inno-lipa hla-c amplification · table of contents english symbols used . . . . . . . . . . . . . ....

25015 v22004-03-10In

noge

netic

s ©

200

4

INNO-LiPA HLA-C Amplification

Distributed by:INNOGENETICS GmbHLembecker Straβe 1946359 Heiden (Westfalen)Germany

+49 2867 99 07 0

INNOGENETICS s.a.r.l.8, Rue du Maréchal de Lattre-de-Tassigny59800 LilleFrance

+33 1 49 93 26 18 INNOGENETICS S.r.lVia del Mare 3600040 Pomezia (Roma)Italy

+39 0691 180375

INNOGENETICS N.V.Technologiepark 69052 GhentBelgium

+32 9 329 1329

INNOGENETICS Diagnostica yTerapeutica (IDT) S.A.Calle Botánica 14608908 Hospitalet de Llobregat (Barcelona)Spain

+34 93 600 8000

Manufactured by:INNOGENETICS N.V.Technologiepark 69052 GhentBelgium

+32 9 329 1329

TABLE OF CONTENTS

English Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5Test Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

Description, preparation for use and recommended storageconditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Specimen (preparation and storage) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

DNA extraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8PCR mix preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8PCR cycling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8Test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10

Visualization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

FrançaisSymboles utilisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

Description, préparation et conditions de conservation . . . . .13Matériel nécessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Consignes de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Echantillons (préparation et conservation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

Extraction ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Préparation du mélange PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15Amplification PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

Remarques et précautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15Procédures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

Visualisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

INNOGENETICS®*

2 * INNOGENETICS® is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.

Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19Deutsch

Verwendete Symbole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20Gelieferte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit . . . . .20Zusätzlich benötigte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21Sicherheitshinweise und Entsorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22Herstellung und Aufbewahrung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

DNA-Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22Herstellen des PCR-Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22PCR-Cycling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

Visualisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Einschränkungen des Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26Leistungsfähigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

ItalianoSimboli utilizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni diconservazione raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29Campioni (preparazione e conservazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

Estrazione del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30Preparazione della mix di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30Protocollo di PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30Procedura del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33

Visualizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34

Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34


3

Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35Español

Símbolos utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35Uso al que está destinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36Principios del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36

Descripción, preparación para el uso y condiciones dealmacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36

Materiales necesarios pero no suministrados . . . . . . . . . . . . . . . . . .37Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37Recogida (preparación y almacenamiento de muestras) . . . . . . . . .38

Extracción de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38Preparación de la mezcla para la PCR (reacción en cadena dela polimerasa) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38Ciclos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38

Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39Procedimiento del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

Visualización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

PortuguêsSímbolos utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43Indicações de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43Princípio do Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

Descrição, preparação e condições de conservaçãorecomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

Materiais necessários mas não fornecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45Segurança e meio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45Amostras (preparação e conservação) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

Extracção do ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Preparação da mistura de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Ciclos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

Observações e precauções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Procedimento do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

Visualização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

INNOGENETICS®

4

Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50Performance do Teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

English

Symbols used

Amplification kit

Manufactured by

In vitro diagnostic medical device

Lot number

Catalogue number

Use by

Consult instructions for use

Temperature limitation

Contains sufficient for <n> tests

Primer Solution

Amplification Buffer

LiPA-Taq

Intended use

The INNO-LiPA HLA-C Amplification kit, for in vitro use, is intended forthe nucleic acid amplification of the second and third exons of the human


5

leukocyte antigen (HLA) C locus. The reaction is performed by means ofthe polymerase chain reaction (PCR)*.

Test Principle

The DNA sample to be amplified by PCR*, is introduced in a reagentmixture containing an excess of deoxynucleoside 5'-triphosphates(dNTPs), biotinylated primers, and thermostable DNA polymerase. Theprimers will amplify exon 2 and exon 3 of the HLA-C locus, and aretherefore called "HLA-C primers". By heating, the two strands of theDNA helix are separated (denaturation) in order to expose the targetsequences to the primers. These primers are complementary to the regionsflanking the target sequence. Therefore, upon cooling to a specifictemperature, the primers will bind to their target region (annealing).

At another temperature, and utilizing the dNTPs, the thermostable DNApolymerase will extend the annealed primers along the target template(extension). This way, two exact biotinylated copies of the templatesequence are produced after one cycle of denaturation, annealing andextension. After 35 cycles, a multi-amplified biotinylated target sequenceis obtained.

* The use of this product is covered by a license of F. Hoffmann - LaRoche Ltd and Roche Molecular Systems, Inc.

Reagents

Description, preparation for use and recommended storage conditions

- If kept at -15/-25°C and stored in the original vials, the reagents arestable until the expiry date from the kit. However it is recommendedto aliquot reagents after first use (except for LiPA-Taq) and thenstore at -15/-25°C. Do not use the reagents beyond the expiry date.

- All reagents should be brought to room temperature (20 - 25°C)approximately 60 minutes before use and should be returned to thefreezer immediately after use.

- The reagents should be stored isolated from any source ofcontaminating DNA, especially amplified products.

- Alterations in physical appearance of the kit reagents may indicateinstability or deterioration.

INNOGENETICS®

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Reagents supplied:

Component Quantity Ref. DescriptionAmplification Buffer 1 x 0.3 ml 56722 Containing all dNTPs and 0.05%

NaN3 as preservative.Primer Solution 1 x 0.3 ml 57028 Containing biotinylated primers,

MgCl2, DMSO and 0.05% NaN3as preservative.

LiPA Taq 1 x 0.035 ml 56723 Taq DNA Polymerase and 0.05%NaN3 as preservative.

Materials required but not provided

- Materials for DNA extraction- Disposable gloves- Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged)- Sterile microtubes- Microtube racks- Microtube centrifuge- DNA Thermal Cycler and equipment- Pipettes adjustable to deliver 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl- Mineral Oil, Silicone Grease (if required)- Autoclaved distilled water

Safety and environment

- Please refer to manufacturer's safety data sheet and productlabeling for information on potentially hazardous components.

- Specimens should always be handled as potentially infectious.- Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety

spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.- Waste should be handled according to the institution's waste disposal

guidelines. All federal, state, and local environmental regulationsshould also be observed.

Specimen (preparation and storage)

NOTE:- Reagents are not supplied


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DNA extraction

Commonly used salting-out DNA extraction methods or methods based onspin columns can be used to prepare genomic DNA starting from acid-citrate-dextrose (ACD)- or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)-anticoagulated whole blood samples.

Store the DNA samples -15/-25°C.

The extracted DNA should have a concentration ≥≥ 0.02 µg/µl. Thepurity (A260nm/A280nm) should be ≥≥ 1.5.

PCR mix preparation

Each component must be added, and supplied in the right amount. Toomuch or too little sample or reagents might result in aspecificamplification or even in no amplification at all.

PCR cycling

The right temperature profile for the INNO-LiPA HLA-C Amplificationshould be selected.

Remarks and precautions

- In order to avoid DNA contamination, a maximum physicalseparation between the pre- and post-amplification steps isrecommended: separate rooms, separate pipettes and other labmaterial, separate lab coats and gloves (and their stock) are minimumprecautions for good laboratory practice. The reagents should beisolated from any source of contaminating DNA, especially amplifiedDNA products. Also avoid microbial contamination of reagents.

- Avoid any return from the post-amplification room to the pre-amplification room.

- All pipette tips and tubes used for the amplification process shouldbe autoclaved. Pipette tips with cotton plugs are recommended. Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen.

- The reagents for amplification processes should be handled in aroom free of amplified DNA. Autoclaved tubes and pipette tips(preferably cotton-plugged) should be used.

- After thawing, vortex Amplification Buffer and Primer Solution, andspin down all reagents, especially LiPA-Taq.

INNOGENETICS®

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Test procedure

NOTE:- This protocol for the amplification of exon 2 to exon 3 of the HLA-C

alleles was designed for optimal amplification using GeneAmp™PCR tubes (0.5 ml) and PE-480 (Perkin Elmer Cetus) thermalcyclers, or MicroAmp® PCR tubes (0.2 ml) and PE-2400 or PE-9600(Perkin Elmer Cetus) thermal cyclers, and LiPA-Taq.

- This protocol can be used for most commercial types of thermalcyclers, but may require some modifications indicated by themanufacturer of the cycler.

- Prior to use, determine whether the protocol is compatible with thethermal cycler in use at your laboratory. Ensure the thermal cycleris calibrated prior to use.

- Take the necessary precautions to avoid non-specific amplificationand primer-dimer formation, which may impair the results:• Perform the pipetting steps on ice and without delay.• Preheat (96°C) the heating block of the thermal cycler before

inserting the samples, and immediately start the cycling processafterwards.

• Keep the LiPA-Taq at -15/-25°C until immediately before use.

1. Dilute each genomic DNA to a concentration between 0.02 and 0.25 µg/µl in TE buffer.

2. Determine the number of vials to be prepared (N) as:N = number of DNA samples + 1 (negative control; no DNA) + 1Using cotton-plugged pipette tips prepare a mastermix in anautoclaved 1.5 ml tube:

(N x 23.75 µl) autoclaved distilled water+ (N x 10 µl) Amplification Buffer+ (N x 10 µl) HLA-C Primer Solution+ (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2.5 U)The total volume of this amplification mix is now (N x 45 µl). Vortex briefly and aliquot 45 µl of this mastermix into (N-1)autoclaved amplification tubes.

