ pelos linfócitos T CD4, CD8 e NK, leva à proliferação de

linfócitos T CD4, favorece a expansão clonal de células Th1 e aumenta a citotoxicidade

dos linfócitos CD8 assim como das células NK. Além disso, tal citocina ativa as células

do sistema imune, mais diretamente as Natural Killer que elevam a secreção de IFN-γ.

(MAHESHWARI et al, 2002; JUNQUEIRA-KIPNIS et al, 2003). O interferon gamma

além de estar envolvido nos mecanismos bactericidas das células fagocíticas, ativa

fatores de transcrição que estimulam a diferenciação das células T CD4+ virgem ao

subtipo Th1, amplificando, dessa forma, o padrão induzido, que é de resposta imune

natural forte (COOPER 2009). Em contrapartida, BALB/c apresenta uma resposta

tendendo ao tipo Th2, sendo esta marcada pela produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-6,

IL-13, IL-10 e TGF-β envolvidas principalmente na regulação das lesões inflamatórias

provocadas pela infecção (COOPER & KHADER 2008). Todavia este tipo de resposta

não é efetiva no controle de infecções micobacterianas, haja visto que essas citocinas

regulam negativamente a resposta Th1 (OTTENHOFF 2012). Com isso, podemos supor

que o balanço entre as repostas Th1 e Th2 possa ser mais eficiente no controle da

infecção e manutenção de todos órgãos.

Desta maneira, o estudo da infecção por Mycobacterium massiliense em

camundongos híbridos BC-F1 oriundos do cruzamento das duas linhagens C57BL/6 e

BALB/c, poderá caracterizar melhor a interação entre patógeno e hospedeiro.

METODOLOGIA

Animais

Camundongos da linhagem BC-F1 utilizados nesse estudo, foram obtidos

através do cruzamento de fêmeas BALB/c com machos C57BL/6, com idade entre 6-8

semanas, provenientes do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

UFG (IPSTP-UFG). Os animais foram mantidos em gaiolas, com água e dieta ad

libitum, em sala de controle com ciclo de luminosidade, umidade e temperatura.

O protocolo para este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Animal da Universidade Federal de Goiás e todos os animais foram mantidos de acordo

com orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

(SBCAL/COBEA).

Inóculo de Mycobacterium massiliense

Uma alíquota da cepa Mycobacterium massiliense isolada pelo LACEN-GO no

surto ocorrido em Goiânia, foi cultivada durante três dias em meio Mueller Hinton

caldo, contendo Tween 80 a 0,05%, sendo mantida sob agitação em temperatura

ambiente até atingir a fase log de crescimento. Posteriormente, a cultura foi ajustado à

concentração de 2x106 UFC/mL.

Infecção endovenosa com Mycobacterium massiliense

Os animais foram agrupados, aleatoriamente, em 5 grupos com 3 animais cada.

A infecção foi realizada pela via intravenosa (via plexo retro-orbital), sendo inoculado,

106 CFU/animal.

Determinação das Unidades Formadoras de Colônia

Para determinar a carga bacteriana nos camundongos após a infecção, três

camundongos de cada grupo foram eutanasiados nos dias 1, 7, 14, 21 e 30 de infecção,

para coleta do pulmão, baço e fígado. Os órgãos coletados foram homogeneizados em

PBS, Tween 80 a 0,05%. Posteriormente, o homogenato foi diluído e plaqueado em

placas contendo meio Mueller Hinton ágar, quando então estas foram incubadas de 3 a 7

dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após este período de

incubação, as colônias crescidas foram contadas para determinar a UFC (unidades

formadoras de colônias).

Produção do extrato proteico de M. massiliense

A partir do inóculo de M. massiliense produzido para infecção coletou-se 1 mL

deste e em seguida foi realizada centrifugação por 6000rpm durante 10 min. Desprezou-

se o sobrenadante, e o ressuspendeu-se o pellet em 500ul de PBS, posteriormente este

volume foi sonicado por 10 ciclos de 30s cada. Feito isso o pellet foi novamente

centrifugado, porém em uma rotação de 10000rpm, durante 10min. Depois disso o

sobrenadante foi desprezado e o pellet foi ressuspendido em 500ul de PBS, quando

então foi fervida por 5min. A concentração do extrato proteico foi considerada 1

mg/mL.

ELISA

Foram coletados sangue para a obtenção de soro e realização da técnica de

ELISA para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para o extrato proteico.

Placas de poliestireno de 96 orifícios (Nunc) foram adsorvidas com o extrato proteico

de M. massiliense (10 µg/mL) diluídos em tampão carbonato/bicarbonato de sódio

0,05M (pH 9,6) e incubadas por 18 h a 4°C. Após este período, as placas foram

bloqueadas por 2 h a 37°C com tampão carbonato/bicarbonato de sódio contendo leite

desnatado 1%. As amostras de soros foram diluídas a 1:80 e adicionadas nos orifícios,

com posterior incubação por 2 h a 37°C. Depois as placas foram lavadas seis vezes com

Tampão Sódio-Fosfato (PBS) Tween 20 0,05%. Os anticorpos conjugados a biotina

(anti-mouse IgG1 e IgG2a Pharmingen) foram diluídos a 1:5000 em PBS contendo leite

desnatado 0,1% (PBSL) e adicionados aos orifícios da placa. Após incubação por 1 h a

37°C, as placas foram lavadas por seis vezes com PBS Tween 20 0,05%.