3. Add 2 drops (~ 40 µl) of mineral oil into each tube if required (e.g. when using the PE-480). Pipette 5 µl (0.10 to 1.25 µg) of thegenomic DNA preparation (through the mineral oil if required). Add5 µl of distilled water (no DNA) to the negative control tube.


9

NOTE:• Do not vortex or mix!• Check that the amplification mixture is at the bottom of the tube!

4. Place the samples into the preheated and calibrated thermal block(see instructions indicated by the manufacturer of the thermal cycler).Start the amplification program designed for the HLA-C amplification.HLA-C amplification profile (cycler type: PE-480, PE-2400, PE-9600):

NOTE: • The same amplification profile is used for all INNO-LiPA HLA

class I products.5. After the amplification process, use the samples immediately with

the INNO-LiPA HLA-C test strips or store the samples at -15/-25°C.NOTE:• Do not store the amplified DNA products together with unused

amplification reagents.

Results

Visualization

- The presence of the amplified product can be checked in a 2%agarose gel. Load 10 µl of the amplified product per slot. The amplicon should appear as a single band with a length of 904 bp.

step temp time1. denature 96°C 5 min.

2. denature 96°C 30 sec. repeat cycle3. anneal primers 64°C 50 sec. step 1 to 44. extend primers 72°C 50 sec. 5 times




14. elongate 72°C 10 min.

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- In-house observations indicate that, if a band with length 904 bp isvisible after checking 10 µl of a 1/10 dilution of the amplifiedproduct on a 2% agarose gel, an interpretable result should be givenby the LiPA assay.

Validation

- Include at least one positive and one negative control each time anamplification is performed. As with any new laboratory procedure,the inclusion of additional positive and negative controls should beconsidered until a high degree of confidence is reached in the abilityto correctly perform the test procedure. If the inclusion of anadditional positive control is desirable, use a known positive sample.

- If a positive band is obtained in the gel for the negative control, the entirerun should be discarded and the complete procedure should be repeated.

Limitations of the procedure

- Use of this product should be limited only to personnel well trainedin the techniques of amplification.

- Polymerase inhibition (e.g. by heparin, haemoglobin) might be thereason for complete failure of the assay!

- Powder from disposable gloves and sodium hypochlorite have aninhibiting effect on amplification.

- Repeated freezing/thawing of the DNA samples might result in lessefficient amplification.

- The sequence at the primer binding site is not known for all alleles. Therisk of mismatch at the primer site is considered to be very low as primerfailure has never been observed and significant numbers of allelesspanning all groups have been tested. However, the possibility of allelicdrop-out should be considered in the event of a homozygous result.

- Good laboratory practice and careful performance of the procedurespreviously specified allow specific amplification.

Test performance

LiPA HLA-C has been evaluated in seven European tissue typinglaboratories on routine typing samples.

During the study a total of 269 samples were tested with LiPA HLA-C.All the samples were successfully amplified.


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Français

Symboles utilisés

Trousse d'amplification

Fabriqué par

Produit pour diagnostic in vitro

Numéro du lot

Référence catalogue

Utiliser avant

Instructions d'emploi

Température de stockage

Conditionnement suffisant pour x tests

Solution Primers

Tampon Amplification

LiPA-Taq

But du test

Le kit INNO-LiPA HLA-C Amplification, à usage in vitro, est destiné àl'amplification des acides nucléiques des exons 2 et 3 du locus HLA-C(human leukocyte antigen). La réaction est réalisée par des réactions enchaîne de polymérisation (PCR)*.

INNOGENETICS®

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Principe du test

L'ADN de l'échantillon à amplifier par PCR est introduit dans un milieuréactionnel contenant en excès des désoxynucléosides 5'-triphosphates(dNTPs), des primers biotinylés et de l'ADN polymérase thermostable. Lesprimers amplifient les exons 2 et 3 du locus HLA-C et sont donc dénommés «primers HLA-C ». Par chauffage, les deux brins de l'hélice ADN se séparent(dénaturation) ouvrant les séquences cibles aux primers. En abaissant latempérature à une température spécifique, les primers vont se fixer aux régionsde séquences complémentaires encadrant la séquence cible (annealing).

A une autre température spécifique, l'ADN polymérase va utiliser les dNTPsen excès pour faire une élongation des primers fixés le long du brin d'ADNcible (extension). Ainsi, deux copies biotinylées de la séquence d'ADN ciblesont produites après un cycle. Après 35 cycles, un nombre important decopies biotinylées de la séquence cible sont obtenues.

* L'utilisation de ce produit est couverte par une licence de F.Hoffmann - La Roche Ltd et Roche Molecular Systems, Inc.

Réactifs

Description, préparation et conditions de conservation

- Maintenus entre -15/-25°C, dans le flacon d'origine, les réactifs sontstables jusqu'à la date de péremption du kit. Après la premièreutilisation, il est recommandé d'aliquoter les réactifs (A l'exceptionde LiPA Taq) et de les conserver entre -15/-25°C. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption du kit.

- Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante (20 - 25°C) environ 60 minutes avant utilisation et recongelésaussitôt après usage.

- Les réactifs doivent être stockés isolés de toute source d'ADNcontaminant, spécialement des produits ADN amplifiés.

- L'altération de l'apparence physique des réactifs peut indiquer uneinstabilité ou une détérioration.

Composant Quantité Réf. DescriptionTampon Amplification 1 x 0.3 ml 56722 Contient tous les dNTPs et 0.05%

NaN3 comme conservateur.


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Solution Primers1 x 0.3 ml 57028 Contient les primers biotinylés,MgCl2, DMSO et NaN3 commeconservateur.

LiPA-Taq 1 x 0.035 ml 56723 Contient la Taq ADN polyméraseet 0.05% NaN3 commeconservateur.

Matériel nécessaire non fourni

- Matériels pour extraction ADN- Gants jetables- Embouts de pipette stériles jetables (de préférence, avec filtre coton)- Microtubes stériles- Portoirs pour microtubes- Centrifugeuse pour microtubes- Thermocycleur et équipement- Pipettes ajustables pour les volumes 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000µl- Huile minérale (si besoin)- Eau distillée autoclavée

Consignes de sécurité

- Se référer aux fiches de sécurité du fabricant et à l'étiquetage duproduit pour toute information sur les risques potentiels descomposants.

- Les échantillons doivent toujours être manipulés commepotentiellement dangereux.

- Utiliser un équipement de protection: gants et écrans de protectionlors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.

- Les déchets devront être éliminés selon les directives en vigueur etles règlements pour la préservation de l'environnement.

Echantillons (préparation et conservation)

NOTE: - Les réactifs ne sont pas fournis.

Extraction ADN

Les méthodes d'extraction ADN communément utilisées, précipitation ousur colonne, peuvent être utilisées pour préparer l'ADN génomique à

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partir d'échantillons de sang recueilli sur ACD (acide -citrate-dextrose) ouEDTA (acide ethylenediaminetetraacétique).

Conserver les extraits ADN entre -15/-25°C.

Les extraits ADN doivent avoir une concentration ≥≥ 0.02 µg/µl. Lapureté (A260nm/A280nm) devra être ≥≥ 1.5.

Préparation du mélange PCR

Chaque composant doit être ajouté et présent à la bonne concentration.Trop ou pas assez d'échantillon ou de réactifs peut conduire à uneamplification aspécifique ou même à une absence d'amplification.

Amplification PCR

Le programme d'amplification défini pour INNO-LiPA HLA-CAmplification doit être sélectionné.

Remarques et précautions

- Pour éviter toute contamination ADN, une séparation physique maximaleest recommandée entre les étapes de pré- et post-amplification: piècesséparées, pipettes et matériel de laboratoire distincts, gants et blouses (etleur stock) séparés sont des précautions minimum pour une bonnepratique de laboratoire. Les réactifs doivent être isolés de toute source decontamination ADN, plus particulièrement de produits amplifiés. Eviteraussi les contaminations microbiennes des réactifs.

- Eviter de retourner en zone pré-amplification après un passage enpost-amplification.

- Les tubes et les embouts de pipette doivent être autoclavés. Desembouts avec filtre coton sont recommandés. Utiliser un nouvelembout stérile à chaque aliquote d'échantillon.

- Les réactifs utilisés lors de l'amplification doivent être manipulésdans une pièce dépourvue de matériel amplifié. Utiliser des tubesautoclavés et des embouts de pipettes avec filtre coton.

- Après décongélation, homogénéiser au vortex le tamponAmplification et la solution Primers, puis centrifuger brièvement tousles réactifs, spécialement LiPA-Taq.


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Procédures

NOTE: - Ce protocole pour amplification des exon 2 à 3 du gène HLA-C a été

préparé pour une amplification optimale en utilisant les tubes PCRGeneAmp™ (0.5 ml) et thermocycleur PE-480 (Perkin Elmer) ou lestubes PCR MicroAmp® (0.2 ml) et thermocycleur PE-2400, PE-9600 ou PE-9700 (Perkin Elmer) et l'ADN polymérase LiPA-Taq.

- D'autres thermocycleurs peuvent être employés mais peuventnécessiter des modifications selon les indications du fabricant.

- Avant utilisation, déterminer si le protocole est compatible avec lethermocycleur du laboratoire. S'assurer que le thermocycleur estcorrectement calibré.

- Pendre les précautions nécessaires pour éviter toute amplificationnon-spécifique et la formation de primer-dimers qui peuvent affecterles résultats :• Réaliser les étapes de pipetage en maintenant les tubes dans de

la glace, et sans interruption.• Préchauffer le bloc chauffant du thermocycleur (96°C) avant

d'insérer les tubes et démarrer immédiatement le programmed'amplification.

• Maintenir LiPA Taq entre -15/-25°C jusqu'à utilisation.

1. Diluer chaque extrait ADN à une concentration entre 0.02 et 0.25 µg/µl en tampon TE.

2. Déterminer le nombre de tubes (N) nécessairesN = Nombre d'échantillons + 1 Contrôle négatif (sans ADN) + 1Avec des embouts stériles munis de filtre coton, préparer unmastermix dans un tube (1.5 ml) autoclavé:

(N x 23.75 µl) eau distillée autoclavée+ (N x 10 µl) Tampon Amplification + (N x 10 µl) Solution Primers HLA-C + (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2.5 U) Le volume total du Mastermix est de N x 45 µl. Vortexer brièvement et aliquoter 45 µl de ce mastermix dans N-1tubes autoclavés pour amplification.

3. Si nécessaire, ajouter 2 gouttes (~40 µl) d'huile minérale dans chaquetube (e. g. PE-480).Introduire 5 µl (0.10 à 1.25 µg) d'ADN génomique extrait (à traversl'huile minérale si présente) et 5 µl d'eau distillée dans le tubeContrôle Négatif (sans ADN).

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NOTE:• Ne pas mélanger !• Vérifier que le mélange réactionnel est au fond du tube.

4. Placer immédiatement les tubes dans le bloc préchauffé et calibré duthermocycleur (voir les instructions fournies par le fabricant duthermocycleur). Démarrer le programme d'amplification INNO-LiPAHLA-C Amplification.Programme d'amplification INNO-LiPA HLA-C Amplification:

NOTE: • Le même programme pour amplification est utilisable pour tous

les produits INNO-LiPA HLA classe I.5. Après l'amplification, procéder immédiatement au test INNO-LiPA

HLA-C ou conserver les échantillons entre -15/-25°C.NOTE:• Ne pas conserver les produits amplifiés avec des réactifs pour

amplification non utilisés.

Etape Température Temps Nb. cycles1. Dénaturation 96°C 5 min.

2. Dénaturation 96°C 30 sec. Répéter cycle 3. Annealing 64°C 50 sec. <1+2+3+4>4. Extension 72°C 50 sec. 5 fois

5. Dénaturation 96°C 30 sec. Répéter cycle 6. Annealing 62°C 50 sec. <5+6+7>7. Extension 72°C 50 sec. 5 fois



14. Elongation 72°C 10 min.


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Résultats

Visualisation

- La présence des amplicons peut être vérifiée en gel d'agarose 2%.Déposer 10 µl de chaque produit amplifié dans un puits sur le gel.L'amplification INNO-LiPA HLA-C produit un amplicon de 904 pb.

- Sur la base d'observations internes, si une bande est visible après dépôtde 10 µl de produit amplifié dilué au 1/10ème sur un gel d'agarose à2%, un résultat interprétable peut être obtenu par test LiPA.

Validation

- Inclure au moins un contrôle négatif et un contrôle positif danschaque série d'amplification. Comme pour toute nouvelle procédure,l'inclusion de contrôles négatifs et positifs supplémentaires peut êtreenvisagée jusqu'à maîtrise parfaite du test avec un niveau deconfiance élevé. Si l'inclusion d'un contrôle positif est envisagée,utiliser un échantillon positif connu.

- Si une bande positive est obtenue sur le gel pour le contrôle négatif,la série entière doit être invalidée et une procédure complète doit êtrerecommencée.

Limites du test

- L'utilisation de ce test doit être restreinte au personnel ayant reçu uneformation pour les techniques d'amplification génomique.

- Une inhibition de la polymérase (e.g. héparine, hémoglobine) peutconduire à un échec complet d'amplification.

- Le talc des gants jetables et l'hypochlorite de sodium ont un effetinhibiteur sur l'amplification.

- Les cycles répétés de congélation/décongélation des extraits ADNpeuvent affecter le rendement d'amplification.

- La séquence au site de fixation des primers n'est pas connue pourtous les allèles. Le risque de mésappareillement au site de fixationdes primers est considéré comme extrêmement faible puisque l'échecd'amorçage des primers n'a jamais été observé et que des nombressignificatifs d'allèles couvrant tous les groupes ont été testés.Cependant, la possibilité d'un manquement d'allèle ne peut pas êtretotalement exclue face à un résultat homozygote.

- Les bonnes pratiques de laboratoire et le respect des précautions demanipulation spécifiées assurent une amplification spécifique.

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Performances

INNO-LiPA HLA-C ont été évaluées dans sept laboratoires européensd'histocompatibilité sur des échantillons de routine à typer.

Au total, 269 échantillons ont été analysés avec INNO-LiPA HLA-C. Tousles échantillons ont été amplifiés avec succès.

Deutsch

Verwendete Symbole

Amplifikationskit

Hersteller

Hilfsmittel für die medizinische In vitroDiagnostik

Chargennummer

Katalognummer

Durchführung durch

Siehe Bedienungsanleitung

Temperaturlimits

Inhalt ausreichend für <n> Tests

Primerlösung

Amplifikationspuffer

LiPA Taq


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Beabsichtigter Verwendungszweck

Der INNO-LiPA HLA-C Amplification Testkit ist für die in-vitro-Verwendung bestimmt. Er dient der Amplifikation der Nukleinsäuren deszweiten und dritten Exons des humanen Leukozytenantigen (HLA) Locus C.Die Reaktion wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)*durchgeführt.

Funktionsweise des Tests

Die DNA-Probe, die mittels PCR* amplifiziert werden soll, wird in eineReaktionsmischung gegeben, die einen Puffer mit einem Überschuss anDesoxynukleosid-5'-Triphosphaten (dNTPs), biotinylierten Primern undhitzestabiler DNA-Polymerase enthält. Die Primer amplifizieren Exon 2und 3 des HLA-C-Lokus und tragen daher den Namen „HLA-C-Primer".Durch Erhitzen werden beide Stränge der DNA-Doppelhelix voneinandergetrennt (Denaturierung), sodass die Zielsequenzen für die Primerfreiliegen. Die Primer haben eine Sequenz, die der der Regionen, die dieZielsequenz flankieren, komplementär ist. Bei Abkühlung auf einebestimmte Temperatur binden diese Primer an die Zielregion (Annealing).

Bei einer anderen bestimmten Temperatur verlängert die thermostabileDNA-Polymerase mit Hilfe der dNTPs die gebundenen Primer längs derZielsequenz (Verlängern). Auf diese Weise entstehen nach einem Zyklusaus Denaturieren, Annealing und Verlängern zwei exakte, biotinylierteKopien der Zielsequenz. Nach 35 Zyklen hat sich eine sehr große Zahlbiotinylierter Kopien der Zielsequenz gebildet.

* Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine Lizenz F. Hoffmann -La Roche Ltd. und Roche Molecular Systems, Inc. lizensiert.

Gelieferte Materialien

Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit

- Alle Reagenzien sind bei Aufbewahrung in den Originalgefäßen bei -15/-25°C bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil. UmKontamination und Zersetzung zu vermeiden, wird empfohlen, alle Reagenzien mit Ausnahme von LiPA-Taq zu aliquotieren und bei-15/-25°C einzufrieren. Verwenden Sie den Kit nicht nachÜberschreitung des Verfallsdatums.

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- Alle Reagenzien sollten ca. 60 Minuten vor Gebrauch aufRaumtemperatur (20 - 25°C) gebracht und nach Gebrauchunmittelbar wieder im Tiefkühlschrank gelagert werden.

- Der Kit muss so aufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mitanderer DNA, vor allem mit amplifizierter DNA, kontaminiertwerden kann.

- Alle Änderungen im physischen Erscheinungsbild der Kit-Reagenzien können auf Instabilität oder Zersetzung hinweisen.

Gelieferte Materialien:Bestandteil Menge Katalog- Beschreibung

nummerAmplifikations-puffer 1 x 0,3 ml 56722 Enthält alle dNTPs und 0,05%

Natriumazid alsKonservierungsmittel.

Primerlösung 1 x 0,3 ml 57028 Enthält biotinylierte Primer,MgCl2, DMSO und 0,05%Natriumazid alsKonservierungsmittel.

LiPA-Taq 1 x 0,035 ml 56723 Enthält Taq DNA-Polymerase (2 U/µl) und 0,05% Natriumazidals Konservierungsmittel.

Zusätzlich benötigte Materialien

- Materialien für die DNA-Extraktion.- Einmalhandschuhe.- Sterile Einmalpipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen).- Sterile Mikrogefäße.- Racks für Mikrogefäße.- Mikrozentrifuge.- DNA-Thermocycler und Zubehör.- Pipetten mit variablem Volumen: 1 - 20 µl, 20 - 200 µl und

200 - 1000 µl.- Autoklaviertes destilliertes Wasser.- Gegebenenfalls Mineralöl und Silikonfett.


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Sicherheitshinweise und Entsorgung

- Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellersund die Produktkennzeichnung bezüglich gefährlicherSubstanzen.

- Behandeln Sie alle Proben als potenziell infektiös.- Bei Beseitigung der Chemikalien sind neben hausinternen

Vorschriften die entsprechenden Gesetze bzw. Verordnungen der EG-Mitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland und derBundesländer zu beachten.