Estreptoavidina-peroxidade (BD Biosciences) diluída em PBSL a 1:10000 foi

adicionada aos orifícios e as placas foram incubadas por 1 h a 37°C. Novamente as

placas foram lavadas. A reação foi revelada com o tampão citrato-fosfato pH 4,5

contendo OPD (ortho-phenylenediamine - Merck) e água oxigenada a 20 V. A reação

enzimática foi finalizada com a adição de ácido sulfúrico 4 N. As placas foram lidas a

492 ηm na leitora de ELISA (LabsystemsMultiskanThermo).

Análise estatística

Os resultados apresentados neste trabalho foram tabulados no Prism 5 software

(Graphpad Software 5.0), expressos como média ± SD. Analise estatística múltipla

(Kruskal Wallis seguido de teste de Dunn’s) foi utilizada para avaliar as possíveis

diferenças entre os grupos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente

significativo.

RESULTADOS

Para avaliar o perfil da resposta imune induzida pela infecção com M.

massiliense em camundongos BC-F1, o sangue de todos os animais foi coletado nos

dias 7, 14, 21 e 30 de infecção. Posteriormente foi determinado no soro os níveis de

anticorpos IgG1 e IgG2a anti-extrato proteico de M. massiliense. Como demonstrado na

(Figura 1A), em todos os pontos em que os níveis séricos de anticorpos foram

determinados houve uma semelhança nos níveis entre as duas classes de anticorpos

IgG1 e IgG2a. Com quatorze dias de infecção foi observados níveis significativos de

anticorpos tanto da classe IgG1 quanto IgG2a quando comparado com o grupo salina

(Figura 1B). Estes resultados demonstram que camundongos BC-F1 apresentam um

perfil de resposta balanceada frente a infecção por M. massiliense.

Figura 1. Níveis séricos de anticorpos específicos anti-extrato proteico de M.

massiliense após o desafio intravenoso com M. massiliense GO06. Camundongos BC-

F1 foram infectados com 106 UFC/mL de M. massiliense GO06. (A) aos 7, 14, 21 e 30

dias de infecção, os níveis séricos de anticorpos IgG1 e IgG2a foram avaliados. (B)

comparação dos níveis séricos de anticorpos específicos IgG1 e IgG2a anti-extrato

protéico de M. massiliense em camundongos BC-F1 aos 14 dias de infecção com M.

massiliense. Diferença estatística: * (p<0,05).

Como observado na Figura 1, os camundongos BC-F1 apresentaram níveis

similares de anticorpos das classes IgG1 e IgG2a sendo um perfil balanceado de

resposta. Diante disso, foi avaliado se esse balanço nos níveis de anticorpos, permitiu o

controle ou não da infecção por M. massiliense. Para isso, camundongos BC-F1

infectados por via endovenosa com M. massiliense foram eutanasiados nos dias 7, 14,

21 e 30, para coleta dos pulmões, baço e fígado. Os quais foram posteriormente

homogeneizados e plaqueados em meio MH para determinação da carga bacteriana. A

figura 2 demonstra que camundongos BC-F1 infectados por via endovenosa com M.

massiliense apresentaram um controle da infecção, sendo observado a formação de uma

curva descendente na cinética da carga bacilar determinada nos órgãos dos animais.

Este resultado demonstra que a resposta imune apresentada por camundongos BC-F1

contra M. massiliense foi efetiva na redução da carga bacilar nos três órgãos avaliados,

reduzindo após 30 dias de infecção três logs de UFC no baço. Já no fígado e pulmão foi

observado apenas a redução de 1,5 logs de UFC.

Figura 2. Determinação da carga bacilar no pulmão, baço e fígado de camundongos

BC-F1 nos dias 7, 14, 21 e 30 de infecção por via intravenosa com 10 6 UFC/mL de M.

Massiliense GO06.

DISCUSSÃO

Neste estudo foi avaliada a susceptibilidade de camundongos híbridos BC-F1,

oriundos do cruzamento entre as linhagens BALB/c e C57BL/6, a cepa de M.

massiliense GO06.

Nossos resultados demonstram que frente a infecção por M. massiliense,

camundongos BC-F1 apresentam níveis igualitários das classes de anticorpos IgG1 e

IgG2a específicos para M. massiliense. Possivelmente, esse semelhança nos níveis de

classes de anticorpos pode estar relacionada a diversidade do MHC apresentada por esta

linhagem. Pois esta é oriunda do cruzamento de duas linhagens que apresentam

respostas imunes diferentes frente a infecção por patógenos intracelulares. Enquanto

camundongos BALB/c montam uma resposta do tipo Th2 com produção de IgG1,

camundongos C57BL/6 geram uma resposta Th1 com produção de IgG2a (REF). Essas

duas linhagens apresentam sucetibilidade a infecção por M. massiliense, isso mostra que

a polarização da resposta imune não ideal para o controle da infecção. Assim, uma

resposta imune balanceada pode ser ideal no controle da infecção e na manutenção do

órgão infectado por patógenos intracelulares.

Em nosso trabalho foi observado que os camundongos BC F1 que apresentaram

uma resposta imune balanceada, foram capazes de controlar a infecção por M.

massiliense, reduzindo carga bacilar no baço, fígado e pulmão. Possivelmente este

controle observado é devido a resposta imune gerada por esta linhagem de

camundongos, sendo diferente da observada em um estudo realizado por De Souza et

al., com a mesma cepa em linhagens diferentes. Neste estudo foi observado que tantos

camundongos BALBc que apresentam uma resposta imune predominantemente Th2 e

C57bl6 do tipo Th1, não foram capazes de reduzir a carga bacilar nos órgãos avaliados.

Estes dados demonstram que a polarização de único tipo de resposta não é ideial para o

controle da para infecção por M. Massiliense, sendo necessário o balanço entre ambos

os tipos de respostas imunes (REF).

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