- Verwenden Sie Schutzkleidung, wenn notwendig: bei der Arbeit mitinfektösen oder gefährlichen Substanzen Handschuhe undSchutzbrille tragen.

Herstellung und Aufbewahrung der Proben

HINWEIS:- Die hierfür benötigten Reagenzien sind nicht im Lieferumfang des

Kits enthalten.

DNA-Extraktion

Zur Herstellung genomischer DNA können Blutproben verwendet werden,die ACD (=Acid-Citrat-Dextrose) oder EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure) als Gerinnungshemmer enthalten. ZurIsolation von DANN können die bekannten Methoden (DANN Fällungdurch Aussalzen oder Säulenextraktion) verwendet werden.

DNA-Proben bei -15/-25°C aufbewahren.

Die extrahierte DNA muss in einer Konzentration von 0,02 µg/µlvorliegen. Die Reinheit (A260nm/A280nm) muss ≥≥ 1,5 sein.

Herstellen des PCR-Mix

Alle Bestandteile müssen in den angegebenen Mengen zugegeben werden.Bei Zugabe von zuviel oder zuwenig Probe oder Reagens kann dieAmplifizierungsreaktion unspezifisch ablaufen oder möglicherweisevollständig inhibiert sein.

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PCR-Cycling

Für den INNO-LiPA HLA-C Amplification muss das angegebeneTemperaturprofil eingestellt werden.

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

- Zur Vermeidung von Kontamination müssen die Arbeitsschritte vorund nach der Amplifikation räumlich voneinander getrennt werden.Zur Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) wird dringend dieVerwendung getrennter Gefäße, Pipetten etc. und auch das Tragengetrennter Laborkittel und -handschuhe empfohlen. Der Kit muss soaufbewahrt werden, dass er auf keinen Fall mit anderer DNA, vorallem mit amplifizierter DNA, kontaminiert werden kann. DieReagenzien dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein.

- Vermeiden Sie, zwischen den beiden Arbeitsplätzen hin- undherzugehen.

- Alle für die Amplifikation verwendeten Reaktionsröhrchen undPipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen) müssen autoklaviertsein. Verwenden Sie Einmalprodukte, und verwerfen Sie diese nacheinmaligem Gebrauch.

- Die Reagenzien für die Amplifikation müssen in einem Raumhergestellt werden, in dem kein amplifizierte DNA vorhanden ist.Reaktionsröhrchen und Pipettenspitzen (möglichst mit Wattestopfen)müssen autoklaviert sein.

- Mischen Sie Amplifikationslösung und Primerlösung nach demAuftauen kurz auf einem Vortex-Mischer durch. Zentrifugieren Siealle Reagenzien kurz, vor allem LiPA-Taq.

Arbeitsablauf

HINWEIS:- Das hier beschriebene Amplifikationsprotokoll für die Amplifikation

der Exons 2 und 3 der HLA-C-Allele ist optimiert für das Arbeitenmit GeneAmp™ PCR-Gefäßen (0,5 ml) und einem ThermocyclerPE-480 (Perkin Elmer) oder MicroAmp® PCR-Röhrchen (0,2 ml)und einem Thermocycler PE-2400 oder PE-9600 (Perkin Elmer)unter Verwendung von LiPA-Taq.

- Das Arbeitsprotokoll ist für die meisten handelsüblichenThermocycler geeignet, muss aber unter Umständen für denjeweiligen Gerätetyp optimiert werden.


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- Vor der Testdurchführung muss überprüft werden, inwieweit dasArbeitsprotokoll für den von Ihnen verwendeten Thermocyclergeeignet ist. Vor Verwendung muss der Thermocycler kalibriertwerden.

- Treffen Sie die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen, umunspezifische Amplifikation und die Bildung von Primer-Dimeren zuverhindern, weil dadurch die Qualität der Versuchsergebnissebeeinträchtigt werden könnte:• Alle im folgenden beschriebenen Pipettierschritte müssen

unverzüglich und im Eisbad durchgeführt werden.• Vor Einsetzen der Proben den Thermocycler auf 96°C erhitzen

und sofort mit der ersten Amplifikationsrunde beginnen.• LiPA-Taq bis unmittelbar vor Verwendung eingefroren (-15/-25°C)

lassen.

1. Genomische DNA mit TE-Puffer auf Konzentration zwischen 0,02und 0,25 µg/µl verdünnen.

2. Anzahl der benötigten Gefäße (N) bestimmen:N = Anzahl DNA-Proben + 1 (Negativkontrolle ohne DNA) + 1. Mit Hilfe einer Pipette mit Baumwollstopfen wird in einemautoklavierten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine Gesamtlösung(Mastermix) hergestellt:

(N x 23,75 µl) autoklaviertes destilliertes Wasser+ (N x 10 µl) Amplifikationspuffer+ (N x 10 µl) ) HLA-C-Primerlösung + (N x 1,25 µl) LiPA-Taq (N x 2,5 U).Das Gesamtvolumen beträgt nun (N x 45 µl).Kurz auf Vortex durchmischen und 45-µl-Aliquots der Gesamtlösungin (N - 1) in autoklavierte Amplifikationsgefäße einpipettieren.

3. Gegebenenfalls (z.B. bei Versuchsdurchführung mit PE-480) 2Tropfen (~ 40 µl) Mineralöl in jedes Röhrchen geben. 5 µl (0,1 bis1,25 µg) der genomischen DNA zugeben (gegebenenfalls durch dieMineralölschicht hindurch). In das Röhrchen für die Negativkontrolle(ohne DNA) 5 µl destilliertes Wasser geben.

4. WICHTIG:• Nicht schütteln (Vortex) oder mischen.• Sicherstellen, dass die Amplifikationsmischung sich auf dem

Röhrchenboden befindet!

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5. Proben in beheizten und kalibrierten Thermoblock stellen(Hinweise des Geräteherstellers beachten). Das spezifischeAmplifikationsprogramm für die HLA-C-Amplifikation starten.Amplifikationsprofil für HLA-C(für Thermocycler PE-480, PE-2400und PE-9600):

HINWEIS: • Die hier aufgeführten Amplifikationsschritte sind für alle

INNO-LiPA HLA Klasse-I-Produkte geeignet.6. Sofort nach der Amplifikation die Proben auf die INNO-LiPA HLA-C-

Teststreifen auftragen oder bei -15/-25°C einfrieren.WICHTIG:• Amplifizierte DNA-Produkte nicht mit unbenutzten

Amplifikationsreagenzien zusammen aufbewahren.

Ergebnisse

Visualisierung

- Die Präsenz von amplifiziertem Material kann durch Trennung ineinem 2%-igen Agarosegel geprüft werden. Jede Bahn wird mit 10µl Amplifikationsprodukt beladen. Die bei der INNO-LiPA HLA-C-PCR enstandenenen Produkte migrieren als einzelne Bande mit einerGröße von 904 bp.

Schritt Temperatur Zeit1. Denaturieren 96°C 5 min.

2. Denaturieren 96°C 30 sec. Schritte3. Annealing der Primer 64°C 50 sec. 1 - 44. Primer verlängern 72°C 50 sec. 5-mal wiederholen



11. Denaturieren 96°C 30 sec. Schritte12. Annealing der Primer 55°C 50 sec. 11 - 1313. Primer verlängern 72°C 50 sec. 15- mal wiederholen

14. Verlängern 72°C 10 min.


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- Interne Untersuchungen haben ergeben, dass die erhaltenenAmplifikationsprodukte für den LIPA-Test geeignet sind, wenn beiDurchführung des oben angegebenen Verfahrens (10 µlAmplifikationsprodukt, Verdünnung 1:10, 2%-iges Agarosegel) eineBande mit einer Größe von 904 bp zu sehen ist.

Validierung

- Bei jeder Amplifikationsserie müssen mindestens je eine Positiv- undeine Negativkontrolle mitgeführt werden. Wie bei jedem neuenLaborverfahren müssen so lange Positiv- und Negativkontrollenmitgeführt werden, bis die Erfahrung zeigt, dass deren Durchführungzu zuverlässigen Ergebnissen führt. Auf Wunsch kann auchzusätzlich eine bekannt positive Probe mitgeführt werden.

- Tritt bei der Negativkontrolle im Gel eine positive Bande auf, mussdie gesamte Serie verworfen werden, und der gesamte Ablauf musswiederholt werden.

Einschränkungen des Verfahrens

- Der Test darf nur von Laborpersonal ausgeführt werden, das dieTechnik der DNA-Amplifikation bereits beherrscht.

- Der Test kann vollständig zu negativen Ergebnissen führen, wenn diePolymerase z.B. durch Heparin oder Hämoglobin inhibiert wurde.

- Pulver von Einmalhandschuhen und Natriumhypochlorit inhibierendie Amplifikation.

- Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der DNA-Proben kann dieEffizienz der DNA-Proben beeinträchtigen.

- Die Sequenz an der Primerposition ist nicht für alle Allele bekannt.Die Gefahr von Fehlpaarungen an dieser Stelle ist sehr gering. Bisherwurden keine Fehlpaarungen beobachtet, obwohl eine großeProbenzahl getestet wurde. Jedoch sollte im Fall eines homozygotenErgebnisses die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass einAllel ausgefallen ist.

- Die Einhaltung der Guten Laborpraxis (GLP) und sorgfältigeDurchführung aller Arbeitsschritte werden dringend empfohlen, umspezifische Amplifikationsergebnisse zu erzielen.

Leistungsfähigkeit des Tests

Der LiPA HLA-C-Test wurde in 7 europäischenGewebetypisierungslabors mit Routinetypisierungsproben evaluiert.

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Bei dieser Studie wurden insgesamt 269 Proben mit Hilfe des LiPA HLA-Cgetestet. Alle Proben wurden erfolgreich amplifiziert.

Italiano

Simboli utilizzati

Kit de amplificación

Prodotto da

Dispositivo medico - diagnostico in vitro

Numero di lotto

Codice

Uso

Consultare le istruzioni per l'uso

Limiti di temperatura

Contenuto sufficiente per n test

Primer Solution

Amplification Buffer

LiPA Taq

Uso previsto

Il kit (per uso diagnostico in vitro) INNO-LiPA HLA-C Amplification èstato progettato per l'amplificazione del secondo e del terzo esone del


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locus C dell'antigene leucocitario umano (HLA). La reazione è condottaper mezzo della reazione polimerasica a catena (PCR)*.

Principio del test

Il campione di DNA da amplificare mediante PCR* viene aggiunto ad unamiscela di reagenti contenente un eccesso di deossinucleosidi 5' trifosfati(dNTP), primers biotinilati e DNA polimerasi termostabile. I primersamplificheranno l'esone 2 e l'esone 3 del locus HLA-C, e sono quindichiamati "HLA-C primers". Mediante riscaldamento, le due catene dell'elica di DNA vengono separate(denaturazione) in modo da esporre le sequenze target ai primers. Questi primers sono complementari alle regioni che fiancheggiano lasequenza target. Quindi, con il raffreddamento ad una specifica temperatura, iprimers si legheranno alla loro regione target (appaiamento).

Ad un'altra temperatura, la DNA polimerasi termostabile, utilizzando idNTP, estenderà i primers appaiati lungo il templato target (estensione). In tal modo vengono prodotte dopo un ciclo di denaturazione,appaiamento ed estensione due copie identiche biotinilate della sequenzatemplate. Dopo 35 cicli, si ottiene un gran numero di copie biotinilatedella sequenza target.

* L'utilizzo di questo prodotto è coperto da licenza di F. Hoffmann - LaRoche Ltd e Roche Molecular Systems, Inc.

Reagenti

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazioneraccomandate

- Se mantenuti a -15/-25°C e conservati nei flaconi originali, i reagentisono stabili fino alla data di scadenza del kit. Tuttavia si raccomandadi aliquotare i reagenti dopo il primo utilizzo (tranne per la LiPA -Taq)e poi di conservarli a -15/-25°C. Non utilizzare i reagenti dopo ladata di scadenza del kit.

- Tutti i reagenti dovrebbero essere portati a temperatura ambiente (20 - 25°C) 60 minuti circa prima dell'uso e dovrebbero essere ripostiin congelatore immediatamente dopo l'uso.

- I reagenti dovrebbero essere conservati lontano da sorgenti di DNAcontaminante, specialmente da prodotti amplificati.

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- Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicareinstabilità o deterioramento.

Componente Quantità Rif. DescrizioneAmplification Buffer 1 x 0.3 ml 56722 Contiene tutti i dNTPs e 0.05%

NaN3 come conservante.Primer Solution 1 x 0.3 ml 57028 Contiene primers biotinilati,

MgCl2, DMSO e 0.05% NaN3come conservante.

LiPA-Taq 1 x 0.035 ml 56723 Contiene Taq DNA polymerasi e0.05% NaN3 come conservante.

Materiali richiesti ma non forniti

- Materiali per l'estrazione del DNA- Guanti monouso- Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro).- Provette sterili- Porta provette- Microcentrifuga- Thermal cycler e accessori- Pipette regolabili per volumi da 1 - 20 µl, da 20 - 200 µl,

e da 200 - 1000 µl.- Olio minerale o olio di silicone (se richiesto)- Acqua distillata autoclavata

Sicurezza e ambiente

- Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza delproduttore e alle etichette del prodotto per informazioni relativeai componenti potenzialmente pericolosi.

- I campioni devono essere sempre maneggiati come potenzialmentepericolosi.

- É necessario l'uso di dispositivi di protezione: guanti e occhiali disicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettivi.

- I rifiuti devono essere smaltiti secondo le linee guida disposte dalleistituzioni. Osservare anche tutte le disposizioni nazionali e locali.


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Campioni (preparazione e conservazione)

NOTA:- I reagenti non sono forniti

Estrazione del DNA

Per preparare DNA genomico partendo da campioni di sangue intero conacido-citrato-destrosio (ACD) o acido etilendiamminotetracetico (EDTA)come anticoagulante, possono essere utilizzati i comuni metodi di estrazionedel DNA salting-out, o i metodi basati sull'estrazione da colonnine.

Conservare i campioni di DNA a -15/-25°C.

Il DNA estratto dovrebbe avere una concentrazione ≥≥ 0.02 µg/µl. Lapurezza (A260nm/A280nm) dovrebbe essere ≥≥1.5.

Preparazione della mix di PCR

Ogni componente deve essere aggiunto e dosato nella corretta quantità.Una quantità maggiore o minore di campione o reagenti può causareamplificazioni aspecifiche o anche nessuna amplificazione.

Protocollo di PCR

Deve essere impostato e selezionato il corretto profilo per INNO-LiPAHLA-C amplification.

Note e precauzioni

- Per evitare contaminazioni da DNA, si raccomanda la massimaseparazione fisica fra i passaggi di pre- e post-amplificazione: stanzeseparate, pipette e altro materiale di laboratorio dedicati, camici e guantiseparati (e loro scorte) sono le minime precauzioni per una buonapratica di laboratorio. I reagenti devono essere isolati da qualsiasisorgente di DNA contaminante, specialmente dai prodotti di DNAamplificati. Evitare anche la contaminazione microbica dei reagenti.

- Evitare qualsiasi rientro dalla stanza di post-amplificazione allastanza di pre-amplificazione.

- Tutti i puntali e le provette utilizzati devono essere autoclavati. Sono consigliati puntali con filtro. Utilizzare un nuovo puntale sterileper ogni campione aliquotato.

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- I reagenti per i processi di amplificazione dovrebbero esseremanipolati in stanze prive di DNA amplificato. Dovrebbero essereutilizzate provette e puntali (preferibilmente con filtro) autoclavati.

- Dopo lo scongelamento, vortexare l'Amplification Buffer e la PrimerSolution, e centrifugare brevemente i reagenti, particolarmente laLiPA-Taq.

Procedura del test

NOTA:- Questo protocollo per l'amplificazione dell'esone 2 e dell'esone 3 degli

alleli HLA-C è stato disegnato per una ottimale amplificazione usandoprovette GeneAmp™ PCR (0.5 ml) e thermal cyclers PE-480 (PerkinElmer Cetus), o provette MicroAmp® PCR (0.2 ml) e thermal cyclersPE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer Cetus), e LiPA-Taq.

- Questo protocollo può essere usato anche per la maggior parte deithermal cyclers commerciali, ma può richiedere alcune modificheindicate dal produttore dello strumento.

- Prima dell'uso determinare se il protocollo è compatibile con ilthermal cycler in uso nel vostro laboratorio. Prima dell'uso,assicurarsi che il thermal cycler sia calibrato.

- Adottare le necessarie precauzioni per evitare amplificazioni nonspecifiche, che possono inficiare il risultato:• Eseguire i passaggi di pipettamento in ghiaccio e senza ritardi.• Preriscaldare (a 96°C) il blocco riscaldante del thermal cycler

prima di inserire i campioni e far partire immediatamente ilprogramma di amplificazione.

• Conservare la LiPA Taq a -15/-25°C fino al momentoimmediatamente prima dell'uso.

1. Diluire ciascun DNA alla concentrazione compresa tra 0.02 e 0.25 µg/µl in tampone TE.


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2. Determinare il numero di provette da preparare (N):N = numero di campioni di DNA + 1 (controllo negativo; no DNA) + 1Usando puntali con filtro preparare la miscela di amplificazione inuna provetta autoclavata da 1.5 ml:

(N x 23.75 µl) acqua distillata autoclavata+ (N x 10 µl) Amplification Buffer + (N x 10 µl) HLA-C Primer Solution + (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2 U) Il volume totale di questa miscela di amplificazione è ora (N x 45 µl).Vortexare brevemente e aliquotare 45 µl di questa miscela in (N-1)provette di amplificazione autoclavate.

3. Aggiungere, se necessario (ad es. quando si usa PE-480) 2 gocce diolio minerale (~ 40 µl) in ogni provetta.Pipettare 5 µl (da 0.10 a 1.25 µg) di DNA genomico estratto (al di làdell' l'olio minerale, se presente).Aggiungere 5 µl di acqua distillata (no DNA) alla provetta delcontrollo negativo.NOTA:• Non vortexare o miscelare.• Controllare che la miscela di amplificazione sia sul fondo della

provetta.4. Posizionare i campioni nel blocco del thermal cycler, preriscaldato

e calibrato (vedere le istruzioni indicate dal produttore del thermalcycler). Far partire il programma di amplificazione designato perl'amplificazione di HLA-C.

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Profilo di amplificazione HLA-C (thermal cycler: PE-480, PE-2400,PE-9600):

NOTA:• Si utilizza lo stesso profilo di amplificazione per tutti i prodotti

INNO-LiPA HLA di classe I.5. Dopo il processo di amplificazione, usare immediatamente i

campioni con le strisce del test INNO-LiPA HLA-C o conservare icampioni a -15/-25°C.NOTA:• Non conservare i prodotti di DNA amplificato insieme ai

reagenti di amplificazione non ancora utilizzati.

Risultati

Visualizzazione

- La presenza del prodotto di amplificazione può essere verificata suun gel di agarosio al 2%. Caricare 10 µl di prodotto amplificato perpozzetto. L'amplicone dovrebbe apparire come singola banda dilunghezza di 904 bp.

step temp tempo1. denaturazione 96°C 5 min.

2. denaturazione 96°C 30 sec. Ripetere gli3. appaiamento 64°C 50 sec. step da 1 a 44. estensione 72°C 50 sec. 5 volte




14. estensione 72°C 10 min.


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- Osservazioni interne indicano che se è visibile una banda dilunghezza di 904 bp dopo aver caricato 10 µl di prodotto amplificatodiluito 1/10 su un gel di agarosio al 2%, si dovrebbe ottenere con ilLiPA un risultato interpretabile.

Validazione

- Includere almeno un controllo positivo e uno negativo ogni volta cheviene eseguita un'amplificazione. Come per ogni nuova procedura dilaboratorio, dovrebbe essere preso in considerazione l'inserimento diun controllo positivo e negativo aggiuntivi fino al raggiungimento diun alto grado di confidenza nell'esecuzione del test. Se si desideraincludere un controllo positivo aggiuntivo, utilizzare un campionepositivo conosciuto.

- Se si ottiene sul gel una banda positiva per il controllo negativo,l'intera seduta deve essere scartata e deve essere ripetuta la proceduracompleta.

Limiti della procedura

- L'uso di questo prodotto dovrebbe essere limitato solo al personaleaddestrato alle tecniche di amplificazione.

- L'inibizione della Polimerasi (es. mediante eparina) può essere lacausa di un completo fallimento del test.

- Il talco dei guanti monouso e l'ipoclorito di sodio hanno effetti diinibizione sull'amplificazione.

- Ripetuti congelamenti/scongelamenti possono portare adamplificazioni meno efficienti.

- La sequenza a livello del sito di legame del primer non è conosciutaper tutti gli alleli. Il rischio di mismatch a livello del sito di legamedel primer è da considerarsi molto basso, tanto che un fallimento delprimer non è mai stato osservato e sono stati testati numerosi alleliappartenenti a tutti i gruppi. Tuttavia nel caso di un risultatoomozigote deve essere presa in considerazione la possibilità di unaperdita allelica (drop-out).

- Le buone pratiche di laboratorio e un'accurata esecuzione delleprocedure precedentemente specificate permetterannoun'amplificazione specifica.

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Performance del test

L'INNO-LiPA HLA-C è stato valutato in sette laboratori europei ditipizzazione tissutale su campioni tipizzati in routine.

Nello studio è stato testato con INNO-LiPA HLA-C un totale di 269campioni. Tutti i campioni sono stati amplificati con successo.

Español

Símbolos utilizados

Kit di amplificazione

Fabricado por

Producto sanitario para diagnóstico in vitro

Número de lote

Número de catálogo

Para ser usado por

Consulte las instrucciones de uso

Limitaciones de temperatura

Contiene suficiente producto para n ensayos

Solución de primers

Tampón de amplificación

LiPA Taq


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Uso al que está destinado

El kit INNO-LiPA HLA-C Amplification, de uso in vitro, está diseñadopara la amplificación de los ácidos nucleicos de los exones 2 y 3 del locusC del antígeno leucocitario humano (HLA). La reacción se lleva a cabomediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)*.

Principios del ensayo

La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en unamezcla de reactivos que contiene un tampón con un exceso dedesoxinucleósido 5'-trifosfatos (dNTPs), "primers" (oligonucleótidoscebadores) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los primersamplifican los exones 2 y 3 del locus C del HLA y por esa razón sedenominan "primers HLA-C". Las dos cadenas de la hélice de ADN seseparan (desnaturalización) por calentamiento, exponiendo las secuenciasdiana a los primers. Tras enfriar la mezcla a una temperatura concreta,estos primers se ligan a regiones complementarias de secuencias queflanquean a la secuencia diana (anillamiento).

A otra temperatura concreta, la ADN polimerasa termoestable utiliza elexceso de dNTPs, extendiendo los primers anillados a lo largo del ADNmolde diana (extensión). De esta forma, tras un ciclo se obtienen doscopias exactas, biotiniladas, de la secuencia diana. Tras 35 ciclos seobtiene un número mayor de copias biotiniladas de la secuencia diana.

* La utilización de este producto está cubierta por una licencia F.Hoffmann - La Roche Ltd y Roche Molecular Systems, Inc.

Reactivos

Descripción, preparación para el uso y condiciones de almacenamientorecomendadas

- Si se mantienen a una temperatura de -15/-25°C en sus botellasoriginales, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidadindicada. No obstante, se recomienda alicuotar los reactivos (exceptoel LiPA-Taq) tras el primer uso, y luego almacenarlos a unatemperatura de -15/-25°C. No utilice los reactivos más allá de sufecha de caducidad.

- Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (20 - 25ºC) aproximadamente 60 minutos antes de ser usados ydevueltos al congelador inmediatamente después de su uso.

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- Los reactivos deben almacenarse completamente aislados decualquier fuente de ADN contaminante, especialmente productos deADN amplificado.

- Las alteraciones de la apariencia física del kit de reactivos puedenser signos de inestabilidad o deterioro.

Componente Cantidad Ref. DescripciónTampón de amplificación 1 x 0,3 ml 56722 Contiene todos los dNTPs y NaN3

al 0,05% como conservante. Solución de primers 1 x 0,3 ml 57028 Contiene los primers biotinados,

MgCl2, tampón Tris, y NaN3 al0,05% como conservante.

LiPA Taq 1 x 0,035 ml 56723 Contiene Taq ADN polimerasa (2 U/µl) y NaN3 al 0,05% comoconservante.

Materiales necesarios pero no suministrados

- Materiales para la extracción de ADN.- Guantes desechables.- Puntas de pipeta estériles desechables (preferiblemente taponadas

con algodón).- Microtubos esterilizados.- Racks de microtubos.- Centrifugadora de microtubos.- Ciclador térmico de ADN y equipo.- Pipetas ajustables para pipetear de 1 - 20 µl, de 20 - 200 µl,

y de 200 - 1000 µl.- Aceite mineral, silicona (en caso necesario).- Agua destilada esterilizada en autoclave.

Seguridad y medio ambiente

- Por favor, consulte la hoja de datos sobre seguridad delfabricante y el etiquetado del producto para obtener informaciónacerca de componentes potencialmente peligrosos.

- Las muestras deben manipularse siempre como productospotencialmente peligrosos.

- Es imprescindible el uso de equipo protector personal: guantes y gafasde seguridad cuando manipule agentes peligrosos o infecciosos.


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- Deseche los residuos de acuerdo con las normas de manejo deresiduos de su institución. Asimismo, cumpla con todas las normasmedioambientales nacionales, autonómicas y locales.

Recogida (preparación y almacenamiento de muestras)

NOTA:- Los reactivos no se suministran.

Extracción de ADN

Para preparar ADN genómico a partir de muestras de sangre enteratratadas con los anticoagulantes ácido-citrato-dextrosa (ACD) o ácidoetilendiaminotetraacético (EDTA) pueden utilizarse los métodos comunesde extracción del ADN por desalación o métodos basados en columnascentrífugas.

Almacene las muestras de ADN a una temperatura de -15/-25ºC.

El ADN extraído debería tener una concentración de 0,02 µg/µl. Lapureza (A260nm/A280nm) debería ser ≥≥ 1,5.

Preparación de la mezcla para la PCR (reacción en cadena de lapolimerasa)

Debe agregarse cada uno de los componentes, y en la cantidad correcta. Si agrega demasiada cantidad o una cantidad insuficiente de muestra o dereactivos, puede producirse una amplificación no específica o incluso noproducirse ninguna amplificación.

Ciclos de PCR

Debe seleccionar el perfil de temperatura correcto para el INNO-LiPAHLA-C Amplification.

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Observaciones y precauciones

- A fin de evitar la contaminación del ADN, se recomienda utilizar unamáxima separación física entre los pasos de pre y posamplificación:salas separadas, pipetas (y demás material de laboratorio) separadas,trajes y guantes de laboratorio (y sus recambios) separados, son lasprecauciones mínimas para las buenas prácticas de laboratorio. Losreactivos deben aislarse de cualquier fuente de ADN contaminante,especialmente productos de ADN amplificado. Evite también lacontaminación microbiana de los reactivos.

- Una vez en la sala de posamplificación evite volver a la sala depreamplificación.

- Todas las puntas de pipeta y tubos utilizados para el proceso deamplificación deben haberse esterilizado en autoclave antes de suuso. Se recomienda utilizar puntas de pipeta taponadas con algodón.Utilice una punta nueva por cada alícuota de muestra que pipetee.

- Los reactivos para procesos de amplificación deben guardarse en unahabitación libre de DNA amplificado. Se deberían usar tuboseppendorf y puntas de pipeta (preferiblemente con filtro) autoclavados.

- Tras la descongelación, vortee la solución de amplificación y lasolución de primers, y centrifugue brevemente todos los reactivos,especialmente la LiPA-Taq.

Procedimiento del ensayo

NOTA:- Este protocolo para la amplificación de los exones 2 y 3 del gen del

HLA-C está diseñado para proporcionar una amplificación óptimautilizando tubos GeneAmp™ (de 0,5 ml) para PCR y cicladorestérmicos PE-480 (Perkin Elmer Cetus), o tubos MicroAmp®(de 0,2 ml) para PCR y cicladores térmicos PE-2400 y PE-9600(Perkin Elmer Cetus), y LiPA-Taq.

- Este protocolo puede utilizarse con la mayoría de los tipos decicladores térmicos comerciales, aunque es posible que debamodificarse en función de las indicaciones del fabricante del ciclador.

- Antes de utilizarlo, determine si el protocolo es compatible con elciclador térmico que utilice en su laboratorio. Asegúrese de calibrarel ciclador térmico antes de utilizarlo.

- Tome las precauciones necesarias para evitar la amplificación noespecífica y la formación de dímeros de primers, ya que, de locontrario, los resultados se verían comprometidos:• Lleve a cabo los pasos de pipeteado en hielo y sin demora.


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• Precaliente (a 96°C) el bloque de calentamiento del cicladortérmico antes de insertar las muestras e inicie de inmediato elproceso de ciclado.

• Guarde la LiPA-Taq a -15/-25ºC inmediatamente después de su uso.

1. Diluya cada ADN genómico a una concentración comprendida entre0,02 y 0,25 µg/µl en tampón TE.

2. Determine el número de viales que se deben preparar (N) utilizandola siguiente fórmula:N = número de muestras de ADN + 1 (control negativo; sin ADN) + 1. Utilizando puntas taponadas con algodón, prepare la mezcla maestraen un tubo de 1,5 ml esterilizado en autoclave:

(N x 23,75 µl) agua destilada esterilizada en autoclave+ (N x 10 µl) Tampón de amplificación+ (N x 10 µl) Solución de primers HLA-C + (N x 1,25 µl) LiPA-Taq (N x 2,5 U) El volumen total de esta mezcla de amplificación es ahora igual a (N x 45 µl). Procese brevemente en vórtice y pipetee 45 µl de estamezcla maestra en (N-1) tubos de amplificación esterilizados enautoclave.

3. Añada 2 gotas (~ 40 µl) de aceite mineral en cada tubo si esnecesario (por ejemplo, si utiliza PE-480).Pipetee 5 µl (0,1 a 1,25 µg) del preparado de ADN genómico (si es necesario, a través del aceite mineral). Añada 5 µl de agua destilada (sin ADN) al tubo de control negativo.NOTA:• No lo vortee ni lo mezcle• Compruebe que la mezcla de amplificación esté en el fondo del

tubo.4. Inserte las muestras en el bloque térmico precalentado y calibrado

(consulte las instrucciones del fabricante del ciclador térmico). Inicieel programa de amplificación diseñado para la amplificación INNO-LiPA HLA-C.

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Perfil de la amplificación INNO-LiPA HLA-C (termociclador PE-480, PE-2400, PE-9600):

NOTA: • Se utiliza el mismo perfil de amplificación para todos los

productos INNO-LiPA HLA de la clase I.5. Concluido el proceso de amplificación, utilice las muestras de

inmediato con tiras INNO-LiPA HLA-C o almacénelas a unatemperatura de -15/-25°C.NOTA: • No almacene los productos de ADN amplificado junto a los

reactivos de amplificación que no se hayan utilizado.

Resultados

Visualización

- La presencia de amplicones puede comprobarse en gel de agarosa al2%. Cargue 10 µl del producto amplificado por ranura. El productoamplificado debe aparecer como una única banda de 904 pb.

- Las observaciones realizadas en nuestros laboratorios muestran quesi es visible una banda de 904 pb tras sembrar en gel de agarosa al2% 10 µl de una dilución 1/10 del producto amplificado puedeobtenerse un resultado interpretable con el ensayo LiPA.

Paso Temperatura Tiempo1. desnaturalizar 96°C 5 min

2. desnaturalizar 96°C 30 s Repetir 5 veces3. anillar los primers 64°C 50 s las fases 1 a 44. extender los primers 72°C 50 s

5. desnaturalizar 96°C 30 s Repetir 5 veces 6. anillar los primers 62°C 50 s las fases 5 a 77. extender los primers 72°C 50 s

8. Desnaturalizar 96°C 30 s Repetir 10 veces9. anillar los primers 60°C 50 s las fases 8 a 1010. extender los primers 72°C 50 s

11. Desnaturalizar 96°C 30 s Repetir 15 veces12. anillar los primers 55°C 50 s las fases 11 a 1313. extender los primers 72°C 50 s

14. Elongar 72°C 10 min


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Validación

- Incluya al menos un control negativo y uno positivo cada vez querealice una amplificación. Como con cualquier nuevo procedimientode laboratorio, deberían incluirse controles positivos y negativosadicionales hasta que el procedimiento de ensayo se consigadesarrollar correctamente con un elevado grado de confianza. Encaso de que sea aconsejable incluir un control positivo adicional,utilice una muestra positiva conocida.

- Si se obtiene una banda positiva correspondiente al control negativoen el gel, debe desecharse la totalidad de la prueba y repetirse todo elprocedimiento.

Limitaciones del procedimiento

- Este producto sólo debe ser utilizado por personal especializado entécnicas de amplificación.

- La inhibición de la polimerasa (por ejemplo, por la heparina o por lahemoglobina) puede anular el ensayo.

- Asimismo, el polvillo de los guantes desechables y el hipocloritosódico tienen un efecto inhibidor sobre la amplificación.

- Una congelación/descongelación repetida de las muestras de ADNpuede ocasionar una amplificación menos eficiente.

- No se conoce la secuencia del lugar de unión del primer para todoslos alelos. El riesgo de unión no deseada en el lugar del primer seconsidera muy bajo, ya que nunca se ha observado un fracaso delprimer y se han probado un número significativo de alelos queabarcan todos los grupos. Sin embargo, en caso de un resultadohomocigótico debe considerarse la posibilidad de un fallo deamplificación alélica.

- La amplificación específica se asegura mediante las buenas prácticasde laboratorio y una cuidadosa ejecución de los procedimientos quese han descrito.

Eficacia del ensayo

El LiPA HLA-C ha sido evaluado en siete laboratorios europeos de tipajede tejido en muestras de rutina.

Durante el ensayo se probaron 269 muestras con el LiPA HLA-C. Todaslas muestras fueron amplificadas con éxito.

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Português

Símbolos utilizados

Kit de amplificação

Fabricado por

Dispositivo médico de diagnóstico In vitro

Número de lote

Número de Catálogo

Utilizar por

Consultar instrucções de utilização

Limites de Temperatura

Conteúdo suficiente para <n> testes

Solução de primer

Tampão de Amplificação

LiPA Taq

Indicações de uso

O kit INNO-LiPA HLA-C Amplificação, para utilização in vitro, éconcebido para a amplificação de ácidos nucleicos do Segundo e terceiroexons do locus C do antigénio leucocitário humano (HLA). A reacção érealizada mediante a reacção em cadeia da polimerase (PCR)*.


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Princípio do Teste

A amostra de AND a ser amplificada por PCR*, é introduzida numamistura de reagentes contendo um excesso de desoxinucleósido 5'-trifosfatos (dNTPs), primers biotinilados e ADN polimerase termoestável.Os primers amplificam o exon 2 e o exon 3 do locus HLA-C, e são porisso chamados "HLA-C primers".Por aquecimento, as duas cadeias da hélice de ADN separam-se(desnaturação), de modo a expor as sequências alvo aos primers. Estes primers são complementares às regiões que flanqueiam a sequênciaalvo. Portanto, após arrefecimento a uma temperatura específica, osprimers ligam-se à sua região alvo (annealing).

A outra temperatura e utilizando os dNTPs, a ADN polimerase termoestávelestenderá os primers ao longo do molde alvo (extensão). Deste modo, apósum ciclo de desnaturação, annealing e extensão, são produzidas duas cópiasexactas, biotiniladas da sequência alvo. Após 35 ciclos, obtém-se um grandenúmero de cópias biotiniladas da sequência alvo.

* A utilização deste produto depende de licença de F. Hoffmann - LaRoche Ltd and Roche Molecular Systems, Inc.

Reagentes

Descrição, preparação e condições de conservação recomendadas

- Se conservados a temperaturas de -15/-25°C e guardados nos frascosoriginais, os reagentes mantêm-se estáveis até ao fim do prazo devalidade do kit. No entanto, recomenda-se a alíquota dos reagentes(excepto para LiPA-Taq) depois da primeira utilização e, então,conservá-los de -15/-25°C. Não usar reagentes para além da data devalidade do kit.

- Todos os reagentes devem ser colocados à temperatura ambiente (20 - 25ºC) aproximadamente 60 minutos antes de usar e devem serrecolocados no congelador imediatamente após a sua utilização.

- Os reagentes devem ser conservados, isolados de qualquer fonte decontaminação do ADN, especialmente de produtos de ADNamplificado.

- Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicarinstabilidade ou deterioração.

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Reagentes fornecidos:

Componente Quantidade Ref. DescriçãoTampão de Amplificação 1 x 0.3 ml 56722 Contém todos os dNTPs and

0.05% NaN3 como conservante.Solução de Primer 1 x 0.3 ml 57028 Contém os primers biotinilados,

MgCl2, e 0.05% NaN3 comoconservante

LiPA Taq 1 x 0.035 ml 56723 Taq ADN Polimerase e 0.05%NaN3 como conservante.

Materiais necessários mas não fornecidos

- Materiais para extracção de ADN.- Luvas descartáveis.- Pontas de pipeta descartáveis, esterilizadas (de preferência com filtro

de algodão).- Microtubos esterilizados.- Suportes de microtubos.- Centrífuga de microtubos.- Termociclador de ADN e equipamento.- Pipetas ajustáveis para dispensar 1 - 20 µl, 20 - 200 µl, e 200 - 1000 µl.- Óleo mineral, gordura de silicone (se necessário).- Água destilada esterilizada em autoclave.

Segurança e meio ambiente

- Consultar a folha de dados de segurança do fabricante e arotulagem do produto para obter informação sobre componentespotencialmente perigosos.

- As amostras devem sempre ser manipuladas como potencialmenteperigosas.

- É imprescindível o uso de equipamento de protecção pessoal: luvas eóculos de segurança quando manusear agentes perigosos ou infecciosos.

- Os resíduos devem ser tratados de acordo com as regras dainstituição, relativas ao tratamento de resíduos. Respeitar tambémtodos os regulamentos oficiais, locais e ambientais.


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Amostras (preparação e conservação)

NOTA:- Os reagentes não são fornecidos.

Extracção do ADN

Para preparar o ADN genómico a partir de amostras de sangue totaltratadas com os anticoagulantes ácido-citrato-dextrose (ACD) ou ácidoetilenodiaminotetracético (EDTA) podem utilizar-se os métodos comunsde extracção do ADN por dessalinização (salting-out) ou os métodosbaseados em colunas.

Guardar as amostras de ADN de -15/-25°C.

O ADN extraído deve ter uma concentração ≥≥ 0.01 µg/µl. A pureza(A260nm/A280nm) deve ser ≥≥1.5.

Preparação da mistura de PCR

Cada componente deve ser adicionado na quantidade certa. Se seadicionar demasiada quantidade ou uma quantidade insuficiente deamostras ou reagentes, pode produzir-se uma amplificação não específicaou mesmo uma não amplificação.

Ciclos de PCR

Deve ser seleccionado o perfil correcto de temperatura para o INNO-LiPAHLA-C.

Observações e precauções

- A fim de evitar a contaminação do ADN, recomenda-se utilizar amáxima separação física entre os passos de pré e pós amplificação:salas separadas, pipetas (e restante material de laboratório)separadas, batas e luvas de laboratório (e o seu stock) separadas, sãoprecauções mínimas para uma boa prática laboratorial. Os reagentesdevem ser isolados de qualquer fonte de contaminação do ADN,especialmente produtos de ADN amplificado. Evitar também acontaminação microbiana dos reagentes.

- Uma vez na sala de pós-amplificação, evite regressar à sala de pré-amplificação.

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- Todas as pontas de pipeta e todos os tubos usados para o processo deamplificação devem ser esterilizados em autoclave antes do uso.Recomenda-se o uso de pontas de pipeta com filtros de algodão.Utilizar uma nova ponta de pipeta esterilizada para cada alíquota daamostra.

- Os reagentes para os processos de amplificação devem sermanipulados numa sala isenta de ADN amplificado. Devem serusados tubos e pontas de pipeta (de preferência com filtros dealgodão) esterilizados em autoclave.

- Após a descongelação, agitar em vortex o Tampão Amplificação e aSolução de Primers e centrifugar brevemente todos os reagentes,especialmente LiPA-Taq.

Procedimento do teste

NOTA:- Este protocolo para a amplificação do exon 2 e do exon 3 dos alelos de

HLA-C foi concebido para uma amplificação óptima usando tubos paraPCR GeneAmp™ (de 0.5 ml) e termocicladores PE-480 (Perkin ElmerCetus), ou tubos para PCR MicroAmp® (de 0.2 ml) e termocicladoresPE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus) e LiPA-Taq.

- Este protocolo pode ser usado com a maioria dos tipos determocicladores comerciais, embora possam ser necessárias algumasmodificações em função das indicações do fabricante do ciclador.

- Antes de usar, determinar se o protocolo é compatível com otermociclador utilizado no seu laboratório. Assegurar-se de que otermociclador foi calibrado antes de usar.

- Tomar as precauções necessárias para evitar amplificação nãoespecífica que pode comprometer os resultados:• Realizar os passos de pipetagem no gelo, sem demora.• Preaquecer (96°C) o bloco de aquecimento do termociclador

antes de juntar as amostras e começar imediatamente o processode ciclagem.

1. Diluir cada ADN genómico numa concentração compreendida entre0.01 e 0.02 µg/µl em tampão TE.


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2. Determinar o número de frascos a ser preparados (N) utilizando aseguinte fórmula:N = número de amostras de ADN + 1 (controlo negativo, sem ADN) + 1.Utilizando pontas de pipeta com filtro de algodão, preparar umamastermix num tubo de 1.5 ml, esterilizado em autoclave:

(N x 23.75 µl) água destilada esterilizada em autoclave+ (N x 10 µl) Tampão de Amplificação+ (N x 10 µl) Solução de Primers DRB1 + (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2 U)O volume total desta mistura de amplificação é agora de (N x 45 µl).Vortex brevemente e aliquote 45 µl desta mastermix em (N-1) tubosde amplificação esterilizados em autoclave.

3. Juntar 2 gotas (~ 40 µl) de óleo mineral a cada tubo, se necessário(por ex. se utiliza o PE-480). Pipetar 5 µl (0.5 a 7.5 µg) da preparação de ADN genómico (atravésdo óleo mineral, se necessário). Juntar 5 µl de água destilada (semADN) ao tubo de controlo negativo.NOTA:• Não agitar ou misturar.• Verificar que a mistura de amplificação está no fundo do tubo.

4. Colocar as amostras no bloco térmico pré-aquecido e calibrado(ver instruções do fabricante do termociclador). Iniciar o programade amplificação concebido para a amplificação com o HLA-C.

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Perfil do HLA-C amplificação (tipo de ciclador: PE-480, PE-2400,PE-9600):

NOTA: • Os mesmos perfis de amplificação são utilizados para todos os

produtos INNO-LiPA HLA classe I.5. Depois do processo de amplificação, usar de imediato as amostras

com as tiras de teste de INNO-LiPA HLA-C ou conservar asamostras de -15/-25°C.NOTA:• Não armazenar produtos de ADN amplificado juntamente com

reagentes de amplificação que não tenham sido ainda utilizados.

Resultados

Visualização

- A presença de produto amplificado pode ser verificada num gel deagarose a 2%. Carregar 10 µl de produto amplificado em cadaranhura. O amplicon deve aparecer como uma banda única com umcomprimento de 904 bp.

Passo temperatura tempo1. Desnaturação 96°C 5 min.

2. Desnaturação 96°C 30 seg. Repetir os ciclos3. Annealing de primers 64°C 50 seg. passos 1 a 44. Extensão de primers 72°C 50 seg. 5 vezes




14. Elongação 72°C 10 min.


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- Observações realizadas nos nossos laboratórios mostraram que podeser obtido um resultado interpretável com o ensaio LiPA se forvisível uma banda com o comprimento de 904 bp após verificação de10 µl de uma diluição 1/10 dilution de produto amplificado em gelde agarose a 2%.

Validação

- Incluir, pelo menos, um controlo negativo e um positivo de cada vezque se realiza uma amplificação. Tal como em qualquer novoprocedimento laboratorial, devem incluir-se controlos positivo enegativo adicionais, até que se atinja um alto grau de confiança nacapacidade de realizar correctamente o procedimento do teste. No caso de ser aconselhável a inclusão de um controlo positivoadicional, usar uma amostra positiva conhecida.

- Se se obtiver uma banda positiva no gel correspondente ao controlonegativo, toda a operação deve ser desprezada e o procedimento deveser repetido por completo.

Limites do procedimento

- A utilização deste produto deve ser limitada a pessoal bem treinadoem técnicas de amplificação.

- A inibição da polimerase (por ex. pela heparina ou pelahemoglobina) pode ser razão para a completa anulação do ensaio.

- O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio têm um efeitoinibidor da amplificação.

- A congelação e descongelação repetida das amostras de ADN poderesultar em amplificações menos eficazes.

- A sequência do local de ligação dos primers não é conhecida paratodos os alelos. O risco de mismatch no local de ligação do primer éconsiderado muito baixo, uma vez que nunca se observou uma falha doprimer e foi testado um número significativo de alelos abarcando todosos grupos. No entanto, no caso de um resultado homozigótico, deve serconsiderada a possibilidade de uma falha de amplificação alélica.

- A amplificação específica é assegurada mediante as boas práticas delaboratório e uma cuidadosa execução dos procedimentos descritos.

Performance do Teste

LiPA HLA-C foi avaliado em sete laboratórios Europeus de tipagem detecidos em amostras de rotina.

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Durante o estudo foram testadas no total de 269 amostras com LiPAHLA-C. Todas as amostras foram amplificadas com sucesso.


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inno-lipa hla-c amplification · table of contents english symbols used . . . . . . . . . . . . . ....

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